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La présente invention a pour objet la prépara- tion- de 'nouveaux 'composés tétracycline-urée, et leur utili' sation dans la récupération de la tétracycline à partir d'-une matière contenant de la tétracycline.
Suivant l'invention, on fournit un procédé de préparation de composés tétracycline-urée, qui consiste à faire réagir l'urée sur la tétracycline ou sur ses sels d'acides ou sels basiques.
Le composé nouveau préparé suivant la présente invention est stable vis-à-vis de la conservation prolon- gée,. et fournit un moyen commode pour obtenir des prépara- tions stables de tétracycline, à partir desquelles on peut régénérer facilement la tétracycline pure. Comme tel, le produit nouveau offre des possibilités d'usage dans l'exoù il devient nécessaire de conserver despréparations/ portation ou dans d'autres circonstances/ de tétracycline pendent des temps prolongés sans toutefois amener de per- tes de pouvoir antibiotique. L'un des avantages impor- tants de ce composé est qu'il peut servir à raffiner la tétracycline comme il sera expliqué ci-après.
Dans le composé tétracycline-urée préparé sui- vant la présente invention, le rapport molaire tétracycli- ne:urée- est de 1:1. On peut obtenir le composé tétracy- cline-urée sous une série de formes hydratées, par exemple sous forme de trihydrate ou de monohydrate.
La solubilité de ce composé dans l'eau est de l'ordre de 325 gammas/cm3, On a déterminé que la rotation optique du composé était : [Ó]D25 -'220,0, en solution à 0,5 % dans le méthanol; ###25d 229,0, en solution à 0,5 % dans l'acide chlorhydrique 0,03 N. Le composé fond avec décomposition à 143-146 C, et il présente des raies caractéristiques, dans son spectre à l'infra-rouge, à 5,75 # et à 6,55# @
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à l'intérieur et au delà des bandes normales dans l'infrarouge de la tétracycline.
Dans la conduite de l'invention, la préparatior la plus 'facile consiste à délayer simplement la tétracycline, eu les sels d'acide ou sels basiques de celle-ci, dans une solution aqueuse d'urée, et à séparer le composé tétracycline-urée qui s'est ainsi formé et précipité.
L'un des avantages principaux de ce composé est qu'il peut servir à raffiner ou à récupérer la tétracycline relativement pure, à partir de mélanges de fermentation ou d'autres solutions qui contiennent de la tétracycline, par exemple à partir de solutions réduites de chlorotétracycline.
Dans la demande de brevet belge déposée ce
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.JOt40 rfl'l3 Gv%j- . même jourfPar la demanderesse pour : "Récupération de la tétracycline à partir d'un mélange en fermentation acidifié", on décrit un procédé perfectionné pour raffiner ou récupérer la tétracycline à partir des mélanges de fermer tation ou autres'solutions contenant de la tétracycline.
Le procédé décrit consiste à filtrer le mélange fermenté à un pH acide tel que le produit actif reste dans le filtrat, à ajuster la teneur en ions calcium du filtrat aqueux à un niveau prédéterminé au moyen d'oxalate, à ajuster le pH du filtrat aqueux entre 8 et 12, et à y mélanger une.certaine uantité d'un composé d'ammonium quaternaire contenant des radicaux alkyle à longue chaîne tel que le 'chlorure de cétyltriméthylammonium, et un solvant organique polaire non miscible à l'eau tel que la méthylisobutylcétone, ce qui fait que la tétracycline s'extrait de la phase aqueuse. On sépare alors la phase solvant de la phase aqueuse qui contient les impuretés de fermentation.
On a découvert maintenant que la formation
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d'un composé tétracycline-urée facilite appréciablement l'isolement ou la récupération d'une tétracycline relativement pure à partir d'extraits de solvants contenant de la tétracycline brute' et des impuretés associées.
Sous cet aspect de la présente invention, on p.rend-un extrait de tétracycline dans un solvant, par exemple un extrait préparé de façon indiquée dans la demande de brevet belge précitée, et on le met en contact avec une solution aqueuse d'urée. On agite le mélange et on ajuste le pH entre 2,5 et 6,0 et de préférence entre 3 et 4, par addition d'un acide minéral approprié tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, etc., le composé tétracycline-urée se forme alors et précipite de la solution en laissant les impuretés en solution. On récupère alors le composé tétracycline-urée par filtration.
Ce procédé aboutit à la formation d'une tétracycline de haute qualité,pratiquement exempte d'impuretés.
