FR2568892A1 - Nouvel antibiotique sandramycine, procede de preparation de celui-ci, culture biologiquement pure du micro-organisme nocardioides sp, atcc no 39419, et composition pharmaceutique contenant la sandramycine - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN NOUVEAU COMPOSE : LA SANDRAMYCINE. LA SANDRAMYCINE A LA FORMULE STRUCTURELLE SUIVANTE: (CF DESSIN DANS BOPI) LA SANDRAMYCINE EST PRODUITE PAR FERMENTATION D'UN NOUVEAU MICRO-ORGANISME, NOCARDIOIDES SP. SOUCHE C49 009, ATCC 39419. LA SANDRAMYCINE POSSEDE UNE ACTIVITE ANTIBACTERIENNE ET INHIBE LA CROISSANCE DES TUMEURS EN EXPERIMENTATION ANIMALE.

Description

L'invention concerne un nouvel antibiotique la sandramycine, un procédé de

préparation de celle-ci, une culture biologiquement pure du microorganisme Nocardioides sp. ATCC N 39419 et une composition pharmaceutique contenant la sandramycine à titre d'ingré-

dient actif.

Plus particulièrement, l'invention concerne un nouvel antibiotique antitumeur depsipeptide cyclique

désigné ci-après en tant que sandramycine et sa prépa-

ration par fermentation d'un nouveau microorganisme, la souche de l'espèce Nocardioides C49 009, ATCC 39419, ainsi que les compositions pharmaceutiques contenant le nouvel antibiotique anti-tumeur. L'invention concerne

également l'utilisation de ce nouvel antibiotique anti-

tumeur comme agent antimicrobien ou comme agent anti-

tumeur. L'invention concerne également le nouveau microorganisme en luimême, qui est utilisé dans la

production par fermentation de sandramycine.

On connaît à partir du document U.S. N 4 360 458, délivré le 23 Novembre 1982 à Koshiyama et al, un complexe antibactérien anti-tumeur désigné BBM928 et sa production par fermentation d'une nouvelle souche d'actinomycètes désignée comme souche G-455-101 (ATCC 31491), qui a été plus tard déterminée comme étant une nouvelle espèce du gène Actinomadura et désignée en tant que Actinomadura luzonensis nov. sp. Uvoir J. Antibiotics,

33(10), 1098-1102 (1980)].

La production, l'isolation, la caractérisation et l'activité anti-tumeur des composants BBM-928 sont

révélées dans J. Antibiotics, 33(10), 1087-1097 (1980).

Les structures de BBM-928A, B, C et D (maintenant dénommé luzopeptine A, B, C et D, respectivement) qui sont les majeurs composants du complexe BBM-928 sont révélées dans le brevet US N 4 451 456, délivré le 29 Mai 1984 à Koshiyama et al, et présentent les formules structurelles suivantes:

H3CX/CH3

CH3 HC C-OH

D 3

CHO30 > x>H DCO-NH-CI2-CO-JN-CH2-CO-N-CH L

0 N AO-NH-CH-C0OR1 CO

" NCHNHHCO, _

CH Nin.

12 " N CH2

uROf v= I J

1 2O N-CO-CH-NH-CO--N

L CH-N-CO-CH2-N-CO-CH -NH-C D HOCH3

HO- C CH3 CH3

H3C CH3

R1 Rz Luzopeptine A -COCH3 -COCH3

" B -COCH3 H

" C H H

-COCH2CH3 -COCH3

Les luzopeptines A, B, C et D contiennent des caractéristiques structurelles qui incluent l'acide 3-hydroxy-6-méthoxyquinaldique comme chromophore et

l'acide 4-hydroxy-2,3,4,5-tétrahydropyridazine-3-

carboxylique o la différence structurelle parmi les trois composants réside seulement dans l'étendue de l'acétylation du groupe hydroxyle dans les fractions tétrahydropyridazines. L'invention concerne plus précisément un nouvel antibiotique anti-tumeur pepsipeptide cyclique désigné 39 ci-après en tant que sandramycine ayant la formule structurelle suivante: qCH-

CH CH3

CH

CH CH

t3 1 3

O>H CO-NHCH2-CO-N-C H 2-CO-N- CH

NCONH-CH-CO-N CO

2 o

O CH

CO N-CO -CH-NHOC t

CH-N-CO-CH -N-CO-CH NH- -COH

I CH& 3H HO

CH3

3 3

CH CH3

et son procédé de préparation, d'isolation et de purifica-

tion de la sandramycine sous une forme sensiblement pure.

