BE596175A - - Google Patents

Description

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    "liouveaux   antibiotiques". 



   La présente invention est relative à de nouveaux compo- sés et à leurs procédés de production. L'invention se rapporte plus spécialement à un nouvel antibiotique, l'actinospectacine, à ses sels par addition d'acide,   et 1   un procédé de prodution de ces com- Dosés.      



   L'actinospectacine est un produit biosynthétique obtenu par la fermentation contrôlée de Streptomyces   spectabilis.   Elle a la propriété d'affecter la croissance des micro-organismes,   spécia-   lement des bactéries. C'est un composé basique qui peut être utili- 

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 se, sous forme de la base libre ou   sous     @orme   d'un sel par addition d'acide de celle-ci, pour   empêcher   la croissance des micor-organis- ses ou réduire le nombre de ceux-ci qui sont présents dans divers milieux. Par exemple, des solutions de lavage contenant de l'acti- nospectacine sont utiles pour des besoins sanitaires, par exemple pour le lavage des mains et pour le nettoyage des installations, planchers ou appareils des locaux ou laboratoires souillés.

   L'acti- nospectacine peut   également   être utilisée, comme additif d'alimen-   tation   permettant de favoriser la croissance des   mammifères   et des oiseaux, en étant employé seul oa en combinaison avec d'autres antibiotiques. Elle peut également être utilisée pour le contrôle sélectif de la croissance des micro-organismes dans des milieux biologiques et comme agent de conservation dans l'industrie, par exemple comme agent de rinçage bactériostatique pour les vêtements nettoyés et pour imprégner le papier et les tissus en vue de les rendre bactériostatiques. 



   Une souche de Streptomyces   spectabilis   qui est partiou- lièrement efficace pour produire l'actionspectacine peut être ob- tenue de la collection permanente de la Fermentation Division, Nor-   thern   Utilization Research Branch, U.S. Department of Agriculture, 
Peoria, Illinois, où cette souche a été déposée sous le nom de   @   
Streptomyces spectabilis NRRL 2792. Le S. spectabilis est décrit dans le brevet britannique   n 811.757   du 8 avril 1959. 



   L'actinospectacine est produite lorsque le S. spectabilis est mis à croître dans un milieu nutritif aqueux sous des conditions aérobies submergées, de préférence dans un milieu nutritif conte- nant, comme source de carbone, un hydrate de carbone addimilible et, comme source d'azote, un composé d'azote assimilable ou une matière protéique. Il sera entendu également que, pour la préparation de quantités limtiées, ou peut employer des flacons secoués et des cul- tures en surface dans des bouteilles.

   D'autres sources de carbone sont le glucose, les mélasses, l'amidon, le galactose, le maltose, :Une autre souche convenable a été déposée sous le nom de Streptomyces spectabliis NRRL 2494. 

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 la dextrine, le glycérol, le mannitol, les huiles glycéridiques, à   savoir   les huiles animales et végétales, et les combinaisons de ces sources de carbone.

   Des sources d'azote convenables sont la levure de brasserie, l'extrait de levure, les solubles de distil- lerie, les grains noirs de distillerie, les liqueurs de macération -:le maïs, la farine de germes de blé, les   salières   solides du lait, collantes de les extraits de viande, la farine de gluten de mais, les liqueurs et d'animaux de poissons,   la ,   farine de poissons, les farines de coton, de soja, d'arachide et de soja dégraissé, l'azote inorganique, par exemple le nitrate et les sels   d'ammonium,   le3 amino-acides, les peptones (viande, soja, oeufs, lait), les produits contenant une peptone, par exemple les hydrolysats pancréatiques et les digestions de ca-   séir.e,   comme les   N-Z-Amines   A et B, les digestions tryptiques de caséine, comme la N-Z-âmine E,

   la trypticase et la. tryptone, ainsi que le   lait, la   viande, le soja et les dérivés des oeufs   protéolysés   
Des sels inorganiques nutritifs, par exemple les sels capables de donner des ions, tels que les ions potassium, sodium, calcium, phosphate, chlorure, sulfate,   etc.,   peuvent être incorporés avantageusement au milieu. Des éléments essentiels en traces, comme le zinc, le magnésium, le manganèse, le cobalt, le fer, etc., peu- vent également être inclus dans le milieu de culture. Ils sont cou- ramment fournis de façon inhérente à l'addition des autres consti- tuants du milieu. 



