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"Procédé de préparation de 16Ó-hydroxystéroïdes et nou- ; veaux produits ainsi obtenus"
La présente invention a pour objet un procédé nouveau pour la préparation de 16Ó-hydroxystéroïdes ainsi que les pro- duits nouveaux, thérapeutiquement utiles, obtenus par ce procédé. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procède microbiologique visant à introduire un groupe hydroxy- le en position 16Ó d'une molécule de etérolde à 19-21 atomes de carbone, en utilisant le nouveau microrrganisme Nocardia Italica m.sp., ainsi que certains nouveaux 16Ó-hydroxy-17Ó- -méthylandrosténols de la série normale et de la série 19-nor, qui ont un pouvoir anticancéreux.
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Les 16cc-hydroxystéroïdes sont bien connue dans la littérature, d'une part comme intermédiaires pour la prépara- , tion de substances thérapoutiquement utiles, d'autre part on tant que produits doués d'une activité antiphlogistique élevée on les prépare au moyen de certains microorganismes Les plus importante de ceux-ci sont s le Streptomyces roseochromogenua (brevet Sud-Africain n 3300 du 3 septembre 1958), le 13279
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Streptomycea ATCC 13278 et le Streptomyces ATCC/(breveta Indien* n" 67 019 du 11 mars 1959 et 69 056 du 24 décembre I960)
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le Streptomyces viridis, le Streptomycea olivaceua, le Streptomyces argenteolua (brevets américaine n 2 709 705 du 31 mai 1955 et 2 855 343 du 7 octobre 1958)
. La littérature !
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signale d'autres souches propres a hydroxyler la position l6att à savoir ltactinomyege lavendulae, la Pestallotia funerea, la Didimella vodka il, le Streptomyces mediodidicuto le Streptomyces halsteidi et d'autres, moins importante.
Le nouveau microorganisme utilisé dans le procédé de l'inven-
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tionp appelé Nocardia italica nespep et déposé a la National Collection of Industrial Bacteria sous le n N.C.I.B. 9386, appartient au genre Nocardia Trevisan, c'est-à-dire à un genre
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dont la capacité d'hydroxyler un etérolde en position 16 n'avait pas été découverte antérieurement, et son utilisation donne des rendements élevés de transformation (70 à 80 %) et
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une forte concentration de etérolde (0,1 %) dans le bouillon de culture.
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ça 2escription et identification dea¯8s# '- Le nouveau microorganisme Nocardia itaiica9 tocie échantillon de sol, présente les caractéristiques ûtj: quos, culturelles et biochimiques suivantes.
Sur les milieux de culture usuels, le mias<d6±g.i¯.i. ¯<s forme d'abord un mycélium étalé présentant des hçhè ij ramifiés non cloisonnés ; au bout de 3 à 4 jours, on obsexve la formation de cloisons transversales et ensuite la mycement se fragmente en portions présentant des formes et des longuers diverses (4 à 8 microns). L'épaisseur des hyphes varie de 0,5 à 0,7 micron. Sur des milieux liquides, la fragmentation ze produit en l'espace de 2 ou 3 jours ; les forces en V et en Y sent fréquentes, tandis que les formes coccoïdes sont absentes. On b'obeserve de mycélium aérien dans aucun milieu.
Le mycélium est gram-positif.et résiste partiellement aux acides. Au tableau suivante on indique les caractéristiques culturelles ;,les observations sont faites après 10, 15, 20 et
25 jours d'incubation à 28 C. Les cultures sont répétées six fois pourchaque type de milieu.