Le nouvel antibiotique, la sandramycine, est obtenu par fermentation d'un nouveau microorganisme que l'on a tenté de classer comme espèce du gène Nocardioides, en accumulant la sandramycine produite par ledit microorganisme et en recueillant la sandramycine antibiotique à partir du bouillon de culture. Un microorganisme de production de sandramycine préféré est Nocardioides sp. souche C 49 009 isolée à partir d'un échantillon de sol recueilli à Mexieo, et des souches mutantes de celuici. Cette souche a été déposée à l'American Type Culture Collection, Rockville,

Maryland, sous le N ATCC 39419.

Le microorganisme

La description suivante est une description

générale du microorganisme préféré de production de la

sandramycine antibiotique anti-tumeur.

Morphologie - La souche C49 009 forme à la fois un mycelium de substrat et un mycelium aérien (0,4 micron de largeur), et le mycelium du substrat est long, bien ramifié et fragmenté en courts filaments ou en tiges après une semaine. La souche N C49 009 tend à perdre sa capacité à former du mycelium aérien par culture continue. Les hyphes du mycelium aérien se ramifient de manière éparse. Les observations microscopiques montrent que les hyphes aériens sont plus ou moins de forme en zigzag au début et se développent en chaînes droites longues de segments cylindriques analogues à des arthrospores (0,5 x 1 à environ 3 micromètres) qui sont séparés ensuite en hyphes translucides. La surface des segments analogues à des spores est uniforme. La souche N C49 009 est

gram-positive et non résistante à l'acide.

Du sporange, des spores motiles et de la

sclérotine ne sont pas observés.

Composition de la paroi cellulaire et des composants de

sucre de la cellule totale -

La paroicellulaire de la souche N C49 009 contient de l'acide LLdiaminopimélique et de la glycine comme composants aminoacides caractéristiques dans la paroi cellulaire selon les méthodes décrites par B. Becker et al, dans Appl. Microbiol., 13, 236-243 (1965) et T. Yamaguchi dans J. Bacteriol.,89, 441-453 (1965). L'hydroiysat de cellule totale montre la présence de glucose, mannose et ribose mais ne montre pas de sucre de diagnostic comme déterminé selon les procédures soulignées par M. P. Lechevalier et al, dans Biol. Actinomycetes Related Organisms, 11, 78-92 (1976). La composition de paroi cellulaire mentionnée ci-dessus et des composants de sucre de cellule totale indique que la souche N C49 009 est une espèce actinomycète de paroi cellulaire type I.

Caractéristiques de culture physiologiques -

La souche N C49 009 est un actinomycète obligatoirement aérobie, et se développe

bien dans la plupart des milieux descriptifs.

Le mycelium aérien est formé abondamment ou modérément sur milieux ISP N s 3, 5 et 7, et agar sucrose-nitrate de Czapek, mais de manière clairesemée sur un milieu organique nutritivement riche tel que les milieux ISP N s 2 et 6, ou l'agar de Bennett. La couleur du mycelium aérien est blanche. Le mélanoîde et d'autres pigments distincts ne sont pas produits dans tous les milieux descriptifs examinés. La couleur du côté inverse du

mycelium végétatif est seulement jaunâtre.

Elle présente une croissance optimale à 28 C, une croissance modérée à 15 C et à 37 C, mais aucune croissance à 5 C et 47 C. La gélatine et l'amidon sont décomposés. La réaction à la tyrosinase est négative. La croissance est inhibée en présence de NaCl

à 7% ou du lysozyme à 0,01%5. Les caractéris-

tiques de culture et physiologiques de la souche N C49 009 sont répertoriées 1 et 2, respectivement. La souche N C49 009 utilise la plupart des sueres pour sa croissance, et l'utilisation des sources de carbone est

répertoriée au tableau 3.

