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La présente invention se rapporte à l'imprégnation de semences par une substance en particules, solide et finement divisée. Plus particulièrement,; l'invention concerne l'inoculation à des semences, dans des conditions de pres- sour réduite, d'une substance en particules, par exemple des microorganismes vi- vants.
L'un des buts les plus anciens des technologues de l'agronomie a été l'inoculation des semences à des fins telles que l'allongement de la durée de vie des semences ou l'amélioration des plantes provenant de celles-ci. Dans cet or- dre d'idées, diverses matières ont été incorporées aux semences. Par exemple, des bactéries fixant l'azote ont été incorporées à des semences potagères afin que les plantes obtenues soient moins subordonnées à la présence des nitrates du sol pour la croissance, Il y a diverses variantes dans la technique de l'incor- poration des bactéries aux semences mais en gros, ces techniques consistent à mêler intimement les semences au fluide ou à la poussière chargés de bactéries pour obtenir un revêtement superficiel des semences.
D'habitude, lorsque des poussières sont utilisées, les semences doivent être humidifiées avant que la substance inoculée n'adhère. Les procédés actuels ont donc pour résultat que les bactéries sont maintenues sous la forme d'un revêtement sur la coquille ou l'é- cale des semences.
Un des principaux inconvénients des procédés actuels est que les se- mences doivent être plantées immédiatement après le traitement si l'on désire obtenir les meilleurs résultats. Si les semences ne sont pas plantées dans les 24 heures, il est généralement recommandé de les réinoculer parce que normale- ment les bactéries seront mortes au-delà de cette limite. Les semences doivent donc être traitées à nouveau. Ainsi, les semences traitées suivant les procédés actuels, ne conservent aucun avantage de ce traitement si elles sont entrepo - sées. Le cultivateur est tenu de coordonner soigneusement le moment du traite- ment avec celui de la plantation ou des semailles.
Comme le moment de la planta- tion dépend de facteurs climatiques incontrôlables et bien souvent imprévisibles, il peut ne pas être possible de planter les semences traitées dans les limites de temps prescrites après le traitement. Dans ces conditions, le traitement n'a pour résultat qu'une perte de temps et d'argent pour le cultivateur.
En outre, comme les baptéries se présentent sous la forme d'une cou- che sur la surface externe des semences, elles sont, ainsi que le revêtement dont elles font partie, susceptibles d'être soumises à des conditions ambiantes, dans lesquelles les bactéries ne survivent pas suffisamment longtemps pour pou- voir contaminer les racines des plantes. De même, le revêtement peut être gratté ou éraflé sur les semences lorsque.l'on utilise des dispositifs mécaniques pour les semer.
Le but de l'invention est de fournir un procédé pour l'introduction de bactéries, par exemple, dans ou en dessous de l'enveloppe des semences. Dans le cas des légumineuses, le procédé permet d'introduire des bactéries fixant l'azote en dessous de la surface des semences, où les bactéries sont protégées contre la sécheresse et les autres conditions ambiantes néfastes. On a trouvé que les bactéries introduites de cette manière survivent plus longtemps que les bactéries se trouvant sur l'enveloppe des semences suivant les procédés actuels.
Suivant l'invention, il est possible de produire des semences inoculées par des bactéries, qui puissent être emmagasinées pendant une période de temps raisonna- ble avant la plantatibn ou les semailles. Il est assez surprenant de constater que les bactéries survivent dans les semences inoculées pendant plusieurs mois, même lorsqu'elles sont entreposées aux températures ambiantes ordinaires. Le pro- cédé d'inoculation peut faire partie du procédé habituel de triage et de nettoya- ge des semences qu'effectue le marchand de semences. Les semences inoculées, sus- ceptilbles d'être entreposées, évitent au cultivateur les opérations, dispendieu- ses au point de vue du temps qu'elles nécessitent et parfois stériles, du trai- tement des semences immédiatement avant le moment de la plantation.