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Milieu <SEP> de <SEP> culture <SEP> Mycélium <SEP> végétatif <SEP> Pigments <SEP> Remer-
<tb> 1 <SEP> solubles <SEP> ques
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1 croissancs couleur , . 89ar-agar Czapek légère incolore # l- . agar-agar levure abondante, jaunâtre - ! -
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<tb> ridée <SEP> ridée
<tb>
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i agar-agar malt abondante, jaunâtre # -
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<tb> ridée
<tb>
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1 agar-agar pomme abondante t jaune, - t #
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<tb> de <SEP> terre <SEP> avec <SEP> plis <SEP> d'oeuf
<tb> en <SEP> relief
<tb>
<tb>
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1 agar-ooer 3enaen petites colo incolore Imies élt.rl<s 1 , agar-agar nutritif abondante, jaune s légèx ti , .. avec glycérol ridée, con-t d'oeuf jaQ' ;
s s1tance, ! tre 1
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<tb>
<tb> pâteuse
<tb>
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agar-agar Bennettl abondante, jaune- - -
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<tb> ridée, <SEP> consia- <SEP> orange
<tb> tance <SEP> pâteuse
<tb>
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1 glucoso, aapara- bonne, uni- jaune
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<tb> gine, <SEP> agar-agar <SEP> forme, <SEP> con- <SEP> d'oeuf <SEP> - <SEP> : <SEP> sistance
<tb> pâteuse
<tb>
<tb>
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agar-agar Sabou- sabnndantQ ri- jaune-brun brun clair - rand Idée, çons
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<tb>
<tb> tance <SEP> pâteuse
<tb>
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agar-agar amidon 1 bonne,. un!-,' orange t e'hydrofor)ne yao on bouillon de 1 1 coloniel tlo- 1 ,,* t levure 8 con2u8e. jaunâtre i - 8 au fond bouillon do pup. coloniea flo- tnitrates t tone connousoa tout t t ## mon
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<tb>
<tb> .. <SEP> au <SEP> fond <SEP> réduits
<tb>
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1 dé, de pomme .abondante, jaune - :
r"' 1 de terre tiarges r plie 'd'ifaujf < ' lait légère pelli- jaunât t r
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<tb> cule <SEP> annulaire
<tb> gélatine <SEP> petites <SEP> - <SEP> ; <SEP> - <SEP> légère
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icoloniea rares 1 rfluidit au fond sficatien
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, heu caractéristique biochimique* du mieroorganisme tloéàtdia kutUa, "rit 1,. lu1.ëftte. 1 d'1t1ne 1. t!u!dltlatt6n l'ft'. et légère. Nitrates t pas de abduction en nitrites.
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Lait f coagulation et pton1'atlon..
À*14on . t hydrolyse ticxatar aruci.oi d'acide. 1 positivo à partie du maltose, du o-x8e, du Û-mannb89p du mannlto1,' U glycérez, du glucose, ci , Nd1atle h partir du lactose, de lladonitole du 0-sorbitol, du L=arb3,nasa, du saccharose.-du ti6haloso# du raffinoseo do l'esculine.
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La description du microorganisme essayé correspond à celle du genre Nddardia Trovisan, qui est mentionné dans le "Manual of determinativ* 9actrriology", de Bergoy (7ème édi- tion, 1957, pages 713-715) et on peut donc conclure que le
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microorganisme de l'invention appartient au genre Nocardia 1rot18 an.
La clef analytique des espèces du genre Nocardia Wàksman et Henrici (Wsksman et Lochevalier i "Guide to the classification and identification of the Actinomycetos and their antibiotics", 1953) indique pour le miaroorganisme une position systématique proche de la Nocardia flava (Krassilnikove 1938), Waksman et Henrici 1948, mais il en diffère parce qu'il résiste partiellement aux acides, parce qu'il liquéfie la gélatine et peptonise le lait et parce que le mycélium ne forme pas de fragments coccrtdes, et il est proche de la Nocardia lutea (Christopherson et Arcibald, 1918) dont il diffère parce qu'il liquéfie la gélatine, qu'il no présente do mycélium rosé ou rouge sur aucun milieu essayé,
et parce qu'il ne forme pas de mycélium
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aérien sur les dés de pomme de terre* On conclut donc
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que le miernorganisme essayé n'a été ni isole , ni décrit précédemment, Les cultures mères de Ne italica peuvent être conservées par lyophilisation], le milieu de suspension étant le lait ou le sérum de lait* On peut aussi les conserver par des transferts (successifs sur un milieu de
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glucose, ..le pomme de terre et diagar-bokr.