Tableau 1

Caractéristiques de culture de la souche N C49 009* Bouillon tryptoneextrait de levure ** (ISP N 1): G : modéré; floccose, sédiments faiblement jaunes, D: aucun Agar sucrose-nitrate (Agar de Czapek) G: abondant R:blanc jaune (92)*** à grisâtre sombre (91) A: modéré, blanc (263) D:jaune modéré (87) Agar glucose-asparagine G: pauvre R: blanc jaunâtre (92) à jaune pâle (89) - A: pauvre, blanc (263) D: aucun Agar glycérol-asparagine (ISP N 5) G: modéré R: légèrement jaune (86) à jaune modéré (87) A:modéré, blanc (263) D:aucun

Agar de sels minéraux-

amidon (ISP N 4) G:modéré R:jaune pâle (89) à jaune modéré (87) A:pauvre, blanc (263) D:aucun Agar de tyrosine (ISP N 7) G: abondant R: jaune pâle (89) à jaune sombre (88) A: modéré, blanc (263) v 5 D: aucun Agar nutritif G: modéré R: jaune pâle (89) A modéré, blanc (263) D: aucun

Agar extrait de levure-

estrait de malt (ISP N 2) G: abondant R: jaune pâle (89) à jaune modéré (87) A: pauvre blanc (263) D: aucun Agar de farine d'avoine (ISP N 3) G: modéré R: blanc jaunâtre (92) à jaune modéré (87) A: modéré, blanc (263) D: aucun Agar de Bennett G: modéré R: jaune pâle (89) à jaune sombre (88) A: insuffisant à pauvre, blanc (263) D aucun Agar peptone-extrait de levure-fer (ISP N 6) G: pauvre R: jaune orange pâle (73) à jaune faiblement orange (70) A: insuffisant, blanc (263 D: aucun

Z568892

* observé après incubation à 28 C pendant 3 semaines ** Abréviation: G = croissance; R = couleur inverse; A = mycelium aérien; D = pigment diffusible * La couleur et le nombre entre parenthèses suivent la couleur standard dans "Kelly, K. L. et D.B. Judd: diagramme de nom de couleur ISCC-NBS illustré avec des couleurs centroides. Département U.S. du Commerce Circulaire 553, Washington, D.C.,

Novembre, 1975".

Tableau 2

Caractéristiques physioloqiques de la souche NO C49 009 Essai Réponse Méthode ou miliseu Domaine de tem- Croissance maximum Agar de Bennett pérature pour à 28 C. Croissance la croissance modérée à 15 C et 37 C. Aucune croissance à 5 C et 45 C Liquéfaction Liquéfiée 1% d'extrait de malt, de gélatine 0,4% d'extrait de levure, 0,4% de glucose, 20%o de gélatine Hydrolyse Hydrolysée Plaque agar d'amidon d'amidon Réactions dans Coagulée Lait écrémé Difco du lait écrémé Formation de Négative Agar tyrosine,

pigment de agar peptone-

mélanoide extrait de levure-

fer et bouillon tryptone-extrait de levure Réactions à Négative Méthode Arai * la tyrosinase

Réduction de Négative Bouillon sucrose-

nitrate nitrate de Czapek Réduction de Négative 0,5%o d'extrait de nitrate levure, 1% de glucose, 0,5% de KN03, 0,1%o de CaC03 Tableau 2 - suite EssaiRépons, Méthode ou milieu Essai Réponse utilisé utilisé Tolérance de pH Croissance à Agar extrait de pH 5,0 à pH 10,5. levure- extrait de Aucune croissance malt à pH 4,5 Tolérance à Croissance à 5,% de Milieu de base: 1,% NaC NaCl ou moins. d'extrait de levure, Aucune croissance 2% d'amidon soluble, à 7% de NaCP 1,5% d'agar Tolérance au Sensible, mais Bouillon de lysozyme partiellement Trypticase de soja résistante plus 1,5% d'agar (croissance de quelques colonies à 0,01% de lysozyme) * Arai, T.et Y. Mikami, "Chromogenicity of Streptomyces, Appl. Microbiol., 23, 402-406 (1972)

