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L@ présente invention concerne un agent d'activation de la respiration à des fins thérapeutiques et un procédé pour sa préparation.'
On a déjà utilisé très fréquemment à des fins thérapeu- tiques du sang ou du sérum, c'est-à-dire le liquide sanguin libéré de ses corpuscules. Ainsi, on a par exemple effectué des transfusion'- de sang d'homme à homme ou bien on a utilisé dans des cas de maladies graves, du sang conservé. On a en outre également prélevé du sang des malades eux-mêmes, on a irradié ce sang à l'extérieur du corps, de préférence par la lumière ultra-violette, puis on l'a injecté de nouveau.
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Dans le cadre de la thérapie au moyen de stimulants, on a employé à usages,externe et interne du sang d'animaux. Aux emplois spéciaux de sang et de ses constituants appartiennent la thérapeu- thie au sérum contre les maladies infectieuses, l'emploi de frac- tions individuelles de protéines du sang, par exemple la globuline gamma ou la globuline antihémophilique (AHG) contre des troubles sanguins, l'emploi de sérum de Bogomoletz, de sérums dits régénéra- teurs etc...
On a également déjà utilisé du sang du sérum comme matière de départ pour la préparation d'hormones, du fait que celles-ci y existent dans de nombreux cas en quantités particulièrement grandes, et qu'on peut ainsi les extraire plus aisément et sous forme plus pure qu'à partir des organes dans lesquels elles sont formées. C'es ainsi qu'on peut , par exemple, extraire l'hormone gonadotrope du sérum de juments pleines.
On a cherché à présent à découvrir dans le sang d'autres substances à caractère hormonique, et en particulier à obtenir des substances à action régénératrice contre des phénomènes de dégénérescence, non pas à partir des cellules ou des tissus dans lesquels elles sont formées, mais à partir de sang qui contient ces substances et les amène à l'endroit où elles doivent agir.
On a cependant, constaté qu'il est extrêmement difficile d'identifier,dans le sang, et d'isoler des substances à action régénératrice contre des phénomènes de dégénérescence ou d'inflamma- tion chronique, parce que le sang renferme un grand nombre de substances possédant des actions les plus diverses, qui se compen- sent mutuellement ou chevauchent.
Or, on a découvert qu'il est possible d'extraire du sang un agent d'activation de la respiration en choisissant parmi les nombreux procédés connus et déjà utilisés pour l'extraction de @ @ substances du sang, des procédés bien déterminés. Pour la découver- te de procédés convenant aux fins désirées, c'est-à-dire de procé-
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dés permettant l'obtention effective du principe actif désiré, on applique des procédés d'essais déterminés connus à l'aide desquels l'existence et la.concentration de ce principe actif peuvent être déterminées.
On peut mentionner qu'il est connu., que dans des phénomènes de régénération, le rendement d'échange de matières augmente et cette augmentation est presque toujours liée à une augmentation de l'activité de la respiration.
.Suivant le procédé de l'invention, on extrait tout d'abord complètement les protéines du sang d'animaux d'abattoirs après en avoir séparé l'agent d'extraction des protéines, puis, on concentre la solution obtenue à une concentration de 10-60 mg de substance sèche par millilitre, et finalement, on filtre ce concen- trat dans des conditions stériles et on le met en ampoules. Ce produit peut être utilisé directement à des fins thérapeutiques.
On a découvert que le sang de jeunes animaux d'abattoirs ainsi que le sang d'animaux dont on a modifié l'état d'activité par un traitement mécanique ou chimique ou par irradiation comme décrit dans le brevet n 537.729, conviennent particulièrement bien comme matière première.. comme matière, première.
Il n'est pas nécessaire de traiter la totalité du sang par le procédé conforme à l'invention; on peut également séparer l'un de l'autre les globules sanguins et le plasma et les traiter individuellement.'Les globules sanguins, principalement les erythrocytes, constituent cornue on le sait une matière première très bon marché, parce qu'ils ne peuvent pas être utilisés dans les abattoirs. Les globules sanguins et le plasma contiennent l'agent d'activation de la respiration conforme à l'invention, environ à la même concentration. On peut évidemment réunir également les produits obtenus par le traitement séparé de ces deux constituants du sang..
Suivant un mode de réalisation préféré du procédé conforme à l'invention, on soumet le sang à un traitement préalable avant d'en extraire les protéines. On peut ainsi, par exemple, traiter la
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sang par hémolyse au moyen d'eau ou le traiter par de l'acétone, et utiliser, de préférence seul, le précipité ainsi obtenu. On peut en outre sécher le sang par pulvérisation, ou enlever la fibrine par agitation ou également-produire la digestion complète ou partielle au moyen de pepsine et/ou de trypsine.
