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NOUVEL IMMUNISANT
La présente invention se rapporte à des nouveaux agents d'immunisation, ainsi qu'à des compositions les contenant ; elle vise plus particulièrement des compositions immunisantes à base d'endotoxines microbiennes, susceptibles de procurer des immunisations non spécifiques. L'invention concerne, en outre, un procédé pour la préparation des dits agents et compositions.
Des produits provenant de bactéries ont été précédemment proposés pour la stimulation de la sécrétion
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d'hormone adrenocorticotrope (ACTH) p la glande pitui- taire, qui ... à son tour - provoque la stimulation de l'écorce des glandes surrénales et la sécrétion de stéroïdes corticaux. De tels traitements, connus également sous le nom de "thérapeutique non spécifique", ont été en général abandonnés à cause de la toxicité et des effets secondaires incontrôlables qu'ils impliquent ; ils ont, d'autre part, cédé la place à la thérapeutique directe, bien contrôlée, qui consiste à employer des hormones ACTH hautement purifiées et des stéroïdes synthétiques.
Le terme "nox spécifique", employé dans la suite de la presente description, a une sign 41v11 jrui faitement valable, mais tout à fait différente du sens qu'il a dans le paragraphe précédent. La nouvelle acception de ce terme, entendue ici, se rapporte à la protection, au moyen d'un produit d'origine microbienne, contre des microorganismes hétérologues, c'est-à-dire contre des microorganismes ne correspondant pas directement, au point de vue immunologique, aux bactéries à partir desquelles l'endotoxine a été obtenue ; ceci constitue une distinction par rapport à l'immunité spécifique, obtenue par l'application dtun antigène spécifique pour une infection homologue, c'est-à-dire d'un vaccin.
Le mécanisme de l'immu- nisation non spécifique et de la protection contre l'infection n'est pas bien connu, mais il semble se rapporter à la stimulation du système réticulo-endothélial. Il est à noter, à ce point de vue, que la composition suivant la présente invention peut induire une stimulation importante de ce système.
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On a suggéré antérieurement l'emploi de dérivés acétylés de vaccins bactériels en tant que vaccins spéci- fiques mais non pas pour l'immunisation non spécifique comme indiquée dans la présente description. On a songé à appliquer de tels vaccins simplement après l'acétylation. sans fractionnement en vue d'isoler la fraction immunolo- giquement active ; même avec acétylation et l'emploi d'une proportion particulière de composition acétylée, il n'y eut pas de réduction sensible ou de suppression de la ou pyrogénicité/de la toxicité du mélange global employé.
Un des objets de la présente invention est un produit d'origine bactérienne convenant à l'immunisation non spécifique, ainsi qu'un procédé pour la préparation de ce produit avec haut rendement, de façon simple et efficace.
Un autre objet de l'invention réside dans des compositions contenant un tel produit et des antibiotiques connus.
Divers autres objets et avantages de l'invention ressortent de la description détaillée qui suit.
Conformément à l'invention, une composition immunisante, pratiquement non toxique, comprend un extrait lipopolysaccharidique d'endotoxine de bactérie, partiel- lement acylé,. l'endotoxine acylée étant lyophobe et inso- luble dans l'eau et dans le chloroforme, l'hydrate de carbone présent étant incomplètement acylé. L'extrait sui- vant l'invention, qui peut contenir une protéine, a son utilité en tant qu'agent non spécifique d'immunisation ; en mélange avec des antibiotiques il conduit à des produits
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thérapeutiques de toxicité diminuée.
Etant donné que cet extrait d'endotoxine ren- force la résistance non spécifique aux porteurs de germes, son addition aux agents thérapeutiques antimicrobiens, tels qu'antibiotiques, par exemple pénicilline, strepto- mycine ou sulfonamide, ouvre la possibilité d'utilisation de doses plus faibles de ces agents, atteignant ainsi le but thérapeutique avec une toxicité moindre due à ces agents. Bien que l'adjonction d'endotoxines à l'antibio- ticothérapie fût proposée antérieurement, les effets secondaires, auxquels elle donne lieu, ont empêché son adoption généralisée. De plus, l'administration dtendo- toxines naturelles, connues, provoque une sensibilisation temporaire, accrue, à l'infection, augmentant ainsi les dangers de leur utilisation dans des conditions infectieuses.
