<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne la préparation d'un décapeptide, qui présente un effet d'augmentation de la pression sangùine identique à celui qu'exerce l'hypertensine, mais toutefois de plus longue durée et qui, par hydrolyse, peut être transformé en cette dernière, en permettant, ainsi, pour la première fois de réaliser la synthèse de cette hormone.
Rien qu'à cela on voit déjà l'importance de la présente invention, notamment lorsqu'on considère que jusqu'à présent l'hypertensine devait être isolée du sang au prix d'un procédé'd'extraction compliqué et ne permettant d'obte- nir, à partir de 100 kg de sang, qu'environ 5 mg de ce polypeptide.
Le nouveau décapeptide est la L-asparaginyl-L-arginyl-L-valyl- L-tyrosyl-L-valyl-L-ristidyl-L-propyl-L-phényl-alanyl-L-histidyl-L-leucine de formule
EMI1.1
Il se différencie de l'hypertensine par le fait que, dans sa molé- cule, le reste de l'asparagine est présent à la place de celui de l'acide asparaginique.
Comme il ressort de la formule ci-dessus, il existe un grand nom- bre de possibilités pour effectuer cette synthèse du nouveau polypeptide.
On a trouvé qu'il était avantageux de partir d'une L-asparagine, dont le groupe aminogène est protégé à l'aide du reste pouvant être scindé par réduction ou hydrolyse et d'une L-arginine, dont le groupe aminogène du groupement amidinique est avantageusement protégé par un reste pouvant être scindé par hydrolyse ou réduction, avantageusement par un groupe No2, et de relier les restes d'une L-asparagine comprenant un groupe aminogene pro- tégé, d'une L-arginine comprenant un groupe amidinogène protégé, d'une L- valine, d'une L-tyrosine comportant ur hydromyle libre ou substitué, comme l'un de ses esters ou éthers, de la L-valine, de la L-histidine, de la L- proline, de la L-phénylalanine,
de la L-histidine et d'un ester de la L- leucine par liaison amidique avec formation d'un décapeptide avec-l'ordre mentionné des restes aminocarboxyliques indiqués, à mettre en liberté dans le polypeptide ainsi obtenu le groupe carboxylique estérifié du reste de la leucine, les groupes aminogènes protégés du reste asparaginique et argi- nilique et, le cas échéant, un hydroxyle substitué du reste tyrosinique et, si on le désire, à transformer en groupe carboxylique libre le groupe carbonamidique du reste asparaginique.
Une forme d'exécution avantageuse du procédé, consiste à acyler de la nitro-L-arginine avec une L-asparagine comportant un groupe aminogène. protégé. La L-asparaginyl-nitro-L-arginien ainsi obtenue peut alors être
<Desc/Clms Page number 2>
condensée en le décapeptide désiré à l'aide d'un ester de la L-valyl-L- tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-leucine.
On peut toùtefois condenser aussi une L-asparaginyl-nitro-L-arginine avec de la L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine pour obtenir une asparaginyl- nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine et faire réagir cette dernière sur un ester de la L-propyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-leucine pour obtenir le décapeptide. Il est en outre possible d'acyler de la L- valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine avec une L-asparaginyl-nitro-L-arginine et de faire réagir la L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- valyl-histidine obtenue sur de la L-propyl-L-phénylalanine pour obtenir de l'octapeptide qu'on peut utiliser pour acyler un ester de la L-histidyl-
L-leucine avec formation du décapeptide.
Les polypeptides mentionnés à propos de l'acylation peuvent être obtenus de diverses manières . C'est ainsi qu'on peut d'abord condenser de la L-valine avec de la L-tyrosine pour obtenir de la L-valyl-L-tyrosine, condenser la L-valine avec de la L-histidine pour obtenir de la L-valyl-
L-histidine, condenser de la L-proline avec de la L-phénhlalanine pour obtenir de la L-prol>yl-L-phénylalanine et, finalement, condenser de la L- histidine avec un ester de la L-leucine pour obtenir un ester de la L-histi- dine-L-leucine. La L-valyl-L-hiétidine ainsi obtenue peut alors être acylée avec la L-valyl-L-tyrosine pour donner de la L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidine.
On peut aussi toutefois condenser de la L-valine avec de la L- valyl-L-tyrosine pour obtenir de la L-valyl-L-tyrosyl-L-valine et condenser alors cette dernière avec de la L-histidine. La L-propyl-L-phénylalanine peut, à l'aide d'un ester de la L-histidyl-L-leucine, être liée à un ester de la prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-leucine. Le même polypeptide est aussi obtenu en acylant de la L-histidine avec de la L-propyl-L-phénylala- nine et en faisant réagir -- ce tripeptide sur un ester de la L-leucine.
Dans les acylations ci-dessus on peut utiliser les procédés con- nus pour la préparation des polypeptides. Dans ce cas on doit protéger provisoirement des groupes aminogènes libres ne participant pas à la réac- tion, notamment à l'aide de restes pouvant être scindés par hydrolyse com- me, par exemple, le reste carbobenzyloxy. Les acides aminés à acyler sont utilisés avantageusement sous la forme de leurs esters.
Comme méthodes d' acylation on citera la réaction d'un acide sur la phosphitamide correspon- dant, par exemple sur le diéthyl-phosphitamide correspondant, la réaction d'un acide sur l'amine en présence d'un carbodiimide, par exemple en présen- ce du 1-cyclohexy1-3-(2-morpholinyl-(4)-éthyl)-carbodiimide, et notamment la réaction d'une amine sur un ester activé, dans lequel est avantageuse- ment présent comme substituant activant, dans la composante alcoolique,le groupe cyanique ou le groupe NO2.
La transformation d'un groupe aminogène protégé en groupe amino- gène libre, ainsi que la transformation d'un groupe carboxylique fonctionnel- lement modifié en groupe carboxylique libre, au cours du procédé de prépa- ration des divers polypeptides , et notamment dans les décappptides obtenus conformément au procédé a lieu suivant des méthodes connues en elles-mêmes par traitement avec des agents d'hydrolyse ou avec des agents réducteurs.
Dans les produits obtenus conformément au procédé, on peut trans- former-fonctionnellement des groupes carboxyliques libres notamment les trans- former en esters ou en amide. Il est en outre possible de substituer des groupes aminogènes libres, par exemple de les alcoyler ou de les acyler.
On peut aussi obtenir ou utiliser les produits du procédé sous la forme de leurs sels.
<Desc/Clms Page number 3>
Une variante'du procédé consiste à partir d'un produit intermédiai- re pouvant être obtenu à un stade quelconque du procédé, puis à effectuer 1 les phases encore manquantes dudit procédé,. On peut aussi toutefois renon- cer à un étage quelconque du procédé, à exécuter les autres phases du procé- dé et, si on le désire, à mettre en liberté dans le polypeptide obtenu un groupe carboxylique ou un hydroxyle fonctionnellement modifié et/ou un groupe aminogène protégé.
On expliquera plus en détail, grâce au schéma de formules ci-après, une forme d'exécution spéciale telle qu'elle est décrite dans les exemples qui font suite : la.. Diéthylphosphitamide (III) de l'ester méthylique de la nitro-L-argini- ne (II).
EMI3.1
EMI3.2
lb. Ester méthylique de la N--oarbo'benzylo2y-L-asparaginyl-ni't;ro--L-arginine (V).
EMI3.3
EMI3.4
2. lT-carbobenzylo7,-y-L-asparae,¯inEl-iiitro-L-arginine (VI.
EMI3.5
<Desc/Clms Page number 4>
3. Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-
EMI4.1
Ir-alyl-L-tyrosyl--valyl-Z-histidine (VIII).
EMI4.2
EMI4.3
4. iT-carbobenzylox-I-asparaginyl-nitro-h-arginyl-L-val 1-Z-tyrosyl-I,-val 1-
EMI4.4
L-histidine (IX) . C lTH CONE, m" Nmw2 CH2 (9H2)3 bzz2 VIII + LiOS p ' 2 "E VIII LiOH ----'T < >-CH20CONIf-CH-CONH-CH-Co- IX 0 .
H-2H CH C3 CH3 CE, t CH3 CH3 C- CE2 1;-/ ""CH/ CH2 CH/ CH2 -IÏE- 6E-CONS- CE-CONE- CE-CONE- CE- COOE
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
5. Ester méthylique de la N-carbobenz lo -L-as ara in 1-nitro-I-ar in 1- va y - - yrosy - -va y - zs i y - pro y - -p eny a any - is i y - L-leucine (XI.
EMI5.2
6. Ester méthylique de la L-asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-
EMI5.3
L-histià3rl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histiàyl-L-leuaine (XII).
EMI5.4
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
7. I-asparagi2l--L-argira.rl-L-valrl-I-tro syI-L-valyl-I-hi,st,i.dl-L-prolyl- L-phénylalanyl-L-histidyl-1-leucine (X1II).
EMI6.2
8. Hypertensine.
EMI6.3
<Desc/Clms Page number 7>
Les polypeptides obtenus conformément au procédé peuvent servir comme produits intermédiaires pour la préparation de médicaments ou égale- ment, notamment le décapeptide décrit au début, comme médicament sous la forme de préparations pharmaceutiques renfermant les peptides en mélange, avec une matière de support pharmaceutique organique ou inorganique appro- priée pour une application entérale, parentérale ou locale. Pour cette ma- tière de support on envisage des substances ne réagissant pas sur les polypeptides comme, par exemple,; la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyli- ques, des gommes, des polyalcoylène-glycols, la vaseline, la cholestérine, ou d'autres excipients connus.