Dans cet aspect de la présente invention, il est préférable d'utiliser 3 à 20 équivalents environ d'uréa aqueuse par équivalent de tétracycline brute dans l'extrait de solvant. La solution aqueuse d'urée est de préférence à demi-saturée,.ou moins encore. On obtient des rendements en composé tétracycline-urée de 90% et au delà, par ce procédé, en partant d'extraits aux solvants.
'Dans un autre aspect de la présente invention. on peut utiliser la formation du composé tétracycline-uré pour isoler la tétracycline des extraits aqueux contenant de le tétracycline, de façon similaire à celle utilisée pour récupérer la tétracycline à partir d'extraits aux -solvants organiques comme il est indiqué plus haut.
Par exemple, suivant la demande de brevet belge précitée, on peut mettre l'extrait de tétracycline
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dans la méthylisobutylcétone en contact avec de l'eau acidulée à un pH'de 1,5-2,5' On mélange les deux phases et on les sépare, et le sel d'acide de la tétracycline passe dans la phase aqueuse. On peut alors, si pn le désire, neutraliser à pH de 2,5 à 8 cet extrait à l'eau acidifiée, en ajoutant une base, et la tétracycline neutre brute cristallise alors dans la solution.
Sous cet aspect de la présente invention, au lieu de neutraliser l'extrait à l'eau acidifiée par une base et de précipiter la tétracycline neutre, on peut mettre l'extrait en'contact avec environ 6 à 30 équivalents d'urée solide par équivalent de tétracycline. On peut alors ajuster le pH de l'extrait à l'eau acidifiée, entre 3 et 5 ; composé tétracycline-urée précipite alors et on peut le récupérer par filtration. Comme dans le procé- dé avec extrait au solvant organique décrit plus haut, l'usage du composé tétracycline-urée dansce procédé avec extrait à l'eau acidifiée, donne aussi de bonnes récupérations de tétracycline purifiée exempte d'impuretés associées. Cette matière est par exemple un trihydrate de grande pureté.
De même, on peut aussi traiter, par l'urée solide, l'extrait aqueux préparé à partir de l'extrait butanolique acide de tétracycline provenant des mélanges de fermentation,' afin de former le composé tétracycline-urée de la présente invention.
Un autre important usage de ce composé consiste à récupérer la tétracycline, sous forme de composé tétracycline-urée, à partir de solutions de tétracycline obtenues par déchloruration réductrice de la chlorotétracycline. Ce processus d'hydrogénolyse est décrit de façot adéquate dans la littérature chimique, par exemple, dans le J.A.C.S. 75, 4621.' On peut mettre ces solutions réduites de chlorotétracycline en contact avec de l'urée
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aqueuse en quantités indiquées ci-dessus, pour donner le composé tétracycline-urée suivant la présente invention.
Ce procédé donne une tétracycline de haute qualité et de grande pureté.
Un autre usage du composé tétracycline-urée préparé suivant la présente invention consiste à former ce composé dans des processus de recristallisation pour purifier davantage la tétracycline après sa récupération à partir du mélange de fermentation.
Sous cet aspect de la présente invention, on prend la tétracycline neutre, telle qu'elle est obtenue par exemple dans,-le procédé décrit dans la demande de brevet belge précitée, on la délaie dans l'urée aqueuse en quantité indiquée plus haut, et on ajuste le pH entre 3 et 5, de sorte que le composé tétracycline-urée cristal- lise' sous forme de trihydrate. On obtient par ce procédé de recristallisaion des rendements de l'ordre de 85-90%, avec une pureté moyenne d'environ 96-100%./
On peut dissocier le composé tétracyclineurée de plusieurs manière pour en récupérer la tétracycline.
Une méthode consiste à délayer le composé tétracycli ne-urée dans un solvant organique hydroxylé approprié tel que le butanol, le 2-éthoxyéthanol etc., et à traiter par un acide afin de précipiter un sel d'acide de la tétracycline, l'urée restant en solution dans ces conditions. On peut utiliser l'acide chlorhydrique pour former dû chlorhydrate de tétracycline par exemple. On peut aussi former le chlorhydrate de tétracycline en dissolvant le composé tétracycline-urée dans un mélange de 2-éthoxyéthanol et de butanol et en ajoutant une base telle que la triéthylamine, puis en acidifiant à l'acide chlorhydrique. On peut évidemment utiliser d'autres acides tels que l'acide
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formique, # l'acide trichloracétique, etc..
