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La présente invention a pour objet des 'perfectionne mente --- d'hydrolyse partielle du dextrane de poids moléculaire relativement élevé en produits de dextrane à plus bas poids molé- culaire .
Le dextrane est un polysaccharide que l'on peut produire par synthèse à partir d'hydrates de carbone tels que le sucre raffiné ou brut, les/mélasses ou d'autres substances renfer- mant des sucroses, par l'action de certains micro organismetels que ceux des types Leuconostoc mésenteroides ou LDextranicum, @ 1 @
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ou '.# l'action de 1-elizylL.: isolée à partir de cul4ures de ces 'licl'oorr;ani::;mGs. Le procédé habituel consiste à introduire une culture de lllÍcroort;anis:.:es au choix ou une solution aqueuse de l'enzyme isolée de sa culture, dans un milieu nutritif sucré et l'y maintenir jusqu'à ce qu'une production maximum de dextrane soit atteinte.
Le dextrane gomme ainsi obtenu est un produit "naturel" dont le poids moléculaire moyen, d'après les calculs, est de l'ordre de Millions. L'on attribue ce poids moléculaire élevé
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à la co-liaison d'un. ea.,.d nombre de molécules, les polysacchar¯-des résultant, apparemment, de la condensation en longues chain-. d'éléments gluco-pyrwinoses. La formule du dextrane est considéré corme 2t¯llt (U6 I'.¯0 05) n, n étant un nombre entier.
Le dextrane, poids moléculaire relativement bas et dans certaines limites, est utilisé dans les liquides pour in-
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jections intraveineuses conane un diluant du pl::.s1'1a sanguin ou comme un substitut pour injections de plasma. Ce diluant du
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plasma .".ll:;'..lÍn ou dextrane "clinique", de poids moléculaire COi.lp2ratjv(:j:.el1t bas, est obtenu par une hydrolyse partielle contrôlée, à partir du dextrane brut "naturel" ci poids moléculaire élevé qui, lui-même , est produit C0i.;ue généralement décrit ci-Jess1.1,;..w(;J procédé consiste à ajouter au milieu en fermenta- tion un alcool ou une cétone miscible à l'eau dans une concentration telle que le dextrane brut y soit insoluble, d' où précipitation du dextrane ;
à le purifier ensuite et le redissoudre dans de l'eau acidulée dans laquelle il est hydrolyse en dextrant à plus bus poids moléculaire. L'un des problèmes auxquels l'on se heurte au cours de l'application de ce procédé est que certaine impuretés comprenantdes matières azotées voisinent dans le milieu en l'éructation avec le dextrane brut et, à moins d'être éliminées par filtration ou centrifugation, elles accompagnent le dextrane précipité, d'où il est difficile de les éliminer par la suite.
Les impuretés peuvent .se trouver occluses avec le dextrane lors de l'hydrolyse de ce dernier, rendre cette hydrolyse difficile ainsi qu'affecter la pureté du pro-
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duit partiel d'hydrolyse et la limpidité des solutions qui en' sont préparées pour une utilisation clinique'.' d'autre part, la filtration et là centrifugation' du milieu de fermentation de
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viscosité très élevée sont' difficiles, longuet è ia:bbiieüse: La présente invention' à pour objei' :P-:t1ticip'àl' de foüni une méthode perfectionnée par laquelle le dèxtr'anè'' 'i5"xua èst précipité du milieu nutritif à l'état pur ou flitifîé i'xtér manière plus rapide.
Quelques-unes des impiirftés se trouvant avec là d6rxtriwiz ne dans le milieu en fermentation y sont solubles, tandis que
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d'autres impuretés y sont insô1üies. Il été trouvé que l'addition d'une quantité déterminée et contrôlée, généralement 15% à 30% en poids, d'un alcool alipaique ou d'une éétone miscible à l'eau,du type dé ceux qui, à plus haute oc)'}:18èn- ' tration, précipitent le dextrane du milieu en fermentation1! insolubilisent les impuretés normalement solubles sans toutefois rendre solubles celles qui sont normalement insolubles dans le fermentât.