Les préparations pharmaceutiques peuvent se présenter , par exemple, à l'état de comprimés, de dragées, de poudre, d'onguents, de crèmes, de suppositoires, ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants ou émulsifiants.
Elles peuvent aussi renfermer encore d'autres substances thérapeutiquement précieuses.
La présente invention concerne également, à titre de produits industriel, nouveaux, les produits conformes à ceux défini ci-dessus.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limi- tatifs qui suivent. Dans ces exemples, les températures sont indiquées en degrés centigrades.
Exemple 1 a.Liéthylphosphitamide (III) de l'ester méthylique de la nitro-L-arginine.
A une solution de 8,50 g (0,037 mol) d'ester méthylique (II) de la nitro-L-arginine et de 8,0 cm3 (0,057 mol) de triéthylamine dans 100 cm3 de dioxarne absolu à 5 , on ajoute en une seule fois une solution refroidie de 9,00 g 75% (C,042 mol) de chlorophosphite de diéthyle (I) dans 20 cm3 de dioxanne absolu. Il se forme alors un précipité épais de chlorhydrate de triéthylamine. Au bout d'une heure, on essore les cristaux à 20 et les lave ensuite avec un peu de dioxanne absolu. La solution dioxannique aban- donne, après évaporation et séchage, 12,52 g du diéthylphosphitamide (III) brut de l'ester méthylique de la nitro-L-arginine sous la forme d'une hùile incolore visqueuse qu'on continue à traiter aussitôt comme décrit ci-dessous. b. Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginine (V.).
Dans 40 cm3 de phosphite de diéthyle, on dissout 12,52 g (environ
0,035 mol) de diéthylphosphitamide huileux brut (III) de l'ester méthylique de la nitro-L-arginine et ajoute 8,00 g (0,030 mol) de N-carbobenzyloxy-L- asparigine (IV) bien sèche et finement pulvérisée. On maintient la solution claire pendant deux heures à 80 et élimine ensuite le plus complètement pos- sible le phosphite de diéthyle sous un vide poussé. On ajoute au résidu
30 cm3 d'eau, ce qui fait qu'il se sépare une huile épaisse. L'huile et la phase aqueuse passent à travers 4 entonnoirs séparateurs avec chaque fois 250 cm3 d'acétate d'éthyle, ce qui fait que la matière huileuse se dissout lentement dans l'acétate d'éthyle.
On lave dans l'ordre les solu- tions d'acétate d'éthyle avec peu d'acide chlorhydrique dilué, avec une so- lution de sulfate de sodium, avec une solution de carbonate de sodium et avec une solution de sulfate de sodium, les sèche sur du sulfate de sodium et obtient par évaporation 7,00 g de résine. Par recristallisation dans l'eau.; on obtient 3,63 g du composé V sous la forme d'aiguilles d'un point de fu- sion de 150-165 , le rendement est de 25% de la théorie. A partir de la les- sive-mère on ne peut pas obtenir d'autres cristaux.
<Desc/Clms Page number 8>
Après avoir été recristallisés à plusieurs reprises dans l'eau, les cristaux bruts fondent, à 170-173 ; [Ó] D=+ 5 +2 (C = 2,0 dans l'acide acétique glacial). Le produit est soluble dans le méthanol, le diméthylfor- mamide et l'eau chaude, difficilement soluble dans l'eau froide, l'acéta- te d'éthyle et le tétrahydrofuranne.
Exemple 2 N-carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginine (VI).
A 4,74 g (0,0099 mol) du composé V d'un point de fusion de 165- 170 , on ajoute 11,0 cm3 d'une solution normale d'hydroxyde de sodium et secoue une heure à 22 . Au bout de 15 minutes environ la majeure partie est dissoute. 15 à 20 minutes, plus tard, il commence à se séparer un volumineux précipité (sel de sodium du composé VI). Le précipité est finalement dissous par addition de 20 cm3 d'eau, débarrassé par filtration d'une trace de ma- tière non dissoute, puis on fait passer du CO2 jusqu'à ce que le pH de la solution soit égal à 8,5.
On lave alors la phase aqueuse à deux reprises avec chaque fois 80 cm3 d'acétate d'éthyle, puis lave les solutions d'acétate d'éthyle une fois avec peu d'une solution de bicarbonate de sodium.
Ori réunit la phase aqueuse et la solution bicarbonatée de lavage ajuste à un pH de 1 à l'aide d'acide chlorhydrique binormal, ce qui provo- que la séparation d'une matière amorphe. On amène cette dernière en solution en extrayant à 4 reprises avec chaque fois 250 cm3 d'acétate d'éthyle; on lave les solutions d'acétate d'éthyle à deux reprises avec chaque fois peu d'une solution de sulfate de sodium, les sèche sur du Naso4 et elles four- nissent par évaporation 4,46 g d'un résidu partiellement cristallin. Par cristallisation dans de l'acétonitrile, on obtient au total 3,26 g du compo- sé VI sous la forme de druses aciculaires d'un point de fusion de 94-98 (71% de la théorie).
Après avoir été recristallisées à deux reprises dans de l'acétonitrile, ces druses fondent à 98-101 . [Ó]d = + 10 +4 (c = 1,4 dans le méthanol).
Les cristaux sont solubles dans le méthanol, le diméthylformamide. l'acétonitrile chaud et l'eau chaude, difficilement solubles dans l'eau froide et l'acétonitrile, l'acétate d'éthyle, le tétrahydrofuranne, l'acéto- ne et facilement solubles dans une solution saturée de bicarbonate de sodium/
Exemple 3 Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-anginnyl-L- valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine (VIII).
A une solution de 2,07 g (4,43 m mol) du composé (VI¯ (fondant à 98-103 ) et de 1,20 g (5,07 m mol)de 1-cyclohexy1-3-[2-morpholinyl-(4)-éthy-1] -carbodiimide dans 5 cm3 de diméthylformamide, on ajoute une solution de 2,05 g (3,87 m mol) d'ester méthylique de L-valyl-L-tyrosy1-L-his- tidine (VII)(fondant à 191-193 ) dans 3 cm3 de diméthylformamide. Au bout de 24 heures à 22 , on élimine par distillation le diméthylformamide sous un vide poussé, à une température de bain de 50 , puis malaxe le résidu avec 8 cm3 d'eau. On essore la poudre insoluble et la lave avec peu d'eau.
On la met alors en suspension dans 6 am3 d'acide chlorhydrique normal, ce qui fait qu'il se forme un précipité gélatineux, difficilement filtrable (chlorhydrate de VIII). On centrifuge ce dernier et le lave dans le verre de centrifugeage, une fois avec peu d'acide chlorhydrique normal, deux fois avec peu d'eau et une solution diluée de carbonate de sodium, ensuite
<Desc/Clms Page number 9>
à nouveau à l'eau et finalement à l'acétone, l'essore finalement dans l'acétone et le sèche. On obtient 1,22 g (32% de la théorie) du composé VIII sous la forme d'une poudre faiblement brunâtre qui fond à 170-180 . La substance est soluble dans le diméthylformamide, un peu soluble dans le méthanol et difficilement soluble dans l'acétone et l'eau.
La poudre¯peut être amenée en solution par addition de peu d'acide chlorhydrique dilué et de beaucoup d'eau et elle est précipitée à nouveau de cette solution sous la forme du chlorhydrate par addition d'acide chlorhydrique assez fort, (par exemple binormal).
L'ester méthylique de L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine uti- lisé comme matière de départ est préparé comme décrit ci-dessous.
Exemple 4
EMI9.1
N-car'bobenzyloy-L-asparainyl-nitro-L-arginl-L-valyl-L--tyrosl-Irvalyl- L-histidine (IX).
Dans 8,0 cm3 de diméthylformamide, on dissout par chauffage 800 mg (0,82m mol) du composé VIII, refroidit à la température ambiante et ajoute 2,5 cm3 d'une solution aqueuse normale d'hydroxyde de lithium. Au bout de 90 minutes à la température ambiante, on sépare par filtration une trace de matière non dissoute, lave avec peu de diméthylformamide et ajoute 2,5 cm3 d'acide chlorhydrique normal (pH 3), La solution est alors évapore à sec sous un vide poussé, à une température de bain de 50 , et la résine qui reste est malaxée avec un peu de méthanol, On essore la poudre insoluble, la lave avec un peu de méthanol et la sèche. On obtient) sous la forme d'une poudre incolore, 350 mg (44% de la théorie) du composé (IX), d'un point de fusion de 185-195 .
Le produit est peu soluble dans l'eau et le méthanol difficilement soluble dans l'acétone. Lorsqu'on ajoute une solution normale de carbonate de sodium, on obtient une solution limpide.