Lors de la préparation de sang séché à l'acétone, on obtient une solution d'acétone contenant la majeure partie des sels sanguins, et un précipité, possédant la plus grande partie de l'activité. La digestion du sang par la pepsine ou la trypsine s'obtient de façon connue par addition de pepsine à un pH de 2-3 environ ou addition de trypsine à un pH de 8-9 environ.
On peut effectuer l'extraction des protéines du sang qui a été soumis ou non à un traitement préalable, des façons les plus variées, en admettant qu'elle s'effectue de façon pratiquement complète et dans des conditions dans lesquelles les substances actives qu'on veut préparer, ne sont pas détruites. On opère par conséquent de préférence à une grande dilution. La dialyse, la précipitation fractionnée par des alcools et 1 a précipitation par des acides, constituent des modes opératoires particulièrement utiles dans le cadre du procédé de l'invention. Evidemment, on peut également utiliser d'autres procédés connus de précipitation des protéines..
-Pour la dialyse, on peut utiliser toute matière de dialyse connue et usuelle. Les tubes flexibles en cellophane conviennent particulièrement bien.Comme milieux de dialyse, on.utilise de préfé- rence de l'eau ou des alcools dilués. Pour l'extraction des protéines par précipitation fractionnée par des alcools, entrent de préférence en ligne de compte des alcools aliphatiques à bas poids moléculaires, à chaîne droite ou ramifiée. Pour la précipitation par les acides, on utilise de préférence l'acide perchlorique parce qu'il peut ensuite être facilement séparé et isolé sous forme de perchlorate de potassium par une solution alcoolique d'hydroxyde
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de potassium.
Quand on utilise comme agent de précipitation, l'acide trichloracétique, la séparation s'effectue par extraction à l'éther qui sépare toutefois également une partie de la matière active recherchée, et pour cette raison, cet acide convient moins bien au but de l'invention.
Quand la séparation des protéines s'effectue par dialyse, il suffit de concentrer les dialysats dans le vide à des tempéra- tures qui ne dépassent pas environ 30 . Dans le cas de séparation des protéines par précipitation fractionnée, il suffit également de concentrer dans le vide la solution obtenue, après filtration, à environ 22-25 , jusqu'-à obtention d'un concentrat exempt d'alcool,
En général, on constate .qu'il suffit que le résidu obtenu après extraction complète des protéines et séparation des agents utilisés à cette séparation, soit amené à une concentration de 10-60 mg de matière sèche par millilitre. Ce résidu doit toute- fois contenir de préférence au moins 30 mg de matière sèche par millilitre. Ce concentrat peut être utilisé directement après filtration stérilisante.
Pour obtenir un produit de grande pureté, ayant une concentration plus élevée en matière active, on peut cependant appliquer encore différents procédés de purification, avant de mettre le produit final en ampoules. On peut ainsi, par exemple par addition de cétones ou d'alcools aliphatiques à bas poids moléculai- res au concentrât obtenu comme il est dit plus haut, obtenir une précipitation modérée ne contenant qu'une partie de la-substance active qui n'est probablement fixée que par adsorption. La solution de la matière active dans la cétone ou l'alcool aliphatique à bas poids moléculaire, séparée du précipité, est alors concentrée dans le vide jusqu'à élimination complète du solvant et filtrée à l'état stérile. L'acétone convient particulièrement bien comme agent de précipitation.
Mais on peut également agiter ou remurer le concentrât avec un solvant immiscible ou seulement partiellement miscible
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à l'eau, par exemple des alcools aliphatiques à 3-8 atomes de carbone ou des éthers aliphatiques à bas poids moléculaires. Dans ce cas, on obtient deux phases, une phase aqueuse et une phase de solvant, qui renferment -la matière active à des concentrations environ comparables. On constate que de façon surprenante la somme des quantités de matière active contenues dans ces deux phases, dépasse celle du concentré non-traité.
On ne s'explique pas encore les causes de ce phénomène, mais on suppose que le traitement du concentrat par le solvant immiscible ou seulement partiellement miscible à l'eau, produit une certaine réactivation de la matière qui a été désactivée par le traitement précédent. Après concentra- tion dans le vide, on peut par conséquent continuer à traiter las deux phases.
Finalement, on peut également évaporer à sec le concentrât et/ou les fractions obtenues par les opérations de purification qui viennent d'être décrites, reprendre le résidu par de l'eau distillée le soumettre ensuite à une filtration stérilisante et éventuellement le rendre lyophile dans des conditions stériles.