Etant donné que l'addition de la quantité déterminée et contrôlée d'alcool ou de cétone diminue d'une manière appréciable la viscosité du fermentât, le rendant relativement fluide et plus aisé à manipuler,;par exemple filtré et centrifugé, l'aspect pratique important; de cette méthode réside en ce que le fermentat peut être filtré ou centrifugé sans difficulté et ce préalablement à la précipitation du dextrane.
En outre le dextrane est précipité à l'état d'une plus grande pureté car les impuretés sont normalement insolubles ou sont insolubilisées par l'alcool ou la cétone, après en avoir ajouté la quantité contrôlée, d'où plus d'impuretés sont éliminées par filtration ou centrifugation et plus le dextrane, éventuellement précipité, est pur, si pas entièrement,libre d'impuretés.
L'isopropanol est actuellement l'agent réactionnel préféré pour être incorporé au fermentât, en concentration com-
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parativement faible, en vue d'insolubiliser les impuretés normalement solubles et de diminuer la viscosité du fermentât au point de le rendre plus facile à manipuler; pour être incorporé à la masse restant après séparation des impuretés, dans une proportion telle que la concentration totale de l'isopropanol soit suffisante pour précipiter le dextrane.
La présente invention sera plus clairement comprise en se référant aux exemples particuliers ci-après et schémas.annexés.
Dans une forme particulière de réalisation , le bouillon nutritif sucré est stérilisé par intermittence et après refroidissement il est inoculé,de préférence immédiatement, à l'aide d'un filtrat de Leuconostoc mesenteroides comme le L. m.
B-512 ( désignation du Northern Régional Research Laboratory).
Le bouillon nutritif peut contenir , en poids: 0,5% caséine hydrolysée, enzymatique
0,8% K2 H P04
0,2% NaC1
0,1% extrait de Bacto-levure 20,0% sucrose 0,0022% Mn S04 le reste étant de l'eau.
Ce bouillon nutritif est ( de préférence immédiatement après stérilisation et refroidissement ) inoculé d'un extrait d'un bouillon agar frais de bactéries. Le pourcentage du produit à inoculer utilisé peut être de 5-10%. Après inoculation, le bouillon est maintenu de 23 C-27 C pendant 24-48 heures. la température est plus ou moins critique; des températures supérieures à environ 27 C tendent à ralentir la réaction, d'où elles requèrent un temps plus long pour atteindre une production donnée de dextrane.
Pendant la fermentation, la viscosité de la solution qui dans l'exemple présent peut-être prise comme un lot de 15
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litres, augmente d'une. manière appréciable et. devient haute- ment visqueuse,, cependant que le PH de la masse tombe d'une va- leur initiale d'environ 7,1-7, 4 à environ 3,9-4,1.. Cette chute de la valeur. du PH dans les limites de 3,9-4,1 indique que la fermentation est presque complète et que la production maximum de dextrane est atteinte. La production de dextrane dans, la mas- devrait .se visqueuse, à ce moments/être d'au moins 80%. de la production théorique.
Suivant la pratique antérieure, le fermentat très vis- queux serait soumis au processus long et laborieux/le filtration ou de centrifugation en vue d'éliminer, autant que possible, les impuretés insolubles et l'on y ajouterait ensuite l'alcool pu la cétone en une quantité telle qu'on provoque la précipitation de tout le dextrane brut auquel reste attachée une certains proportion d'impuretés. Cependant, dans le présent procédé l'alcool ou la cétone est maintenant incorporée au fermentât à une concentration contrôlée et relativement basse de 15-30% en poids, en vue d'insolubiliser les impuretés solubles, tandis que le dextrane, en majeure partie, reste dissous dans le fermentat et baisse la viscosité de la masse.
Comme indiqué précédemment, il est préférable d'utiliser l'isopropanol,
L'addition de 15-30% d'isopropunol au fermentât a pour effets d'y ralentir l'accroissement ultérieur, d'un réduire la vis- cosité de manière que la masse soit plus facilement manipulée et d'insolubiliser les impuretés solubles azotées et autres impuretés qui peuvent être éliminées, rapidement, pratiquement et sélectivement, par filtration ou centrifugation.
Il est préférable de laisser séjourner le fermentât, contenant l'iaopropanol à la concentration voulue, à une ternpé- rature voisine de la température ambiante jusqu'à ce que l'al- cool insolubilise les impuretés et len rende éliminables par filtration ou par centrifuguti n en panier. Une courte période de repos de 30 minutes à 1 heure est généralement suffisante.