   La production de l'antibiotique peut être réalisée à toute température contribuant à la croissance de l'organisme, par exemple entre environ 18-37 C. Une   température     relativement   élevée, par   exemple   supérieure à 28 C, de préférence de 32  à 34 C. est   ce-   pendant préférée, les plus hautes températures favorisant la produc- tion de l'antibiotique. Ordinairement, spécialement aux températu- res supéricures, la produetion optimum de l'antibiotique est obte- nue en 2 à 10 jours.

   Le milieu de culture, avant inoculation avec le   raicro-organisne,   est avantageusement réglé à un pa compris entre 7 et   ô.   Le milieu reste normalement à celui-ci et   devrait   être alca- 

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 lin durant fermentation, le pH final dépendant, en partie, du pH initial du milieu de culture, des tampons présents, etc. 



   Lorsque la croissance est réalisée dans de grands réser- voirs ou récipients, il est préférable d'utiliser la forme végéta- tive du micro-organisme pour l'inoculation afin d'éviter un retard prononcé dans la production de l'antibiotique et l'utilisation inef- ficace, qui en découle,de l'installation. De ce fait, il est désira- ble de produire d'abord une culture couchée, par exemple sur du mal-   tose-tryptoïtë   gélose, qui est ensemencée avec une culture lyophilée ou une culture de sol. Un inoculum végétatif du micro-organisme est alors produit par inoculation d'une quantité relativement pe- tite d'un milieu de culture nutritif liquide, l'inoculum étant grat- té de la culture couchée sur gélose.

   Lorsqu'on a ainsi obtenu un   inoculun   végétatif actif, on le transfère de façon aseptique dans de ::rands récipients ou réservoirs. Le milieu dans lequel l'inocu- lum végétatif est produit peut être le même ou être différent de celui utilisé pour la production de l'antibiotique pour autant qu' il soit tel qu'une bonne croissance de l'organisme soit obtenue. 



     L'actinospectacine   est une base azotée, dibasique, ayant un pKa1 de 7 et un pKa2 de   8,7.   Elle est soluble dans l'eau, le méthanol et l'éthanol, et insoluble dans l'acétone et les solvants hydrocarbures. Comme elle n'est que difficilement soluble dans les solvants   organiques   non miscibles à l'eau, il est désirable de réa- liser sa récupération et sa purification par des processus d'adsorp- r tion, notaient une adsorption sur du carbone adsorbant, des résines décolorantes, du gel d'alumine ou des adsorbants   capillaires   simi- laires, ou sur des résines échangeuses de cations, avec ensuite une élution avec un agent   Gluant   convenable.

   Il est   avantageux,   dans de tels procédés, 3'avoir   l'antibiotique   sous forme protonée et, à cet   effet,   il est désirable de   .maintenir   le milieu de culture fermenté et les solutions de récupération à un pH acide au presque neutre. 



   Suivant un processus   préfère,   la liqueur entière est fil- 

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 trée, réglée si nécessaire à un pH aci- de ou presque neutre, de façon convenable entre 4 et 8, et amenée en contact avec du carbone adsorbant. L'antibiotique, encore sous forme protonée ou de sel, est ensuite débarrassée du carbone par élution avec de l'eau, ordinairement de l'eau de ville ou de l'eau désionisée, à laquelle on peut ajouter une petite quantité d'une alkanone inférieure, par exemple de l'acétone. L'éluat peut être acidifie, si on le désire. L'antibiotique peut être récupéré direc- tement de   l'éluat   par évaporation de celui-ci jusqu'à siccité.

   Au lieu de carbone, on peut utiliser des résines décolorantes,   couune   le   Perutit   DR (Brevet USA   n 2.702.263).   



   Dans un autre processus préféré, la totalité de la li- ,lueur est filtrée, réglée si nécessaire à un pH acide ou presque neutre, de façon convenable entre 6 et 8, et amenée en contact avec une résine échanseuse de cations sous tome hydrogénée. On peut utiliser tous les types d'acides carboxyliques et   sulfoniques.   



  Des résides   convenables   d'acides carboxyliques sont les résines d'acides polyacryliques obtenues par la copolymérisation d'acide acrylique et de diviaylbenzène par le processus donné à la page 87 de Ion Exchange Resins, Kunin, 2e Edition   (1958),   John   Wiley   and Sons, Inc. Des résines échangeuses de cations d'acides carboxyli- ques de ce type sont vendues soas les marques Amberlite   IRC-50   et Zeokarb 226. Des résines d'acides   sulfoniques   convenables sont les résines de polystyrène sulfoné nucléaires, pourvues de liaisons transversales avec du divinylbenzène obtenu par le processas donné à la page 84 de l'ouvrage précité de Kunin.