Les produits finals obtenus par le procédé conforme à l'invention, sont bien stables et peuvent être conservés pendant un temps quasi illimité ; peut toutefois y ajouter aussi un agent de conservation. Comme tels entrent en jeu, de préférence le phénol, le crésol, etc...
Les'substances activant la respiration, conformes à l'invention, ont un-bas poids moléculaire. En ce.qui concerne les effets obtenus par leur action, il ne peut donc être question en aucun cas d'actions modifiées de sérum ou d'actions indéterminées de protéines. Les nouvelles substances actives se distinguent fonda- mentalement des substances actives connues introduites dans le sang ou en provenant. Dans des essais à l'appareil de Warburg, les nouvel- les substances activant la respiration, exercent sur des homogénats de tissus, une augmentation de la respiration qui ne dépend pas exclusivement du substrat et qui ne peut être atteinte , même de
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loin, au moyen des substances extraites du sang jusqu'à présent.
L'invention concerne par conséquent également le produit extrait du sang, augmentant de 100-400% la respiration d'homogénats de tissus.'
Le dessin annexé reproduit l'action d'une préparation con- forme à l'invention, sur la respiration d'un ensemble d'homogénat de foie. La mesure s'effectue dans un appareil de Warburg, à 37 . On suit la consommation d'oxygène en fonction du temps, au moyen d'un manomètre. On prépare un homogénat de foie de rats 1:4 d'un pH de 7.4 au moyen de tampon de Sörensen. On y ajoute 0,2 ml d'une substan. ce active préparée suivant l'invention, réglée au pH de 7.4 au moyen de tampon de Sörensen.La durée de traitement est de 10 minutes ; fréquence des secousses, de 100 par minute.
Sur le dessin, les ordonnées représentent la consommation d'oxygène en mm3 de O2 et les abcisses, la durée de l'essai en minutes. La courbe X a été obtenue sur un homogénat de foie de rat seul, et la courbe 0, sur Lui homogénat de rat additionné de 0. 2 ml de la matière active conforme à l'invention.
Comme on le voit sur le dessin, une augmentation de respiration au quadruple environ, est obtenue après 50 minutes.
Les résultats sont reproductibles à une tolérance usuelle d'erreur biologique de + 10%.
Jusqu'à présent, l'oxydation biologique de l'adrénaline a été attribuée à des ferments déterminés, par exemple des amino- oxydases et polyphéholoxydases. On a pu prouver que l'adrénaline est oxydée par catalyse, sans .action de ferments, par les matières actives à bas poids moléculaires obtenues suivant l'invention. Cette propriété peut être appliquée également à l'essai des matières acti- ves.
On effectue la mesure suivant la technique manométrique de Warburg, déjà décrite ci-dessus, dans des vases à secousses contenant, au départ, 0.4 ml de solution 1 N de NaOH, 0,2 à 0,4 ml de la substance active conforme à l'invention et 0. 6 ml d'une
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solution de bitartrate d'adrénaline à 200 mg %, dans une chambre de réaction à 38 et à une fréquence de secousses de $0-100/minute.
Après avoir fait passer de l'oxygène dans le système manométrique pendant 10 minutes, et après une période consécutive de 10 minutes d'équilibrage de la température, on relève toutes les 10-20 minutes pendant 2 heures., la consommation d'oxygène.
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EXEMPLE: <SEP> Consommation <SEP> d'oxygène <SEP> en <SEP> mm3 <SEP> après
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<tb> 1 <SEP> heure <SEP> 2 <SEP> heures
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<tb> Substance <SEP> active <SEP> seule <SEP> 7.1 <SEP> 9.3
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<tb> Solution <SEP> d'adrénaline <SEP> seule <SEP> 1.4 <SEP> 3. <SEP> 9
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<tb> Solution <SEP> d'adrénaline <SEP> + <SEP> 134.2 <SEP> 172.S
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<tb> substance <SEP> active
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-La consommation d'oxygène est proportionnelle à l'activité de la substance active conforme à l'invention.
Les exemples suivants illustrent l'invention, sans la limiter.
EXEMPLE 1.-
On remue 2 litres de sang de jeunes veaux dans 6 litres d'acétone. On décante le précipité formé de la solution d'acétone limpide et on le remue de nouveau dans 2 litres d'acétone. On répète ensuite l'opération de nouveau avec 2 litres d'un mélange 1:1 d'acétone-éther, on sépare nettement le précipité par centri- fugation et on.le sèche à l'air* On obtient ainsi environ 355 g d'un sang séché'à l'acétone, qu'on peut conserver plusieurs mois en milieu sec et froid, sans qu'il ne perde son activité. Pour continu- er le traitement, on remue le.sang sec dans 4-5 parties d'eau distillée, et on traite la suspension ainsi obtenue par dialyse vis-à-vis d'une quantité égale d'eau distillée, à environ 2 , en utilisant un tube flexible en cellophane.