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Suivant la présente invention, on soumet les semences à une pression réduite pendant qu'elles sont en contact avec une suspension liquide de bacté- ries appropriées, Rhizobium app., par exemple. Le vide partiel obtenu est rompu et les semences sont alors séchées de manière appropriée. Une caractéristique essentielle de l'invention est que les semences sont en contact avec une suspen- sion liquide ou une dispersion des 'bactéries pendant que la pression est réduite, Cela peut être réalisé en plongeant les semences dans la suspension liquide des 'bactéries et en soumettant le mélange des semences et de la suspension bactérien- ne liquide à une pression réduite.
D'une autre façon, la suspension bactérienne peut être appliquée sur les semences en les plongeant ou en les aspergeant de façon qu'elles soient revêtues de suspension bactérienne sur toute, ou pratique- ment toute, leur surface. Les semences sont ensuite soumises au traitement sous une pression réduite. Comme l'immersion des semences peut contaminer la bouillie et limiter son réemploi, l'application par aspersion est généralement préférée étant donné le coût de préparation des suspensions bactériennes. En outre, les semences revêtues par aspersion retiennent moins du liquide de suspension de la bouillie que celles qui ont été plongées dans la bouillie pendant le traitement sous une pression réduite et dès lors elles peuvent être plus aisément séchées après l'inoculation.
Un des buts de l'invention est d'obtenir l'inoculation des semences sans les imbiber et dès lors sans gonflement qui briserait ou détruirait inutile- ment l'enveloppe ou l'écale protectrice des semences. Suivant l'invention, on évite une immersion prolongée des semences dans la bouillie bactérienne. Dans la phase d'inoculation ou d'imprégnation du procédé, la pression est réduite et ensuite le vide est rompu soit immédiatement, soit après une période de temps relativement courte qui est insuffisante pour provoquer la saturation des semen- ces jusqu'à un point tel qu'elles soient boursoufflées ou gonflées ce qui détrui- rait leur enveloppe protectrice.
Cette période de temps relativement courte est également insuffisante pour amorcer le processus de germination qui entraînerait la mort des semences si elles n'étaient pas plantées ou semées immédiatement.
Ainsi, il est donc possible d'obtenir des semences inoculées, susceptibles d'être entreposées, qui restent intactes malgré les influences d'ambiances nuisibles et, dans le cas de microorganisms vivants, qui retiennent les microorganismes à l'abri sous la surface de la semence.
Le point jusqu'auquel la pression peut être réduite dans la phase d'inoculation du procédé suivant l'invention peut varier considérablement. L'in- oculation effective des semences à enveloppes lâches, comme celles du type com- prenant les fèves ou pois de lima, commence à se produire peu après le début de la réduction de la pression et dès que la pression commence à diminuer. Des pres- sions plus basses peuvent être avantageuses pour l'inoculation de semences ayant des enveloppes adhérentes et dures, comme celles du type comprenant les semen- ces d'alfalfa ou de trèfle, bien que l'emploi de pressions plus basses puisse être évité en traitant de façon appropriée ces semences avant la phase d'inocu- lation.
Le traitement peut s'effectuer, par exemple, par scarification, qui, comme le savent les spécialistes, consiste à entailler superficiellement les en- veloppes des semences. La limite inférieure de la pression à laquelle des se- mences peuvent être soumises est en général déterminée par la pression de vapo- risation de l'agent liquide dans lequel les bactéries pu toute autre substance e particules finement divisée est en suspension. En général, l'eau est un agent liquide approprié, et dans le cas de l'inoculation de semences en contact avec une bouillie bactérienne aqueuse, un traitement sous une pression réduite de 1,1 pouce de mercure (28 mm) assure une rapide inoculation des bactéries aux semen- ces.
En tout cas, il est possible de soumettre les semences à la pression rédui- te et de relâcher le vide ainsi créé après un temps très court, en évitant ainsi d'imbiber les semences ce qui provoquerait la rupture désavantageuse de l'enve- loppe ou de l'écale protectrice de celles-ci. Le mot "vide" est utilisé ici pour caractériser l'état de pression réduite existant sur les semences ou le mélange de semences et de bouillie.