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Les impuretés sont alors séparées mécaniquement, par centrrfu- gation en panier ou par filtration. Cette manière d'éliminer les impuretés donne une solution limpide de dextrane dont la teneur en matières azotées est pratiquement inférieure à celle rencontrée généralement, et de laquelle le dextrane peut être précipité à l'état considérablement plus pur.
La séparation mécanique de;impuretés insolubles du fermentât à viscosité corrigée (réduite) est, de préférence, effectuée à un PH de'2-5. Le fermentat dilué avec la quantité limitée d'isopropanol peut avoir un PH inhérent Se situant dans ces limites.
Dans ce cas, aucune correction de PH n'est requise. Néanmoins, si le PH est supérieur à 5,0 il est amené à une valeur de 2-5 par l'addition d'acide sulfurique ou chlorhydrique et ce préalablement à la centrifugation ou filtration de la masse.
La solution de dextrane restant après filtration ou centrifugation est d'ordinaire translucide. Ledextrane brut est à présent précipité de cette solution par de l'alcool ou de la cétone à une plus forte concentration à laquelle le dextrane est insoluble. L'agent de précipitation du dextrane est de préféren- ce le même qui celui utilisé lors de l'abaissement de la viscosité du fermentât. Dès lors, dans le cas présent, comme l'isopropanol a été utilisé pour insolubiliser les impuretés et pour abaisser la viscosité, l'isopropanol est de même utilisé pour précipiter le dextrane de la solution clarifiée, mais à une concentration plus élevée allant de 35-50% en poids.
Le dextrane, entraînant avec lui un peu d'isopropanol et de l'eau, se dépose au fond du récipient et la portion surnageante peut être rapidement décantée.
Le dextrane brut précipité peut être ensuite/Lavé avec de l'isopropanol afin d'enlever toutes impuretés qui pourraient y adhérer.
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Ce produit peut être séché et réduit en petites particules s'il devait être utilisé cornue tels
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Néanmoins, s'il doit être hydrolyse partiellement en un dextrane à plus bas poids 1JiO:J:éëúlaiTe', '1', 8.1-de "2i":a.c5.dé7, 'on le dissout dans de l'eau à concurrence a.''éirv"ir6n ;"e% ''d1i Vonrziê du fermentât initial et, à la'soutien vl-squëttae 2:Z's2 obtenue, on ajoute de l'hydroxide de sodium fort, en quantité suffisante, pour élever le PH à 6,8-7,Oi On effectue alors 1,.ßolyse en chauffant la solution ne'uê .3aqu' à-atteindre \:l1:'Í 'température constante dé 75-85'C, mah1:Íienant là Solution à 'c'êtte température élevée pendant que l''on procède à ' a,juste3nené' du PIPI dans les limites acides par -1teoàà:ition ditxâ à:
cïde 'minéral fort,, comme l'abàde chlorhydrique 'ou Ibal-furique et tout 'en continuant à maintenir la solution à la température d'*nydr'olys'ë -jusqu'à ce que l'hydrolyse partielle ait eu lieu dans la mesure désirée.
La température, le temps et le PH sont interdépendants et peuvent varier suivant le poids moléculaire ou le poids moléculaire moyen que l'on désire en produit d'hydrolyse ou en fractions de ce produit. Lorsqu'on désire obtenir du dextrane à poids moléculaire adapté à l'utilisation clinique, le PH de la solu-
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tion peut être amené à 1,0q.-3.s26 et la solution maintenue à 75-85 C pendant environ une heure. On comprend dès lors que, si on le désire, on peut effectuer l'hydrolyse partielle du dextrane naturel sans qu'aucune des fractions ne renferme un produit d'hydrolyse à poids moléculaire correspondant à des utilisations cliniques, mais que toutes pourront satisfaire à diverses applications industrielles.
Après chauffe ou lorsque l'hydrolyse a atteint la limite prédéterminée, l'attaque du dextrane par l'acide peut être arrêtée en ajoutant rapidement une solution d'hydroxyde de sodium en quantité et en concentration NaCH en sorte d'amener le PH à 6,8-7,0. la solution neutre est ensuite refroidie à
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5-4U Ci C.
