La présente invention concerne un procédé de fermen- tation aérobique et est particulièrement utile dans la pousse ou croissance de levures et moisissures, la fabrication, d'antibio- tiques, de stéroïdes et autres produits similaires.
Dans la pratique actuelle des procédés de fermentation, le problème de stériliser l'appareil et la matière devant être utilisés dans le procédé de fermentation est important; en raison des difficultés rencontrées, on constate des variations considérables dans la production ou les rendements à partir de masses différentes de produits de départ. De plus, les procé- dés ne conduisent pas d'eux-mêmes à la fourniture d'oxygène à une vitesse et dans une mesure optima aux micro-organismes, par conséquent suivant la demande des organismes pour leur croissance
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optimum.
L'invention vise à créer un procédé efficace pour effec- tuer la stérilisation des matières premières dans un procédé de fermentation, tout en utilisant eu même temps le dispositif de stérilisation comme nouvelle aide dans la production d'oxygène aux matières utilisées dans l'opération de fermentation, Selon le procédé de l'invention, de l'oxygène sous forme de fines bulles est rendu disponible pour pouvoir être mieux assimilé ou utilisé dans la pousse de levure ou autre inoculum. L'invention crée un ' procédé efficace, dans lequel de l'oxygène est fourni sous une forme désirée, dans une mesure et à une vitesse appropriées au mieux à assurer la pousse des organismes et à satisfaire à la demande croissante d'oxygène de la part des organismes en cours de croissance.
Dans ce procédé, la vitesse de pousse ou crois- sance est contrôlée efficacement par la fourniture d'un milieu nutritif contenant un agent de stérilisation qui est utilisé à son tour pour distribuer de l'oxygène au cours du traitement, tout en fournissant aussi un moyen efficace pour distribuer de l'oxygène indépendamment du milieu nutritif aux matières subissant la fermentation pour satisfaire à leurs demandes croissantes.
Le procédé utilise une nouvelle combinaison d'opérations par laquelle une levure ou moisissure contenant une plus grande pro- portion d'azote et affectant la forme d'acide nucléique est obtenue. Le procédé assure la préparation d'un gâteau, de levure ou moisissure qui est complètement exempt d'organismes conta- minants, ce gâteau constituant un produit qu'il n'était pas possible d'obtenir avec les procédés antérieurs de fabrication de levure ou moisissure.
Diverses autres caractéristiques buts et avantages de l'invention ressortent d'ailleurs de la description détaillée qui suit.'
Dans une phase de l'invention, on traite un milieu nutritif avec de l'eau oxygénée pour stériliser ce milieu et on ajoute ensuite de la catalase à la matière stérilisée, l'inoculum
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étant ajouté au mélange. Au fur et à mesure que les micro- organismes se développent et croissent, on continue à ajouter de l'eau oxygénée dont la décomposition est catalysée par la catalase pour la production d'oxygène. L'oxygène fourni affecte la forme de fines bulles qui donnent l00% d'oxygène aux inter- faces des organismes, de façon à augmenter la vitesse d'utili- sation de l'oxygène par ces derniers.
Le procédé est exécuté dans l'appareil usuel formant un système ouvert ou fermé, un évent étant prévu dans le système fermé pour l'échappement de gaz et des tubes distributeurs étant prévus pour fournir l'eau oxygénée et amener le milieu nutritif dans les matières subissant la fermentation. Il n'est pas essenti el que de l'air en petites quantités soit exclu. Un tel appareil est classique et il est inutile de le décrire davantage.
Il est évident que le procédé de fermentation est exé- cuté sous la température et les conditions de pH appropriées à la croissance de l'organisme. Par exemple, dans la production de levure ou moisissure (saccharomyces ou torula), on a trouvé qu'une tmeprér sure désirable est 30 C et qu'un pH désirable est 7,0. Ceci contraste avec le pH de traitement normal qui est dans la gamme acide de 4,5 à 5,5. Etant donné que les températures et les conditions de pH favorables pour la pousse des divers micro-organismes varient selon l'organisme, ces conditions étant bien connues, il est inutile de les décrire davantage.