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Il ne semble pas qu'il y ait aucun avantage à répéter les traite - ments sous pression réduite. Il est seulement nécessaire que les semences en con- tact avec la bouillie bactérienne soient maintenues à une pression réduite pen- dant une période de temps relativement courte, afin que les semences ne soient pas endommagées, ainsi qu'on l'a décrit plus haut. On peut croire que le vide re- lâche légèrement l'enveloppe des semences de sorte que lorsque la pression sur celles-ci est réduite, les bactéries puissent pénétrer au travers de l'enveloppe.
La rupture du vide introduit alors les bactéries dans ou sous l'enveloppe des se- mences. Bien que la pression puisse être réduite progressivement, le vide doit de préférence être rompu plutôt rapidement parce que l'augmentation de pression lors du retour à la pression atmosphérique fait pénétrer les baotéries ou la substan- ce en particules sous la surface des semences.
Les bouillies bactériennes à utiliser suivant la présente invention peuvent être préparées suivant les procédés usuels bien connus. Les bactéries peuvent être cultivées sur un milieu de culture approprié, séparées du milieu de culture et ensuite simplement mises en dispersion ou en suspension dans un agent liquide approprié, par exemple de l'eau. Cependant on a découvert au cours de la mise en application de la présente invention que certaines modifications de la bouillie bactérienne sont avantageuses, comme décrit ci-dessous. Ainsi, la pré- sence de certaines matières dans la bouillie bactérienne semble avoir un effet protecteur sur les bactéries dans les semences. Ces matières sont des corps étran- gers, comme la gomme bactérienne et les produits métaboliques obtenus dans la culture bactérienne.
Ces produits métaboliques et la gomme bactérienne peuvent être ajoutés à la bouillie en même temps que les bactéries. En outre, la présen- ce d'agents tensio-actifs est avantageuse dans la bouillie bactérienne, parce qu'ils amorcent l'imprégnation et semblent stimuler la croissance des bactéries après que les semences ont été plantées ou semées. La réduction de la tension su- perficielle de la bouillie bactérienne, due à la présence d'agents tensio-actifs, favorise le mouillage des semences et facilite l'entrée des bactéries dans celles- ci. On peut utiliser tous les agents tensio-actifs non toxiques pour les bacté- ries; par exemple, on peut citer les dérivés polyoxyalkyléniques d'esters par - tiels d'acides gras à longue chaîne et d'anhydride d'hexitol.
Il est évident que la bouillie bactérienne peut contenir encore d'autres constituants. Par exemple, la bouillie peut contenir divers éléments qui favorisent la survie ou la crois- sance des bactéries ou favorisent la croissance de la plante.
Les exemples ci-dessous sont donnés à titre d'illustrations de la présente invention et ne doivent pas être considérés comme la limitant d'aucune façon.
EXEMPLE A.
Préparation de la bouillie bactérienne.
Des bactéries du genre Rhizobium sont cultivées sur un agar-agar de levure-mannitol. Les rhizobia sont récoltées en enlevant la culture de l'agar- agar par lavage avec de l'eau pour entraîner avec les bactéries les corps étran- gers, comme la gomme bactérienne et les produits métaboliques produits pendant la culture. De l'eau est ensuite ajoutée à celle du lavage pour obtenir une bouil- lie ayant la concentration désirée. La concentration des bactéries dans la bouil- lie peut varier entre des limites larges sans nuire à l'efficacité du procédé.
Des bouillies contenant enciron 39 x 10 bactéries par om3 et des bouillies con- tenant environ 39 x 104 bactéries par cm3 ont été avantageusement utilisées.
EXEMPLE B.-
Phase d'imprégnation sous vide.
Des semences d'alfalfa entaillées ont été plongées dans une bouillie de rhizobia obtenue comme décrit dans l'exemple A. Le mélange de semences et de bouillie bactérienne est placé dans un récipient approprié et on y crée un vide
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correspondant à environ 1,1 pouce de mercure (28 mm). Le vide est ensuite rompu et les semences sont retirées de la bouillie. Le temps total de contact des se- mences avec la bouillie est d'environ 10 minutes, ce qui est insuffisant pour im- biber les semences et les gonfler. Après enlèvement des semences de la 'bouillie, on les laisse sécher à l'air.