Exemple 5 Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-aspariginyl-nitro-L-arginyl-L- valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L- leucine XI
Dans 4 cm3 de diméthylformamide, on dissout par chauffage 350 mg (0,036 m mol) du composé (IX), refroidit à la température ambiante et ajoute
EMI9.2
une solution de 110 mg (0,46 m mol) de 1-cyclohexyl-3- C 2-morpholinyl-(4)- 6thylj-carbodiimide dans 0,5 cm3 de diméthylformamide. On ajoute ensuite d'un coup 216 mg (0,41 m mol) d'ester méthylique de la L-propyl-L-phényla- lanyl-L-histidyl-L-leucine (X) (amorphe) et abandonne la solution pendant 24 heures à 30 .
On sépare ensuite par filtration une trace de matière non dissoute, élimine complètement le diméthylformamide par distillation sous un vide poussé, lave le résidu sec résine avec peu d'une solution norma- le de carbonate de sodium et ensuite avec peu d'eau, puis sèche. On conti- nue ensuite à laver la poudre sèche à trois reprises avec peu de méthanol.
Après séchage, on obtient sous la forme d'une poudre faiblement brunâtre 100 mg du composé (XI) qui fond à 185-195 (en suintant à partir de 160 environ); le rendement est de 19%.
Le produit est soluble dans le diméthylformamide, un peu soluble dans le méthanol et l'eau, soluble danslacide chlorhydrique normal.
<Desc/Clms Page number 10>
L'ester méthylique de la L-propyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L- leucine (X) utilisé comme matière de départ est préparé comme décrit ci- dessous.
Exemple 6 Ester méthylique de la L-asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-
EMI10.1
L-histidyl-L-poll-L-phénsylalanyl-L-histidyl-L-leucine (XII).
Dans 2 cm3 d'une solution méthanolique d'acide chlorhydrique décinormal, on dissout 60 mg du composé (XI) (0,041 m mol) et secoue la solution pendant 15 heures dans une atmosphère d'hydrogène, en présence de 50 mg de charbon au palladium - 10% de Pd), à la température ambiante et à la pression normale .On sépare ensuite le catalyseur par filtration, lave avec un peu de méthanol et évapore à sec. On ajoute au résidu, à plusieurs reprises,de petites quantités de méthanol et évapore à nouveau à sec. Après séchage sous un vide poussé, le résidu (résine) pèse 67 mg (calculé pour le tétrachlorhydrate du composé (XII) : 61 mg).
Le produit est facilement soluble dans le méthanol et l'eau. La solution aqueuse fournit avec le nitrate d'argent un précipité de chlorure d'argent; lorsqu'on ajoute une solution binormale de carbonate de sodium, il ne se forme pas de précipité.
Exemple 7
EMI10.2
L-.aspara inl-L-ar in 1-L-val 1-L-t os 1-L-val 1-L-histid 1-L-pro7, 1-L- phénylalanl-.L--histidyl-L-leucine (XIII).
Dans 0,25 cm3 d'eau, on dissout 52 mg -(-environ 0,035 m mol) de tétrachlorhydrate brut, amorphe, du composé XII de l'exemple 6 et ajoute 0,25 cm3 d'une solution normale d'hydroxyde de sodium (ce qui correspond à 7 équivalents). On abandonne la solution trouble pendant une heure et demie à la température ambiante ( à la fin le pH de la solution est de 10,5) et ajoute ensuite 0,25 cm3 d'une solution normale d'acide chlorhydri- que (pH de la solution égal à environ 3,5). Il se forme alors un précipité floconneux. On le sépare par centrifugation et lave le sédiment à deux re- prises avec 0,5 cm3 d'eau (centrifugeage). Après séchage, la matière pré- cipitée pèse 4 mg.
On réunit la solution aqueuse et l'eau de lavage ; ajoutant goutte à goutte une solution décinormale d'hydroxyde de sodium, on ajuste à un pH de 6,5 (volume final = 3,8 cm3).
On dilue une prise d'essai de la solution avec une quantité cen- iuple d'une solution physiologique de chlorure de sodium lorsqu'on injecte à des rats 0,1 cm3 de cette solution on observe un fort effet d'augmentation de la pression sanguine qui se maintient pendant environ deux fois plus de temps que l'augmentation de pression sanguine provoquée par l'.hypertensine.
La majeure partie de la solution est gelée dans un bain-de glace et de chlorure de sodium, puis elle est lyophilisée sous une pression de 0,1 mm de mercure. Le décapeptide obtenu comme résidu (31 mg ) est une poudre incolore qui se dissout facilement dans l'eau , mais qui toutefois à l'encontre de l'hypertensine , est assez difficilement soluble dans le méthanol.
On peut saponifier en groupe carboxylique le groupe (3-carbonamidi- que du reste asparaginyle à l'aide d'agents d'hydrolyse, comme par exemple l'acide chlorhydrique.
<Desc/Clms Page number 11>
Exemple 8 Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-valyl-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-
EMI11.1
L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-leucine.
Dans 10 cm3 de diméthylformamide, on met en suspension 1,95 g (0,003 mol) de carbobenzyloxy-Wvalyl-Wtyrosyl-L-valyl-L-histiàine, puis ajoute 1,58 d (0,03 mol) d'ester méthylique de la L-prolyl-L-phénylalanyl- L-histidyl-L-leucine et 0,84 g (0,0035 mol) de 1-cyclohexyl-3-morpholinyl- éthyl-carbodiimide. Au bout de 30 minutes, la matière de départ est complè- tement dissoute. On laisse reposer 1% solution réactionnelle pendant une nuit à la température ambiante, la débarrasse ensuite du diméthylformamide sous une pression de 0,1 mm de mercure, puis ajoute de l'eau glacée au résidu. On malaxe la matière solide formée avec de l'acide chlorhydrique binormal froid, ce qui fait qu'il se forme un chlorhydrate, huileux au dé- part, du produit réactionnel basique, qui se solidifie à nouveau lorsqu'on continue à malaxer.
Après avoir lavé à deux reprises avec de l'acide chlor- hydrique binormal, on transforme à nouveau la substance en la forme basique par traitement avec une solution diluée de carbonate de sodium, lave à plusieurs reprises à l'eau et sèche sous vide à la température ambiante.
L'ester méthylique brut de la carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-
EMI11.2
valyl-:G-histidyl-Ir-prolyl-Z-phenylalanyl-Ir-histidyl-L-leucine est dissous dans 20 cm3 d'éthanol, séparé par filtration d'un peu de matière insoluble et évaporé sous vide. En malaxant le résidu avec de l'acétate d'éthyle, il se forme un produit granuleux qui présente un point de fusion peu net de 160 . Le rendement est de 2,29 g (66),
Le traitement du chlorhydrate brut de l'ester méthylique du N- carbobenzyloxy-octapeptide peut aussi être effectué comme suit: On dissout dans 30 cm3 d'eau, sépare par centrifugeage un peu des composants non dis- sous et précipite par addition de 7,5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré à 0 , (concentration finale environ celle de l'acide chlorhydrique binormal).
Pour le transformer en le dérivé octapeptidique libre, on dissout à nouveau le chlorhydrate dans 30 cm3 d'eau et ajoute , à 0 , 3 cm3 d'une solution dé- canormal de carbonate de potassium. On sépare par filtration la matière solide formée, la lave à l'eau jusqu'à neutralité et la sèche sous vide à 35 , Par malaxage avec de l'acétate d'éthyle, il se forme une poudre amor- phe qui présente un point de fusion peu net de 160 . Le rendement est de 2,29 g.
L'ester méthylique brut de la carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L- valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-histidyl-L-leucine est purifié davantage par une répartition à contre-courant, dans le système méthanol (3), eau (1)/ chloroforme (1), tétrachlorure de carbone (2), la moitié environ de la subs- tance mise en jeu se retrouvant, après 48 stades de répartition, dans les éléments 25 à 43 (coefficient de répartition k = 2,16). En répartissant à nouveau cette matière dans le système méthanol (3), eau (1)/chloroforme (2), tétrachlorure de carbone (1) en 48 stades, on obtient une répartition pondérale de la substance dans les éléments 5 à 14 qui correspond à la cour- be théorique, avec une coefficient de répartition k = 0,23.
La matière amorphe purifiée (rendement 23%) fond après avoir été reprécipitée à deux reprises dans l'acétone à 170-173 ;[Ó] 24D = - 73 D 4 (c = 1,01 dans l'éthanol).
Analyse : C60H78O12N12 (1159,38) (séché pendant 5 heures à 80 ) calculé . C 62,16 H 6,78 N 14,50 OCH 3 2,67% trouvé ;C 60,45 H 6,83 N 14,24 OCH3 2,60%
<Desc/Clms Page number 12>
Exemple 9 Ester méthylique de la L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phé nylalanyl-L-histidyl-L-leucine. a) A une solution de 579 mg (0,0005 mol) d'ester méthylique de la carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phénylala- nyl-L-histidyl-L-leucine, on ajoute 1 cm3 d'une solution méthanolique d'aci- de chlorhydrique normal et hydrogène à 20 et sous la pression normale en présence de 0,2 g de charbon au palladium (10% de Pd), (le CO2 formé étant absorbé dans une solution d'hydroxyde de sodium), ce qui fait qu'au cours de 90 minutes,
un peu plus de la quantité calculée d'hydrogène se trouve ab- sorbée. On sépare ensuite le catalyseur par filtration et évapore le fil- trat. On lave à l'acétone le dichlorhydrate du produit réactionnel (0,51 g) que l'on obtient, le dissout ensuite dans peu d'eau, puis alcaline la solu- tion avec un excès d'une solution de carbonate de sodium, L'ester méthyli- que de la L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L- histidyl-L-leucine qui se sépare à l'état solide est lavé à l'eau et séché sous vide à 40 .