Après que la fermentation est sensiblement;complète, le produit peut être récolté comme dans le procédé usuel.
Dans le procédé indiqué dans ce qui précède pour illustrer l'invention, on constate que de l'eau oxygénée peut être ajoutée en une quantité de 0,2% à 1% pour produire la sté- rilisation du milieu nutritif. Ordinairement, la période d'une heure ou deux sera suffisante pour effectuer la stérilisation de la matière. L'eau oxygénée est particulièrement efficace dans des organismes inaotivants, tels que bactéries, et on constate cornue résultat de l'utilisation complète assurée dans la matière
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que l'on. peut obtenir des rendements et résultats uniformes.
Pour la stérilisation initiale, on constate que l'addition d'environ 0,2% d'eau oxygénée est suffisante pour la stérilisation efficace de la matière nutritive.
Après la stérilisation, de la catalase est additionnée de préférence en une quantité permettant de catalyser la décom- position efficace de l'eau oxygénée, y compris celle ajoutée sub- séquemment au cours du développement du procédé. Toute catalase convenable comprenant de la catalase végétale ou animale peut être utilisée. On préfère employer de la catalase de foie. Après l'addition dé'la catalase, la levure ou autre inoculum est ajouté sous la forme d'une suspension aqueuse au milieu et à la catalase.
Ensuite, on préfère ajouter de l'eau oxygénée à une vitesse croissante d'admission pour satisfaire aux demandes, pour la croissance, d'oxygéne de la levure, moisissure ou autre matière subissant la fermentation. La vitesse croissante d'admission d'eau oxygénée est facilement assurée par la manipulation d'un robinet placé dans la canalisation de distribution de cette eau oxygénée.
Dans les systémes dans lesquels de l'air stérile est disponible, on peut utiliser une combinaison d'air, de catalase et d'eau oxygénée, dont chacun peut individuellement être la source d'oxygène. 'Par exemple, la catalase et l'eau oxygénée peuvent être utilisées pour la stérilisation, de l'air stérile et/ou de, la catalase et de l'eau, oxygénée étant ensuite utilisés comme source d'oxygène. Il est possible d'utiliser de l'air stérile indépendamment comme source d'oxygène à la suite de la stérilisation à la catalase et à l'eau oxygénée.
On a trouvé que le milieu nutritif qui est traité avec de l'eau oxygénée pour le stériliser peut être distribué encontinu et suivant une progression aux matières subissant la fermentation, l'eau oxygénée servant au double but de stériliser le milieu Qui arrive et aussi de fournir de l'oxygène pour la pousse des micro-organismes.
A titre d'exemple, lorsque de .La levureest l'inoculum,
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on constate que l'on obtient des rendements importants quand on utilise une quantité minimum d'eau oxygénée par litre et par heure, cette quantité étant d'environ 0,33 g. Des résultats très avantageux ont été obtenus lorsque l'eau oxygénée par litre et par heure est en une quantité de 0,66 g.
La mesure de catalase utilisée doit être suffisante pour décomposer l'eau oxygénée ajoutée au cours du traitement.
Ordinairement, on trouve que 100 unités Keil de catalase par litre sont suffisantes. Il est naturellement indésirable au point de vue économique d'avoir un grand excès de catalase, mais il est désirable d'avoir suffisamment de catalase pour empêcher l'accumulation d'eau oxygénée et pour fournir les quantités d'oxygène pur nécessaires dans le traitement.