Les semences inoculées suivant le procédé décrit dans l'exemple B sont soigneusement lavées avec une solution aqueuse 'bactéricide d'environ 0,5% d'hypochlorite de sodium en poids. Cela a pour but de tuer les baetéries qui pourraient subsister sur la surface des semences. Des semences stérilisées en surface sont plantées immédiatement après l'inoculation, et après des périodes d'entreposage. Les semences qui sont entreposées et ensuite plantées sont stérili- sées en surface une seconde fois immédiatement avant la plantation.
Les semences inoculées stérilisées en surface sont plantées dans un milieu de culture pauvre en azote. Ce milieu pauvre en azote consiste en un mé- lange aqueux d'agents nutritifs des plantes appropriés solidifié par l'addition 3 d'agar-agar. Le mélange aqueux d'agents nutritifs des plantes consiste en 0,5 cm
EMI4.1
de KCl 1 M; 0,2 cm de MgS04.7H0 0,1 M; 0,2 cm3 de Ca(Il2PO4)2-920 0,25 M; 8,0 cm de CaSO4 0,5 M; 0,05 cm de 0,5% de Fe sous la forme d'un chélate d'aci- de tétra-aoétique éthylènediamine; 0,05 cm3 d'une solution d'éléments de trace; et 91 cm3 d'eau désionisée. Environ 1,5 g d'agar-agar est ajouté à ce mélange aqueux qui est passé à l'autoclave. Le pH du milieu de culture passé à l'auto- clave est alors amené à environ pH 8 par addition d'hydroxyde de sodium.
Les se- mences inoculées stérilisées en surface sont ensuite placées aseptiquement sur la surface de l'agar-agar après solidification. Les racines des plantes pous- sant des semences sont examinées pour y déceler la formation de nodules. La pré- sence de nodules est la preuve de la présence de rhizobia vav.ants dans les semen- ces inoculées. Les données du tableau 1 illustrent la viabilité des bactéries dans les semences inoculées.
TABLEAU 1
EMI4.2
<tb> Durée <SEP> de <SEP> l'en- <SEP> 1/2 <SEP> mois <SEP> 1 <SEP> 1/2 <SEP> mois <SEP> 3 <SEP> 1/2 <SEP> mois <SEP> 4 <SEP> 1/2 <SEP> mois
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> treposage
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Formation <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nodules <SEP> Oui <SEP> Oui <SEP> Oui <SEP> Oui
<tb>
Donc, même lorsqu'elles poussent dans les conditions les plus sévères, les se- mences produisent des plantes qui ont des nodules formés sur les racines. En ou- tre, l'on n'a pas à utiliser des conditions spéciales d'entreposage des semen- ces. Elles sont entreposées dans des récipients fermés, aux températures et de- gré d'humidité ambiants ordinaires.
A titre de comparaison, les données du tableau II montrent que les bactéries ne restent pas vivantes sur des semences qui ont été seulement plongées dans la bouillie bactérienne. Des semences d'alfalfa sont plongées dans une bouil- lie bactérienne préparée de la façon décrite dans l'exemple A. Elles sont mainte- nues dans la bouillie à la pression atmosphérique pendant environ 10 minutes, ce qui est également la période de temps maximum durant lesquelles les semences du Tableau I ont été maintenues en contact avec la bouillie. Les semences plongées sont laissées à l'air pour sécher mais ne sont pas stérilisées en surface. On utilise le même processus de plantation que celui indiqué plus haut.
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TABLEAU II
EMI5.1
<tb> Durée <SEP> de <SEP> l'entreposage <SEP> Néant <SEP> i <SEP> mois <SEP> 3 <SEP> mois
<tb>
<tb> Formation <SEP> de
<tb> nodules <SEP> Oui <SEP> Non <SEP> Non
<tb>
Le tableau suivant illustre l'effet avantageux de l'addition d'un dépressant de la tension superficielle à la bouillie bactérienne et montre éga- lement que la concentration des baotëries n'est pas critiquée L'agent tensio-ac- tif dans ce cas est le dérivé polyoxyéthylénique du monolaurate de sorbitanne.