   Des résiner échangeuses de citions sulfonées de ce type sont vendues sous les   barques   Dowex- 50, Amberlite IR-120, Nalcite HCR,   Chempro   C-20, Permutit Q et   Zeokarb   225. 



   L'antibiotique protoné est élué de la résine avec de l' eau à un pH acie, de façon avantageuse à un pH inférieur au pKa de la résine échangeuse de   cations   utilisée. Dn obtient des résultats   satisfaisants   avec un pH   d'environ   1 à 6. L'excès d'acide dans l'é- 

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 luat est neutralisé jusqu'à environ un pH de 6 à   7,   de préférence avec une résine échangeuse d'anions fortement basique, de manière à enlever l'excès d'acide par rapport à la quantité nécessaire pour protoner les groupes basiques.

   Des résines échangeuses d'anions convenant à cet effet sont obtenues'par chlorométhylation, par le processus donné aux pages 88 et 977 de l'ouvrage de Kunin, de po- lystyrène pourvu de liaisons transversales, si on le désire, avec du divinylbenzène prépare par le processus donné à la page 84 de l'ouvrage de Kunin, et "quaternisation" avec de la triméthylamine ou de la diméthylalkanolamine par le processus donné à la page 97 de l'ouvrage de Kunin. Des résines échangeuses d'anions de ce type sont vendues sous les marques Dowex 2, Dowex 20, Amberlite IRA- 400, Duolite A-102 et Permutit S-1. 



   Après que l'antibiotique a été récupéré du milieu de culture, il est encore purifié par adsorption et élution répétées ou par des processus de partage ou de distribution à contre-courant Par exemple, une préparation obtenue par adsorption sur un ad- sorbant peut être purifiée en répétant le procédé, de façon avanta- geuse cependant avec un adsorbant différent, par exemple un échange d'ions, puis une adsorption capillaire, et vice versa.

   A titre   j'exemple,   une préparation obtenue avec une résine échangeuse de cations peut être encore fractionnée sur une colonne chromatogra-   phique   au carbone, dans laquelle l'antibiotique protoné est élué de la colonne avec de l'eau, avantageusement de l'eau désionisée, qui a ordinairement un pH d'environ 5 à 7,   cu   de l'eau de ville qui a ordinairement un pH d'environ 6 à 7, une petite quantité d'environ 1 ou 2% d'une alkanone inférieure, par exemple de l'acé- tone, pouvant y être ajoutée si on le désire. L'éluat dans ce cas ne devra ordinairement pas être concentré   jusqu' à   siccité, car, par concentration et refroidissement,l'antibiotique protoné se sépare- ra ordinairement sous forme d'un sel cristallin.

   Le sel formé dé- pendra de l'acide   particulier   utilisé pour protoner l'antibiotique durant ou après la première adsorption ; par exemple, si on utili- 

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 se de l'acide sulfurique, le sel cristallin est du sulfate d'acti- nospectacine. 



   L'antibiotique peut également être purifié par une chromatographie à partage utilisant un support de diatomite, terre à foulon, silice, cellulose ou matière inerte finement di- visée similaire, et un système solvant à deux phases, par exemple butanol-eau (de préférence avec une trace d'acide para-toluène sulfonique, méthyléthylcétone-eau, et butanol-cyclohexane-eau, ou par une chromatographie à adsorption utilisant   du   carbone ou autre adsorbant. 



     L'artibiotique   peut également être purifié par des transferts successifs de la forme protonée à la forme non protonée et vice versa, spécialement avec interposition d'autres types de traitements, par exemple une recristallisation ou les traitements décrits précédemment. Il peut également être purifié par conver- sion de l'antibiotique, protoné ou non, à des formes moins solu- bles, par exemple par réaction de l'acide hélianthique, de l'acide de Reinecke, de l'acide azobenzène sulfonique, de l'acide picri- que, etc. Les sels ainsi obtenus peuvent être utilisés dans le même but que la base libre, ou bien ils peuvent être reconvertis en base libre et ensuite convertis en d'autres sels, tels que le chlorhydrate, le phosphate et le sulfate. 



   Une recristallisation est réalisée par dissolution du sel d'actinospectacine cristallin dans de l'eau, addition d'une alkanone inférieure, par exemple de l'acétone, et refroldissement par amorcer la cristallisation. Les cristaux sont filtrés et lavés avec une solution aqueuse d'alkanone et, si on le désire, par une alkanone anhydre, et ensuite séchés sous le vide. 