Dans le traitement qui précède, on constate que l'utilisation d'eau oxygénée au commencement du traitement est de grande importance en ce que la stérilisation très efficace donne un produit uniforme et un grand rendement. En outre, l'eau oxygénée sert non seulement à la stérilisation, mais elle est aussi efficace pour dégager l'oxygène dans l'appareil. De plus, on constate que l'on obtient de grands rendements en augmentant la vitesse d'admission d'eau, oxygénée à peu près proportionnelle- . ment à la croissance progressive des organismes. Dans la pratique antérieure, il était courant d'ajouter de l'air à vitesse cons- tante en perdant ainsi de vue le besoin croissant de la matière de recevoir davantage d'oxygène au fur et à mesure que la fermen- tation se développait.
Dans le présent procédé, il n'est jamais nécessaire d'assurer un excès d'oxygène, mais celui-ci est fourni conformément aux demandes croissantes des organismes, cette aug- mentation d'oxygène étant efficacement réglée en manoeuvrant le robinet placé dans la canalisation de distribution de l'eau oxygénée.
Dans l'exemple dans lequel de 1.a levure est traitée, le produit résultant est obtenu non seulement en rendements de 35 à 50 lois plus, mais le gâteau de levare rais produit contient
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@ une plus grande proportion d'azote sous la forme de purines plutôt que comme protéine. Une levure ayant une teneur acide nucléique supérieure est particulièrement désirée pour la boulan- gerie et les produits dérivés de la levure.
Le procédé peut être utilisé pour le traitement de fermentation de nombreux produits, y compris la levure, de vitamines, telles que la vitamine B12, de riboflavine, d'acide citrique, etc., d'antibiotiques, tels que pénicilline, strepto- mycine, auréomycine, terramycine, bacitracine et produits similaires. Le procédé peut en outre être appliqué dans l'oxy- génation de stéroldes pour la production d'autres stéroides, etc.
Dans tous les traitements de fermentation, on constate que la stérilisation initiale, au cours de laquelle l'eau oxygénée est utilisée, est extrêmement efficace pour obtenir des résultats uniformes avec un grand rendement, tandis qu'en même temps l'eau oxygénée en-excès est utilisée pour fournir l'oxygène nécessaire à la pousse des micro-organismes.
Des exemples particuliers du procédé peuvent être exposés comme suit :
Exemple 1
Le milieu nutritif ou bouillie de propagation était composé cornue suit :
150 g. mélasses
1 g. CaHPO4
1 g. (NH4)2HPO4
2 g. Urée
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Na2S04 2 ô. Tda2S04 eau de conduite pour compléter à un litre.
La catalase utilisée était la catalase Armour A-100 (100 unités Keil par ml). La levure était la saccharomyces cerevisiae.
Le pH fut réglé à 7,0 avant la stérilisation. La stérilisation du récipient fermé et des produits contenus fut
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effectuée par l'introduction de H2o2 à 30% en quantité suffisante pour établir une concentration finale en H2O2 de'1 %. On laissa reposer la bouillie à la température ambiante pendant environ 2 heures pour effectuer une stérilisation complète. On ajouta ensuite 100 unités Keil de catalase au litre de matière. Une suspension aqueuse de 3 g de gâteau de levure (levure ordinaire de boulangerie) fut ensuite ajoutée et, après cela, on additionna de l'eau oxygénée prélevée sur un réservoir contenant de l'eau oxygénée à 5 %.
Le milieu fut maintenu dans un bain à tempéra- ture constante, en agitant, à 30 C. L'eau oxygénée fut ajoutée tout d'abord à une faible vitesse initiale en augmentant progres- sivement la quantité en 12 heures jusqu'à 50 ml par litre à l'heure.
La fermentation fut exécutée pendant 24 heures, la gamme de températures étant entr 26 et 34 C et l'accroissement de la levure étant de 3500 %. On récupéra 15% de la catalase après récolte du produit.'
Le gâteau de levure, tel que récolté, était exempt d'organismes contaminants. contrairement à l'inoculum de levure, qui était contaminé avec des nombres relativement grands de strep- tocoques, de lactobacilïes et autres organismes.