Il n'est nécessaire d'utiliser que de très petites quantités de l'agent tensio- actif. Dans le cas des exemples du tableau III, il représente 0,1% en poids de la bouillie . La concentration dans ce cas représente le niveau auquel la ten- sion superficielle est réduite au plus bas niveau possible avec le dérivé poly- oxyéthylênique du monolaurate de sorbitanne. En dehors de l'addition de l'agent tensio-actif, la bouillie est préparée de la manière décrite dans l'exemple A et est identifiée dans le tableau III comme la bouillie "concentrée" (contenant en- viron 39 x 108 bactéries par cm3) Des semences d'alfalfa sont inoculées au mo- yen de la bouillie concentrée suivant le processus décrit dans l'exemple B,
et d'autres lots de sementcs d'alfalfa sont inoculées de la même manière avec des dilutions décimales de la concentration indiquée dans le tableau III. Les semen- ces sont également stérilisées en surface et plantées ou semées de la manière décrite plus haut. Deux groupes témoins de semences d'alfalfa sont également plantés.
TABLEAU III
EMI5.2
<tb> Dilution <SEP> de <SEP> la <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> plantes <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> plantes
<tb>
<tb>
<tb> bouillie <SEP> (agent <SEP> par <SEP> récipient <SEP> avec <SEP> formation <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> tensio-actif <SEP> 0,1%) <SEP> nodules
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Concentrée <SEP> 5 <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1/10 <SEP> 5 <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1/100 <SEP> 5 <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1/1000 <SEP> 5 <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1/10.000 <SEP> 4 <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Témoin <SEP> (plongé <SEP> dans
<tb>
<tb>
<tb> la <SEP> bouillie <SEP> concentrée) <SEP> 3 <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Témoin <SEP> (non <SEP> traité)
<SEP> 4 <SEP> 0
<tb>
On a ainsi montré que de petites unités de substance peuvent être incorporées en dessous de la surface des semences sans détruire ou briser désa- vantageusement l'enveloppe de celles-ci. Cela a été illustré typiquement avec des bactéries; en outre, on a montré que les bactéries sont susceptibles de sur- vivre dans les semences pour de relativement longues périodes de tempsD'autres microorganismes vivants, comme des fungi utiles, peuvent également être incorpo- rés dans les semences de la même manièreo De même, des insecticides, des fongici- des, des bactéricides) etc., relativement insolubles peuvent être incorporés dans les semences sous la forme de substances en particules, finement divisées.
Bien que certains exemples et modes de réalisation typiques aient été décrits pour illustrer la présente invention, il est clair que l'on peut y apporter de nombreuses modifications sans sortir de son cadre.
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The present invention relates to the impregnation of seeds with a particulate, solid and finely divided substance. More particularly ,; the invention relates to the inoculation of seeds, under reduced pressure conditions, with a particulate substance, for example living microorganisms.
One of the oldest goals of agronomic technologists has been inoculating seeds for such purposes as extending the life of seeds or improving the plants derived from them. In this vein, various materials have been incorporated into the seeds. For example, nitrogen fixing bacteria have been incorporated into vegetable seeds so that the resulting plants are less dependent on the presence of soil nitrates for growth. There are various variations in the technique of incorporating them. bacteria to seeds but basically these techniques consist of intimately mixing the seeds with the bacteria-laden fluid or dust to obtain a surface coating of the seeds.
Usually, when dusts are used, the seeds must be moistened before the inoculated substance adheres. Current methods therefore result in bacteria being maintained as a coating on the seed shell or shell.
One of the main drawbacks of current methods is that the seeds must be planted immediately after treatment if the best results are to be obtained. If the seeds are not planted within 24 hours, it is generally recommended to re-inoculate them because normally bacteria will be dead beyond this limit. The seeds must therefore be treated again. Thus, the seeds treated according to current methods do not retain any advantage of this treatment if they are stored. The grower must carefully coordinate the timing of treatment with that of planting or sowing.
As the timing of planting depends on uncontrollable and often unpredictable climatic factors, it may not be possible to plant treated seeds within the prescribed time limits after treatment. Under these conditions, the treatment results in a waste of time and money for the grower.
Furthermore, since the baptisms occur as a layer on the outer surface of the seeds, they, as well as the coating of which they are a part, susceptible to being subjected to ambient conditions, in which the bacteria do not survive long enough to contaminate plant roots. Likewise, the coating may be scratched or scuffed on the seeds when mechanical devices are used to sow them.