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Lorsque Ici solution contient du dextrane de poids molécu- laire dans les limites cliniques, il est de préférence décoloré, dé-ionisé et clarifié avant d'être séché par pulvérisation ou par tout autre traitement en vue d'obtenir du dextrane à l'état de poudre séchée. Il est évident que ces post-traitements spéciaux de purification peuvent être omis lorsque le dextrane hy- drolysé est destiné à des utilisations industrielles ; moins dans certains cas et suivant l'utilisation désirée, la solution neutre refroidie est.alors séchée par pulvérisation directement après refroidissement ou par tout autre traitement en vue d'obtenir le dextrane à l'état de particules menues.
La décoloration peut être obtenue en faisant passer la solution neutre refroidie sur une couche de charbon de bois. La solution, pour le moins partiellement décolorée, peut être dé ionisée en la faisant passer dans une colonne ou sur une couche de substance minérale ou résine agissant efficacement comme échangeuse d'anions et de cations. La clarifi.cation ultérieure peut enfin être obtenue et complétée en faisant passer la solution décolorée et dé-ionisée à travers une couche de terre diatomacée.
Soumise ou non à ces traitements de purification, la solution de dextrane hydrolyse peut être séchée par pulvérisation et le dextrane partiellement dégradé peut être précipité de la solution aqueuse en y ajoutant de l'isopropanol, déshydraté par des traitements successifs à l'acétone et à l'isopropanol et finalement séché sous vide à 50-80 0.
Lors de la production du dextrane clinique par le procédé et dans les conditions décrites, il est nécessaire de fractionner le produit d'hydrolyse partielle afin de séparer le produit acceptable du point de vue clinique du dextrane à poids molé- culaire plus élevé ou plus bas que celui prescrit pour l'injection intraveineuse. Ce fractionnement peut s'effectuer au cours de la précipitation du dextrane de la solution d'hydrolyse en y ajoutant l'agent précipitant successivement et dans
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des quantités déterminées dans lesquelles les fractions de dextrane de poids moléculaire différents sont insolubles, rendant ainsi possible la séparation successive des diverses fractions.
Dès lors, si l'hydrolyse est effectuée dans les conditions spécifiques données pour l'obtention du dextrane clinique (dextrane de poids moléculaire se situant entre 20. 000 et 200.000; poids moyen 60.000 à 80. 000), cette fraction de dextrane -clinique- peut être séparée du produit hydrolysé en ajoutant à la solution aqueuse neutre une quantité d'isopropanol telle que le dextrane à poids moléculaire plus élevé, indésirable (du moins pour utilisation clinique), précipite ; on élimine'ce précipité par filtration et l'on ajoute ensuite une quantité supplémentaire d'isopropanol en vue de précipitér le dextrane clinique désiré. Ce dernier précipité,après séparation par filtration, peut être convenablement déshydraté, de préférence à l'aide d'acétone,et ensuite granulé.
Ou le précipité peut être redissous dans l'eau et séché par pulvérisation.
Dans ce processus, lorsque le fermentat est additionné de 15% à 30% d'isopropanol afin de le. rendre relativement plus fluide et d'insolubiliser les impuretés, un peu de dextrane, ordinairement une quantité comparativement très petite, de poids moléculaire le plus élevé, peut être précipité et éliminé au moment où les impuretés insolubles sont filtrées ou centrifugées. Ce fait ne constitue pas un désavantage lorsque le dextrane brut est destiné à être hydrolyse en un dextrane à plus bas poids moléculaire et en fait il est réellement avantageux car il simplifie l'hydrolyse par l'élimination d'un peu de dextrane à poids moléculaire extrêmement élevé devant être divisé au cours de la réaction.