On continue la dialyse jusqu'à ce qu'aucune quantité notable d'azote ne passe plus dans le dialysat extérieur. On concentre les dialysats extérieurs obtenus à 200 ml, dans le vide, à une température ne dépassant pas 22-25 . le poids sec de la solution atteint environ 40 mg/ml. Après
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filtration stérilisante et addition d'un agent de conservation approprié, par exemple de phénol ou de crésol, la solution convient à une application thérapeutique directe. A côté de produits de désintégration des acides nueléiniques., la solution contient des acides aminés et des oligopeptides, qu'on peut caractériser par des procédés connus de chromatographie sur papier ou d'électropho- rèse sur papier.
La solution contient une forte proportion de principe activant la respiration- EXEMPLE 2, -
On peut traiter de la même façon que le sang séché à l'acétone de l'exemple 1, du sang de veau séché de façon ménagée dans une tour de pulvérisation, après y avoir ajouté 5 parties d'eau distillée. Le produit final obtenu correspond à celui préparé suivant l'exemple 1, excepté qu'il possède une concentration saline plus élevée.
EXEMPLE 3.-
On traite 1 litre de sang de veau fraîchement recueilli après l'abatage, par 1 litre d'eau distillée, pour produire l'hémoly- se. On sépare les résidus de fibrine par filtration grossière et on' soumet ensuite la solution à la dialyse à travers un tube flexible de cellophane, vis-à-vis de 2 litres d'eau distillée. Le dialysat extérieur est échangé 4-5 fois et on traite les dialysats extérieurs réunis, comme décrit dans 1* exemple 1. On obtient environ 300 ml de concentrât contenant 40 mg de matière sèche par millilitre.
Le pH de cette solution est voisin de 8.5 et on le réglée à la valeur 7, de préférence par de 1* acide chlorhydrique, pour l'emploi thérapeutique.
EXEMPLE 4.- On règle au pH 8, deux litres de sang de veau frais hémolyse suivant l'exemple 3, et on le fait digérer partiellement à 37 pendant 24 heures, avec 0,2 g de trypsine extra-pure. Après réglage au pH 7, on effectue, comme dans l'exemple 1, une précipi- tation quantitative par 6 litres d'acétone. On remue de nouveau
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le précipité dans 2 litres d'acétone, puis dans 2 litres de mélange acétone-éther 1:1, on le sépare par centrifugation et on le sèche.
Le rendement atteint 300-320 g de produit sec, dont on poursuit le traitement par-les méthodes de dialyse décrites dans les exemples précédents.
EXEMPLE .5.-
On ajoute lentement à + 2 , en1 heure, en remuant, un total de 1000 ml d'alcool à 96% à 500 ml de sang de veau frais, dont on a enlevé la fibrine par agitation. On continue à remuer pendant environ 5 heures et on sépare ensuite la solution alcoolique du résidu par centrifugation. On filtre la solution alcoolique, et on la concentre dans le vide, à une température maximum de 22 , jusqu'à obtention de 100 ml de concentrat exempt d'alcool. On règle le pH à 7. La solution est portée lentement à froid à une concentra- tion en alcool de 80% en poids en ajoutant de l'alcool et en remuant Environ 400 ml d'alcool sont nécessaires à cet effet. On laisse repo. ser 24 heures à 0 . Le précipité de protéine ainsi séparé est pratiquement exempt de substance activant la respiration, et peut être rejeté.
On concentre de nouveau la solution alcoolique à 100 ml dans le vide, jusqu'à ce qu'elle soit exempte d'alcool, et on la filtre dans des conditions stériles. Cette solution contient 15 mg de matière sèche par millilitre, et possède un abaissement du point de congélation de 1.18 . Elle peut être employée directement à des fins thérapeutiques.
EXEMPLE 6. -
On-hémolyse 200 ml de sang de veau frais, défibrinisé, par addition de 200 ml d'eau distillée, et on le traite ensuite à froid, par addition goutte-à-goutte d'environ 18 ml d'acide perchlorique à 60%, en remuant. L'extraction des protéines du sang est complète quand la concentration de l'acide perchlorique est 0.4 - 0. 6 N.
On remue ensuite encore une heure à froid, on sépare le précipité par centrifugation, on le lave par de l'acide perchlorique 0.4 N, et
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on filtre les solutions réunies. On traite la solution à froid par environ 40 ml de KOH 5N jusqu'à obtention d'un pH de 7.2-7.3 et on complète la précipitation du perchlorate de potassium par addition d'environ 30 à 40% d'alcool absolu* On laisse reposer la solution pendant 24 heures à 0 , on l'essore ou on la filtre jusqu'à ce qu'elle soit limpideet on évapore l'alcool dans le vide.