En contraste frappant avec cet état de choses, les extraits d'endotoxine acylés, suivant l'invention, ne produisent pas d'effets secondaires incontrôlables ; mélangés aux antibiotiques ils donnent lieu à une synergie imprévue, permettant d'abaisser les doses efficaces d'antibiotique, ce qui réduit la toxicité due à la dose de ce dernier ; les extraits selon l'invention permettent donc l'emploi, à faibles doses, des antibiotiques trop toxiques pour être utilisés à doses habituelles provoquant souvent une atteinte du nerf auditif, de la moelle osseuse ou autres accidents.
L'extrait acylé d'endotoxine, pratiquement non toxique, applicable comme agent d'immunisation non spécifique, conformément à l'invention, est préparé par un
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procédé qui comprend l'extraction de l'endotoxine d'un milieu de culture microbienne à Gram positif ou négatif, ou bien de micro-organismes acidorésistants, suivie d'a- cylation - de préférence acétylation - dans un milieu substantiellement anhydre, avec un dérivé acylé, le mé- lange résultant étant fractionné à une température élevée, c'est-à-dire 80 C à 120 C. Le mélange réactionnel, une fois refroidi, est soumis à la centrifugation amenant le dépôt d'un. précipité qui est séparé. Le précipité est ensuite traité par une solution saline exempte de pyrogène, et le mélange est centrifugé ou séparé par sédimentation ou par toute'autre méthode connue.
A la suite de cet Le opération on obtient un précipité compact et une suspension fine. Cette dernière est re jetée. Après des lavages successifs du précipité, avec de l'eau stérilisée, exempte de pyrogène, le produit résultant est séché pour former la composition suivant l'invention, qui sera désignée comme Fraction P dans la suite de la description.
L'acylation de l'endotoxine est réalisée de façon à acyler partiellement l'hydrate de carbone présent ; l'extrait doit être lyophobe, c'est-à-dire ne donnent pas de solution opalescente dans l'eau, tout en n'étant pas converti en un produit complètement acylé, soluble dans le chloroforme. Il est entendu que le degré d'acylation dépend du pourcentage d'hydrate de carbone présent dans l'en- dotoxine initiale, à acyler ; lespréparations plus riches en azote contiennent moins d'hydrate de carbone.
Le précipité formé au cours de la première cen-
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trifugation est normalement séché en vue de l'élimina- tion de l'agent d'acylation qui n'a pas réagi ; broyé à l'état de poudre il est envoyé à la seconde centri- fugation avec la solution saline exempte de pyrogène.
Les différentes phases de dessication, auxquelles le précipité est soumis dans le présent procédé, ont lieu à la température ambiante sous un courant d'azote.
La préparation de l'endotoxine, ainsi que le fractionnement subséquent, sont, bien entendu, conduits au sein d'une solution saline physiologique stérile., exempte de pyrogène. Les appareils employés à cet effet sont rendus exempts de pyrogènes par cuisson à 175 C - 180 C pendant environ deux heures.
Les endotoxines employées ici sont extraites d'une variété d'organismes à Gram positif ou négatif, ou acido-résistants, par diverses techniques classiques ; les extraits obtenus présentent des activités biologiques similaires, variant cependant selon le degré de purification effectuée. Ces endotoxines, appropriées à la préparation des compositions acylées suivant l'invention, ont des poids moléculaires évalués à un million jusqu'à dix millions ; elles apparaissent comme constituées de lipides, d'hydrates de carbone et de protéines ; la teneur en ces dernières est sensiblement diminuée, voire supprimée, lorsque la purification est plus poussée.