Le procédé d'intiodubtîbn d'un groupe hydrotyir= en position 16a de la molécule de stéroda, tel du'il ejit décrit selon la présente invention, peut s'appliquer à un grand nombre de composée etéroldos et 01us exactement a toua ceux qui contiennent 19 à 21 atomes de carbone et qui portent un groupe méthylène on position! 16. Ces stéroïdes peuvent contenir par exemple dans leur molécule une ou
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plutieurs doubles liaisons qû position 1.4p 6, (11), de < atomes d'halogènes en position 6 ou 9, un ou plusieurs
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groupes hydroxyle ou alcoxylo en position 9, H, 17, âl, un ou plusieurs groupes céione en position 3, lit z 20, un ou plusieurs groupes alcoyle en position 6, 17.
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Comme exemples typique$ de composés etéroldes dug l'on peut soumettre aa procédé de fermentation au moyen de N. italien, on citera : la progestérone, la cortisone, Ithydrocort4,qone# la testostérone, le composé S do Roidhstein, la dosoxycortioosterone, la 9a-fluorohydrocottisone, la 9aflûâr,'oprednisolone, la 4-androstènedione-3917p la 9ot- -chlorohydrocortisoner la 9 -bramohydrocortisone, la
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11-&plhydrocortisona. la 9a-flucrocortioena, la 9K-mthoxy-' cortisone, la 6a-fluorohydrocortisona, la 6 -mdthVlhYdrOcor-
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tisone, le tt 4,t?a,2t-trihydroxy-3,20-elioxoprgnadi'-,b, la t?a-mCthyl-19-nortestostronQ, la 4-hydroxy-9?am.thy testostérone$ la 4hydroxy-1?a-méthyl t9-nortestostroum La procédé suivant l'invention, qui vise à introduis-j un groupe hydroxyle on position 1 ft des stéroïdes, corf .:
. faire fermenter la N. italica dans des milieux et d0&: co..-tions appropriés, puis à soumettre le t6..dsox ytro initial à l'action du microorganisme ou de ses enzymes* On peut ajouter le stéroïde aux cultures, soit au débat de
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la croissance, soit pendant celle-ci ou à la fin de eells-cir, soit sous forme cristalline soit en solution dans des solv appropries tels que l'alcool méthylique, l'alcool éthylique.
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4 ',çitne, la dlm6thylformalde etc.
Les milieux de culturd comprennent une source de carbone, une source d'azote et des sels. La source d carbone peut être constituée par l'amidon, la dextrine, le saccharose,
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le#lcose, le maltose, le glycdrçlp des huiles végétales, des famines de céréales ou de légumineuses, la liqueur de acra-
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1 n ç3, mais et d'autres substances habituellement ui.ss.
La source d'azote, outre les substances complexes
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azotées citées p..us haut, peut ctre constituée pa:r la aslin lus sels d'ammonium, les pepionas, la farine de , viande 'et de poisson ou d'autres substances habituellement utilisées. Les !sels minéraux utilisés peuvent être des sul-
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aosi phosphates ou h.oruros de sodium, de potassium ou 4e magnésium, finsi que le carbonate do calcium, il est utile aussi d'ajouter des surfactifs, par exemple ceux de marques commorciales "Tween 80" et "Span".
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Le microorganiamo se développa dans des conditions submergées ut aérées, dans des flacons de secoueuse ou des
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cuves do fermentation, à une température variant de 24 à 30 C, de préférence à 28 c.
Le pH du milieu doit être compris entre 6 et 7,5, de préférence il est de 6,8. Pondant la fermentation, le pH est tout à fait constante Pour vérifier pondant la fermentation
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la transformation du 16-désoxystdrolde initial en dériva 16cc-hydroxy correspondant, on opère de* chroma tograpJ4e en couches minces. La chromatographie un couches minces est décrite dans la littérature par Egon Sthl (Pharmac, WooU4d 195i, page 62!? ChomAkor Ztg. , 198, page 323) 1t par 9,J*De Van Dam et al, (J. Chromatogrophy 4e 1960, page 26.