On obtient 175 m1 de solution de matière active exempte de protéines, contenant 17.4 mg de matière sèche par m1, et possédant un abaisse- ment du point de congélation de 1.6 .
EXEMPLE 7.- On peut également traiter suivant le procédé décrit dans les exemples 1-6, de préférence après hémolyse, le plasma obtenu
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par centrifugation ou le dépôt d'érythrocytes. En partant de ces deux matières de départ, on obtient des produits activateurs de la respiration. Toutefois, on réalise le meilleur effet en réunissant de nouveau ces produits.
EXEMPLE 8.-
On règle au pH 5.5 -une solution de matière. active préparée par le procédé des exemples 1-6,et on l'extrait de façon répétée par du n-butanol. On traite, par exemple, 100 ml d'extrait, huit fois par 20 ml de butanol saturé d'eau*. On sèche les extraits aqueux et butanoliques dans le vide à -une température qui ne dépa ase pas 20 , et on les reprend chacun par 50 ml d'eau distillée. Suivant ce procédé,' environ 15-20$ de matière sèche passent de la phase aqueuse dans l'extrait butanolique. Suivant l'essai de Warburg, les deux fractions sont actives.
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On traite 100 ml d'un extrait préparé suivant le mode opératoire des exemples 1-6, au pH 7,par 500 ml d'acétone, en. remuant lentement. Le précipité .formé est centrifugé et repris par 100 ml d'eau distillée. Cette solution ne possède qu'une faible activité. On reprend de nouveau dans 100 ml d'eau distillée, la solution d'acétone évaporée à sec dans le vide, et on la filtre
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de façon stérile. Elle renferme la majeure partie des substances activatrices de l'oxygène.
REVENDICATIONS
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1.- Procédé de préparation d'un agent d'activation-de la respiration à des fins thérapeutiques, caractérisé en ce qu'on extrait pratiquement complètement les protéines du sang d'animaux d'abattoirs, on libère la solution obtenue des agents utilisés à la séparation des protéines, on la concentre à une concentration de 10-60 mg de matière sèche par millilitre, on filtre le concentrat dans des conditions stériles, et on le met en ampoules.
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The present invention relates to a respiration activating agent for therapeutic purposes and to a method for its preparation.
Blood or serum, that is to say the blood fluid released from its corpuscles, has already been used very frequently for therapeutic purposes. Thus, for example, human-to-human blood transfusions have been carried out or, in cases of serious diseases, stored blood has been used. In addition, blood was also taken from the patients themselves, this blood was irradiated outside the body, preferably with ultra-violet light, and then injected again.
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In the course of therapy with stimulants, animal blood has been used both externally and internally. To the special uses of blood and its constituents belong serum therapy against infectious diseases, the use of individual fractions of blood proteins, for example gamma globulin or antihemophilic globulin (AHG) against blood disorders. , the use of Bogomoletz serum, so-called regenerating serums, etc.
Serum blood has also already been used as a starting material for the preparation of hormones, since these exist in many cases there in particularly large quantities, and can thus be extracted more easily and in a form. purer than from the organs in which they are formed. This is how, for example, the gonadotropic hormone can be extracted from the serum of pregnant mares.
We have now sought to discover in the blood other substances of a hormonal nature, and in particular to obtain substances with regenerative action against phenomena of degeneration, not from the cells or tissues in which they are formed, but from blood which contains these substances and brings them to the place where they should act.
It has, however, been observed that it is extremely difficult to identify, in the blood, and to isolate substances with regenerative action against phenomena of degeneration or chronic inflammation, because the blood contains a large number of substances possessing the most diverse actions, which compensate each other or overlap.
Now, it has been discovered that it is possible to extract an agent for activating respiration from the blood by choosing, among the many known methods already used for the extraction of @ @ substances from the blood, well-defined methods. For the discovery of processes suitable for the desired ends, that is, to process
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As soon as the desired active principle is actually obtained, certain known test methods are applied, with the aid of which the existence and the concentration of this active principle can be determined.
It may be mentioned that it is known that in regeneration phenomena, the yield of material exchange increases and this increase is almost always linked to an increase in the activity of respiration.
Following the method of the invention, the proteins are first completely extracted from the blood of slaughter animals after having separated the extracting agent from the proteins, then, the solution obtained is concentrated to a concentration of 10-60 mg of dry substance per milliliter, and finally this concentrate is filtered under sterile conditions and placed in ampoules. This product can be used directly for therapeutic purposes.