Une certaine teneur en azote, par exemple jusqu'à 6% en poids, est toutefois normalement présente dans l'endotoxine ottenue, ce qui correspond à la présence d'au moins de traces de
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protéine en plus de sucres aminés. L'extraction de l'en- dotoxine est généralement réalisée au moyen d'acide trichloracétique ou de solutions aqueuses de phénol ; des modes opératoires bien connus dans l'art sont décrits par exemple par : WESTPHAL et autres dans "Zeitschrift fûr Naturforschung" vol. 7 B, Page 148 (1952) ; BURGER - "Bacterial Polysaccharides" pages 231,243, 244, 248, 251 et suivantes (1950) ; WESTPHAL - "Die Chemie" vol. 57, pages 57 et 61 (1944) ; Boivin, A.L.
Mesrobeanu (1935) - Rev. d'Immunol 1, 553 - 569.
Des endotoxines convenant à l'acylation et la production de la Fraction P susindiquée, par le pr# édé décrit ici, sent extraites des bactéries à Gram négatif, telles que Salmonella typhosa, Salmonella paratyphi, Salmonella enteritides, Salmonella abortus equi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marscens, Brucella abortus, Shigella dysenteriae, Hemophilus pertussis.
Les Gram positives, appropriées, comprennent les staphylocoques tels que Staphylococcus aureus et des espèces de Streptocoques. De plus, des extraits convena- bles, de nature endotoxique, peuvent provenir des organis- mes acido-résistants tels que Mycobacterium tuberculosis (BCG).
L'acylation des endotoxines, extraites de ces différents microorganismes, peut Être effectuée, d'après l'invention, avec des halogénures d'acyles, par exemple chlorure d'acétyle ou chlorure de benzoyle ; elle peut l'être avec des anhydrides, comme par exemple ceux des
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acides butyrique, propionique ou - de préférence .. anhydride acétique, c'est-à-dire des anhydrides d'acides monocarboxyliques saturés, dans lesquels chacune des moitiés acyliques contient 2 à 4 atomes de carbone. Un procédé particulièrement efficace consiste à produire l'acylation au moyen d'anhydride acétique et d'acétate de sodium.
Il est à noter que la composition- immunisante, non spécifique, acylée suivant l'invention, désignée comme
Fraction P, tout en étant dépourvue de la toxicité mani- festée par l'endotoxine de départ elle-même, jouit, dans beaucoup de cas, de propriétés d'immunisation non spéci- @ endotoxine. Un fait important, à noter à ce propos, est la réversibilité de la détoxification de la Fraction P.
Ainsi, la désacylation de la Fraction P au moyen d'une base alcaline, telle que soude (c'est-à-dire 0,01 N
NaOH, 50 C, 30 minutes), a pour effet de rendre à l'endo- toxine initiale ses pyrogénéité et léthalité. D'autre part, une acylation excessive de la Fraction P fait dis- paraitre l'activité. Au cours de la désacylation, la pro- tection non spécifique revient avant la toxicité.
D'après ce qui a été dit plus haut, on voit qu'au cours de la préparation selon l'invention des frac- tions, contenant l'endotoxine modifiée et partiellement modifiée, sont extraites du mélange réactionnel acylé.
Ainsi, après chauffage à 80 C - 120 C, et de préférence à environ 100 C, du mélange d'endotoxine avec l'agent
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d'acylation, et après centrifugation subséquente, on obtient une Fraction L à partir de la solution résultante qui contient l'excès d'agent d'acylation, par exemple d'anhydride acétique ; cette solution est évaporée par chauffage doux, pour produire la Fraction L susmen- tionnée, sous la forme d'un solide sec.
Le précipité formé, restant après la centri# fugation et séparation de la solution contenant de l'halogénure d'acyle ou de l'anhydride libre, est broyé et centrifugé dans une solution saline exempte de pyrogène, ce qui conduit à une suspension fine et un précipité lourd compact. La suspension est réunie aux eaux des lavages successifs, effectués sur le précipité lourd avec de l'eau stérilisée exempte de pyrogènes ; ce mélange liquide est alors dialysé à basse température, par exemple à 4 C, avec renouvellements répétés d'eau stérile, exempte de pyrogènes, dans le but d'éliminer le chlorure de sodium. La suspension ainsi d-ialysée est ensuite lyo- philisée pour récupérer une seconde fraction de solides, désignée par le nom de Fraction E.
Le précipité compact est séché dans un courant d'azote, comme indiqué plus haut, en vue de la préparation de la Fraction P.