The aim of the invention is to provide a process for the introduction of bacteria, for example, into or below the seed coat. In the case of legumes, the process allows nitrogen fixing bacteria to be introduced below the seed surface, where the bacteria are protected against drought and other adverse environmental conditions. Bacteria introduced in this manner have been found to survive longer than bacteria found on the seed coat by current methods.
According to the invention, it is possible to produce seeds inoculated with bacteria, which can be stored for a reasonable period of time before planting or sowing. It is quite surprising that the bacteria survive in the inoculated seeds for several months, even when stored at ordinary room temperatures. The inoculation process can be part of the usual seed sorting and cleaning process carried out by the seed dealer. The inoculated seeds, which can be stored, save the grower the time-consuming and sometimes sterile operations of treating the seeds immediately before planting.
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In accordance with the present invention, the seeds are subjected to reduced pressure while in contact with a liquid suspension of suitable bacteria, eg Rhizobium app., For example. The partial vacuum obtained is broken and the seeds are then dried appropriately. An essential feature of the invention is that the seeds are in contact with a liquid suspension or dispersion of the bacteria while the pressure is reduced. This can be achieved by immersing the seeds in the liquid suspension of the bacteria and subjecting the mixture of seeds and liquid bacterial suspension to reduced pressure.
Alternatively, the bacterial suspension can be applied to the seeds by dipping or spraying them so that they are coated with the bacterial suspension over all, or substantially all, of their surface. The seeds are then subjected to the treatment under reduced pressure. As seed immersion can contaminate the slurry and limit its reuse, spray application is generally preferred given the cost of preparing bacterial suspensions. Further, the seeds coated by sprinkling retain less of the slurry suspension liquid than those which have been dipped in the slurry during treatment under reduced pressure and therefore can be more easily dried after inoculation.
One of the aims of the invention is to obtain inoculation of the seeds without imbibing them and therefore without swelling which would break or unnecessarily destroy the protective shell or shell of the seeds. According to the invention, prolonged immersion of the seeds in the bacterial slurry is avoided. In the inoculation or impregnation phase of the process, the pressure is reduced and then the vacuum is broken either immediately or after a relatively short period of time which is insufficient to cause saturation of the seeds to a point. such that they are swollen or swollen which would destroy their protective envelope.
This relatively short period of time is also insufficient to initiate the germination process which would result in the death of seeds if they were not planted or sown immediately.
Thus, it is therefore possible to obtain inoculated seeds, capable of being stored, which remain intact despite the influences of harmful environments and, in the case of living microorganisms, which retain the microorganisms under the surface of the soil. the seed.
The point to which the pressure can be reduced in the inoculation phase of the process according to the invention can vary considerably. The effective inoculation of seeds with loose coats, such as those of the type including lima beans or peas, begins to occur soon after the onset of pressure reduction and as soon as the pressure begins to decrease. Lower pressures may be advantageous for inoculation of seeds having adherent and hard shells, such as those of the type comprising alfalfa or clover seeds, although the use of lower pressures can be avoided. by treating these seeds appropriately before the inoculation phase.
The treatment can be carried out, for example, by scarification, which, as specialists know, consists in superficially notching the seed coats. The lower limit of the pressure to which seeds can be subjected is generally determined by the vaporization pressure of the liquid agent in which the bacteria or other finely divided particulate matter is suspended. In general, water is a suitable liquid agent, and in the case of inoculating seeds in contact with an aqueous bacterial slurry, treatment under a reduced pressure of 1.1 inches of mercury (28 mm) ensures rapid inoculation of bacteria to the seeds.
In any case, it is possible to subject the seeds to the reduced pressure and to release the vacuum thus created after a very short time, thus avoiding to imbibe the seeds which would cause the unfavorable rupture of the envelope. or the protective shell thereof. The word "vacuum" is used herein to characterize the state of reduced pressure existing on the seeds or the mixture of seeds and slurry.