It has been found that the blood of young slaughter animals as well as the blood of animals whose state of activity has been altered by mechanical or chemical treatment or by irradiation as described in Patent No. 537,729 are particularly suitable as raw material .. as material, raw.
It is not necessary to treat all of the blood by the method according to the invention; blood cells and plasma can also be separated from each other and processed individually. Blood cells, mainly erythrocytes, are known to be a very cheap raw material, because they cannot be used in slaughterhouses. The blood cells and the plasma contain the respiration activating agent according to the invention, at approximately the same concentration. It is obviously also possible to combine the products obtained by the separate treatment of these two constituents of the blood.
According to a preferred embodiment of the method according to the invention, the blood is subjected to a preliminary treatment before extracting the proteins therefrom. One can thus, for example, treat the
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blood by hemolysis using water or treating it with acetone, and using, preferably alone, the precipitate thus obtained. The blood can be further spray dried, or the fibrin can be removed by agitation or also complete or partial digestion by means of pepsin and / or trypsin.
When preparing acetone-dried blood, an acetone solution is obtained which contains most of the blood salts, and a precipitate, which has most of the activity. Digestion of blood with pepsin or trypsin is obtained in a known manner by adding pepsin at a pH of approximately 2-3 or by adding trypsin at a pH of approximately 8-9.
The extraction of proteins from the blood which has been subjected or not to a preliminary treatment can be carried out in the most varied ways, assuming that it is carried out practically completely and under conditions in which the active substances which one wants to prepare, are not destroyed. The operation is therefore preferably carried out at a high dilution. Dialysis, fractional precipitation with alcohols and precipitation with acids are particularly useful procedures in connection with the process of the invention. Of course, other known methods of protein precipitation can also be used.
-For dialysis, any known and customary dialysis material can be used. Flexible cellophane tubes are particularly suitable. As dialysis media, water or dilute alcohols are preferably used. For the extraction of proteins by fractional precipitation with alcohols, preferably low molecular weight, straight chain or branched aliphatic alcohols are taken into account. For the acid precipitation, perchloric acid is preferably used because it can then be easily separated and isolated as potassium perchlorate with an alcoholic hydroxide solution.
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potassium.
When trichloroacetic acid is used as the precipitating agent, the separation takes place by extraction with ether which, however, also separates part of the desired active material, and for this reason this acid is less suitable for the purpose of the precipitation. 'invention.
When protein separation is by dialysis, it is sufficient to concentrate the dialysates in vacuo at temperatures not exceeding about 30. In the case of separation of proteins by fractional precipitation, it is also sufficient to concentrate in vacuo the solution obtained, after filtration, to approximately 22-25, until an alcohol-free concentrate is obtained,
In general, it is found that it is sufficient that the residue obtained after complete extraction of the proteins and separation of the agents used for this separation, is brought to a concentration of 10-60 mg of dry matter per milliliter. This residue should, however, preferably contain at least 30 mg of dry matter per milliliter. This concentrate can be used directly after sterilizing filtration.
To obtain a product of high purity, having a higher concentration of active material, it is however possible to apply still different purification processes, before placing the final product in ampoules. It is thus possible, for example by adding ketones or low molecular weight aliphatic alcohols to the concentrate obtained as mentioned above, to obtain a moderate precipitation containing only a part of the active substance which is not probably fixed only by adsorption. The solution of the active ingredient in ketone or low molecular weight aliphatic alcohol, separated from the precipitate, is then concentrated in vacuo until complete elimination of the solvent and filtered in a sterile state. Acetone is particularly suitable as a precipitating agent.
However, the concentrate can also be stirred or stirred with an immiscible or only partially miscible solvent.
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with water, for example aliphatic alcohols with 3-8 carbon atoms or aliphatic ethers of low molecular weight. In this case, two phases are obtained, an aqueous phase and a solvent phase, which contain the active material in approximately comparable concentrations. It is found that, surprisingly, the sum of the quantities of active material contained in these two phases exceeds that of the untreated concentrate.
The causes of this phenomenon are not yet explained, but it is assumed that the treatment of the concentrate with the solvent immiscible or only partially miscible with water produces a certain reactivation of the material which has been deactivated by the previous treatment. After concentration in a vacuum, it is therefore possible to continue processing the two phases.
Finally, the concentrate and / or the fractions obtained by the purification operations which have just been described can also be evaporated to dryness, the residue is taken up in distilled water, then subjected to sterilizing filtration and optionally made lyophilic in sterile conditions.
The end products obtained by the process according to the invention are very stable and can be stored for an almost unlimited time; can however also add a preservative. As such come into play, preferably phenol, cresol, etc.