     L'actinospectacine   sous forme de la base libre ou d'un sel par addition d'acide est intéressante dans le traitement des mammifères et des oiseaux pour détruire ou alterner l'effet des ma- ladies qui affectent de tels animaux. Par exemple, l'antibiotique, 

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 comme base libre ou sel, peut être administré dans les aliments   ou l'eau   de boisson d'animaux de laboratoire, tels que souris et rats, durant leur transport pour agir de façon prophylactique en protégeant ces animaux contre le Streptococcus viridans. Les ani- maux peuvent   également   recevoir une injection parentérale d'une   solution   aqueuse stérile de l'antibiotique dans le   mené   but.

   L'an- tibiotique peut également âtre utilisé pour traiter de la volail- le infectée du Salmornella pullorum. 



   Les sels peuvent être convertis à la base libre par neutralisation avec un alcali ou par contact avec une résine anion. que pour élever le pH au-dessus d'environ 8,7, à savoir le pKa2 de   l'antibiotique,   avantageusement jusqu'à environ 9,5 à 11. Des sels particuliers par addition d'acide peuvent alors être prépa- rés par neutralisation de la basa libre avec l'acide approprié jusqu'à un pH inférieur à environ 8,7, avantageusement d'environ 5 à 7. Des acides convenant à det effet sont les acides chlorhydri- ques,   sulfurique,-phosphorique,   acétique, succinique, maléique et fummarique, méthanesulfonique, benzènesulfonique, hélianthique, de   Reinecke,   azobenzènesulfonique, picrique, etc. 



   Les exemples suivants illustrent le procédé et les pro- duits de la présente invention, sans aucun but de limitation. Tous les pourcentages   son+-,   en poids et toutes les proportions du mélan- ge dissolvant sont en volumes, à moins d'indications contraires. 



  EXEMPLE 1 : 
A. Production d'Actinospectacine. 



   Une culture lyophilée de   Streptomvces   spectabilis NRRL 2792 étatit utilisée pour ensemencer le milieu stérile suivant de gélose en tubes couchés . 



   Maltose 10 gr 
Tryptone 5 gr 
K2HPO4 0,5 gr 
NaC1   0,5   gr 
FeSO4 0,1 gr 
Axxx Gélose 20 gr 
Eau désionisée pour faire 1 litre. 

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   Les cultures couchées étaient incubées pendant 7 jours à 30 C: à la fin de cette période, la sporulation était terminée. 



  Les spores   provenant   des cultures couchées sur gélose étaient uti- lisées, en suspension aqueuse, pour inoculer 100 ml de milieu de 
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 pré-ense3encernent dans un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml. Le milieu de pré-ensemencement stérile était constitué comme suit : 
Levure totale séchée 10 gr 
Glucose 10 gr 
Digestionpancréatique de caséine   (N-Z-Amine B)   5 gr 
Eau de ville pour faire 1 litre réglage à un pH de 7,2 avant stérilisation. 



   Le flacon d'ensemencement était incubé pendant 24 heu- res à 32 C sur un secoueur alternatif, après quoi il était utilisé connue inoculum pour un appareil de fermentation d'ensemencement de 20 litres, en une quantité d'environ 5%. L'appareil de fermenta- tion de 20 litres contenait un milieu stérile constitué comme suit: 
Glucose 15 gr 
Amidon de mais 25 gr 
Solubles de distillerie 15 gr 
Levure de brasserie 10 gr 
Liqueur de macération de mais 20 gr 
Eau de ville pour faire 1 litre réglage du pH à 7,2 avant stérilisation. 



   L'appareil de fermentation était incubé pendant 24 heu- res à 32 C et aéré au taux de 6 litres d'air par minute, en pré- voyant une agitation à mouvement circulaire. L'appareil de fermen- tation   était,   utilisé pour inoculer 250 litres du même milieu dans un réservoir de fermentation de   100   gallons.   1200   ml d'huile de saindoux étaient ajoutés durant la fermentation pour contrôler la 
 EMI9.2 
 forman-6&tion de mousse. Le réservoir était soumis à agitation avec une hélice et aéré au taux de 75 litres d'air par minute. Après 96 ii ce"w> r'Io- --.1... ,I...,...!-- ., '"1..!¯..-.-- ..L.''---": 556 -¯¯I¯, d'asti- 7V heures uc .J.t::.l-111t::Uvdv.1.UU, .1.d..L.Lq""',,;""'''' t-trot 550 icgr/Eil d'acti- nospectacine (18,3 mcgr/mgr à sec).

   L'actinospectacine est titrée en considérant son activité contre le Klebsiella pneumoniae par un processus de diffusion standard sur gélose et en utilisant du sul- 

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 fate d'actinospectacine cristallin. 