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There does not appear to be any advantage in repeating the reduced pressure treatments. It is only necessary that the seeds in contact with the bacterial slurry be maintained at reduced pressure for a relatively short period of time, so that the seeds are not damaged, as described above. . It is believed that the vacuum loosens the seed coat slightly so that when the pressure on the seeds is reduced bacteria can enter through the seed coat.
Breaking the vacuum then introduces bacteria into or under the seed envelope. Although the pressure can be reduced gradually, the vacuum should preferably be broken rather quickly because the increase in pressure upon return to atmospheric pressure causes the baoteria or particulate substance to penetrate below the surface of the seeds.
The bacterial slurries to be used according to the present invention can be prepared according to the usual well known methods. Bacteria can be cultured on a suitable culture medium, separated from the culture medium and then simply dispersed or suspended in a suitable liquid agent, for example water. However, it has been found in the course of practicing the present invention that certain modifications of the bacterial slurry are advantageous, as described below. Thus, the presence of certain materials in the bacterial slurry appears to have a protective effect on the bacteria in the seeds. These materials are foreign bodies, such as bacterial gum and metabolic products obtained in bacterial culture.
These metabolic products and the bacterial gum can be added to the porridge along with the bacteria. Furthermore, the presence of surfactants is advantageous in the bacterial slurry, because they initiate impregnation and appear to stimulate the growth of bacteria after the seeds have been planted or sown. The reduction in the surface tension of the bacterial slurry, due to the presence of surfactants, promotes wetting of the seeds and facilitates the entry of bacteria into them. All surfactants which are non-toxic to bacteria can be used; for example, mention may be made of polyoxyalkylenic derivatives of partial esters of long-chain fatty acids and of hexitol anhydride.
It is obvious that the bacterial slurry may contain still other constituents. For example, the porridge may contain various elements which promote the survival or growth of bacteria or promote the growth of the plant.
The examples below are given by way of illustrations of the present invention and should not be construed as limiting it in any way.
EXAMPLE A.
Preparation of bacterial porridge.
Bacteria of the genus Rhizobium are grown on yeast-mannitol agar. Rhizobia are harvested by removing the agar agar culture by washing with water to entrain foreign bodies, such as bacterial gum, and metabolic products produced during cultivation with the bacteria. Water is then added to that of the wash to obtain a slurry of the desired concentration. The concentration of bacteria in the broth can vary within wide limits without adversely affecting the efficiency of the process.
Slurries containing about 39 x 10 bacteria per m³ and slurries containing about 39 x 104 bacteria per cm 3 have been advantageously used.
EXAMPLE B.-
Vacuum impregnation phase.
Notched alfalfa seeds were dipped into a rhizobia slurry obtained as described in Example A. The mixture of seeds and bacterial slurry is placed in a suitable container and a vacuum is created therein.
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corresponding to approximately 1.1 inches of mercury (28 mm). The vacuum is then broken and the seeds are removed from the porridge. The total contact time of the seeds with the slurry is about 10 minutes, which is insufficient to soak the seeds and swell them. After removing the seeds from the slurry, they are allowed to air dry.
The seeds inoculated according to the method described in Example B are washed thoroughly with an aqueous bactericidal solution of about 0.5% sodium hypochlorite by weight. The purpose of this is to kill any baeteria which may remain on the surface of the seeds. Surface sterilized seeds are planted immediately after inoculation, and after periods of storage. Seeds that are stored and then planted are surface sterilized a second time immediately before planting.
The surface sterilized inoculated seeds are planted in a culture medium poor in nitrogen. This nitrogen-poor medium consists of an aqueous mixture of suitable plant nutrients solidified by the addition of agar-agar. The aqueous mixture of plant nutrients consists of 0.5 cm
EMI4.1
1 M KCl; 0.2 cm of 0.1 M MgS04.7H0; 0.2 cm3 of Ca (Il2PO4) 2-920 0.25 M; 8.0 cm of 0.5 M CaSO4; 0.05 cm3 of 0.5% Fe as a chelate of tetra-aoetic ethylenediamine acid; 0.05 cm3 of a solution of trace elements; and 91 cm3 of deionized water. About 1.5 g of agar is added to this aqueous mixture which is autoclaved. The pH of the autoclave culture medium is then brought to approximately pH 8 by addition of sodium hydroxide.