La Fraction E, conserve la toxicité de l'endo- toxine de départ, tandis que les Fractions L et P sont essentiellement non toxiques. La fraction E peut être employée comme matière de départ pour une nouvelle acylation, permettant de récupérer encore une portion de Fraction P.
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La Fraction L est pratiquement inactive au point de vue de la protection que procure la Fraction P ; cette dernière est non pyrogénique et non toxique, tout en manifestant une activité d'immunisation non spécifi- que, équivalente à celle de l'endotoxine initiale.
Les exemples qui suivent, illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLE 1
Une endotoxine de haute activité, contenant 6% d'azote, a été préparée par la méthode d'extraction clas- a sique, à l'acide trichloracétique, à partir de Salmonella @ '"P'....&.1 endotoxine est d'environ 1/1000 de microgramme ; LD50 pour la souris est d'environ 0,25 mg. Elle protège contre l'infection aux doses de l'ordre de microgramme.
On place 100 mg de cette endotoxine dans un tube conique de centrifugation, de 40 ml, stérilisé, exempt de pyrogène ; on y ajoute 25 ml d'anhydride acétique (qualité ACS) et lOmg d'acétate de sodium anhydre. Le mélange réactionnel est ensuite chauffé dans un bain d'eau bouillante, pen- dant 2 heures. Le tube centrifuge et son contenu sont alors refroidis et centrifugés. La solution claire d'anhy- drïde acétique est transférée dans un flacon stérilisé, dans lequel leolvant est évaporé sous azote, par chauf- fage doux à 30 C- 35 C ; les solides secs, ainsi obtenus, constituent la Fraction L.
Le précipité brunâtre, restant dans le tube centrifuge, est séché dans un courant d'azote à la température
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ordinaire, jusqu'à élimination de toutes trces d'anhydrid.
Après dessication, le solide est broyé en une poudre fine, dans un mortier stérilisé, et il est remis dans le tube centrifuge avec 20 ml d'une solution saline (0,85% NaC1), stérilisée et exempte de pyrogène. Après la mise en sus** pension de la poudre dans cette solution, la suspension est centrifugée à faible vitesse ; on obtient un précipité compact et une suspension fine, soyeuse, de solides dans la solution saline ; cette suspension est séparée.
Le précipité est lavé deux fois, et l'on termine par un lavage avec de l'eau stérilisée, exempte de pyrogène.
Les eaux de lavage réunies sont dialysées, à environ 4 C,
EMI11.1
"Dar 311mpq n''''<>' ..+..!:..;, ¯'¯:"'r , r éliminer NaCl de la solution initiale ; la suspension, ainsi dialysée, est alors lyophilisée et l'on récupère les solides qui forment la Fraction E.
Le précipité lourd, lavé à la solution saline et à l'eau, est à nouveau séché sous azote, à la température de la pièce, et broyé en une poudre fine, à l'aide d'un mortier stérilisé ; on a ainsi la Fraction P, l'agent non spécifique d'immunisation, selon l'invention.
La Fraction L, récupérée à partir de la solution séparée après la 1ère centrifugation, est dissoute complètement dans un mélange chloroforme-méthanol 2:1. et la solution résultante est introduite dans une fiole tarée. Le solvant est évaporé sous azote à la température ambiante, après quoi on repèee la fiole.
La Fraction solide E, obtenue après lyophilisation, ainsi
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que la fraction P, séchée sous azote, sont également pesées. Comme indiqué, l'endotoxine de départ et les différentes fractions sont préparées, avec toutes précautions de stérilisation, en suspension dans des solutions salines physiologiques, stérilisées et exemptes de pyrogène. Tous les appareils, employés en contact direct avec ces compositions sont rendus exempts de pyrogène par cuisson à 175 C - 180 C pendant deux heures.
On obtient : 31 mg de Fraction L, 22 mg de Fraction E et 45 mg de Fraction P, soit un total de 98 mg.
Les résultats d'analyse de ces fractions sont réunis au Tableau I, ci-dessous.