Exemple 2 ]Le procédé fut appliqué comme décrit à l'exemple 1, sauf que l'inoculum de levure était le torula utilis. La quantité initiale d'eau oxygénée utilisée dans le traitement de stérilisa- tion était de 0,2% et, après l'addition de l'inoculum, la vitesse d'admission de l'eau oxygénée fut augmentée en 12 heures jusqu'à 50 ml par litre à l'heure. Des résultats comparables à ceux décrits à l'exemple 1. furent obtenus.
Exemple 3
Le procédé iut exécuté comme décrit à l'exemple 1, sauf
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que l'on. utilisa l'inoculum saccharomyces.lactis NRRL Yl205 et la source de carbohydrate était du petit lait. La stérilisa- tion du récipient et des produits contenus fut effectuée en chauf- fant sous une pression de vapeur de 1,05 kg/cm2 pendant 15 minutes. On ajouta ensuite de la catalase et, après cela, on introduisit de l'eau oxygénée en continu pendant 12 heures, la quantité étant augmentée pendant ce laps de temps. Une quantité minimum d'eau oxygénée utilisée par litre à l'heure était 0,66 g.
Exemple 4
Au cours de cette opération, une bouillie de propagation de la sorte décrite à l'exemple 1 fut utilisée et l'inoculum était des saccharomyces cerevisiae. La catalase Armour A-100 fut utilisée et l'eau oxygénée fut amenée à la vitesse de 0,66 g au litre à l'heure, la quantité étant augmentée pendant la fer- mentation et la température étant maintenue à environ 30 C. On obtint un rendement de 5000 de levure.
Exemple 5
Le procédé fut exécuté comme décrit à l'exemple 1, sauf que l'on additionna des mélasses et de l'eau oxygénée en continu pendant le traitement et sans agiter. Les mélasses ajoutées étaient stériles en raison de la teneur en eau oxygénée et 1'on obtint un excellent rendement.
Exemple 6
Le procédé fut exécuté comme décrit à l'exemple 1, sauf que l'on ajouta de l'eau oxygénée à 5% à des vitesses @ allant de 10 m1/litre/heure à 50 ml/litre/heure pendant une période de croissance-de 24 heures. Le faible niveau d'admission d'eau oxygénée au commencement du traitement et son augmentation au cours de celui-ci eurent pour résultat un excellent rendement.
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Exemple 7
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Le procéda fub exécuté cofi1-,.e récrit u. l'exemple 1, sauf que l'on. utilisa une cat.luse Fer"lco ayant une activité constatée de 800 unités Saret par ml. Bien que la catalase sembla avoir une vitesse de conversion inférieurs à celle de
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la catalase Armour, on obtint une augmentation, iruportante de la croissance de la levure-
Exemple 8
Il s'agit d'un procédé de production de riboflavine
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ell utilisant de l'eremotheoium azhbyi.i dans un milieu contenant 10 ;.. de peptone, 0,1 à 1-0 )1 de protéine et environ 0,5 à 2 '/ de glucose, 0,05 de phosphate acide de potassium, 0,05 % de sulfate de (U8.i..Snésium, 0,15 7 de chlorure de sodium, 0,001 % de sulfate de fer et 0,5% d'huile de grains;
, en plus de la catalase.
Avant l'inoculation, le milieu fut stérilisé avec 0,2 % d'eau oxygénée en poids et le pH initial est porté à 7,5 L'eau. oxygénée est ajoutée pendant la culture de l'organisme pour donner
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de l'oxygène en quantité aUS"t3ntant de 0,84 à 8j,4. litres par 928 cm3 de surface de bouillie au cours de l'opération. La vitamine fut produite en rendement d'une quantité de 1 mg par ml de milieu, de culture.
Exemple 9
11 s'agit de la production d'acide citrique par aspergillus niger ayant poussé sur un milieu contenant 7 % de mélasses, 1 à 2% de phosphate acide de potassium, 0,25 à 0,50 %
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de sulfate de .att:sima et des traces de I1ljtaux. Avant l'inocu- lation avec l'organistue, on utilisa 0,2 ;1 en poids d'eau oxygénée pour stériliser le milieu. le pH fut ra16 à 7,0. La catalase fut additionnée et l'eau oxygénée fut introduite pour fournir de 0,2 à 1 litre dio:Y,-.>0ne n.--r litre do milieu a la minute.