The respiration-activating substances according to the invention have a low molecular weight. As regards the effects obtained by their action, there can therefore be no question in any case of modified actions of serum or indeterminate actions of proteins. New active substances are fundamentally distinguished from known active substances introduced into or from the blood. In tests with the Warburg apparatus, the new substances which activate respiration exert on tissue homogenates an increase in respiration which does not depend exclusively on the substrate and which cannot be achieved even from
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far, by means of the substances extracted from the blood so far.
The invention therefore also relates to the product extracted from blood, increasing the respiration of tissue homogenates by 100-400%.
The appended drawing shows the action of a preparation in accordance with the invention on the respiration of a set of liver homogenate. The measurement is made in a Warburg apparatus, at 37. Oxygen consumption is monitored as a function of time, using a manometer. A 1: 4 rat liver homogenate with a pH of 7.4 is prepared using Sörensen's buffer. 0.2 ml of a substan is added thereto. this active agent prepared according to the invention, adjusted to pH 7.4 using Sörensen's buffer. The treatment time is 10 minutes; frequency of shaking, 100 per minute.
In the drawing, the ordinates represent the oxygen consumption in mm3 of O2 and the abscissas, the duration of the test in minutes. Curve X was obtained on a rat liver homogenate alone, and curve 0 on a rat homogenate supplemented with 0.2 ml of the active material in accordance with the invention.
As can be seen in the drawing, about a quadruple increase in respiration is obtained after 50 minutes.
The results are reproducible at a usual tolerance of biological error of + 10%.
Until now, the biological oxidation of adrenaline has been attributed to specific ferments, for example amino oxidases and polyphéholoxidases. It has been possible to prove that adrenaline is oxidized by catalysis, without the action of ferments, by the low molecular weight active materials obtained according to the invention. This property can also be applied to the test of active substances.
The measurement is carried out according to the manometric technique of Warburg, already described above, in shaking vessels containing, at the start, 0.4 ml of 1N solution of NaOH, 0.2 to 0.4 ml of the active substance in accordance with invention and 0.6 ml of a
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200 mg% adrenaline bitartrate solution, in a reaction chamber at 38 and at a shaking rate of $ 0-100 / minute.
After passing oxygen through the manometric system for 10 minutes, and after a consecutive period of 10 minutes of temperature equilibration, the oxygen consumption is recorded every 10-20 minutes for 2 hours.
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EXAMPLE: <SEP> Oxygen <SEP> consumption <SEP> in <SEP> mm3 <SEP> after
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<tb> 1 <SEP> hour <SEP> 2 <SEP> hours
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<tb> Substance <SEP> active <SEP> only <SEP> 7.1 <SEP> 9.3
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<tb> Adrenaline <SEP> only <SEP> solution <SEP> 1.4 <SEP> 3. <SEP> 9
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<tb> Adrenaline <SEP> Solution <SEP> + <SEP> 134.2 <SEP> 172.S
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<tb> active <SEP> substance
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-The oxygen consumption is proportional to the activity of the active substance in accordance with the invention.
The following examples illustrate the invention without limiting it.
EXAMPLE 1.-
2 liters of blood from young calves are stirred in 6 liters of acetone. The precipitate formed is decanted from the clear acetone solution and stirred again in 2 liters of acetone. The operation is then repeated again with 2 liters of a 1: 1 mixture of acetone-ether, the precipitate is clearly separated by centrifugation and dried in air. In this way approximately 355 g of water are obtained. 'a blood dried' with acetone, which can be kept for several months in a dry and cold environment, without losing its activity. To continue the treatment, the dry blood is stirred in 4-5 parts of distilled water, and the resulting suspension is treated by dialysis against an equal amount of distilled water, to about 2 , using a flexible cellophane tube.
Dialysis is continued until no significant amount of nitrogen passes into the outer dialysate. The external dialysates obtained are concentrated to 200 ml in vacuum at a temperature not exceeding 22-25. the dry weight of the solution reaches about 40 mg / ml. After
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sterilizing filtration and addition of a suitable preservative, for example phenol or cresol, the solution is suitable for direct therapeutic application. Besides nuclear acid decay products, the solution contains amino acids and oligopeptides, which can be characterized by known methods of paper chromatography or paper electrophoresis.
The solution contains a high proportion of principle activating respiration - EXAMPLE 2, -
Can be treated in the same way as the blood dried with acetone of Example 1, calf blood dried in a gentle manner in a spray tower, after adding 5 parts of distilled water. The final product obtained corresponds to that prepared according to Example 1, except that it has a higher salt concentration.