La chromaographie en couchas minces convient aussi tr' bien à une analyse quantitative si l'on compare l'intensité des taches avec colle d'une solution étalon de stéroïde de concentration connue,
Pour récupérar les stéroïdes contenus dans le bouillon da culture (produits transformes et éventuellement inaltérés), on applique les procédés connus d'extraction. Do préférence,
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on effectue y,ctaon la façon, suivante.
On mélange le bo1lon de fprmnton une matière siliceuse du genre du kiosalguhr ou des terras d'qf$01re,. et on chauffe le mélange 50-60'C pendant quelques rrutas; puis on filtre le tout, pn lave la tourteaux l'eau 50% et on la jette.
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)1' ':$;:-,'e':Io1>êtl&Ít'l ,tljh'1*:': f'V.' 8t¯k '1'1' -ï.;::*((;ftè | àn|4 it, À 1# chlorure da jiià\ne éri i. . '' 'i*"",i:(iit. iVo'fÀ.è1! une '',â'lt '-i'tâ ",ô&t'6.- tâ''1àr dVe'é dé' ' ; "!.t é..,tt1!ji(::.. î,";'it,:,,itp ot' <' ::if 111 piodi: 4ii: ti.ih â f' fâçÓFJ uell. t ' . .. . . - ,, 4bntilort j ::f, fatlU ru.' âhld' slii ar "11J(# d-,ac6t;hè Ilrt ttj''t!r,1 Ptl; dit f)iJ -"à.(r'.1 iJHil ,.,at4u"'tJè, 'ip.'txa ott. on Q\2t utiliser #" 1. CQlléttOt#"5h14" IJri 4it eux .,.4; '60 silice pôiï- "ijtèn1lr' 1 'ctpo sous fôrrfiè pure.
Au lieu do e6umotti;e lée prédu1ts bruts de i'lrivent!8n au pocdd de purit1tlOh'è1-dGssù,. on peut les nijyir en pôéit'ii Ji16 ou un positif i4# avac l'aKhydrido ou ie ch1.iur atun d1d& a.iptgt'qu, c'cloaliphatiquë ou 4r imati|uo 1 9 iMe's'db aboiii,, on ! présence ou rion d''âfria! toltiaira cotme la rif.nc 0U ses analogues, la dimthjian.3né; 2a1 imthyiami:ro, pU8 oh les isole ' et on les purifié.
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Cullime exemples typiqdw de dérivxs aYlé',o5tÓrlUS suivant l'invention, on citera ceux des acides suivants 1 acides acétique t prhpionicjue éyolopontylpropionlque, benxolqup, phenylpropioniquot La demandereèso a trouva aussi qu'en soumettant certains 17o;mothylandro<tenols do la sério normale et de ft la série 19-nor au procède do fermentation ci'-dessus a l'aide de là Noeardia italica n.sp., on diminue les propriétés androgèrioa du 16-dsoxystcrodé. ,nicial au point qu'elles deviennent négligeables, tandis que les 16 -hydrûxystérïdes obtenus présentent uno activité rawarquable d'inhibition des ..(ppia7l$VfJi$' eipt1rttâÍ.8
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te 'rablëmb éte. tONure .et très) Important .et JjQtt'f1t , de plue en plus atntion *<J* mrurgiM' des médecins èk ttéè biologistes et pour le rabâre on à fait laaaaip".