A:,5r?;s 5 jours ae culturo, 55 ;,, du sucre disponible furent
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transformés en acide citrique.
Exemple 10
Dans un procédé de production de produits analogues à la vitamine B12 en utilisant le streptomyces griseus, on prépara un milieu contenant 453 g de peptone de boeuf par 40 litres de bouillie. On ajouta dans le même milieu 1359 g d'hydrolysat de caséine, 680 g de chlorure de sodium, 2265 g de sulfate ferreux, 0,1 litre d'huile de soja et 10 parties par million de nitrate de cobalt à 30 litres d'eau. Le milieu fut stérilisé par traitement avec 1% d'eau oxygénée en volume pendant la nuit. La catalase fut ajoutée et les inoculats furent introduits. La fermentation. s'effectua à 28 à 32 C pendant 24 à 48 heures. L'eau oxygénée fut ajoutée à une vitesse appropriée à fournir de l'oxygène à raison de 5,6 m3 à 28 m3 à l'heure.
Le bouillon fut filtré et le filtrat contenait 0,1 à 1 microgramme d'activité B12 par litre.
Exemple 11
Dans la production de pénicilline G, on fit pousser le pénicillium chrysogenum Q176 à partir d'un milieu contenant 40 ml de liqueur infusée de grains par litre, 27,5 g de lactose, 3 g de glucose, 3 g de nitrate de sodium, 0,5 g de sulfate de magnésium, 15 g de phosphate acide de potassium, 0,05 g de sulfate de zinc, 0,025 g de sulfate manganeux et-0,8 - d'acide phénol- acétique. La bouillie fut traitée avec 0,2 d'eau oxygénée en poids pendant la nuit. De la catalase fut ajoutée et l'inocu- lum fut introduit.
La pousse à 24 C et au pH 7,0 fut accompagnée par l'introduction d'eau oxygénée à une vitesse appropriée pour donner 0,02 à 0,2 volume d'oxygène par litre à la minute. Au. bout de 72 heures, le titre de pénicilline G dans le bouillon filtré était de 800 à 1350 unités au ml.
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Exemple 12
Dans la production de streptomycine, on fit pousser des streptomyces griseus sur un. milieu contenant 10 g de mélasses par litre, 50 g de caséine hydrolysée, des sols inorganiques et pas de cobalt. Le milieu fut traité avec 0,2 % d'eau oxygénée en poids pendant la nuit. De la catalase fut additionnée et
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1 inoculurrr fut introduit. La pousse de l'organisme à 25 à 3pua 0 fut accompagnée par l'introduction, d'eau oxygénée pour donner de 0,0168 à 0,168 litre d'oxygène à la minute par 3,78 litres. Après une culture de 5 jours, la streptomycine était présente à un niveau de 100 microgrammes par ml de milieu.
Exemple 13
Dans un procédé de transformation oxydative de 11-
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deshydrocorticostérone, le trichothecium roseum fut maintenu dans une culture de remplacement à 30 C qui comprenait un soustrat à un niveau de 0,1 et de la catalase, à laquelle on additionna de l'eau oxygénée pour donner 0,1 litre d'oxygène au litre de milieu à la minute. Le produit d'oxydation, la cortisone, représenta un rendement de 4% du produit et donna une récupéra- tion de 80%du réactif originel.
Exemple 14
Le procédé fut exécuté comme décrit à l'exemple 13, sauf que le stéroïde était de la progestérone et le produit final était la 11-hydroxy progestérone.
Bien qu'on ait indiqué en détail dans ce qui précède des opérations particulières et certaines matières de traitement avec beaucoup de détails pour illustrer l'invention, il est évident que l'on peut faire varier ces détails sans sortir du cadre de cette dernière.