Tableau 3

Utilisation de carbohydrate par la souche

C 49 009

Glycérol + D(-)-arabinose +

L(+)-arabinose --

D-xylose + D-ribose + L-rhamnose + D-glucose + D-galactose + D-fructose + D-mannose +

L(-)-sorbose -

Sucrose + Lactose + Cellobiose + Mélibiose + Tréhalose + Raffinose + D(+)mélézitose + Amidon soluble + Cellulose Dulcitol Inositol + D-mannitol + D-sorbitol Salicine Observé après incubation à 280C pendant 3 semaines Milieu de base: milieu minéral Pridham-Gottlieb Abréviation: +: utilisation positive, -: utilisation négative 256889e Taxonomie - La souche N C49 009 est caractérisée par sa réaction gram-positive, sa nature non résistante à l'acide, sa fragmentation du mycelium de substrat, la formation d'un mycelium aérien blanc, la segmentation analogue à l'arthrospore en parties complètes de mycelium aérien et l'absence de capacité

à former des pigments distincts. Ces caracté-

ristiques, ainsi que la présence d'acide LL-diaminopimélique et de la glycine, mais l'absence de sucre de diagnostic dans la paroi cellulaire, placent la souche

N C49 009 dans le gène Nocardioides LH.

Prauser, Intl. J. Syst. Bacteriol., 26, 58-65 (1976) 1. La souche N C49 009 est différenciée de l'actinomycètenocardioforme de formation de mycelium aérien incluant Norcadiopsis dassonvillei, Saccharopolyspora hirsuta et toutes les espèces hétérologues du gène Nocardia dans l'aminoacide ou le suere de diagnostic de la paroi cellulaire et les propriétés physiologiques de diagnostic

comme décrit par R. E. Gordon et al, J. Gen.

Microbiol., 109, 69-78 (1978) et comme montré au tableau 4. La souche N C49 009 est en outre différenciée du gène Streptomyces dans sa morphologie du type nocardiae sporogène; par exemple, les hyphes du substrat de la souche N C49 009 se fragmentent en filaments ou tiges courts. Les segments analogues à l'arthrospore de la souche N C49 009 se distinguent des spores de Streptomyces dans le site de formation, l'arrangement en coquille d'hyphe et

l'absence de paroi de spore distincte.

Tableau 4

Caractéristiques physiologiques de diagnostic de la souche C49 009 Résistance à l'acide Décomposition de: Adénine Caséine + Hypoxanthine Tyrosine + Urée Xanthine Résistance: Lysozyme Rifampicine + Hydrolyse de: Aesculine + Hippurate + Amidon + Acide à partir de: D(-)-arabinose + L(+)arabinose Erythritol Glucose + Inositol + Lactose + D-mélézitose + Mélibiose + Méthyl o<-glucoside Raffinose + Utilisation de: Benzoate Citrate + Tableau 4 - suite Mucate Succinate + Tartrate Nitrite à partir de nitrate Survivance à 50 C, 8 heures Abréviation: +: caractéristique positive; -: caractéristique négative Le profil de sensibilité relativement à une série de phages taxo-spécifiques distingue les souches du gène Nocardioides des genres proches tels que Streptomyces ou Nocardia [ voir H. Prauser: Host-phage relationship in nocardioform organisms, "In the Biology of the Nocardiae", Edit. M. Goodfellow et al, Londres, New York et San Francisco, Academic Press (1976)3. La sensibilité de la souche N C49 009 à ces actinophages n'est pas examinée parce que nous n'avons pas de phages disponibles. Sur la base des caractéristiques de culture et physiologiques, les 17 souches du gène Nocardioides qui ont été isolées à partir d'échantillons du sol recueillis dans divers districts du monde ont été placées dans un groupe unique, Nocardioides albus. La souche N C49 009 diffère de Nocardioides albus dans son utilisation de la L-arabinose et de l'inositol, mais est similaire à cette dernière dans

les caractéristiques de culture et physiologiques générales.

Ainsi, on a tenté de classer la souche NO C49 009 comme

espèce du gène Nocardioides.