EXAMPLE 3.-
1 liter of calf's blood freshly collected after slaughter is treated with 1 liter of distilled water to produce hemolysis. The fibrin residues are separated by coarse filtration and the solution is then subjected to dialysis through a flexible cellophane tube, against 2 liters of distilled water. The outer dialysate is exchanged 4-5 times and the combined outer dialysates are treated as described in Example 1. About 300 ml of concentrate is obtained containing 40 mg of dry matter per milliliter.
The pH of this solution is close to 8.5 and it is adjusted to a value of 7, preferably with hydrochloric acid, for therapeutic use.
EXAMPLE 4 Two liters of fresh calf blood hemolysis according to Example 3 are adjusted to pH 8 and partially digested at 37 for 24 hours with 0.2 g of extra-pure trypsin. After adjustment to pH 7, as in Example 1, a quantitative precipitation is carried out with 6 liters of acetone. We stir again
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the precipitate in 2 liters of acetone, then in 2 liters of acetone-ether mixture 1: 1, it is separated by centrifugation and dried.
The yield reaches 300-320 g of dry product, the treatment of which is continued by the dialysis methods described in the preceding examples.
EXAMPLE .5.-
Slowly added at + 2, over 1 hour, with stirring, a total of 1000 ml of 96% alcohol to 500 ml of fresh calf blood, from which the fibrin has been removed by stirring. Stirring is continued for about 5 hours and then the alcoholic solution is separated from the residue by centrifugation. The alcoholic solution is filtered, and it is concentrated in vacuo, at a maximum temperature of 22, until 100 ml of alcohol-free concentrate is obtained. The pH is adjusted to 7. The solution is slowly brought in cold to an alcohol concentration of 80% by weight by adding alcohol and stirring. Approximately 400 ml of alcohol are required for this purpose. We leave it to rest. ser 24 hours to 0. The protein precipitate thus separated is practically free of the respiration activating substance, and can be discarded.
The alcoholic solution is again concentrated to 100 ml in vacuo, until it is free of alcohol, and filtered under sterile conditions. This solution contains 15 mg of dry matter per milliliter, and has a lowering of the freezing point of 1.18. It can be used directly for therapeutic purposes.
EXAMPLE 6. -
200 ml of fresh, defibrinized calf's blood is hemolysed by the addition of 200 ml of distilled water, and is then treated in the cold, by the dropwise addition of about 18 ml of 60% perchloric acid. , stirring. The extraction of proteins from the blood is complete when the concentration of perchloric acid is 0.4 - 0. 6 N.
The mixture is then stirred for a further hour in the cold, the precipitate is separated by centrifugation, washed with 0.4N perchloric acid, and
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the combined solutions are filtered. The solution is treated cold with approximately 40 ml of 5N KOH until a pH of 7.2-7.3 is obtained and the precipitation of the potassium perchlorate is completed by the addition of approximately 30 to 40% of absolute alcohol. stand the solution for 24 hours at 0, drain or filter until it is clear and the alcohol is evaporated in vacuo.
175 ml of protein-free active ingredient solution are obtained, containing 17.4 mg of dry matter per ml, and having a freezing point depression of 1.6.
EXAMPLE 7 The plasma obtained can also be treated according to the method described in Examples 1-6, preferably after hemolysis.
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by centrifugation or erythrocyte deposition. On the basis of these two starting materials, products which activate respiration are obtained. However, the best effect is achieved by bringing these products together again.
EXAMPLE 8.-
A solution of matter is adjusted to pH 5.5. active agent prepared by the method of Examples 1-6, and repeatedly extracted with n-butanol. 100 ml of extract are treated, for example, eight times with 20 ml of water-saturated butanol *. The aqueous and butanolic extracts are dried in vacuo at a temperature which does not exceed 20, and each is taken up in 50 ml of distilled water. According to this process, about 15-20% of dry matter passes from the aqueous phase into the butanol extract. According to Warburg's test, both fractions are active.
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EXEiVI? L¯ E 9. -
100 ml of an extract prepared according to the procedure of Examples 1-6, at pH 7, are treated with 500 ml of acetone, in. stirring slowly. The precipitate formed is centrifuged and taken up in 100 ml of distilled water. This solution has only a low activity. The acetone solution evaporated to dryness in vacuum is taken up again in 100 ml of distilled water, and it is filtered.
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sterile. It contains most of the oxygen activating substances.
CLAIMS
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1.- Process for the preparation of an agent for activating respiration for therapeutic purposes, characterized in that the proteins are practically completely extracted from the blood of slaughter animals, the solution obtained is released from the agents used on separation of the proteins, it is concentrated to a concentration of 10-60 mg of dry matter per milliliter, the concentrate is filtered under sterile conditions, and it is placed in ampoules.