i6chorChe orientées prti4u1irmÓnt vejts1 !'±&* det d' 1 frnt. uBs4anèua cb Iai jt ldttüre -J lhhlb4i- u t '1 f, Jollulo nez. 'lioé réJikthts obteMt, du moine ; ; ' jdsqii'à 6.kt. né tarit pas éatlsfaisantè ettii donnent <tne amélioration tompordte. II. K 1 1 1 Par exemple, en sait que les etérïdoa horrhfcriaùx andr6gènës gnt la prepritd d'amondr la régression d'une ' tumeur de là ttando màmmaire 1 &ehdant, la prdtotico de , 1 activité Àndro9n amène des ffets safcandiifos *t&!"" j. rablè.. 1 # l ' 1\, i Lés produits qui représentant une nouvelle contrez #è±û*n a la réalisation de 8ubstancél nouvelles à ans la , thérapeutique dos t&méurl sont - la 4, 16cx..od$\ydroxy-17ëx- l\ # -mthyl tost6lt6rono, la 4,16diHydroxy5?it-m'étïlYyl-'19 -nortastoatirona et loura dérivés 4#16-diàcyiésr la 16et- ;
-hydroxy-17c-méthyl-19-nortostostérono ot s<*s dérivés 16-acylés. Le t6-désoxystéro!do initial destiné a la prépara 1on de la 4,lba-dlihydroxy-1?oc-methyltestostérone est la
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4-hydrexy 17a-méthyltûstostére ne (décrite dans le brevet 'anglais n 848 288), tandis quo 1j 16-d6soxystéro!do initial destiné à la préparation de la 4,16 -dihydrQxy-17 -
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-rI\<ahyl-19-nortostostéronu est la 4-hydroxy-t7.mthyl -nortastostdrone (décrite dans le brovet anglais nd B zt, et quo la 16-désoxystérolda destina la pr6paati'1 Qv , ' 16a-hydroxy-17a mJthyl-19-nortosto t(JrPn3 est Ici 7së.,T,,; -19-nortostostérona* Parmi les composée mentionndup Io oûul produit connu dans la littérature est la 16 -hydy1 -mqthyl-19-nortastostérone, décrite par Seymour e" E.W.
C&'r tra.1 (J, Orge Chou. 26o 1961. page 3560), aignalês comm potiseulement do très faibles propriétés androcibnect sans YWII . 10ft fait mention du pouvoir al\t1canc(rGsgo i '1 1:, ! Ce$ nfQ"ut8 ont une activité anticanc4rQut\l et i@ t 8'tQt utilo d 41e lnibitio de "êerpe éjyh pt de umour''9119Vq'hJ:l. fis1 - rf1 Aipqt r. le d4ontrûrl P;us loin, les 4CI ts da j,5|||vonjtl$n-fdnini6tr(Js h fjes pMfi? âu|qull<|è o| 10 4 l'ad|n|p|F|>inraQ 4Er&el pu la 4",4e asi|(|uo 4; ÍCh, 999 rcfgsiço'tjo la ur lant of lot ", '1 ,1 P',\t.t p,f4rnf9 par vpa 1't1uqn1f' l ''²f' t'QQ.tR', tlp ",tt1p " u jjjulnt 1 1 lt : .'t l f!t .tf IPqtY;tIaYltP!f19$ ."hto
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la limiter.
On utilise une cuivre de 5 jours de N. italica sur glucose, pomme de terre et agar-agar, pour Inocula deux flacons Erlanmayer de 300 cm contenant chacun 60 cm3 du milieu suivant t caséine s g doctrine 20 g liqueur de macé- ration de mais 3 g CaCO3 4 g (NH4)2SO4 1 Ici ,
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,2llPOd Q 9 , . I glucose , |P9 <# , . 4 ' "''# '* ea4 04 go4ng }ffî* f ' #< r 1 . , ;i pH t 6,.6 ' . t ' '' avilis Jt|.9n t 24 pendpt 20 M4t'gom, 1 C f at1 1" plPQx a( f.oas .
Po ! .r ugl ègulg> at. 20 t% p t#t t3P de 6 ï. au3' ai *l obtoue *efvà|fU ,r.iq di E".!"i ..¯W.*' irez' z/, [r.i bzz, .ir= c CoC î :. 5' ' , !'"1 a ! , i'i' t i 'r t, a ..j i , .? , ; , t ' , . , bzz , tds..$ft,"t a nt 'uto ¯
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f'b inocule chaque flacon avec 6 cm de c aitliôti vcS-! gétatlf en ajoutant 60 mg do 9tt-fluorohydrocortisdne dissous dans 0,5 ama de dlméthylformamldo.