Le rendement est de 213 mg (41%). La substance est soluble dans l'éthanol, le chloroforme et beaucoup d'acétone, difficilement soluble dans l'acétate d'éthyle et l'acétonitrile. b) On obtient un meilleur rendement en procèdant comme suit : Une solution de 347 mg (0,3 m mol) d'ester méthylique de carbobenzyloxy-L- valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L- leucine dans 10 cm3 de méthanol absolu est hydrogénée, à 20 et sous pres- sion normale, en présence de 0,2 g de charbon au palladium (10% de palladium) (le CO2 formé étant absorbé dans une solution d'hydroxyde de sodium)., pour qu'au cours de 90 minutes un peu plus de la quantité calculée d'hydrogène se trouve absorbée. On évapore sous vide la solution réactionnelle filtrée et reprécipite le résidu solide dans un mélange de méthanol et d'éther.
L' ester méthylique de l'octapeptide (276 mg, 90%) que l'on obtient est solu- ble dans l'éthanol, difficilement soluble dans l'acétone, le chloroforme, l'acétonitrile ,et insoluble dans l'eau; on peut l'utiliser directement pour d'autres réactions. c) Le trbromhydroate peut être préparé de la façon suivante : Avec 0,1 cm3 d'acide acétique glacial, on malaxe 128 mg (0,11 m mol) d'ester
EMI12.1
méthylique de la carbobenzylo:xr-L-valyl-L-trosyl-L-valyl-L-histidvl -L- prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-leucine jusqu'à obtenir une huile unitai- re, puis ajoute 0,35 cm3 d'une solution 1,6-nôrmale (0,55 m mol) d'acide bromhydrique dans l'acide acétique glacial. Au bout de 10 minutes, le produit réactionnel, commence à se séparer de la solution limpide sous la forme d'une huile foncée.
On continue de secouer mécaniquement le mélange pendant deux heures et demie et l'évapore ensuite complètement à 35 sous une pression de 0,1 mm de mercure. Le résidu huileux devient solide lorsqu' on le malaxe avec de l'éther et il fournit après lavage à l'acétone chauffé 118 mg (85%) d'un tribromhydrate de l'ester méthylique de l'octapeptide sous la forme d'une poudre faiblement brunâtre qui fond de façon peu nette à 210 en se décomposant. Elle est facilement soluble dans l'eau, le métha- nol et l'éthanol.
EMI12.2
Analyse ; C52H 72010N12 3 Tmr (1268,02 ) calculé : Br 18,91% trouvé : 18,57%
L'ester méthylique libre de l'octapeptide ne peut être obtenu à partir de tribromhydrate qu'avec un mauvais rendement (41%), de sorte qu'on le prépare plus avantageusement suivant le procédé décrit sous b.
<Desc/Clms Page number 13>
Exemple 10
EMI13.1
Ester m6thylique de la i7-carbo*benzyloxy-L-asparagipyl-L-nitro-arginyl-L-va lyl-L-t3r?;osyl-L-valy.l-L-histidjjl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-leu- cine. a) Dans 0,3 cm3 de diméthylformamide, on dissout 70 mg (1,5 x 10-4 mol) de la carbobenzyloxy-L-asparaginyl-L-nitroarginine et 154 mg d'ester méthylique de la L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phénylala- nyl-L-histidyl-L-leuoine (1,5 x 10-4 mol), ajoute 48 mg (2 x 10 -4 mol )
EMI13.2
de 1-cyclohexyl-3-morpholinyléthyl-carbodiimide puis laisse reposer pendant 20 heures à la température ambiante. On élimine ensuite le solvant sous une pression de 0,1 mm de mercure, malaxe le résidu avec de l'eau glacée, filtre et lave à l'eau à plusieurs reprises.
On met le produit brut en suspension dans 1 cm3 d'eau, le transforme en le chlorhydrate soluble en acidifiant faiblement avec de l'acide chlorhydrique, filtre la solution avec de la mori- te, puis alcalinise le filtrat avec une solution saturée de carbonate de sodium. La matière solide formée est lavée à l'eau, séchée, malaxée dans de lacétone et lavée à plusieurs reprises avec le même solvant.
L'ester
EMI13.3
méthylique dela carbobenzyloxy-L-asparaginyl-L-nitroarginyl-L-valyl=L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolylL-phénylalanyl-L-histidyl-L-leucine que l'on obtient présente un point de fusion de 180 et est identique au dérivé décapeptidique décrit dans l'exemple 5. b) Dans 1,5 cm3 de diméthylformamide on dissout 234 mg (0,5 m
EMI13.4
mol) de carbo'benzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginine et 185 mg (0,18 m mol) d'ester méthylique de la L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl- L-phénylalanyl-L-histidyl-L-leucine, ajoute 119 mg (0,5 m mol) de 1-cyclohe- xyl-3-morpholinyléthyl-carbodiimide, puis laisse reposer pendant 20 heures à la température ambiante.
On élimine ensuite le solvant par distillation sous une pression de 0,1 mm de mercure, malaxe le résidu avec de l'eau gla- cée, sépare la matière solide par filtration, lave à l'eau à plusieurs repri- ses et sèche sous vide à 35 . Après avoir malaxé le produit brut à plusieurs reprises avec de l'acétone, on obtient, sous la forme d'une poudre jaunâtre 184 mg du dérivé décapeptidique,
Lorsqu'on le soumet à une répartition à contre-courant, le pro- duit obtenu s'avère être encore fortement non unitaire.
On peut, en procèdant à des répartitions successives dans les systèmes.:
EMI13.5
a) CH30H (3), H20 (1) CHC13 (2), cci4 (1) b) CH30H (3), H20 (1) /CHCI3 (2), CCI4 (2) c) CH30H (3), H20 (1) /CHCI3 (4), CCI4 (1) séparer largement les sous-produits, et une autre répartition du produit principal (environ 1/3 de h substance mise en jeu) dans le système a) en 36 stades fournit une répartition pondérale dans les éléments 14 à 30 qui correspond à peu près à la courbe théorique, avec un coefficient de réparti- tion k = 1,55.
EMI13.6
Après repréci:liîtatioli , dans peu d'éthanol, la substance amorphe fond de façon peu nette à 181-184 (en se décomposant à 187 ); [Ó] D = - -55 +4 (c = 0,65 dans une solution méthanolique d'acide chlorhydrique cen- tinormal).
Analyse : CE ON (1474,68) (séché pendant 5 heures à 80 ) calculé ;C 57,01 H 6,49 N 18,05 trouvé : C 56,14 H 6,49 N 17,64
<Desc/Clms Page number 14>
Exemple 11
Ester éthylique de la N-carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosine. a) à l'aide de carbodiimide.
A une solution de 50,2 g (0,2 mol) de carbobenzylcy-L-valine et de 41,8 g (0,2 mol) d'ester éthylique de L-tyrosine dans 400 cm3 d'acéto- nitrile, on ajoute 45,3 g (0,22 mol) de 1,3-dicyclohexyl-catrbodiimide puis laisse reposer pendant 5 heures à la température ambiante. Le mélange sépa- ré de la dicyclohexyl-urée et du produit rétionnel est séparé par filtra- tion et le dérivé dipeptidique est extrait de ce mélange à l'aide d'acétate d'éthyle. On évapore sous vide la solution réactionnelle initiale, dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle, lave cette solution avec de l'acide chlorhydrique binormal, avec une solution binormale de bicarbonate de so- dium et à 11-eau, la sèche et la réunit avec la solution d'acétate d'éthyle ci-dessus du produit réactionnel intialement séparé.
Le résidu obtenu par évaporation sous vide cristallise par addition d'éther et fournit 74,5 g (84%) d'ester éthylique de la carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosine d'un point de fusion de 142-145 . Par recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther, on obtient 68,6 g de matière pure fondant à 148-149 ; [Ó]24 = + +33 + 1 (c = 3,96 dans le chloroforme). b) en passant par l'ester p-nitrophénylique
Dans 25 cm3 de pyridine sèche, on dissout 20 g (0,08 mol) de carbobenzyloxy-L-valine et ajoute 26,6 g (0,082 mol) de sulfite de di-p- nitrophényle. On laisse la solution reposer pendant une nuit à 30 et la débarrasse ensuite du solvant sous vide.
On ajoute au résidu environ 50 g de glace et acidifie le mélange avec de l'acide chlorhydrique binormal (pH = 1); 10 minutes plus tard, on extrait avec 500 cm3 d-'éther, lave ensui- te la solution éthérée avec de l'acide chlorhydrique binormal, de l'eau gla- cée, une solution diluée d'hydroxyde de sodium refroidie à la glace et à nouveau à l'eau puis sèche et évapore. Après cristallisation dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole le résidu huileux (25 g) fournit 22,7 g (= 76%) d'ester p-nitrophénylique de carbobenzyloxy-L-valine d'un point de fusion de 63-640.