Une autre mé-
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tnode de dissociation consiste à convertir le composé tétracycline-urée en tétracycline neutre en préparant une solution du composé dans un solvant organique puis en repré cipitant la-tétracycline neutre de cette solution par addition d'eau, et en élevant le pH de la solution aux environs du point neutre. Des solvants organiques appropriés sont le méthanol-, l'éthanol, le butanol, l'acétone, le tétrahydrofurane, etc. On peut aussi obtenir la tétracycline neutre en dissolvant le composé dans l'eau acidifiée et en neutralisant par un alcali pour cristalliser la tétracycline neutre. On a trouvé que les rendements de conversion du composé tétracycline-urée en chlorhydrate de tétracycline par les méthodes ci-dessus sont de l'ordre de 90%..
Une caractéristique surprenante de la présente invention, consiste en ce que la formation d'un composé d'urée insoluble puisse être obtenue, pour autant que l'on sache, seulement avec l'antibiotique tétracycline. Autrement dit) la formation d'un composé d'urée insoluble ne peut pas être obtenue dans ces conditions, lorsqu'on remplace la tétracycline par d'autres antibiotiques tels que
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la chlorotétracycline, l'oxytêtracycline, ltanhydrotétra- cycline, la quatrimycine, la chloroquatrimycine, etc.. On ne sait pas exactement pourquoi il en est ainsi, et on n'avancera aucune théorie à ce sujet.
Il est entendu que la présente invention n'est pas limitée,à la préparation du composé tétracycline-urée à partir de la tétracycline proprement dite, -e--est-à-dire de la base libre, car on a trouvé que, pour préparer le composé tétrpcycline-urée suivant la présente invention, on peut utiliser, avec la même facilité, les sels formés par la tétracycline avec des acides ou des bases, c'est-àdire les sels formés par la tétracycline avec des acides
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minéraux, les sels formés par la tétracycline avec des métaux alcalins,.les sels d'ammonium et d'aminés de la tétracycline.
'On décrira l'invention plus en détail à propos des exemples précis qui suivent.
EXEMPLE 1
On prend 2 litres de mélange de fermentation de tétracycline titrant 5100 gammas/em3, et on les acidifie avec de l'acide sulfurique à 25% jusqu'au pH 1,8, on agite pendant 40 minutes et on filtre à l'aide de 200 g de terre d'infusoires. On délaie les solides dans 1,5 litres d'eau à 45 C, on ajuste à pH 1,85 avec 2,5 cm3 d'acide sulfurique à 25%,on agite pendant 40 minutes et on filtre. On réunit les filtrats, on les traite par 88.2 g d'oxalate d'ammonium, on agite pendant 30 minutes à la température ambiante, on conserve à 4 C pendant 2 heures et on filtre. On lave le gâteau filtre avec 50 cm3 d'eau pour assurer une récupération complète de produit actif.
Aux 2,97 litres d'extrait aqueux, on ajoute 300 cm3 de méthylisobutylcétobe et 15 cm3 de chlorure de cétyltriméthylammonium à 50% ("Arquad 16")¯ et on ajuste le mélange à pH 8,8 par traitement avec 23 cm3 de NaOH 18N.
Après avoir agité pendant 20 minutes, on sépare les deux phases; On traite la phase aqueuse par 100 cm3 de méthyl-. isobutylcétone, 5 cm3 de chlorure de cétyltriméthylammoniur à 50% ("Arquad 16") et 2 cm3 de NaOH 18 N pour ajuster le pH à 8,8. On agite le mélange pendant 20 minutes, on sépare et on extrait la phase aqueuse par une autre portion de. 100 cm3 du même solvant. On réunit les extraits et on les agite avec 40 cm3 d'eau, on sépare la liqueur de lavage aqueuse et on la jette. On fait un deuxième lavage avec 40 cm3 d'eau$ en utilisant de la soude pour ajuster le pH à11,5 avant de filtrer et de séparer.
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EXEMPLE 2
On prend une portion de 200 cm3 d'extrait à la méthylisobutylcétone et clarifié (préparé comme dans l'exemple 1) titrant.40 500 gammas de tétracycline par cm3, et on traite par 32 cm3 de solution aqueuse saturée d'urée et 32 cm3 d'eau. On ajoute de l'acide chlorhydri- que-concentré pour abaisser le pH de 9,0 à 5,5. On place le mélange sur une secoueuse rotative pendant 16 heures, on ajuste à pH 3,0 par une nouvelle addition d'acide chlorhydrique et on agite pendant 48 heures de plus. On filtre le produit qui s'est précipité, on le lave à l'eau et on le sèche sous vide à 50 C. On obtient un rendement de 7,80 g de composé tétracycline-urée titrant 938 gammas/ mg, ce,qui représente 90,3 % du rendement calculé.
