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L@ présente invention concerne un agent d'activation de la respiration à des fins thérapeutiques et un procédé pour sa préparation.'
On a déjà utilisé très fréquemment à des fins thérapeu- tiques du sang ou du sérum, c'est-à-dire le liquide sanguin libéré de ses corpuscules. Ainsi, on a par exemple effectué des transfusion'- de sang d'homme à homme ou bien on a utilisé dans des cas de maladies graves, du sang conservé. On a en outre également prélevé du sang des malades eux-mêmes, on a irradié ce sang à l'extérieur du corps, de préférence par la lumière ultra-violette, puis on l'a injecté de nouveau.
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Dans le cadre de la thérapie au moyen de stimulants, on a employé à usages,externe et interne du sang d'animaux. Aux emplois spéciaux de sang et de ses constituants appartiennent la thérapeu- thie au sérum contre les maladies infectieuses, l'emploi de frac- tions individuelles de protéines du sang, par exemple la globuline gamma ou la globuline antihémophilique (AHG) contre des troubles sanguins, l'emploi de sérum de Bogomoletz, de sérums dits régénéra- teurs etc...
On a également déjà utilisé du sang du sérum comme matière de départ pour la préparation d'hormones, du fait que celles-ci y existent dans de nombreux cas en quantités particulièrement grandes, et qu'on peut ainsi les extraire plus aisément et sous forme plus pure qu'à partir des organes dans lesquels elles sont formées. C'es ainsi qu'on peut , par exemple, extraire l'hormone gonadotrope du sérum de juments pleines.
On a cherché à présent à découvrir dans le sang d'autres substances à caractère hormonique, et en particulier à obtenir des substances à action régénératrice contre des phénomènes de dégénérescence, non pas à partir des cellules ou des tissus dans lesquels elles sont formées, mais à partir de sang qui contient ces substances et les amène à l'endroit où elles doivent agir.
On a cependant, constaté qu'il est extrêmement difficile d'identifier,dans le sang, et d'isoler des substances à action régénératrice contre des phénomènes de dégénérescence ou d'inflamma- tion chronique, parce que le sang renferme un grand nombre de substances possédant des actions les plus diverses, qui se compen- sent mutuellement ou chevauchent.
Or, on a découvert qu'il est possible d'extraire du sang un agent d'activation de la respiration en choisissant parmi les nombreux procédés connus et déjà utilisés pour l'extraction de @ @ substances du sang, des procédés bien déterminés. Pour la découver- te de procédés convenant aux fins désirées, c'est-à-dire de procé-
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dés permettant l'obtention effective du principe actif désiré, on applique des procédés d'essais déterminés connus à l'aide desquels l'existence et la.concentration de ce principe actif peuvent être déterminées.
On peut mentionner qu'il est connu., que dans des phénomènes de régénération, le rendement d'échange de matières augmente et cette augmentation est presque toujours liée à une augmentation de l'activité de la respiration.
.Suivant le procédé de l'invention, on extrait tout d'abord complètement les protéines du sang d'animaux d'abattoirs après en avoir séparé l'agent d'extraction des protéines, puis, on concentre la solution obtenue à une concentration de 10-60 mg de substance sèche par millilitre, et finalement, on filtre ce concen- trat dans des conditions stériles et on le met en ampoules. Ce produit peut être utilisé directement à des fins thérapeutiques.
On a découvert que le sang de jeunes animaux d'abattoirs ainsi que le sang d'animaux dont on a modifié l'état d'activité par un traitement mécanique ou chimique ou par irradiation comme décrit dans le brevet n 537.729, conviennent particulièrement bien comme matière première.. comme matière, première.
Il n'est pas nécessaire de traiter la totalité du sang par le procédé conforme à l'invention; on peut également séparer l'un de l'autre les globules sanguins et le plasma et les traiter individuellement.'Les globules sanguins, principalement les erythrocytes, constituent cornue on le sait une matière première très bon marché, parce qu'ils ne peuvent pas être utilisés dans les abattoirs. Les globules sanguins et le plasma contiennent l'agent d'activation de la respiration conforme à l'invention, environ à la même concentration. On peut évidemment réunir également les produits obtenus par le traitement séparé de ces deux constituants du sang..