Dans 3 cm3 de tétrahydrofuranne, on dissout 1,12 g (0,003 mol) de cet ester et 0,63 g (0,003 mol) d'ester éthylique de L-tyrosine, puis lais- se la solution reposer pendant 48 heures à la température ambiante. Après avoir éliminé le solvant sous vide, on reprend le produit réactionnel dans l'acétate d'éthyle, lave la solution d'acétate d'éthyle avec ''. de l'acide chlorhydrique binormal, une solution saturée de bicarbonate de sodium et à l'eau, la sèche et l'évapore sous vide. Par addition d'éther, il se sépare
0,90 g (67%) d'ester éthylique solide de carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosine qui fond à 145-147 après recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther; [Ó]23 = +34 + 1 (c = 4,03) dans le chloroforme.
Exemple 12 Ester éthylique de la N-carbobenzyloxy-L-valyl-O-benzoyl-L-tyrosine.,
Dans 1 cm3 d'acétate d'éthyle, on disssout 373 mg (0,001 mol) de l'ester p-nitrophénylique de carbobenzyloxy-L-valine décrit dans le paragraphe b) de l'exemple 11, puis ajoute 1 cm3 d'une solution dans l'acé- tate d'éthyle de 0,0013 mol d'ester éthylique d'0-benzoyl-L-tyrosine (frai- chement préparé à partir du chlorhydrate). En laissant reposer la solution à la température ambiante, le produit réactionnel commence à se séparer à l'état de matière solide.
Au bout de 22 heures, on filtre (466 mg) puis,
<Desc/Clms Page number 15>
après avoir lavé le filtrat avec de l'acide chlorhydrique binormal, avec une solution binormale de bicarbonate de sodium et à l'eau, on l'évapore et obtient par addition d'éther 56 autres mg de substance; on obtient au total 522 mg (95%). Après avoir été recristallisé à deux reprises dans un mélange d'acétone et d'éther, l'ester éthylique de la N-carbobenzyloxy-Lvalyl-0-benzoyl-L-tyrosine fond à 173-175 ; [Ó] 23D = + 34 + 2 (c = 1,51 dans le chloroforme.
Exemple 13
EMI15.1
N- car'bob enzyl oxy-L-va lyl-L- tyr o s ine. a) à partir de l'ester éthylique de la N-carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrcsine.
Dans 300 cm3 de méthanol, on dissout 70,7 g (0,16 mol) d'ester éthylique de carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosine et tout en agitant, ajoute au cours de 15 minutes à 10 degrés environ 400 cm3 d'une solution normale d'hydroxyde de sodium. On laisse la solution réactionnelle limpide reposer pendant deux heures à la température ambiante, puis la débarrasse sous vide du méthanol et sépare par filtration un peu de matière solide.
En acidifiant
EMI15.2
le filtrat à l'aide d'acide chlorhydrique dilué, la carbobenzyloxy-L-valyl- L-tyrosine se sépare sous forme cristalline; on la sépare par filtration, la lave à l'eau etla sèche sous vide à 50 elle fond à 161-163 et présente un pouvoir rotatoire spécifique [Ó] 22 + 26 + 1 (c = 4,01 dans la pyridine.). le rendement est de 64,01 g (97%).
EMI15.3
b) à partir de l'ester éthylique de la ld-car'bobenzyloxy-L-valyl-0-benzoyl- L-tyrosine.
Dans 20 cm3 de méthanol chaud, on dissout 546 mg (0,001 mol) d'ester éthylique de la carbobenzyloxy-L-valyl-0-benzoyl-L-tyrosine et re- froidit rapidement la solution, puis ajoute aussitôt 4 cm3 d'une solution normale d'hydroxyde de sodium. Au bout de deux heures, on traite comme dé- crit ci-dessus, ce qui fait qu'on obtient 380 mg (97%) de matière cristalli- ne d'un point de fusion de 161-163 qui est identique à la carbobenzyloxy- L-valyl-L-tyrcsine décrite sous a).
Exemple 14
EMI15.4
a) Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-valyl-L-histidir¯e.
A une solution de 25,1 g (0,1 mol) de carbobenzyloxy-L-valine et de 16,7 g (0,1 mol) d'ester méthylique de L-histidine dans 100 cm3 d'acé- tonitrile, on ajoutera 10 environ,26,1 g (0,11 mol) de 1-cyclohexyl-3- morpholinyléthylcarbodiimide puis laisse reposer à la température ambiante.
Au bout d'une heure environ il commence à se séparer un produit gélatineux que l'on sépare par filtration au bout de 15 heures, et lave à l'acétonitrile'.
30,8 g (77%) d'un point de fusion de 152-1560. Après recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther, l'ester méthylique de la carbobenzy- loxy-L-valyl-L-histidine fond à 161-163 et présente un pouvoir rotatoire spécifique [Ó]23 = - 22 + 22 (c = 2,04 dans l'éthanol). b ) Ester méthylique de la L-valyl-L-histidine.
Dans 100 cm3 de méthanol, on dissout 10 g (0,025 mol) d'ester
EMI15.5
méthylique de la carbobenzylor-L-valyl-L-histzdine, y ajoute une solution méthanolique de 0,03 mol d'acide chlorhydrique gazeux et hydrogène, à la température ambiante et à la pression normale en présence de 2 g de char- bon au palladium (10 % de palladium) (le CO2 formé étant simultanément absorbé dans une solution d'hydroxyde de sodium). Après absorption de la quantité
<Desc/Clms Page number 16>
calculée d'hydrogène, l'hydrogénation s'arrête au bout d'une heure. On sépa- re le catalyseur par filtration et concentre la solution réactionnelle sous vide.
On dissout dans¯peu d'eau le chlorhydrate de la base obtenue sous forme huileuse (8,7 g) et après avoir recouvert la solution avec de 1' acétate d''éthyle, on alcalinise fortement avec une solution saturée de carbonate de potassium en secouant à 0 . La phase d'acétate d'éthyle ren- fermant des produits réactionnels est séchée et évaporée sous vide et l'on peut utiliser directement l'ester méthylique de L-valyl-L-histidine (6,5 g) que l'on obtient sous la forme d'un résidu huileux.
Exemple 15 Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valine. a) à l'aide de carbodiimide.
Tout en refroidissant, on ajoute à une solution de 53,8 g (0,13 mol) de N-carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyROSINE et de 17,0 g (0,13 mol) d'ester méthylique de la L¯valine (fraîchement préparé à partir du chlorhydrate), 30 g (0,15 mol) de N-N'-dicyclyohexyl-carbodiimide et laisse-.' reposer pen- dant 4 heures à la température ambiante. On sépare par filtration la matière solide formée qui est constituée par un mélange de dérivés tripeptidiques et de dicyclohexyl-urée, l'extrait au tétrahydrofuranne, sépare par filtra- tion le composé uréique non dissous, évapore le filtrat sous vide et ajou- te de l'éther au résidu, ce qui fait qu'on obtient 42,1 g d'une matière gélatineuse fondant à 117-179 .
On évapore également sous vide la solution réactionnelle initiale, reprend le résidu dans beaucoup d'acétate d'éthyle, puis lave la solution d'acétate d'éthyle avec de l'acide chlorhydrique binor- mal, avec une solution binormale de bicarbonate de sodium et à l'eau, la sèche et l'évaporé. Après avoir ajouté de l'éther au résidu, on peut isoler 13,3 g de la matière fondant à 170-172 . Le rendement total est de 55,4 g (81%). Après recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther on ob- tient 51,4 g (75%) d'ester méthylique de N-carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl- L-valine d'un point de fusion de 194-196 et d'un pouvoir rotatoire spécifi- que [Ó]D =- 24 + 1 (c =4,08 dans l'acide acétique glacial). b) à l'aide d'un ester activé.
Dans un mélange de 5 cm3 d'acétate d'éthyle et de 0,32 cm3 (0,004 mol) de pyridine, on dissout 0,83 g (0,002 mol) de N-carbobenzyloxy- L-valyl-L-tyrosine, ajoute 0,69 g (0,002 mol) de sulfite de di-p-nitrophé- nyle et chauffe pendant 8 heures à 50 . Par refroidissement , il se sépare une partie (0,14 g) du produit réactionnel, tandis que la majeure partie (0,50 g) est obtenue après lavage de la solution réactionnelle à l'acide chlorhydrique dilué, avec une solution saturée de bicarbonate de sodium et à l'eau, séchage, évaporation et cristallisation du résidu dans de 1' éther:
Le composé obtenu fond à 175-176 C. Le rendement est de 0,64 g (60%). Après recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther l'ester nitrophylique fond à 176-177 C et présente un pouvoir rotatoire spécifique [Ó] =-2 +1 (c =4,07 dans l'acétone) il est composé par un mé- lange d'ester de N-carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosine.
On laisse reposer pendant 48 heures à la température ambiante une solution de 535 mg (0,001 mol) de l'ester p-nitrophénylique du N-carbo- benzyloxy-dipeptide obtenu et de 131 mg (0,001 mol) d'ester méthylique de L-valine dans 2 cm3 de tétrahydrofuranne, puis la débarrasse ensuite sous vide du tétrahydrofuranne. Par addition d'acétate d'éthyle il cristallise 261 mg du produit réactionnel d'un point de fusion de 172-174 et après avoir traité la solution d'acétate d'éthyle comme sous a) on obtient par cristallisa-
<Desc/Clms Page number 17>
tion dans l'éther 170 mg (soit un total de 431 mg = 82%).