Analyse : calculée pour le monohydrate de tétracycline-urée :
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233010 : C 52, 80 ; H 5,75 ; N 10,72. Effective : C 5285 ; H 5968 ; N 10,70.
EXEMPLE 3
A 1,05 litre d'extrait à la méthylisobutylcétone titrant 95 400 gammas de tétracycline par cm3 et préparé comme dant l'exemple 1, on ajoute 525 cm3 d'eau et on ajuste le pH à 1,75 par addition de 52 cm3 d'acide chlorhydrique concentré. On agite le mélange et on le sépare, pour obtenir 736 cm3 de phase aqueuse titrant 124 800 gammas/cm3. On agite une portion de 100 cm3 de l'extrait aqueux avec 50 g d'urée jusqu'à ce que la dissolution soit complète. On ajuste le pH à 4,60 avec de la soude 18 N, et on agite le mélange pendant 24 heures. On filtre le produit, on le lave à l'eau et on le sèche sous vide à 50 C. On; obtient un rendement de 10,70 g de composé té-
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tracycline-urée titrant 905 gammas/mg, ce qui représente 78,1 % du rendement calculé.
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EXEMPLE 4
On prend une portion de 400 cm3 d'extrait aqueux titrant 67 500 gammas de tétracycline par cm3, et préparé'comme dans l'exemple 3, et on agite avec 120 g d'urée jusqu'à ce que la dissolution soit complète, et on élève le pH à 3,3 par addition de soude. Après avoir agité doucement pendant 40 heures, on filtre le précipité, on le lave à l'eau, et on le sèche sous vide à 50 C. On obtient unrendement de 26,46 g de composé tétracycline-urée, titrant 932 gammas/mg, et représentant 91,2% du rendement calculé.
EXEMPLE 5 .On prend 2 litres de mélange de fermentation de tétracycline titrant 3970 gammas/cm3, et on traite par 10 g de trisilicate de magnésium, 120 g de terre d'infusoires comme adjuvant de filtration, et on ajuste à @ 7,6 avec de la soude.- On agite le mélange 30 minue et on filtre. On délaie le gâteau filtre dans 600 cm3 de bu- tanol et on ajuste à pH 1,42 avec 18 cm3 d'acide chlorhydrique concentré. Après avoir agité 40 minutes, on filtre la bouillie. On délaie à nouveau le gâteau filtre avec 600 cm3 de butanol et 30 cm3 d'eau, on ajuste à pH 1,47 avec 2 cm3 d'acide chlorhydrique, on agite 40 minutes et*'on filtre.
On délaie le gâteau filtre dans 600 cm3 de butanol avec 30 cm3 d'eau, et on ajuste le pH à 1,38 par addition de 1 cm3 d'acide chlorhydrique. On agite le mélange pendant 40 minutes et on filtre. On lave le gâteau filtre avec 250 cm3 de butanol.
On réunit les trois extraits butanoliques et la liqueur de lavage au butanol, en les traite par 2 g de charbon de bois décolorant, et 10 g de chlorure de sodium, on agite pendant 15 minutes et on filtre à l'aide de terre d'infusoires. On laisse reposer la solution fil
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trée à 4 C et on la sépare pour éliminer la phase saline.
On ajuste l'extrait butanolique clarifié à pH 1,85 avec--- de la soude 18 N, et on concentre sous vide à 20-24 C jusqu'à.environ 110 cm3, On extrait le concentré à 4 re- prises par 110 cm3 d'eau, en utilisant de l'acide chlorhy- drique¯concentré pour maintenir un pH de 1,$ - 2,0. On lave à deux reprises l'extrait aqueux global avec 22 cm3 de chloroforme. On concentre sous vide l'extrait aqueux lavé, jusqu'à 120 cm3. Au concentré, on ajoute 2,5 cm3 de butanol et 3 g d'éthylènediamine-tétraacétate de so- dium, et on ajuste le pH à 6,2 avec de la soude 18 N. On agite la solution une nuit et on filtre les cristaux, on les lave à deux reprises avec 6 cm3 d'eau saturée de bu- tanol et on sèche sous vide. On obtient un rendement de 5,77 g. Le produit titre 1003 gammas/mg.
Cela représen- te un rendement de 81% par rapport au mélange de fermen- tation, si l'on tient compte des échantillons prélevés pour titrage au cours du processus.