Suivant un mode de réalisation préféré du procédé conforme à l'invention, on soumet le sang à un traitement préalable avant d'en extraire les protéines. On peut ainsi, par exemple, traiter la
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sang par hémolyse au moyen d'eau ou le traiter par de l'acétone, et utiliser, de préférence seul, le précipité ainsi obtenu. On peut en outre sécher le sang par pulvérisation, ou enlever la fibrine par agitation ou également-produire la digestion complète ou partielle au moyen de pepsine et/ou de trypsine.
Lors de la préparation de sang séché à l'acétone, on obtient une solution d'acétone contenant la majeure partie des sels sanguins, et un précipité, possédant la plus grande partie de l'activité. La digestion du sang par la pepsine ou la trypsine s'obtient de façon connue par addition de pepsine à un pH de 2-3 environ ou addition de trypsine à un pH de 8-9 environ.
On peut effectuer l'extraction des protéines du sang qui a été soumis ou non à un traitement préalable, des façons les plus variées, en admettant qu'elle s'effectue de façon pratiquement complète et dans des conditions dans lesquelles les substances actives qu'on veut préparer, ne sont pas détruites. On opère par conséquent de préférence à une grande dilution. La dialyse, la précipitation fractionnée par des alcools et 1 a précipitation par des acides, constituent des modes opératoires particulièrement utiles dans le cadre du procédé de l'invention. Evidemment, on peut également utiliser d'autres procédés connus de précipitation des protéines..
-Pour la dialyse, on peut utiliser toute matière de dialyse connue et usuelle. Les tubes flexibles en cellophane conviennent particulièrement bien.Comme milieux de dialyse, on.utilise de préfé- rence de l'eau ou des alcools dilués. Pour l'extraction des protéines par précipitation fractionnée par des alcools, entrent de préférence en ligne de compte des alcools aliphatiques à bas poids moléculaires, à chaîne droite ou ramifiée. Pour la précipitation par les acides, on utilise de préférence l'acide perchlorique parce qu'il peut ensuite être facilement séparé et isolé sous forme de perchlorate de potassium par une solution alcoolique d'hydroxyde
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de potassium.
Quand on utilise comme agent de précipitation, l'acide trichloracétique, la séparation s'effectue par extraction à l'éther qui sépare toutefois également une partie de la matière active recherchée, et pour cette raison, cet acide convient moins bien au but de l'invention.
Quand la séparation des protéines s'effectue par dialyse, il suffit de concentrer les dialysats dans le vide à des tempéra- tures qui ne dépassent pas environ 30 . Dans le cas de séparation des protéines par précipitation fractionnée, il suffit également de concentrer dans le vide la solution obtenue, après filtration, à environ 22-25 , jusqu'-à obtention d'un concentrat exempt d'alcool,
En général, on constate .qu'il suffit que le résidu obtenu après extraction complète des protéines et séparation des agents utilisés à cette séparation, soit amené à une concentration de 10-60 mg de matière sèche par millilitre. Ce résidu doit toute- fois contenir de préférence au moins 30 mg de matière sèche par millilitre. Ce concentrat peut être utilisé directement après filtration stérilisante.
Pour obtenir un produit de grande pureté, ayant une concentration plus élevée en matière active, on peut cependant appliquer encore différents procédés de purification, avant de mettre le produit final en ampoules. On peut ainsi, par exemple par addition de cétones ou d'alcools aliphatiques à bas poids moléculai- res au concentrât obtenu comme il est dit plus haut, obtenir une précipitation modérée ne contenant qu'une partie de la-substance active qui n'est probablement fixée que par adsorption. La solution de la matière active dans la cétone ou l'alcool aliphatique à bas poids moléculaire, séparée du précipité, est alors concentrée dans le vide jusqu'à élimination complète du solvant et filtrée à l'état stérile. L'acétone convient particulièrement bien comme agent de précipitation.
Mais on peut également agiter ou remurer le concentrât avec un solvant immiscible ou seulement partiellement miscible
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à l'eau, par exemple des alcools aliphatiques à 3-8 atomes de carbone ou des éthers aliphatiques à bas poids moléculaires. Dans ce cas, on obtient deux phases, une phase aqueuse et une phase de solvant, qui renferment -la matière active à des concentrations environ comparables. On constate que de façon surprenante la somme des quantités de matière active contenues dans ces deux phases, dépasse celle du concentré non-traité.