La substance qui, après recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther, présente un point de fusion de 173-175 est un mélange d'ester méthylique de N- carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valine et d'ester méthylique de N-carbo- benzyloxy-L-valyl-D-tyrosyl-L-valine. Le pouvoir rotatoire spécifique est seulement un peu moindre que pour le produit obtenu sous a).
Exemple 16 N- carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valine.
A une solution de 47,5 g (0,09 mol) d'ester méthylique de N-car- bobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valine, dans 350 cm3 de méthanol, on ajoute, à 10 environ en agitant, 250 cm3 d'une solution normale d'hydroxyde de so- dium et laisse reposer pendant deux heures à la température ambiante. On élimine ensuite le méthanol par distillation sous vide, filtre la solution aqueuse, légèrement trouble, refroidit à 0 et acidifie avec de l'acide chlorhydrique. C n sépare par filtration la matière solide formée, la lave à l'eau, la dissout à l'état humide dans un litre d'une solution demi-normale de bicarbonate de sodium, élimine par filtration environ 0,8 g de matière insoluble, précipite à nouveau par addition d'un excès d'acide chlorhydrique, puis lave à l'eau. La substance séchée fond à 218-220 .
Le rendement est de 37,1 g (= 80%). Par recristallisation dans un mélange d'éthanol et d'eau,, on obtient 32,1 g (= 70%) de N-carbobènzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valine pure d'un point de fusion de 222-2240; EU] 23D = - 26 + 1 (c = 4,16 dans l'éthanol).
Exemple 17 Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histi- dine. a) à partir des dérivés dipeptides à l'aide de carbodiimide :
A une solution de 9e94 g (0,024 mol) de carbobenzyloxy-L-valyl- L-tyrosine, dans 100 cm3 d'acêtonitrile, on ajoute 6,64 g (0,28 mol) de 1- cyclohexyl-3-morpholinyléthyl-carbodiimide et, ensuite, 6,5 g (0,024 mol) d'ester méthylique de L-valyl-L-histidine. Au bout de 15 heures, on sépare par filtration le produit réactionnel formé et le lave à l'acétonitrile. On dissout, dans 500 cm3 de méthanol chaud, le produit brut, (11,2 g = 70%) d'un point de fusion de 208-211 , concentre la solution à 100 cm3 et ajoute le même volume d'éther.
L'ester méthylique de la carbobenzyloxy-L-valyl-L- tyrosyl-L-valyl-L-histidine qui se sépare à l'état pur fond à 222-224 et présente un pouvoir rotatoire spécifique la] 24 27 2 (c = 2,00 dans l'acide acétique glaciâl). b) à partir de dérivés dipeptidiques en passant par l'ester active
Dans 4 cm3 de tétrahydrofuranne, on dissout 539 mg (0,001 mol ) de l'ester p-nitrophénylique du carbobenzyloxydipeptide décrit sous b) à l'exemple 16 et 270 mg d'ester méthylique de L-valyl-L-histidine. Lorsqu'on laisse reposer la solution, le produit réactionnel commence déjà à se sépa- rer au bout de trente minutes et on le sépare par filtration au bout de 24 heures. On obtient 462 mg ( = 70%) d'une substance d'un point de fusion de 208-211 .
Après recristallisation dans un mélange de méthanol et d'éther, le dérivé tétrapeptide possède un point de fusion un peu plus bas (219-221 ) que la matière décrite sous a) et également un pouvoir rotatoire spécifique un .peu diminué. Le point de fusion mixte des produits obtenus suivant a) et b) ne présente pas de diminution bien que, suivant b), on n'obtienne pas l'ester méthylique pur de la carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-his-
<Desc/Clms Page number 18>
tidine, mais en mélange avec l'ester méthylique de la carbobenzyloxy-L-va- lyl-D-tyrosyl-L-valyl-L-histidine. c) à partir du dérivé tripeptide à l'aide de carbodiimide :
A une solution de 28,22 g (0,055 mol) de N-carbobenzyloxy-L-va- lyl-L-tyrosyl-L-valine et 10,14g ( 0,06 mol) d'ester méthylique de L-histi- dine , dans 300 cm3 de tétrahydrofuranne, on ajoute , à 10 environ, une solution de 14,22 g (0,06 mol) de 1-cyclohexyl-3-morpholinyl-éthyl-carbodîimi- de dans 100 cm3 d'acétonitrile, puis laisse reposer le mélange pendant 15 heures à la température ambiante, ce qui fait que le produit réactionnel se sépare sous forme solide. On sépare ce dernier par filtration (16,0 g d'un point de fusion de 213-216 ) et, par concentration de la lessive-mère, on isole une autre fraction (6,35 g d'un point de fusion de 207-210 ).
La substance réunie (22,35 g = 61%) est recristallisée comme sous a), dans un mélange de méthanol et d'éther et fournit 18,5 g (=50%) d'un dérivé té- trapeptidique qui fond à 225-228 et présente un pouvoir rotatoire spéci- fique [Ó] 20D = - 28 + 2 (c = 2,02 dans l'acide acétique glacial).
Exemple 18
EMI18.1
a) lT-carbobenzyloxy-L-valyl-Wt r pl-L-val 1-L-hîstjdine.
A une suspension de 3,32 g (0,005 mol) d'ester méthylique de carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine, dans 30 cm3 de métha- nol, on ajoute, à 10 environ, 15 cm3 d'une solution normale d'hydroxyde de sodium, ce qui fait que la matière de départ passe rapidement en solu- tion. On laisse la solution réactionelle reposer pendant deux heures à la température ambiante, la débarrasse ensuite sous vide du méthanol et, après avoir séparé par filtration quelques flocons, acidifie avec 20 cm3 d'acide acétique binormal.
La matière gélatineuse séparée et centrifugée mise en suspension à plusieurs reprises dans de l'eau, est à nouveau centrifugé' puis finalement lavée à l'acétone et au méthanol et séchée sous vide à 40 La carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine est obtenue avec un rendement de 2,74 g (84%) et fond, après lavage au méthanol chaud, à 236-238 ; la] 23D = - 10 + 2 (c = 2,10 dans l'acide acétique glacial); elle est insoluble dans tous les solvants organiques usuels, à l'exception du diméthylformamide et de l'acide acétique glacial.
EMI18.2
b) Ester méthylique de la L-val 1-L-t ¯os 1-L-val 1-L-histidine.
On broie finement 3,32 g (0,005 mol) d'ester méthylique de la carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine, le met en suspension dans 100 cm3 de méthanol absolu et hydrogène en présence de 1,0 g de char- bon au palladium (10% Pd) ( en absorbant le CO2 formé dans une solution d'hydroxyde de sodium): Après absorption d'une quantité d'hydrogène un peu supérieure à la quantité calculée, l'hydrogénation s'arrête. La solution débarrassée du catalyseur par filtration, est évaporée sous vide, le résidu est malaxé avec de l'acétone et le résidu est séparé par filtration. L'es- ter méthylique de la L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine que l'on obtient ainsi (2,02 g = 76%) présente un point de fusion peu net de 190 et est suffisamment pur pour d'autres réactions.
Exemple 19
EMI18.3
N-carbobenzylo L-prolyl-L-phénylalanine. a) ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-prolyl-ls-'Phénylalamin'e en pas- sant par l'anhydride mixte.
A une solution 'de 1 g (0,004 mol) de lT-carb¯obenzyloxy-L-proiine cristallisée dans 15 cm=3 de tétrahydrofuranne absolu, on ajoute à-10 ,
<Desc/Clms Page number 19>
0,61 cm3 (0,0044 mol) de triéthylamine et au bout de cinq minutes à la même température 0,42 cm3 (0,0044 mol) de chloroformiate d'éthyle. Le chlor- hydrate de triéthylamine précipite aussitôt sous la forme d'un précipité cristallir blanchâtre.
La solution d'ester méthylique dela L-phénylalanine obtenue à partir de 1,1 g (0,0051 mol) de chlorhydrate de l'ester méthylique de phénylalanine et de 0,71 cm3 (0,0055 mol) de triéthylamine, qu'on prépare en même temps et sépare par filtration du chlorhydrate de triéthylamine, est également refroidie à -10 et ajoutée à la solution d'anhydride mixte.
Après avoir laissé reposer pendant deux heures à la température ambiante, on sépare le précipité par filtration et évapore le solvant sous vide 9.40- 45 . On reprend dans de l'acétate d'éthyle le résidu, limpide comme de l'eau, le lave à quatre reprises avec chaque fois 5 cm3 d'une solution normale d' acide chlorhydrique, à deux reprises avec de l'eau, à quatre reprises avec chaque fois 2 cm3 d'une solution binormale de bicarbonate de sodium et finalement à l'eau jusqu'à neutralité. La solution d'acétate d'éthyle abandonne par évaporation et séchage 1,8 g d'une huile jaunâtre renfermant encore un peu de solvant.