   B.   Isolement   du sulfate d'actinospectacine. 



   L'actonospectacine était ensuite récoltée comme suit : 
L'entièreté de la liqueur, 250 litres, était filtrée, en utilisant de la diatomite comme adjuyant de filtration. On fai- sait passer le filtrat clair de bas en haut à travers une colonne contenant 40 livres de résine échangeuse de cations de divinylben- zène-acide polyacrylique sous la forme hydrogénée, et ce à une al- lure telle que la résine ne déborde pas de la colonne, en n'excé- dant pas 2 litres par minute. La résine particulière utilisée était une résine en perles de 16 à 50 mailles USA., obtenue par polymérisation en suspension de 95 parties d'acide acrylique et de 5 parties de divinylbenzène en présence de 1 partie de peroxyde de benzoyle suivant l'ouvrage de Kunin.

   Après que toute la liqueur avait traversé la colonne de réine, celle -ci était purgée avec 40 litres d'eau désionisée (pH de 5), et ensuite la colonne était sou- .:.ise à insufflation à sec avec de l'air. La résine était transfor- mée en boue avec environ 5 litres d'eau désionisée, le   pH   était ré- glé à 1,8 avec de   l'acide sulfurique-,   et la boue acidifiée était agitée pendant environ 15 minutes. L'éluat était récupéré par fil-   tr3tion   et le processus était répété avec une autre portion de 5 litres d'eau désionisée.

   La boue était filtrée et la résine était      soumise à insufflation avec de l'air pour enlever   l'éluat.   Les fractions   d'éluat   étaient rassemblées, et le pH était réglé à une valeur de 6,5 par l'addition d'une résine échangeuse d'anions con- tenant des groupes -NMe2C2H4-OH, sous la forme hydroxyle. La rési- ne particulière utilisée était preparee par chlormethylation de perles de polystyrène dépourvu de liaisons transversales de 20 à 50 mailles USA et quaternisation avec de la diméthyléthanolamine suivant le processus de Kunin. L'éluat neutralisé était séparé de la résine par filtration, et ensuite fractionné par une chromato- graphie au carbone (l'éluat séché titrait 120 mgr/mgr d'actino- 

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 spectacir.e).

   Une boue contenant 7,5 livres de charbon actif et 7,5 
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 livres de diatonite était bourrée dans wie colonnx yant un dia- mètre de 6 pouces, à une pression de 10 à 15 livres par pouce car- ré. L'éluat filtré était amené à travers la colonne. Celle-ci était 
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 ) XME7 lavée avec environ 4 volumes (environ 40 litres) d'eau et ensuite éluée avec une solution d'acétone aqueuse à 1% à l'al- lure de 40 ml/minute, 152 fractions de 1 litre numérotées consécu-   tiveent   étant enlevées et titrées. Les fractions titrant plus de 
600 mcgr/ml d'actinospectacine (fractions 60 à 88) étaient rassem- blées, concentrées jusqu'à environ 175 ml, et parachevées par fil- tration. Des cristaux étaient produits par une lente addition avec sigtation d'éthanol aqueux à   95%   à un volume égal du concentré. 



   Par   filtration,   on récupérait 72,5 gr de cristaux titrant 720 mcgr/ mgr d'actinospectacine. Une seconde récolte de cristaux était ob- tenue à partir de la liquear-mère de la mené manière, en procurant 
4,2 gr supplémentaires titrant 720 mcgr/mgr d'actinospectacine. 



   Les matières cristallines combinées étaient dissoutes dans 400 ml d'eau, la solution était filerée et chauffée jusqu'à environ 50 C, et 400   ml   d'acétone étaient ensuite ajoutés lentement, avec agita- tion, à la solution aqueuse. Le mélange était réfrigéré à 4 C pen- dant 24 heures, une cristallisation se produisant pendant ce temps. 



   Les cristaux étaient filtrés de la solution et lavés avec environ 
50 ml d'un mélange d'acétone et d'eau   (1/1   v. /v.) et ensuite avec 
100 ml d'acétone. Lors d'une dessiccation sous le vide à 25 C, on obtenait 55,5 gr de sulfate d'actinospectacine dihydraté, titrant 
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 1000 mc-r/-- r11-r.;nnc:nt"T.,..;nCl P""''';T"\'\'''''+;l"'\n' i, qui, lors d'uns ....¯1::)-'--1:) - j " Y" " 3 -1, qui, ...a..V.LU u \A.±..&. dessiccation ultérieure à   1C0 C..   devenait anhvdre. Préparation la. 