On ne s'explique pas encore les causes de ce phénomène, mais on suppose que le traitement du concentrat par le solvant immiscible ou seulement partiellement miscible à l'eau, produit une certaine réactivation de la matière qui a été désactivée par le traitement précédent. Après concentra- tion dans le vide, on peut par conséquent continuer à traiter las deux phases.
Finalement, on peut également évaporer à sec le concentrât et/ou les fractions obtenues par les opérations de purification qui viennent d'être décrites, reprendre le résidu par de l'eau distillée le soumettre ensuite à une filtration stérilisante et éventuellement le rendre lyophile dans des conditions stériles.
Les produits finals obtenus par le procédé conforme à l'invention, sont bien stables et peuvent être conservés pendant un temps quasi illimité ; peut toutefois y ajouter aussi un agent de conservation. Comme tels entrent en jeu, de préférence le phénol, le crésol, etc...
Les'substances activant la respiration, conformes à l'invention, ont un-bas poids moléculaire. En ce.qui concerne les effets obtenus par leur action, il ne peut donc être question en aucun cas d'actions modifiées de sérum ou d'actions indéterminées de protéines. Les nouvelles substances actives se distinguent fonda- mentalement des substances actives connues introduites dans le sang ou en provenant. Dans des essais à l'appareil de Warburg, les nouvel- les substances activant la respiration, exercent sur des homogénats de tissus, une augmentation de la respiration qui ne dépend pas exclusivement du substrat et qui ne peut être atteinte , même de
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loin, au moyen des substances extraites du sang jusqu'à présent.
L'invention concerne par conséquent également le produit extrait du sang, augmentant de 100-400% la respiration d'homogénats de tissus.'
Le dessin annexé reproduit l'action d'une préparation con- forme à l'invention, sur la respiration d'un ensemble d'homogénat de foie. La mesure s'effectue dans un appareil de Warburg, à 37 . On suit la consommation d'oxygène en fonction du temps, au moyen d'un manomètre. On prépare un homogénat de foie de rats 1:4 d'un pH de 7.4 au moyen de tampon de Sörensen. On y ajoute 0,2 ml d'une substan. ce active préparée suivant l'invention, réglée au pH de 7.4 au moyen de tampon de Sörensen.La durée de traitement est de 10 minutes ; fréquence des secousses, de 100 par minute.
Sur le dessin, les ordonnées représentent la consommation d'oxygène en mm3 de O2 et les abcisses, la durée de l'essai en minutes. La courbe X a été obtenue sur un homogénat de foie de rat seul, et la courbe 0, sur Lui homogénat de rat additionné de 0. 2 ml de la matière active conforme à l'invention.
Comme on le voit sur le dessin, une augmentation de respiration au quadruple environ, est obtenue après 50 minutes.
Les résultats sont reproductibles à une tolérance usuelle d'erreur biologique de + 10%.
Jusqu'à présent, l'oxydation biologique de l'adrénaline a été attribuée à des ferments déterminés, par exemple des amino- oxydases et polyphéholoxydases. On a pu prouver que l'adrénaline est oxydée par catalyse, sans .action de ferments, par les matières actives à bas poids moléculaires obtenues suivant l'invention. Cette propriété peut être appliquée également à l'essai des matières acti- ves.
On effectue la mesure suivant la technique manométrique de Warburg, déjà décrite ci-dessus, dans des vases à secousses contenant, au départ, 0.4 ml de solution 1 N de NaOH, 0,2 à 0,4 ml de la substance active conforme à l'invention et 0. 6 ml d'une
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solution de bitartrate d'adrénaline à 200 mg %, dans une chambre de réaction à 38 et à une fréquence de secousses de $0-100/minute.
Après avoir fait passer de l'oxygène dans le système manométrique pendant 10 minutes, et après une période consécutive de 10 minutes d'équilibrage de la température, on relève toutes les 10-20 minutes pendant 2 heures., la consommation d'oxygène.