TAELEAU I
EMI12.1
<tb>
<tb> Fraction <SEP> Analyse
<tb> Hexose <SEP> Acétyle
<tb> Endotoxine <SEP> initiale <SEP> 32 <SEP> 1,6
<tb> Fraction <SEP> L <SEP> 18 <SEP> 7,0
<tb> Fraction <SEP> E <SEP> 35 <SEP> 3,2
<tb> Fraction <SEP> P <SEP> 29 <SEP> 12,0
<tb>
L'hexose, déterminé par la méthode d'anthrone, est exprimé en pourcents, comme une partie de glucose pour une de galactose.
L'acétyle est déterminé par saponification avec NaOH 0,02 N à 55 C pendant 30 minutes, et titrage au rouge de phénol avec HC1 0,01 N.
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La toxicité relative de l'endotoxine de départ, utilisée dans le présent exemple, et des fractions obtenues après acylation, a été étudiée par des essais dans lesquels ces substances étaient administrées aux souris, par voie intrapéritonale.
La Fraction E a montré une toxicité équivalente à celle de l'endotoxine de départ.
Les fractions L et P étaient dépourvues de toxicité.
Les résultats de ces essais sont indiqués au Tableau II.
TABLEAU II Toxicité pour les souris :
EMI13.1
<tb>
<tb> Mortes/total <SEP> % <SEP> Mortes
<tb> Endotoxines, <SEP> 0,3 <SEP> mg.... <SEP> 13/20 <SEP> 65
<tb> " <SEP> 0,6 <SEP> " <SEP> .... <SEP> 17/24 <SEP> 71
<tb> " <SEP> 0,9 <SEP> " <SEP> .... <SEP> 10/10 <SEP> 100
<tb> Fraction <SEP> L, <SEP> 0,6 <SEP> mg <SEP> .... <SEP> 0/15 <SEP> 0
<tb> " <SEP> E <SEP> 0,3" <SEP> .... <SEP> 6/10 <SEP> 60
<tb> " <SEP> E <SEP> 0,6 <SEP> " <SEP> .... <SEP> 10/10 <SEP> 100
<tb> " <SEP> P <SEP> 0,6 <SEP> " <SEP> .... <SEP> 0/9 <SEP> 0
<tb> " <SEP> P <SEP> 0,9 <SEP> " <SEP> 0/10 <SEP> 0
<tb>
Le degré de pyrogénicité de l'endotoxine initiale et des fractions préparées a été déterminé sur des lapins mâles de 2 à 2,5 kg de souches différentes.
Les substances à essayer étaient administrées par voie intraveineuse, et on prenait la température rectale des animaux traités, toutes les demi heures après l'injection, pendant cinq heures.
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Il en résulte que la Fraction E manifeste un haut degré de pyrogénicité, produisant des réponses fébriles égales à celles de l'endotoxine initiale, aux mêmes doses.
Par contre, la Fraction P était caractérisée par un abaissement considérable des effets pyrogènes, cornue le montre la mesure de sa pyrogénicité résiduelle, ne dépas- sant pas le millième (1/1000) de celle que manifestait l'endotoxine initiale.
D'autre part des essais ont été effectués pour se rendre compte de la protection non spécifique apportée par les substances en question. Pour cela, des solutions salines isotoniques, non pyrogéniques, de ces substances étaient injectées à des souris ICR (Bellewood) pesant de 16 à 18 grammes, par voie intrapéritonale ; traitement était appliqué 24 heures avant injection, par la même voie, d'un organisme infectant. La morlalité des animaux traités et des animaux témoins était déterminée à différents intervalles de temps, selon la nature de l'infection inoculée. Le tableau III, ci-dessous, montre que la Fraction P procure une protection au moins équivalente à celle de l'endotoxine initiale, pour les mêmes doses, contre Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa.
Dans ce tableau III les rapports morts/total étaient notés 3 jours après l'inoculation de l'infectant. Le mot "Saline" désigne les témoins ayant subi l'injection de solution saline, sans immunisant.