   C. Caractérisation du sulfate   d'actinospectacine.   



   Le sulfate d'actinospectacine, préparé comme décrit en 
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 L, 1UV,U\'.J..d....I..\I 1C3J .i-".LV,1J.J.....I,.("..V\J':  ValQW p110Vltiué ,oU...1..VcUl\.10,o, Activité antimicrobinne (in vitro) 

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 TABLEAU 1 
 EMI12.1 
 
<tb> Organisme <SEP> de <SEP> test <SEP> Concentration <SEP> inhibitrice <SEP> minimum
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> ; <SEP> dans <SEP> bouillon.. <SEP> de <SEP> cervelle) <SEP> (CIM), <SEP> en <SEP> mcgr/ml <SEP> (20 <SEP> heures).
<tb> 
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<tb> 



  Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 250
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<tb> Streptococcus <SEP> hemoly-tious <SEP> 64
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<tb> Streptocnccus <SEP> viridans <SEP> 500
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<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 250
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<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> '64
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<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 32
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<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 64
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<tb> 
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 250
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<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 64
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<tb> Pseudoonas <SEP> aeruinosa <SEP> 250
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<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 125
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<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 64
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<tb> Salmonella <SEP> 

  pullorum <SEP> 64
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<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 32
<tb> 
 Activité   antimicrobienne   (in vivo) 
L'activité antibactérienne in vivo est montrée au ta- bleau II. Les résultats étaient obtenus sur des souris et représen- tent la dose nécessaire pour obtenir 50% de survie parmi les ani- maux infectés. Parmi les animaux témoins   non   traités, aucune des souris infectées ne survivait. 



   TABLEAU II 
 EMI12.2 
 
<tb> Organisme <SEP> Dose <SEP> protectrice <SEP> moyenne
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<tb> 
<tb> (CD50), <SEP> mgr/kg/jour
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> sous-cutanée <SEP> buccale
<tb> 
<tb> 
<tb> Straphylococcus <SEP> aureus <SEP> 40 <SEP> 314
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 22,5 <SEP> 714
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> hemolyticus <SEP> 57 <SEP> >800
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 63 <SEP> >800
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 194 <SEP> >800
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Klebsiella <SEP> multocida <SEP> 14 <SEP> 355
<tb> 
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<tb> 
<tb> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 26 <SEP> 112
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 22,

  5 <SEP> 120
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> >320 <SEP> >800
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> >320 <SEP> >800
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> 208 <SEP> ---
<tb> 
 
Les tests in vivo sur les souris, en utilisant l'acti- nospectacine, montraient que la dose tolérée maximum (DTM) était 

 <Desc/Clms Page number 13> 

 supérieure à 400   mgr/kg   par voie sous-cutanée et de plus de 1000   mgr/kg   par voie buccale, et que la LD50 par voie intérieure au péritoine était inférieure à 2000 mgr/kg. 



    Analyse   du chromatogramme sur   papier :   
L'allure du chromatogramme sur papier caractéristique dans différents systèmes solvants, où la zone active est localisée par   bioautographie   avec du K. pneumoniae, est montrée au tableau III. 



  Chromatogramme sur papier de l' actinospectacine. 



   Les rapports liquide/liquide sont donnés en volume par volume. Les solides, en pourcentages des liquides, sont données en grammespar millilitre. 



   TABLEAU III. 
 EMI13.1 
 
<tb> 



  Système <SEP> solvent <SEP> Rf
<tb> 
<tb> n-butanol, <SEP> eau <SEP> (84:16) <SEP> 0,025
<tb> n-butanol, <SEP> eau <SEP> (82:16) <SEP> plus <SEP> 0,25%
<tb> d'acide <SEP> p-toluènesulfonique <SEP> 0,17
<tb> n-butanol, <SEP> acide <SEP> acétique, <SEP> eau <SEP> (2:1:1) <SEP> 0,43
<tb> 2% <SEP> pipéridine <SEP> dans <SEP> n-butanol, <SEP> eau <SEP> (84:16) <SEP> 0,2
<tb> 
 Caractéristiques physiques : Analyse élémentaire : Dessiccation à 25 C. C : 36,46 ; H :   6,94 ;   N : 5,85 ; 
0 : 46,91 ; S : 8,22 Dessiccation à   100 C. ;     C :   39,02; H : 6,60; N :   6,08 :   o :   42,72 ; s :   7,33. 



   Ces analyses s'accordent le mieux respectivement aux formules suivantes : C14H25N2O7.H2SO4.2H2O et C14H26N2O7.H2SO4. 



  Point de fusion : décomposition'à environ 185'Ce Rotation optique : [Ó]25- +17  (H2O)   @   Spectre dans l'ultraviolet : pas d'absorption à 220-400 mu (H2O). 