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EXEMPLE: <SEP> Consommation <SEP> d'oxygène <SEP> en <SEP> mm3 <SEP> après
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<tb> 1 <SEP> heure <SEP> 2 <SEP> heures
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<tb> Solution <SEP> d'adrénaline <SEP> seule <SEP> 1.4 <SEP> 3. <SEP> 9
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<tb> Solution <SEP> d'adrénaline <SEP> + <SEP> 134.2 <SEP> 172.S
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<tb> substance <SEP> active
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-La consommation d'oxygène est proportionnelle à l'activité de la substance active conforme à l'invention.
Les exemples suivants illustrent l'invention, sans la limiter.
EXEMPLE 1.-
On remue 2 litres de sang de jeunes veaux dans 6 litres d'acétone. On décante le précipité formé de la solution d'acétone limpide et on le remue de nouveau dans 2 litres d'acétone. On répète ensuite l'opération de nouveau avec 2 litres d'un mélange 1:1 d'acétone-éther, on sépare nettement le précipité par centri- fugation et on.le sèche à l'air* On obtient ainsi environ 355 g d'un sang séché'à l'acétone, qu'on peut conserver plusieurs mois en milieu sec et froid, sans qu'il ne perde son activité. Pour continu- er le traitement, on remue le.sang sec dans 4-5 parties d'eau distillée, et on traite la suspension ainsi obtenue par dialyse vis-à-vis d'une quantité égale d'eau distillée, à environ 2 , en utilisant un tube flexible en cellophane.
On continue la dialyse jusqu'à ce qu'aucune quantité notable d'azote ne passe plus dans le dialysat extérieur. On concentre les dialysats extérieurs obtenus à 200 ml, dans le vide, à une température ne dépassant pas 22-25 . le poids sec de la solution atteint environ 40 mg/ml. Après
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filtration stérilisante et addition d'un agent de conservation approprié, par exemple de phénol ou de crésol, la solution convient à une application thérapeutique directe. A côté de produits de désintégration des acides nueléiniques., la solution contient des acides aminés et des oligopeptides, qu'on peut caractériser par des procédés connus de chromatographie sur papier ou d'électropho- rèse sur papier.
La solution contient une forte proportion de principe activant la respiration- EXEMPLE 2, -
On peut traiter de la même façon que le sang séché à l'acétone de l'exemple 1, du sang de veau séché de façon ménagée dans une tour de pulvérisation, après y avoir ajouté 5 parties d'eau distillée. Le produit final obtenu correspond à celui préparé suivant l'exemple 1, excepté qu'il possède une concentration saline plus élevée.
EXEMPLE 3.-
On traite 1 litre de sang de veau fraîchement recueilli après l'abatage, par 1 litre d'eau distillée, pour produire l'hémoly- se. On sépare les résidus de fibrine par filtration grossière et on' soumet ensuite la solution à la dialyse à travers un tube flexible de cellophane, vis-à-vis de 2 litres d'eau distillée. Le dialysat extérieur est échangé 4-5 fois et on traite les dialysats extérieurs réunis, comme décrit dans 1* exemple 1. On obtient environ 300 ml de concentrât contenant 40 mg de matière sèche par millilitre.
Le pH de cette solution est voisin de 8.5 et on le réglée à la valeur 7, de préférence par de 1* acide chlorhydrique, pour l'emploi thérapeutique.
EXEMPLE 4.- On règle au pH 8, deux litres de sang de veau frais hémolyse suivant l'exemple 3, et on le fait digérer partiellement à 37 pendant 24 heures, avec 0,2 g de trypsine extra-pure. Après réglage au pH 7, on effectue, comme dans l'exemple 1, une précipi- tation quantitative par 6 litres d'acétone. On remue de nouveau
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le précipité dans 2 litres d'acétone, puis dans 2 litres de mélange acétone-éther 1:1, on le sépare par centrifugation et on le sèche.
Le rendement atteint 300-320 g de produit sec, dont on poursuit le traitement par-les méthodes de dialyse décrites dans les exemples précédents.