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TABLEAU III
EMI15.1
<tb>
<tb> Organisme <SEP> Fraction <SEP> Dose <SEP> en <SEP> Morts/total <SEP> Morts
<tb> infectant <SEP> micro <SEP> gramme <SEP> s <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> Saline <SEP> - <SEP> 10/10 <SEP> 100
<tb> aeruginosa <SEP> Endotoxine <SEP> 10 <SEP> 4/10 <SEP> 40
<tb> Fraction <SEP> P <SEP> 10 <SEP> 3/10 <SEP> 30
<tb> Escherichia <SEP> Saline <SEP> - <SEP> 10/10 <SEP> 100
<tb> coli <SEP> Endotoxine <SEP> 10 <SEP> 5/10 <SEP> 50
<tb> Fraction <SEP> P <SEP> 10 <SEP> 2/10 <SEP> 20
<tb>
Les doses appliquées étaient d'environ 0,6 mg par kilogramme d'animal.
Les temps de survie étaient étudiés sur des souris, par injection intrapéritonale de solution saline physiologi- que, non pyrogénique, contenant la substance à essayer, et ensuite inoculation d'une dose léthale de Salmonella typhimurium. Le Tableau IV résume ces essais.
TABLEAU IV Infection par Salmonella typhimurium.
Morts / Total
EMI15.2
<tb>
<tb> Fraction <SEP> Dose <SEP> en <SEP> Jours <SEP> : <SEP>
<tb> microgrammes <SEP> I <SEP> II <SEP> III <SEP> IV <SEP> V <SEP> VI <SEP> VII
<tb> Saline <SEP> - <SEP> 0/10 <SEP> 0/10 <SEP> 5/10 <SEP> 9/10 <SEP> 10/10 <SEP> - <SEP> L <SEP> ... <SEP> 10 <SEP> 0/10 <SEP> 1/10 <SEP> 4/10 <SEP> 6/10 <SEP> 8/10 <SEP> 10/10 <SEP> - <SEP>
<tb> E <SEP> 10 <SEP> 0/10 <SEP> 0/10 <SEP> 0/10 <SEP> 1/10 <SEP> 1/10 <SEP> 2/10 <SEP> 5/10
<tb> P <SEP> 10 <SEP> 0/10 <SEP> 0/10 <SEP> 0/10 <SEP> 1/10 <SEP> 2/10 <SEP> 3/10 <SEP> 4/10 <SEP>
<tb> Endotoxine <SEP> 10 <SEP> 0/10 <SEP> 0/10 <SEP> 1/10 <SEP> 2/10 <SEP> 3/10 <SEP> 6/10 <SEP> 6/10
<tb>
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Des essais similaires, avec inoculation de staphylococcus aureus, et observation en 48 heures sont relatés au Tableau V.
TABLEAU V
Infection par le Staphylocoque aureus
EMI16.1
<tb>
<tb> Fraction <SEP> Dose <SEP> en <SEP> Morts/total
<tb> microgrammes
<tb> Saline <SEP> - <SEP> 5/10
<tb> Endotoxine <SEP> 10 <SEP> 0/10
<tb> " <SEP> 50 <SEP> 0/10
<tb> P <SEP> 10 <SEP> 0/10
<tb> P <SEP> 50 <SEP> 0/10
<tb>
étaient cultivés dans un bouillon d'extrait cérébral (Difco) pendant 18 heures à 35 C, que l'on diluait, con- venablement, avant l'injection, avec du bouillon stérile, selon la technique classique.
Le liquide d'inoculation de E. coli contenait approximativement 2)( 108 cellules viables par ml, tandis que celui de Ps. aeruginosa en contenait environ 6 x 108. Ces nombres étaient ; 13 x 108 pour le S. typhimurium (Tableau IV) et 14 x 109 pour le Staph. aureus (Tableau V). L'injection par voie intrapéritonale comprenait 0,25 ml; sauf dans le cas du Staph. aureus dont on injectait 0,1 ml.
Les essais ont montré que la protection conférée par les
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fractions P et E était pratiquement équivalente à celle de l'endotoxine de départ elle-même.
D'autres essais ont prouvé que la sensibilité momentanée à l'infection, qui a lieu au début, après l'administra- tion d'endotoxines naturelles, ne se produit pas avec les extraits préparés conformément à l'exemple 1. Ainsi, dans une série d'essais on a inoculé aux souris une dose non léthale de Staphylocoque aureus, après des injections indiquées au Tableau VI ci-après,qui donne les % de aurvie dans chaque cas.