L'ester méthylique brut de la carbobenzyloxy-L- prolyl-L-phényl-alanine est aussitôt saponifié en la N-carbobenzyloxy-L- prolyl-L-phénylalanine. b) Saponification en N-carbobenzyloxy-L-proline-L-phénylalanine.
On laisse reposer pendant une heure et quart à la température am- biante dans 5 cm3 de méthanol, 1,8 g (environ 0,004 mol) d'ester méthylique
EMI19.1
brut de la aarbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanine avec 4,4 cm3 d'une solu- tion normale d'hydroxyde de sodium, ajoute ensuite 25 cm3 d'eau et extrait la solution al.caline aqueuse à deux reprises avec de l'acétate d'éthyle frais. En acidifiant avec de l'acide chlorhydrique normal jusqu'à avoir une réaction acide au congo, la carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanine se sépare sous la forme d'une huile visqueuse incolore. On extrait l'huile et la phase aqueuse à trois reprises avec de l'acétate d'éthyle frais dans trois entonnoirs séparateurs, lave les solutions d'acétate d'éthyle avec de l'eau jusqu'à neutralité, sèche sur du sulfate de sodium et évapore sous pression réduite.
Il reste 1,4 g d'une écume incolore. Dissoute dans 2 cm3 d'acétone et additionnée de 10 cm3 d'éther cette écume fournit, lorsqu'on a ajouté par portions de l'éther de pétrole, à 0 , 1,3 g (82%) de carbobenzy- loxy-L-proline-L-phénylalanine cristalline d'un point de fusion de 121-1230 et d'un pouvoir rotatoire spécifique [Ó[23 = - 49 (c = 1,215 dans le chlo- roforme). c) N-carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanine en passant par l'ester activé.
1. Ester p-nitrophénylique de la N-carbobenzyloxy-L-proline. Dans 8 cm3 de pyridine absolue on laisse reposer pendant 23 heures à la tempéra- ture ambiante 5 g (0,02 mol) de N-carbobenzyloxy-L-proline et 6,5 g (0,02
EMI19.2
mol) de sulfite de di:-p- 1i trophényle, essore ensuite la pyridine sous vide et ajoute au résidu de l'évaporation de la glace et de l'acide chlorhydrique binormal jusqu'à avoir un pH égal à 1.'L'huile formée se solidifie après un repos d'une heure dans le bac à glace pour donner un produit amorphe.
On le filtre et le lave avec beaucoup d'eau et d'éther. Après séchage lé pro- duit amorphe pèse 2,9 g.
La lessive-mère éthérée est secouée en refroidissant complètement à la glace dans une chambre froide à deux reprises avec une solution binom- male d'acide chlorhydrique, à deux reprises avec de l'eau, énsuite alterna- tivement à quatre reprises avec une solution normale d'hydroxyde de sodium et de l'eau, puis elle est finalement lavée à l'eau jusqu'à neutralité En évaporant la solution sèche, on obtient 3,5 g de cristaux jaunâtres.
<Desc/Clms Page number 20>
Après avoir recristallisé une fois les deux fractions dans beaucoup d'éther, on obtient, avec un rendement de 80%, 5,9 g d'ester p-nitrophénylique de N- carbobenzyloxy-L-proline d'un point de fusion de 94-950.
2. Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylala- nine. Dans 20 cm3 d'acétate d'éthyle, on met en suspension 1 g (0,0046 mol) de chlorhydrate de l'ester méthylique de la L-phénylalanine, on ajoute 0,7 cm3 (0,005 mol) de triéthylamine et tout en secouant assez souvent lais- se reposer pendant 15 minutes à la température ambiante. On ajoute au tout 1,72 g (0,0046 mol) d'ester p-nitrophénylique de carbobenzyloxy-L-proline dans 5 cm3 d'acétate d'éthyle et laisse le tout réagir pendant 72 heures à 20 . On traite la solution réactionnelle à trois reprises avec de l'acide chlorhydrique binormal, à deux reprises avec de l'eau, à quatre reprises al- ternativement avec une solution binormale d'hydroxyde de sodium et avec de l'eau puis, finalement, la lave jusqu'à neutralité.
On obtient 1,9 g d'es- ter carbobenzyloxy dipeptidique renfermant encore un peu de solvant. On utilise ce produit directement pour le traitement ultérieur.
3. Saponification.
La saponification avec une solution normale d'hydroxyde de sodium dans le méthanol suivant b) fournit 1 g (63%) de N-carbobenzyloxy-L-prolyl-L- phénylalanine cristalline d'un point ce fusion de 121-124 et d'un pouvoir rotatoire spécifique de [Ó] D = -31 dans le chloroforme.
Exemple 20 Ester p-nitrophénylique de la N-carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanine.
Dans 16 cm3 de pyridine absolue, on dissout à chaud 10 g (0,025 mol) de carbobnzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanine.
On refroidit à nouveau la solution à la température ambiante et y ajoute 8,14 g (0,025 mol) de sulfite de di-p-nitrophényle. Après avoir laissé repo- ser pendant une heure la totalité du contenu du ballon est solidifiée. On ajoute encore au tout 10 cm3 de pyridine et abandonne le mélange réactionnel pendant 5 heures au total. On essore la pyridine, en majeure partie sous vi- de et ajoute au résidu cristallin beaucoup d'éther. On essore les cristaux (9 g d'un point de fusion de 146-147 ) et les lave avec beaucoup d'éther.
La lessive-mère concentrée est lavée avec de l'acide chlorhydrique dilué, avec du bicarbonate de sodium et avec de l'eau. Après évaporation de l'éther sécher il reste 1,7 g d'ester p-nitrophénylique cristallin de la N-carboben- zyloxy-L-prolyl-L-phénylalanine qui, après avoir été recristallisé à trois reprises dans l'acétate d'éthyle,présente un point de fusion de 155 . Le rendement total est de 10,2 g (79%).
Exemple 21 a) Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histi- dine.
Lorsqu'on les fait réagir sur deux équivalents de méthylate de sodium dans du méthanol , 3 g (0,0124 mol) de dichlorhydràte de l'ester mé- thylique de la L-histidine fournissent 2,5 g d'ester méthylique brut de la L-histidine . On dissout cet ester dans 5 cm3 de tétrahydrofuranne absolu et laisse reposer pendant 64 heures à la température ambiante avec une solu- tion de 4 g (0,078 mol) d'ester p-nitrophénylique de N-carbobenzyloxy-L- prolyl-L-phénylalanine dans 25 cm3 de tétrahydrofuranne absolu. Au bout de 40 minutes l'ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylala- nyl-Z-histidine commence à se séparer. On obtient ainsi 2,5 g d'ester cris- tallin du carbobenzyloxy-tripeptidique.
On évapore la lessive-mère sous vide
<Desc/Clms Page number 21>
jusqu'à dessication, reprend le résidu d'évaporation huileux dans de l'acé- tate d'éthyle et l'extrait à six reprises avec chaque fois 3 cm3 d'acide chlorhydrique pentanormal.On amène la solution chlorhydrique à un pH de 8 à 9 à l'aide de carbonate de potassium solide, et extrait l'huile formée à trois reprises avec de l'acétate d'éthyle frais. llprès évaporation de la solution d'acétate d'éthyle préalablement lavée à neutralité et séchée sur du sulfate de sodium, il reste 1,55 g d'ester méthylique huileux du car- bobenzyloxy-tripeptidique qui est suffisamment pur pour ¯. le traitement ul- térieur.
Le rendement total est de 4,05 g (92%).
EMI21.1
b) 2:-carbobenzyloxyL-prolyl-L-phénylalanylL-histidine.
Dans 5 cm3 de méthanol, on saponifie pendant une heure à 20 avec 2,9 cm3 d'une solution normale d'hydroxyde de sodium 1,6 g (0,0029 mol) d'ester méthylique de carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidine brut. On essore ensuite partiellement le méthanol à la température ambiante et ajoute au résidu 5 cm3 d'eau. Pour éliminer les produits non saponifiés, on lave la solution aqueuse à deux reprises à l'acétate d'éthyle et les pha- ses obtenues à l'acétate d'éthyle à deux reprises avec 3 cm3 d'eau. En aci- difiant les phases aqueuses réunies avec 2,9 cm3 d'acide chlorhydrique nor-
EMI21.2
mal, la carbolenzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-hzstidine se sépare sous la forme d'une huile jaunâtre.
Cette dernière est insoluble dans l'acétate d'éthyle et est en conséquence extraite à trois reprises avec du chloroforme frais. Apres avoir lavé la solution chloroformique à neutralité et l'avoir séchée., on l'évapore à un petit volume et précipite le carbobenzyloxytripeptide avec beaucoup d'acétate d'éthyle. Le rendement est de 1,2 g (78%) . Une seconde précipitation dans un mélange de chloroforme et d'acétate d'éthyle fournit un produit d'un point de fusion de 128-135 qui est très hygroscopique et est aussitôt soumis à d'autres traitements.
Exemple 22
EMI21.3
Ester méthylique de la N-carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histiàyl- L-leucine. a) A partir des dérivés dipeptidiques à l'aide de carbodiimide.