Il est évident que le présent perfectionnement n'est pas seulement important lorsqu'il s'agit d'hydrolyser partiellement le dextrane brut en dextrane de plus bas poids moléculai- re. L'insolubilisation des impuretés azotées et autres au sein du fermentât de même que l'abaissement de la viscosité de celui-
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ci résultant en me manipulation plus facile, et la séparatin de ces substances insolubles du fermentat, préalablement à la précipitation de toute quantité appréciable de dextrane brut, sont. importantes car/il est généralement préférable de libérer le- dextrane des impuretés quels que soient les traitements auxquels il pourrait être soumis ou/l'usage auquel il serait destiné ;
et il est plus simple, et à la longue plus économique et plus rapide, d'éliminer les impuretés du fermentat et d'éviter ainsi leur précipitation en même temps que celle du dextrane que d'éliminer des quantités appréciables d'impuretés le dextrane après sa précipitation. Par exemple, même lorsque de dextrane est utilisé à l'état naturel pour différents usages industriels ou lorsqu'il est hydrolysé par d'autres moyens que les acides, comme, par exemple lorsque l'hydrolyse est effectuée par l'action des enzymes, l'élimination des impuretés est encore désirable et ce but est atteint d'une manière satisfaisante par le présent procédé consistant en l'élimination des impuretés ou de la ma- .jeure'partie de oelles-ci, du fermentat et ce avant la précipitation du dextrane.
L'exposé a eu pour objet jusqu'à présent la production du dextr'ane dans des conditions courantes et conduisant à l'obtention d'un dextrane naturel à poids moléculaire très élevé.
Dans tous les processus impliquant la synthèse du dextrane à partir de sucrose ou de substances similaires en faisant agir un microorganisme producteur de dextrane ou son enzyme, on trouve, dans le bouillon nutritif ou fermentât des impuretés qui accompagnent le dextrane généré.
Le présent perfectionnement préconisant- l'addition d'alcool ou de cétone, et de préférence de l'isopropunol, au fermentat en vue de diminuer la viscosité de celui-ci et de le rendre apte à être centrifugé ou filtré rapidement et efficacement et d'insolubiliser les impuretés ; et la séparation des impuretés insolubilisées, préalablement à la précipitation du dextrane, peut être appliqué.
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dans toutes les synthèses de ce genre et dans -celles 'effectuées dans des conditions particulières de contrôle en vue de la production d'un dextrane naturel à poids moléculaire plus bas que ,.celui du dextrane/ootenu dans des conditions courantes..
La quantité d'isopropanol, dans les limites de 15%-30%, en poids,est choisie telle qu'elle provoque une diminution de la viscosité, l'insolubilisation des impuretés et leur élimination, sans précipitation notable du dextrane en question. S'il a été dit précédemment que la quantité préférentielle de substance à inoculer au bouillon nutritif sucré se situe entre
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5'ff et 10%, des quantités allant de 2% à 15% peuvent cepnd&1iJ.t,. être utilisées. Lorsqu'on ajoute 2% de bouillon de culture au .bouillon nutritif, des périodes de fermentation plus longues sont nécessaires à une production satisfaisante de dextrane et. le temps de fermentation requis est généralement supérieur à 48 heures.
A une concentration de 15% de la substance à inocu- ler correspondent des périodes de fermentation'plus courtes, environ 16 , heures étant considérées comme acceptables, mais la production de dextrane est réduite .à cause des réac- tions secondaires. Pour ces raisons, une concentration de 5% à 10% d'inoculum est préférée.
La présente invention ne se limite pas à un microorganis- me producteur de dextrane en particulier. Le Leuconostoc mesen- teroides B- 512 (NRRL) est pris comme exemple et il est or- dinairement préféré lorsqu'il s'agit de produire du dextrane clinique. Néanmoins, le milieu nutritif peu être inoculé par une culture d'autres espèces de Leuconostoc mesenteroides (ou par l'enzymeen provenant) y compris les espèces portant les
B-1146, désignations NRRL suivantes : L. m. B-119,/B-1190, B-742, B-1191,
B-1196, B-1208, B-1216, B-1120, B-1144 et B-523, ou par des cul- tures de Streptobacterium dextranioum B-1254 et de Betabacterium vermiforme B-1139.
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Différents changements et modifications peuvent être apportés aux détails particuliers indiqués dans l'application de la présente invention. Etant donné que de telles variantes peuvent être envisagées sans se départir de l'esprit et du but de l'invention, il en ressort qu'il n'est pas de l'intention de la Demanderesse de poser des limites à la présente invention, sinon celles.définies dans les revendications en annexe.
REVENDICATIONS.