EXEMPLE .5.-
On ajoute lentement à + 2 , en1 heure, en remuant, un total de 1000 ml d'alcool à 96% à 500 ml de sang de veau frais, dont on a enlevé la fibrine par agitation. On continue à remuer pendant environ 5 heures et on sépare ensuite la solution alcoolique du résidu par centrifugation. On filtre la solution alcoolique, et on la concentre dans le vide, à une température maximum de 22 , jusqu'à obtention de 100 ml de concentrat exempt d'alcool. On règle le pH à 7. La solution est portée lentement à froid à une concentra- tion en alcool de 80% en poids en ajoutant de l'alcool et en remuant Environ 400 ml d'alcool sont nécessaires à cet effet. On laisse repo. ser 24 heures à 0 . Le précipité de protéine ainsi séparé est pratiquement exempt de substance activant la respiration, et peut être rejeté.
On concentre de nouveau la solution alcoolique à 100 ml dans le vide, jusqu'à ce qu'elle soit exempte d'alcool, et on la filtre dans des conditions stériles. Cette solution contient 15 mg de matière sèche par millilitre, et possède un abaissement du point de congélation de 1.18 . Elle peut être employée directement à des fins thérapeutiques.
EXEMPLE 6. -
On-hémolyse 200 ml de sang de veau frais, défibrinisé, par addition de 200 ml d'eau distillée, et on le traite ensuite à froid, par addition goutte-à-goutte d'environ 18 ml d'acide perchlorique à 60%, en remuant. L'extraction des protéines du sang est complète quand la concentration de l'acide perchlorique est 0.4 - 0. 6 N.
On remue ensuite encore une heure à froid, on sépare le précipité par centrifugation, on le lave par de l'acide perchlorique 0.4 N, et
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on filtre les solutions réunies. On traite la solution à froid par environ 40 ml de KOH 5N jusqu'à obtention d'un pH de 7.2-7.3 et on complète la précipitation du perchlorate de potassium par addition d'environ 30 à 40% d'alcool absolu* On laisse reposer la solution pendant 24 heures à 0 , on l'essore ou on la filtre jusqu'à ce qu'elle soit limpideet on évapore l'alcool dans le vide.
On obtient 175 m1 de solution de matière active exempte de protéines, contenant 17.4 mg de matière sèche par m1, et possédant un abaisse- ment du point de congélation de 1.6 .
EXEMPLE 7.- On peut également traiter suivant le procédé décrit dans les exemples 1-6, de préférence après hémolyse, le plasma obtenu
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par centrifugation ou le dépôt d'érythrocytes. En partant de ces deux matières de départ, on obtient des produits activateurs de la respiration. Toutefois, on réalise le meilleur effet en réunissant de nouveau ces produits.
EXEMPLE 8.-
On règle au pH 5.5 -une solution de matière. active préparée par le procédé des exemples 1-6,et on l'extrait de façon répétée par du n-butanol. On traite, par exemple, 100 ml d'extrait, huit fois par 20 ml de butanol saturé d'eau*. On sèche les extraits aqueux et butanoliques dans le vide à -une température qui ne dépa ase pas 20 , et on les reprend chacun par 50 ml d'eau distillée. Suivant ce procédé,' environ 15-20$ de matière sèche passent de la phase aqueuse dans l'extrait butanolique. Suivant l'essai de Warburg, les deux fractions sont actives.
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On traite 100 ml d'un extrait préparé suivant le mode opératoire des exemples 1-6, au pH 7,par 500 ml d'acétone, en. remuant lentement. Le précipité .formé est centrifugé et repris par 100 ml d'eau distillée. Cette solution ne possède qu'une faible activité. On reprend de nouveau dans 100 ml d'eau distillée, la solution d'acétone évaporée à sec dans le vide, et on la filtre
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de façon stérile. Elle renferme la majeure partie des substances activatrices de l'oxygène.
REVENDICATIONS
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1.- Procédé de préparation d'un agent d'activation-de la respiration à des fins thérapeutiques, caractérisé en ce qu'on extrait pratiquement complètement les protéines du sang d'animaux d'abattoirs, on libère la solution obtenue des agents utilisés à la séparation des protéines, on la concentre à une concentration de 10-60 mg de matière sèche par millilitre, on filtre le concentrat dans des conditions stériles, et on le met en ampoules.