1. Ester méthylique de la L-histidyl-L-leucine. Dans 30 cm3 de méthanol absolu et 2 équivalents d'acide chlorhydrique, on hydrogène, en présence de 600 mg de palladium à 10% sur du charbon jusqu'à ce que l'hydrogénation s'arrête ,2 g (0,0048 mol) d'ester méthylique de carbobenzyloxy-L-histidyl- L-leucine (préparée suivant R.w.Holley et E. Sondheimer; "J. Am. Chem.
Soc." 76,1326 (1954). Au bout de 70 minutes, 121 cm3 'd'hydrogène sont absorbée (en théorie 120 cm3), La solution débarrassée du catalyseur est évaporée à 40 sous vide jusqu'à dessiccation. On dissout le résidu dans 2 cm3 d'eau, recouvre avec 10 cm3 d'acétate d'éthyle et ajoute, à 0 , 5 cm3 d'une solution à 50% de " bicarbonate de potassium refroidie à la glace.
Après avoir séché la solution avec du MgSO4, on l'évapore et obtient sous la forme d'une huile 1,1 g (82%) d'ester méthylique de la L-histidyl-L-leu- cine.
2. Répartition de la carboberzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanine sur l'ester mé- thylique de la L-histidyl-L-leucine. On réunit une solution fralchement préparée de 1,1 g (0,0039 mol) d'ester méthylique de la L-histidyl-L-leuci- ne dans 5 cm3 d'acétonitrile absolu avec une solution de 1,54 g (0,0039 mol) de N-carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanine dans 10 cm3 d'acétonitrile absolu, puis ajoute au tout 890 mg (0,0044 mol) de dicyclohexylcarbodiimide.
Après avoir laissé reposer pendant 5 heures à la température ambiante,on ajoute à la solution réactionnelle 0,2 cm3 d'acide acétique glacial et au bout de 15 minutes, sépare par filtration l'urée formée. On évapore l'acéto-
<Desc/Clms Page number 22>
nitrile à 40 sous vide et dissout le résidu dans le l'acétate d'éthyle.
On extrait les solutions d'acétate d'éthyle à 4 reprises avec chaque fois 3 cm3 d'acide chlorhydrique normal et ensuite à six reprises avec chaque fois 5 cm3 d'acide chlorhydrique pentanormal. En alcalinisant les cinq extrait obtenus à l'acide chlorhydrique pentanormal à l'aide de carbonate de potassium solide séché à 0 et en extrayant à l'acétate d'éthyle, on obtient en évaporant les solutions à l'acétate d'éthyle préalablement séché sur du sulfate de sodium, 1,6 g (63%) d'ester méthylique amorphe de la carbobenzy-
EMI22.1
loxy-L-prolYk-LiiliéYlalany12-histidyl-L-leUCie qui présente un pouvoir ro- tatoire spécifique [Ó]D= 60 + 4 (c = 1,04 dans le méthanol). b) A partir de dérivés dipeptidiques en passant par les esters activés.
A 1,21 g (0,0043 mol) d'ester méthylique de la L-histidyl-L- leucine (obtenu à partir de 2,16 g d'ester méthylique de la carbobenzyloxy- L-histidyl-L-leucine) dans 5 cm3 de tétrahydrofuranne absolu, on ajoute une solution de 2,06 g (0,004 mol) d'ester p-nitrophénylique de carbobenzyloxy- L-prolyl-L-phénylalanine dans 15 cm3 de tétrahydrofuranne absolu puis laisse réagir pendant 42 heures à 20 . On évapore le tétrahydrofuranne sous vide.
On extrait le résidu dans l'acétate d'éthyle à trois reprises avec chaque fois 5 cm3 d'acide chlorhydrique normal et à huit reprises avec chaque fois 3 cm3 d'acide chlorhydrique pentanormal. En alcalinisant les extraits obtenus avec l'acide chlorhydrique pentanormal à l'aide de carbonate de po- tassium solide à 0 et en extrayant l'huile formée à l'acétate d'éthyle, on obtient, après une précipitation dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, 1,65 g (62%) d'ester méthylique amorphe de carbobenzylo---
EMI22.2
xy-h-pralyl--Z-phénylalanyl-Z-hi3idy1-h-leucine qui présente un pouvoir rotatoire spécifique de [Ó] 23D= 53 + 4 (c = 1,07 dans le méthanol). c)A partir du dérivé tripeptidique à l'aide de carbodiimide.
Après
EMI22.3
avoir réuni une solution de 2 g (0,0037 mol) de ïT-carbobenzyloxy-h-prolyl- L-phénylalanyl-L-histidine dans 15 cm3 de chlorure de méthylène absolu et une solution de 650 mg (0,0045 mol) d'ester méthylique de L-leucine dans 4 cm3 de chlorure de méthylène absolu, on y ajoute 860 mg (0,0041 mol) de dicyclohexylcarbodiimide et laisse réagir pendant 5 heures à la température ambiante. Le traitement comme décrit sous a) fournit 1,7 g (66%) d'ester
EMI22.4
méthylique amorphe de la N-carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidylL-leueine d'un pouvoir rotatoire spécifique de a D2 ¯ - 53 + 4 (c = 0,830 dans le méthanol).
Exemple 23
EMI22.5
Ester méthylique de la L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-leueine. - a) par scission hydrogénante; Dans 30 cm3 de méthanol on dissout 1,98 g (0,003 mol) d'ester méthylique de carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phényla- lanyl-L-histidyl-L-leucine, ajoute une solution méthanolique de 0,006 mol de gaz chlorhydrique et hydrogène à la température ambiante et sous la pression normale en présence de 0,5 de charbon au palladium (10% de PD), (en utilisant un second récipient d'hydrogénation rempli d'une solution diluée d'hydroxyde de sodium pour absorber le dioxyde de carbone formé).
Après absorption au cours de 3 heures d'une quantité d'hydrogène un peu supérieure à la quantité calculée, on sépare par filtration la solution réactionnelle neutre du catalyseur et évapore sous vide. On dissout dans 5 cm3 d'eau le dichlorhydrate de la base obtenue sous la forme d'une masse solide (1,88 g), extrait un peu de matière insoluble avec l'acétate d'éthy- le,aloalinise la solution aqueuse limpide à 0 avec un excès d'¯une solution saturée de carbonate de sodium. On reprend l'huile formée dans de l'acétate
<Desc/Clms Page number 23>
d'éthyle, lave la solution à l'acétate d'éthyle à l'eau, sèche et évapore.
L'ester méthylique de L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-leucine que l'on obtient ainsi (1,13 g - 74%) est suffisamment pur pour d'autres réactions. b) Par scission avec de l'acide bromhydrique dans de l'acide acé- tique glacial On triture finement 1,98 g (0,003 mol) d'ester méthylique
EMI23.1
de carbobenzylaxy-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-Ieucine avec 1,5 cm3 d'acide acétique glacial et ajoute 6,3 cm3 d'une solution 1,6 normale (0,01 mol) d'acide bromhydrique dans de l'acide acétique glacial. La matiè- re de départ est complètement dissoute au bout de 30 minutes, on laisse la solution réactionnelle reposer à la température ambiante jusqu'à ce que le dégagement de gaz carbonique ait cessé (5 heures) et l'évapore ensuite complètement sous vide.
Par malaxage avec de l'éther solide le résidu hui- leux fournit après lavage à l'acétate d'éthyle et'à l'éther, sous la forme d'une poudre hygroscopique, 2,07 g (calculé 2,06 g) de dibromhydrate de l'ester méthylique du tétrapeptide. L'ester libre est obtenu de la manière décrite sous a); rendement 1,43 g (90%) huile difficilement soluble dans l'eau, facilement soluble dans l'acide chlorhydrique binormal, l'acétone èt le chloroforme.
REVENDICATIONS
I. Un procédé de préparation d'un nouveau polypeptide et de ses dérivés, caractérisé par le fait qu'on réunit les restes d'une L-asparagine comportant un groupe aminagène protégé, d'une L-arginine comportant un grou- pe amidinogène protégé, de la L-valine, d'une L-tyrosine comportant un hydro- xyle libre ou substitué, de la L-valine, de la L-histidine, de la L-proline de la L-phénylalanine, de la L-histidine, et d'un ester de la L-leucine, à la manière d'un amide, avec formation d'un décapeptide, avec l'ordre mention- né des restes aminocarboxyliques indiqués, qu'on met en liberté, dans le polypeptide ainsi obtenu, le groupe carboxylique estérifié du reste de la leucine, les groupes aminogènes protégés du reste de l'asparagine et du reste de l'arginine et, le cas échéant,
un hydroxyle substitué du reste de la tyrosine et, si on le désire, qu'on transforme le groupe carbonylamidi- que du reste asparaginique en un groupe carboxylique libre.
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants :
1) On acyle de la nitro-L-arginine avec une L-asparagine présentant un groupe aminogène protégé, et utilise la L-asparaginyl-nitro-L-arginine ainsi obtenue pour édifier un polypeptide suivant I.
2) On condense une L-asparaginyl-nitro-L-arginine avec un ester de la L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phénylalanyl-L-his- tidyl-L-leucine.
3) On condense une L-asparaginyl-nitro-L-arginine avec de la L- valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine pour obtenir une L-asparaginyl-nitro-L- arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidine, et fait réagir cette dernière sur un ester de la L-prolyl-L-phénylalanyl-L-histidyl-L-leucine pour obtenir un décapeptide.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.