    Spectre dans l'infrarouge : /La courbe dans l'infrarouge montre une absorption ca-     ractéristique   aux fréquences suivantes : 3540, 3400, 3250, 3050, 
2470 2740, 1610, 1493, 1420, 1360, 1345,   1330,   1290, 1265,   1240,   1198,   982, 1163, 1133, 1118, 1080. 1065. 1050. 1038. 1012. 996. 982, Q62. 940   

 <Desc/Clms Page number 14> 

 896, 870, 848, 705. 
 EMI14.1 
 Basicité : .......1r 7 (uz0) "d2 : 15 (H 0) Tests par touches 
Anthrone, positif 
Benedicts, négatif à légèrement positif 
Biuret, positif discutable   Maltol.,   négatif 
Molish, positif discutable   Ninhydrin e,   négatif   Sakaguchi   négatif   Diffraction   des rayons   X .   



   Les résultats donnés ci-après montrent des espacements interplanaires, exprimés en unités Angstroems, caractéristiques des cristaux de sulfate.      



   LIGNES PRINCIPALES, A 
9,71   4,43   3,25 2,49 
8,40   4,27   3,15   2,43   
7,37 4,04 3,05 2,36 
6,60 3,93 2,95 2,29 
6,09 3,78 2,87 2,23 
5,63 3,65 2,74 2,20 
5,26   3,54   2,61 2,17 
4,89 3,47 2,57 2,12   4,74   3,37 2,51 2,06 
1,95 EXEMPLE 2 : 
Formation de la base libre d'actinospectacine. 



   1 gr de sulfate d'actinospectacine, préparé comme à l'exemple 1, était dissous dans 10 ml d'eau bouillie à ur. pH de 6,4. La solution était passée à travers une colonne contenant 10   ,il   de la même résine qu'à l'exemple 1B. La colonne était lavée avec de l'eau bouillante (pH 6,4), qui avait été refroidie, pour donner 50 ml de solution aqueuse à un pH de 10,5. Celle-ci était séchée par congélation pour donner   500   mgr   d'actinospectacine   sous forme de la base libre, Préparation 2. 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 



   Caractéristtion de la base libre d'actinospectacine. 



   La base libre d'actinospectacine, préparée comme ci- avant, montrait essentiellement les mêmes activités antimicrobien- nes in vitro et in vivo que le sulfate d'actinospectacine cristal- lin, donne la mène allure caractéristique au chromatogramme sur papier, et avait les caractéristiques chimiques et physiques sui- vantes :   Formule : C14H26N207   
Rotation optique : [Ó]25 = -20  (H2O) 
Spectre dans l'ultraviolet : pas d'absorption 220-400 m    (H20)   
Spectre dans l'infrarouge : 
La courbe dans l'infrarouge montre une absorption ca- ractéristique aux fréquences suivantes : 3380, 3280,   3140,   1733, 1600, 1340, 1250, 1255, 1163,   1115,   1100, 1055, 1020, 953, 925, 885,   845,   805. 



  Basicité : pKal : 6,95 (H2O); pKa2 : 8,7   (H20)   Tests par touches   3enedicts :   négatif à légèrement positif 
Maltol: négatif 
Sakaguchi: négatif 
La base libre   d'acinospectacine   peut également être produite par l'addition d'hydroxyde de baryum à une foluticn aqueu- se de sulfate d'actinospectacine, en une quantité suffisante pour élever le pH à environ 10,5. La solution résultante est ensuite filtrée et séchée pour donner la base libre   diactinospectacine,     EXEMPLE 3 : :   
Préparation du dichlorhydrate ci'actinospectacine. 



   2 gr de la base libre d'actinospectacine, préparée suivant   l'exe..iple   2, étaient dissous dans 95 ml d'eau.   A   cette   so-   lution, on ajoutait 0,82 ml d'acide chlorhydrique concentré pour modifier le pH de 10 à 6,6. La solution était   séchée   par congéla- tion pour donner 2,26 gr de dichlorhydrate d'actinospectacine, Préparation 3, sous   forrie   d'une solide amorphe. 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 



   Du dichlorhydrate d'actinospectacine, préparé   comme   ci-avant, avait essentiellement les mêmes activités antimicrobien- nes in vitro et in vivo que le sulfate cristallin. 



  EXEMPLe 4 : 
Préparation du   phosphate   d'actinospectacine. 



   2 gr de la base libre d'actinospectacine, préparée suivant l'exemple 2, étaient dissous dans 95 ml d'eau. A cette solution, on ajoutait 0,4 ml d'acide phosphorique concentré pour   modifier le   pH de 10 à 6,5. La solution était séchée par congéla- tion pour donner   2,74   gr de phosphate d'actinospectacine, Prépara- tion 4, sous forme d'un solide amorphe. 