The surface sterilized inoculated seeds are then placed aseptically on the surface of the agar after solidification. The roots of seed-growing plants are examined for the formation of nodules. The presence of nodules is evidence of the presence of rhizobia vav.ants in the inoculated seeds. The data in Table 1 illustrate the viability of bacteria in the inoculated seeds.
TABLE 1
EMI4.2
<tb> Duration <SEP> of <SEP> in- <SEP> 1/2 <SEP> month <SEP> 1 <SEP> 1/2 <SEP> month <SEP> 3 <SEP> 1/2 < SEP> month <SEP> 4 <SEP> 1/2 <SEP> month
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> storage
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Training <SEP> of
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nodules <SEP> Yes <SEP> Yes <SEP> Yes <SEP> Yes
<tb>
So even when growing under the harshest conditions, seeds produce plants that have nodules formed on the roots. In addition, special seed storage conditions do not have to be used. They are stored in closed containers at ordinary ambient temperatures and humidity.
By way of comparison, the data in Table II show that the bacteria do not stay alive on seeds which have only been dipped in the bacterial slurry. Alfalfa seeds are immersed in a bacterial broth prepared as described in Example A. They are kept in the slurry at atmospheric pressure for about 10 minutes, which is also the maximum time period. during which the seeds of Table I were kept in contact with the slurry. The dipped seeds are left in the air to dry but are not sterilized on the surface. The same planting process as described above is used.
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TABLE II
EMI5.1
<tb> Duration <SEP> of <SEP> storage <SEP> None <SEP> i <SEP> months <SEP> 3 <SEP> months
<tb>
<tb> Training <SEP> of
<tb> nodules <SEP> Yes <SEP> No <SEP> No
<tb>
The following table illustrates the advantageous effect of adding a surface tension depressant to the bacterial slurry and also shows that the concentration of baoteria is not criticized. The surfactant in this case is the polyoxyethylene derivative of sorbitan monolaurate.
It is only necessary to use very small amounts of the surfactant. In the case of the examples in Table III, it represents 0.1% by weight of the slurry. The concentration in this case represents the level at which the surface tension is reduced to the lowest possible level with the polyoxyethylene derivative of sorbitan monolaurate. Apart from the addition of the surfactant, the slurry is prepared as described in Example A and is identified in Table III as the "concentrated" slurry (containing about 39 x 108 bacteria per. cm3) Alfalfa seeds are inoculated using the concentrated slurry following the process described in Example B,
and other batches of alfalfa sementcs are inoculated in the same manner with decimal dilutions of the concentration shown in Table III. The seeds are also surface sterilized and planted or sown as described above. Two control groups of alfalfa seeds are also planted.
TABLE III
EMI5.2
<tb> Dilution <SEP> of <SEP> the <SEP> Number <SEP> of <SEP> plants <SEP> Number <SEP> of <SEP> plants
<tb>
<tb>
<tb> slurry <SEP> (agent <SEP> by <SEP> container <SEP> with <SEP> training <SEP> of
<tb>
<tb>
<tb> surfactant <SEP> 0.1%) <SEP> nodules
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Concentrated <SEP> 5 <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1/10 <SEP> 5 <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1/100 <SEP> 5 <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1/1000 <SEP> 5 <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 / 10,000 <SEP> 4 <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Witness <SEP> (immersed <SEP> in
<tb>
<tb>
<tb> the <SEP> slurry <SEP> concentrated) <SEP> 3 <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Witness <SEP> (not <SEP> processed)
<SEP> 4 <SEP> 0
<tb>
It has thus been shown that small units of substance can be incorporated below the surface of the seeds without destroying or disadvantageously breaking the seed coat. This has typically been illustrated with bacteria; Furthermore, it has been shown that bacteria are capable of surviving in seeds for relatively long periods of time. Other living microorganisms, such as useful fungi, can also be incorporated into seeds in the same way. relatively insoluble insecticides, fungicides, bactericides) etc. can be incorporated into the seeds as particulate, finely divided substances.
Although some typical examples and embodiments have been described to illustrate the present invention, it is clear that many modifications can be made to it without departing from its scope.