Ch fait incuber les fiacons à 28 C sur une oeooueuse rotative similaire à celle que l'on a décrite pour la préparation des culturels végétatives.
L'essai chromatographique, effectué après 3 jours d'incubation, indique la disparition de.la matière première et la formation d'un produit qui présente un Rf égal à calui
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de la 16 -hYdroxy--fluorohydrocortlsone.
On réunit la contenu de* flacon , on y ajoute 100 g de terre d'infusoires et on chauffe la masse à 60 C en agitant pendant 10 minutes puis on filtre le tourteau de mycélium et on le lave avec 100 cm 3 d'eau à 60 C.
On extrait le filtrat à trois reprises par l'acétate d'éthyle. On réunit les extrait à l'acétate d'éthyle, on les lave une fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, puis à deux reprises avec do l'eau distillée.
On évapore sous vide l'extrait organique pour ramener le volume à environ 150 cm3 de solution résiduelle j on trans-
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vase celle-ci dans un flacon plus petit et on l'évaporé.jusqu'à un volume de 30 cm3; à ce stade, il se produit une cristalli- sation abondante.
On conserve le flacon dans un réfrigérateur pendant 20 heures,puis on filtre le produit et on le lave à l'acétate
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d'éthyle froid. On obtient 0,460 g de 16 -hroxY-9 -flro- -hydrocortisone fondant à 24 245 C ; Z-m-7'D2 - 00" (à 1 % dans le méthanol).
En recristallisant par un mélange de méthanol et
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dtacdtate d'éthyle# on obtient 0,400 g de l6tc-hydroxy-9a- -22 -fluorohydrocortisone, fondant à 248-250*\: 2 m +10510 (à 1 % Jans le méthanol).
Rendement : 80 %.
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Exemple 2.
On effectue la fermentation comme dans l'exemple on utilisant un milieu do la composition suivante t produits solubles de distillerie 10 g entrait de viande 5 g N'ici 2,5 g glucose 15 g 'ween 80" 0,5 cm3 eau du robinet 1000 cm3 pH : 6,7 stérilisation : 20 C pondant 20 minuter
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L'essai chromatographique montre la disparition do la matière première au bout de 4 jours d'incubation. On obtient un produit dont le Rf est égal à colui de la 16Ó-hydroxy-
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..9rfluorohydrocortisone, En extrayant par l'acétate d'dthyle et en concentrant ensuite jusqu'à début de cristallisation,
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cm obtient la t6ac-hydroxy-9oc-fluorohydrocortisone pure avec un rendement de 75 %.
Exemple 3.
On stérilise 3 litros de milieu végétatif comme celui de l'exemple 1 pendant 60 minutes à 120 C dans une cuve de fermentation de laboratoire dû 5 litres. Puis on inocule avec 30 cm3 de bouillon de culture dansun flacn comme celui de l'exemple 1 et on fait incuber pendant 24 heures à 28 c en agitant avec un agitateur à 4 pales à raison do 400 t/mn, avec un taux d'aération de 3 1/mn.
On stérilise 5,4 litres du milieu de fermentation décrit à l'exemple 1 dans une cuve de fermentation do laboratoire de 10 litre* ot on inocule avec 600 cm3 do milieu vdgdtatif.
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On ajoute au milieu, dans des conditions stériles
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6 g de 9a-fluorohydrocortlsone dissous dans 35 en! de di#éthi- formamido et on fait incuber à 28 C sous agitation, avec tare agitateur à 4 pales, 450 t/mn et avec un taux d'aérzation de 5 1/mn.
Les essais chromatographiques montrent la diapr aites de la matière première au bout de 65 heures de @ ' En extrayant par l'acétate d'éthyle puis en concentement
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obtient la 16 -hydroxy-9l'c-flu9rohydrocort1sone avoc un ±r*i>- ment de 80 %. Exemple 4.