EXEMPLE 6
On prend 10 g de tétracycline neutre brute (préparée comme dans l'exemple 5), à 815 gammas/mg, on les délaie pendant 30 minutes dans 50 cm3 d'urée aqueuse concentrée contenant 4 gouttes d'un mouillant, l'éther isooctylphénylique du polyéthylène-glycol. La dissolu- tion et la recristallisation se produisent simultanément.
On filtre le produit, on le lave à l'eau, puis à ,1'éther, et on le sèche sous vidé. On obtient un rendement de 8,54 gde composé tétracycline-urée titrant 863 gammas/mg. soit 90,5% du rendement calculé.
EXEMPLE 7
On agite 5 g de chlorhydrate de tétracycline dans 25 cm3 d'urée aqueuse saturée et 25 cm3 d'eau. On obtient une dissolution pratiquement complète et on fil-
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tre. La cristallisation commence presque immédiatement. On laisse vieillir la bouillie 5 heures et on filtre. On lave le produit evec 5 portions de 10 cm3 d'eau et on sè- chesous vide pour obtenir 3,34 g d'un trihydrate de tétracycline-urée, point de fusion 143 - 146 C (décomposi- tion).' -Le titrage spectre photométrique donne 842 gemmas/
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mg, le titrage m1crobiologique (turbidimétrique) donne 810 gammas/mg. Analyse : calculée pour C3HZ$N0.3HZ0 : C 49,46; H 6,14; N 10,03 ; urée 10,75.
Effective : C 49,69; H 6,42; N 9,97; urée 11,23. Rotation optique
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/"o( "%D5 ¯ -220 ,.0 en solution à 0, 5 po dans le méthanol, L, o( J5 , - -z9;0 en solution à 0,5 % dans HC1 0, 03 N.
EXEMPLE 8
On mélange 5 g de chlorhydrate de chlorotétra- cycline avec 10 cm3 de 2-éthoxyéthanol, 10 cm3 de butanol, 0,7 cm3 d'eau, 0,7 g de catalyseur palladium à 5% sur charbon de bois et 3,4 cm3 de triéthylamine. On réduit le mélange sur une secoueuse Parr, en fixant la quantité calculée d'hydrogène au bout de 20 minutes. On filtre le catalyseur et on le lave avec 5 cm3 de butanol. On réunit le filtrat et les liqueurs de lavage. A la solution globale, on ajoute 30 cm3 de solution aqueuse saturée d'urée, 30 cm3 d'eau, et 0,83 cm3 d'acide chlorhydrique concentré, pour amener le pH du mélange à environ 3. Aprè.
28 heures de.vieillissement, on filtre le composé tétracycline-urée précipité, on le lave et on le sèche. La matière pèse 4,0 g et titre 924 gammas/mg, et 3,36% d'eau.
EXEMPLE 9
On prend une portion de 5 g du composé préparé dans l'exemple 7, on la délaie dans 35 cm3 de mélange butanol : 2-éthoxyéthanol à 90 :10 contenant un équivalent calculé d'acide chlorhydrique concentré. On filtre rapidement la solution résultante, on l'ensemence et on l'agi-
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te pendant 48 heures pour permettre la cristallisation. On filtre le produit, on le lave au 2-propanol, et on le sèche sous vide pour obtenir 3.94 g de chlorhydrate de tétracycline titrant 1002 gammas/mg. Rendement : 91,4 % du rendement calculé.
EXEMPLE 10
On prend 9 g du composé tétracycline-urée préparé dans l'exemple 2, on délaie dans 45 cm3 de mélange butanol:2-éthoxyéthanol à 2:1, et on ajoute de l'acide chlorhydrique concentré pour abaisser le pH à 1,7. On agite le mélange'pendant 60 heures à la température ambiante et on le filtre. On. lave le produit au 2-propanol et on le sèche sous vide pour obtenir 7.49 g de chlorhydrate de tétracycline titrant 982 gammas/mg (conversion 90.2%). Le produit satisfait à tous les tests de la pharmacopée pour le chlorhydrate de tétracycline destiné à l'administration buccale.
EXEMPLE 11
On prend 5 g de composé tétracycline-urée titrant 817 gammas/mg, et on les dissout, avec chauffage, dans 100 cm3 de méthanol pour former une solution complète. On filtre la solution à chaud et on la mélange avec 100 cm3 d'eau distillée. On laisse reposer le mélange à la .température ambiante pendant environ 3 heures, après quoi on filtre une récolte de tétracycline neutre, on la lave à l'eau et on la sèche, sous vide, sur P2O5. Le produit titre 1009 gammas/mg. La microanalyse indique que le produit est une tétracycline neutre hydratée.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.