TABLEAU VI Infection par Staphylococcus aureus
EMI17.1
<tb>
<tb> Fraction <SEP> Dose <SEP> en <SEP> Tenps <SEP> % <SEP> Morts
<tb> microgrammes <SEP> 30 <SEP> minutes
<tb> avant
<tb> l'injection
<tb> Saline <SEP> - <SEP> " <SEP> 0
<tb> Endotoxine <SEP> 1 <SEP> " <SEP> 50 <SEP>
<tb> " <SEP> 10 <SEP> le <SEP> 67 <SEP>
<tb> Endotoxine
<tb> acétylée <SEP> 1 <SEP> " <SEP> 0 <SEP>
<tb> "10
<tb>
Ces essais montrent que les extraits d'endotoxine acétyl , suivant l'invention, ne présentent pas la caractéristique d'augmenter initialement la sensibilité aux infections comme c'est le cas des endotoxines naturelles. Il en résulte que les nouveaux extraits peuvent être mélangés aux antibiotiques, ce qui ne/peut avoir lieu, avec sécurité, avec les endotoxines naturelles.
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EXEMPLE 2
100 milligrammes d'endotoxine, extraite comme décrit dans l'exemple 1, ont été ajoutés à 10 ml de pyridine dans un tube de centrifuge, stérilisé et exempt de pyrogènes. On y a versé goutte à goutte 0,5 ml de chlorure de benzoyle, en maintenant le mélange à 0 C sous agitation, pendant 1/2 heure. Le mélange réactionnel a alors été centrifugé ; on a séché le précipité obtenu, et après lavage on l'a traité comme dans l'exemple 1.
La produit obtenu, l'extrait d'endotoxine benzoylée, n'était pas toxique et donnait les mêmes résultats que l'extrait acétylé, indiqués plus haut.
Il y a lieu de croire que la raison de l'immu-
EMI18.1
nsa1aon non apec:tque e"& ae .La resS1iance aux l.nIeC1i:LOIl8 est la stimulation du système réticuloendothélial, puisque ce système élimine les bactéries et désintoxique l'organisme du sujet. Cette stimulation est mesurée par le taux d'élimination de particules de carbone injectées dans le sang du sujet. La stimulation a pour effet d'accélérer cette élimination, ce qui se produit par l'action d'endotoxines de bactéries à Gram positif ou négatif, telles que celles employées dans les exemples qui précèdent.
L'activité stimulante de la composition immunisante selon l'invention, la Fraction P, a été déterminée sur la souris au moyen d'injections intrapéritonales. A des animaux témoins on a injecté une solution saline physiologique, exempte de pyrogène ; à chacun des animaux témoins
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d'une deuxième série on a injecté 10 microgrammes d'- endotoxine initiale de l'exemple 1 ; aux souris d'un troisième groupe on a administré 10 microgrammes de.Fraction P de l'exemple 1. Après 24 heures, délai d'inoculation de bactéries pathogènes dans le mode opératoire décrit, on déterminait les/taux d'élimination du carbone pour chaque souris de/chacun, des groupes.
Les demi-temps moyens (t 1/2) trouvés étaient : (1) Animaux témoins (solution saline) 12,5 minutes (2) " " (endotoxine) ............ 7,5 " (3) " traités à la Fraction P 6,5 " Ainsi, la Fraction P, cause une stimulation du système réticuloendothélial au moins aussi forte, et plutôt plus rapide que l'endotoxine initiale.
Bref, la fraction immunisante de l'endotoxine acylée, désignée comme Fraction P, a manifesté xine activité protectrive non spécifique sur des mammifères, contre des infections bactériennes, équivalente à celle des endotoxines hautement actives dont elle est issue ; son action est exempte de tous effets pyrogéniques, toxiques ou autres effets secondaires.
Dans ce qui précède l'invention a été décrite seulement en rapport avec ses formes d'exécution préférées, mais des modifications ou variantes peuvent être utilisées sans sortir du cadre de l'invention.