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On effectue la fermentation comme dans I8@xf>mpl \)u . n u.|:$Llisant tomme matière; première la. 9cc-fluororQdpls@lt'o A, u que f'04Stl chromatographique indiqua q J 1<b Otto4neoo e complètement transformée, on of*4e-t ?| is* 0 uuoLla s| 6nUbtl|tîi la 16<?:-hytioxy-9K-n |||f4si||l /. tàj OC. J:n,rocrjâ111s8ni! Ray un M4 an 4f'1| ! :|. te 1 fthYrP et.de th9n, on obtot le guît p t4 qui fflà ; ,t t:"Pt262/,pt .
2 '"1' <ja 1 dant mthanol).
1! etuq 19 fermentation comme dans l'ettemple le ;( ejr|, lin| jt,i 4'hY.rrCrC?,, COG froide Initiale ebiet a -hYdryydcord ?tnd?nt à 25-23p?C p| C;1'Qaf0}ar l'acétate d'éthyle) 1 ZJ T*V* !JI( ,;f qqP' ,"JthP1)r ' ' t'!n J.trlf1rtçfalHfatr)lp'r 4#lcdt4te 19P ô 'tj Mint Wdrxyrpqprispnf fondant Iqfcfflfft j' ' On fffectu 1H . fermprftation ,o<|romo dans 3L |xqw2,@ 1 tope n ,.1Uart M pr8t<lfpi|e (4 ,st eèe .t9F" j.
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Aproe reerietalatiQn''p9r 'tat9 416thyl0. on obtient la 16ec-hydroxyprogestdrone fondant t 12..2140C* , D ft -<48* (à 1 % dans le chloroforme).
Xf\'I".',\} 1...
C effectue la formantation pomme 1n4 l'exotpplp en utilisent 60 g de ta808&rono.
Après l'extraction, un chrQmAogt4P1Q le produit azur une colonne de gel de silice, en éluent ayec de 3, t 4thor contas nant 5 % dtai.,èton4j on obtiont la t6cf.-hydroxyte<to<rone, point de fusion 1e2-14OC . c#.:fJ .. -t-75* ( 1 % dans le mdtno,i.
E}<ample¯8.
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On effectue la fermentation Foiim dans ilop,P9 le tout en ut18at c lf' crémière le p.P,4 S Il'ot, On axtreit par 1 aStato d'<!l pn 'V9Rrj " '.clt4 et gn rlqtqil19 Qr un gotpnge 4.a4te je '1, ; , opF 01\ oben 72hYidyox,OMpr4-/ pG1t: qe 4cp rj . o ( % dans le m4tb4ap), l' ihramnlo9. 5, ' 1 Cha ecue fqJ"ntaq9..,C.Bfi fane }"9.¯t. 1 " e rxat ç, . , rn .da,ç i 4 1.' ! ., ."'tt"'} .....1>:", ¯ ... '-/-,..
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ir ' y. '''txayaM par 1'i ' dtllyl' êh ci-1:tnl1t- 'JI IJ .I . /ili} .rs . e i an. 'fé"l1tÍ !, '' ',"t!.. qi i& 6caüla .1.jtic .1t{tWtt' i!h 'oupp hydroktie <:;f l4ii'idh ct, ,1!!' s .âtaü. 1a sapôliièiéàiiort dû I t ... .y l . r o ' n k 1... ''0''iCtFtG'fi.i9t ' On vee0etue J,.d r'"'l;oi cdmtc t8lâ Ilekdrin4le .1, 6r1, tl1i8arit tobrn maifi lhli,èrtâ la 17o:-m6tnYJ.-19-riortestds- ;n0 , ai px a..thy.r on dvapre aquà rlotit' ot on iecristalliao par un mélange d'acétone et d'úther etnyÏiqo on obtient la 6oc-ydroxy-t7cc-!nthyl-t9-riortestc- 8Jr,Ce f6dâht a -2te1 , 21 L ,, a...' .2 0 " ' e, (à % dàns le dioxane) ;
nithano b 24i % Max 241 mtt , Et' 524.