REVENDICATIONS
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1'- Procédé de :ne-rrnenwt.îon a5robici.ue, dons lequel un inoculum est ajouté à uu milieu nutritif, caractérisa en ce qu'on.
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stérilise phéliininairement le milieu en y ajoutant de l'eau oxygénée, on.'introduit de la catalase dans la matiére, on ajoute un inoculum à cette matière,, on maintient celle-ci sous des condi- tions appropriées pour la pousse de l'inoculum et on continue à ajouter de- 3 'eau oxygénée au fur et à mesure qe la fermentation. s'effectue.
2 - Procédé suivant la revendication 1, dans lequel la fermentation est effectuée dans un système fermé.
3 - -Procédé suivant la revendication 1, dans lequel la vitesse d'admission de l'eau oxygénée est élevée au fur et à mesure que la fermentation s'effectue.
4 - Procédé suivant la revendication 1, dans lequel on ajoute un milieu nutritif stérilisé avec de l'eau oxygénée à la matière subissant la fermentation, au fur et à mesure que cette dernière s'effectue.
5 - Procédé de fermentation aérobique, dans lequel un inoculum est ajouté à un milieu nutritif, caractérisé en ce qu'on stérilise préliminairement le milieu en y ajoutant de l'eau oxygénée, on ajoute ensuite de la catalase aux matières, on additionne un inoculwn au milieu, on maintient le milieu éune température favorable à la pousse de l'inoculum et on continue à ajouter de l'eau oxygénée au fur et à mesure que la fermentation s'effectue tout en maintenant un excès de catalase dans les matières subissant la fermentation.
6 - Procédé de fermentation aérobique suivant la re- vendication 5, caractérisé en ce qu'il est exécuté dans un système fermé.
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7 - Procédé à ierme;rtution aérotiicue, dans lequel un inoculum de levure est ajouté à un milieu nutritif dans un système fermé,,caractérisé en ce eu'on additionne de la catalase
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au milieu, on ajoute ensuite l'inoculum de levure à la matière, on maintient la matière sous des conditions de température favora- bles à la pousse de la levure et on additionne de l'eau oxygénée aux matières subissant la fermentation au fur et à mesure que celle-ci a lieu.
8 -- Procédé suivant la revendication 7, dans lequel de l'eau, oxygénée est ajoutée à environ 0,66 g par litre à l'heure.
9 - Procédé suivant la revendication 7, dans lequel de l'eau oxygénée est ajoutée initialement en une quantité de 0,2 à 1% en poids..
10 - Procédé de fermentation aérobique, dans lequel un inoculum est ajouté à un milieu nutritif, caractérisé en ce qu'on ajoute de l'eau oxygénée au milieu pour le stériliser, on ajoute ensuite de la catalase, on additionne un inoculwn au milieu, on continue à ajouter de l'eau oxygénée au fur et à mesure que la fermentation s'effectue et on continue à additionner le milieu nutritif contenant de l'eau oxygénée au fur et à mesure que la fermentation s'effectue.
11 - Procédé de fermentation aérobique suivant la revendication 10, dans lequel l'inoculum est ajouté à un milieu nutritif dans un système formé.
12 - Procédé suivant la revendication 10, dans lequel l'eau oxygénée est additionnée à une vitesse croissante d'admission au fur et à mesure que la fermentation s'effectue.
13 - Procédé de transformation oxydative de stéroïde, caractérisé en ce qu'on ajoute le stéroïdo à traiter à une culture
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d'un rnicro-or¯.ni,^.A,a, on fait fermenter cette culture en présence de catalase et d'eau oxygénée pour former un produit d'oxydation et on sépare ce dernier.
14 - Procédé suivant la revendication 13, dans lequel
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le stérolde est la 11.-de,:,klydroCOrtiCOStarc):1 et la produit d'oxydation est la 11-progestérone.