   Le phosphate d'actinospectacine, préparé comme ci-avant      avait essentiellement les mêmes activités   antimicrobiennes   in vi- tro et in vivo que le sulfate cristallin. 



  EXEMPLE 5 : 
Préparation du dihélianthate d'actinospectacine. 



   A 500 mgr de sulfate d'actinospectacine, préparé sui- vant l'exemple 1, dissous dans 10 ml   d'eau,   on ajoutait 500 mg de méthylorange dissous dans 15 ml d'eau chaude. Un précipité cristal- lin se formait immédiatement. On laissait refroidir la solution pen dant 2 heures à 4 C. Les cristaux étaient enlevés par filtration et lavés à l'eau. Les cristaux lavés étaient dissous dans 70 ml de méthanol et on ajoutait 20   ml   d'eau. On laissait reposer la so- lution pendant une nuit à environ 4 C, une cristallisation se pro- duisant pendant ce temps.

   Les cristaux étaient récupérés par fil- tration, lavés à   l'eau   et séchés sousle vide pour   dorner   200 mgr de dihélianthate d'actinospectacine cristallin, Préparation 5, qui avait un point de fusion de   220 -225 C.   Cette matière a également une activité antibactérienne semblable à celle du sulfate d'actino- spectacine tristallin. Par   dissolution   clans du méthanol aqueux cota-   .:le   ci-avant et neutralisation avec une résine échangeuse d'anions sous la forme hydroxyde comme à   l'exemple   2, on obtient la base li- bre d'actinospectacine d'un degré   élevé   de pureté.

Claims (1)

1. REVENDICATIONS.

   1. Un procède consistant à cultiver un organisme pro- duc@eur d'actinespectacine dans un milieu nutritif aqueux sous des conditions aérobies jusqu'à ce qu'une activité d'actinospectacine importante soit impartie à ce milieu par production d'actinospec- tacine, et à isoler l'actinospectacine de ce milieu de culture.

   2. Un procédé suivant la revendication 1, dans lequel l'organisée est le Streptomyces spectabilis.

   3. Un procédé suivant les revendications 1 ou 2, dans lequel l'actinospectacine est isolée du milieu de culture par ad- sorption sur un adsorbant solide.

   4. Un procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions précédentes, dans lequel la culture est effectuée à une tem- pérature d'environ 18 C à environ 37 C pendant une période compri- se entre environ 2 et 10 jours.

   5. Un procédé suivant l'une quelconque des revendica-' tions précédentes, dans lequel l'isolement est réalisé par adsorp- tion de l'actinospectacine, sous forme protonée, sur un adsorbant solide, et élution de l'actinospectacine protonée à partir de cet adsorbant.

   6. Un procédé suivant la revendication 5, dans lequel l'adsorbant solide est une résine échangeuse de cations.

   7. Un procédé suivant la revendication 6, dans lequel l'actinospectacine protonée isolée est encore fractionnée par chromatographie.

   8. Un procédé de récupération d'actinospectacine à partir d'une solution aqueuse en contenant, qui comprend la mise en contact de la solution aqueuse à un pH compris entre environ 5 et 7 avec une résine échangeuse de cations, et l'élution de l'acti-. nospectacine adsorbée, avec une solution aqueuse d'un acide miné- ral non oxydant fort à un pH inférieur au pKa de la résine.

   9. Un procédé de récupération d'actinospectacine à par- tir d'une solution aqueuse en contenant, qui comprend la mise en <Desc/Clms Page number 18> contact de la solution aqueuse, à un pH compris entre environ 5 et 7, avec un adsorbant capillaire solide, et l'élution de l'ac- tinosepctacine adsorbée, avec de l'eau, à un pH compris entre en- viron 5 et 7.

   10. L'actinospectacine sous la forme de la base libre ou a'un sel de celle-ci.

   11. L'actinospectacine sous la forme de la base libre cristalline ou d'un sel cristallin de celle-ci.

   12. La base libre d'actinospectacine.

   13. Un sel par addition d'acide de l'actinospectacine.

   14. Un composé suivant la revendication 13, sous sa fore cristalline essentiellement pure.

   15. Le sulfate d'actinospectacine.

   16. Le composé de la revendication 15, dans sa forme cristalline essentiellement pure.

   17. Le dichlorhydrate d'actinospectacine.

   18. Le phosphate d'actinospectacine.

   19. Le dihélianthate d'actinospectacine.

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