$0,.., 1-drOX1l17m6thY1-1"nor+'etostérone. bzz effectue la préparation de la mme façon que dans l'axemplu it, seule la technique d'extraction diffère* Plus exaetament, on effectue l'extraction du bouillon de fermantation avec la méthyl-laobutyledtoné, sans dliminer préalablement le mycélt.um, pule, en chxomatographiaut l'extrait sec sur du kiesblguhrlp on élue la 16K-'hydroxy7a:-mdthyl-19-norteato<<rone avèc un mélange d'éther 6thylique contenant 10 % dtac6tones 1e dérivé 16#-acatyl , obtenu de façon connue avec l'anhydride acétique dans la pridirid, fond à 177-180ce ; 0 -17. (h z6 dâne le. dioxane) ! mthanol max. 240 te ai 473.
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,édrocr..'.tiyil trori. ,'j/ , i'râtfo : 4 vf da 11 trt1# ajdn 4mie .. rt dn t it ant itan d , lolll d.. J.tA..,.. .J.. î'IfxefltyL o't on! partant df l> 4-hyd-i7h1<?l\iyii.tffi4 -| t3'&nOi du abt1.n J.6 4 l6tc h 9u x Y 9'.9uf x tre'l'ri toàâàhî 2-228 fc fondant 2' -a j 1 56 diexhne) mth1!.!n61 ? x. z17 m)r. 1, tu'93. eh faisant fdagir ce composé 8r euh agent d'kcyiaftion, de façon connlap et obtient le's d6rlvd',16-dlatVld' cbîtràapondant.. bà cette' façon, on obtient le ,aiLedtàtil4oi6o la dipropionat4,16, le dibantoaté-4,t6 m d'autres d :
ti,..d'a 4, t 6-dla cyl\! 8. fOI"î' 110¯t. , 4,t6x-dihydtaCti-t'a-m3thyL-19.narteatoet&âri On effectue la préparation de 1' mêrrià fat4 t dan l'exemple lp à partir de la a..hydroxyt7c-thyl-19-iote'o. etérene obtient 4#16 -dihydroxy-la-Méthl,1-11-nottbe' et<!rono ! on obtient la 4#1o\t-dihydroxy-17a-mi5thtl-i9-nortè8t6f sttroraa qui cristallise avec difficulté.
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En acétylant de façon connue par l'anhydride acétique
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dans la pyridino, en obtient le diac6tate..4,t6 qui fend a 6-1aac ZX7d " -1 ' z in dans le dioxane) 1 * méthanol max. 246 me Etcm 385.
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Exemple 15 -, - Pharmacologie La tableau suivant indique les activités g>r;7-"c et anticancéreuse de la 4,t 6oc-dihydroxy-9?oe-m ey.-v s -..... ::.:. .¯-.
t 5ronof de la 4,16a-dihydroxy-t?oc-mtthyltaatnat¯-, " \(; co iia t6<!t-hydroxy-17cc"!n(!thyl-t9-nortostostéronet e(j)mé;)8 ;:" ûc-XI des 16-dÓsoxystéroIdos initiaux.
L'activité androgène est djtorminde suivant la fecîfehiîsd de Hershberger et al. (Proc. Soc. Exp. Bîole and ? v i fô$9 page 175) et l'activité anticanedreuse est essayée 8MF l'adénocarcinome d'Ehrlich.
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La valeur de l'activité and09ne est rapstbr 1 .çl.0 du prpionate de tastost<!rone appelle '!00 tandis que 1 \pleur8 'd'activité1 nt1aJrese sort # indiiff on ' ,ceng? M-n'lPtP.'1 do l' aCCr01s8Qm9n de '<9d ç gro d'Snr1ch. Les produits sont dmii,trctp v1, . # ' wf-cutani 't ' ' Le tableau montre quo les 16a-J>ydrxystdrô|dôs9 JPl'c$Jjj)ar,ss suivait l'invention, présentent une activité .1", rrr"dogène négligeable et une activité anticqncJ"9 ramai? Uj9blem9n uriQU,re oalle des 16-diÎ8oxyat>5r4ïddt inJ.1;laux. " ' '
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