On comprendra que la présente invention n'est pas limitée à l'emploi de la souche particulière N C49 009

ou à des organismes répondant pleinement à la description

ci-dessus. On désire spécialement inclure d'autres souches productrices de sandramycine ou de souches mutantes dudit organisme qui peuvent être produites à partir de

256889?

l'organisme décrit par des moyens connus tels que radiation X, radiation ultraviolette, traitement avec

des moutardes d'azote, exposition aux phages, et analogues.

Production de l'antibiotique La sandramycine est produite en cultivant la souche Nocardioides sp. NO C49 009 (ATCC 39419), une souche mutante de celle-ci, dans un milieu nutritif conventionnel. L'organisme se développe dans un milieu nutritif contenant des sources nutritionnelles connues, c'est-à-dire, des sources assimilables de carbone et d'azote plus des sels minéraux éventuels et d'autres facteurs de croissance connus. Des conditions aérobies submergées sont employées de préférence pour la production de grandes quantités d'antibiotiques, bien que pour la production de quantités limitées des cultures de surface

et des bouteilles puissent être utilisées.

Le milieu nutritif devrait contenir une ou plusieurs sources de carbone assimilables telles que Glycérol, glucose, sucrose, mannose, fructose, amidon de blé ou de mais, maltose, mannitol, mélasses et analogues, soit à l'état brut ou soit à l'état-purifié. Le milieu nutritif devrait également contenir une ou plusieurs sources d'azote assimilablestelles que, par exemple, de la farine de graines de soja, de la farine de poisson, de l'extrait de malt, de l'extrait de levure, de la peptone, de la farine de gluten, de la farine embryonnaire de graines de coton, de la farine de soja, de la farine de graines de lin, de la farine de graines de coton, de la caséine, des substances protéiniques hydrolysées, des nitrates, des sels d'ammonium, de l'urée et analogues. Des sels minéraux nutritifs tels que le chlorure de sodium, le phosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le carbonate de calcium et des quantités de traces de sels métalliques lourds tels que le cuivre, le zinc, le manganèse, le fer, et analogues, peuvent également être

ajoutés au milieu nutritif.

256889e La température de fermentation devrait être dans le domaine de 15 C à environ 30 C, et de préférence dans le domaine d'environ 5 C à environ 30 C. Le pH du milieu de fermentation devrait être dans le domaine d'environ 5 à environ 10,5, et le domaine préféré est d'environ 6 à environ 8,5 Ordinairement, la production optimum de sandramycine est obtenue en environ 2-9 jours, selon la température. Lorsqu'on réalise la fermentation en réservoir, il est souhaitable de produire un inoculum végétatif dans un bouillon nutritif en inoculant le milieu de bouillon avec une culture inclinée ou une culture de

sol, ou une culture lyophilisée du microorganisme.

Après l'obtention d'un inoeulum actif de cette manière, celui-ci est transféré aseptiquement au milieu du

réservoir de fermentation.

Isolation de la sandramycine Lorsque la fermentation est complète, on récupère la sandramycine à partir du milieu de culture et on l'isole sous une forme sensiblement pure selon la procédure multi-étape illustrée dans le diagramme de

procédure suivant.

Bouillon de fermentation complet.

(1) extraire avec l'acétate d'éthyle (2) mélanger avec de la terre de diatomée, filtrer (3) séparer les phases et évaporer 1r I aqueux épuisé extrait antibiotique brut (1) extraire avec du méthanol aqueux et du Skellysolve B et séparer les phases Phase Skellysolve B, phase eauméthanol (1:9) mettre de côté (1) diluer avec de l'eau phase eau-méthanol (1:3) (1) extraire avec du tétrachlorure de carbone et évaporer

résidu A phase eau-

méthanol (1:3) (1) diluer avec de l'eau phase eau-méthanol

(7:13)

(1) extraire avec du chloroforme et évaporer

résidu B phase eau-

méthanol (7:13), mettre de côté (1) chromatographie sur colonne des résidus A et B en utilisant un support de terre de diatomée (2) fraction de toluène évaporée résidu C (1) chromatographie sur gel de silice (2) élution à gradient linéaire sandramycine (1) recristallisation sandramycine purifiée sandramycine purifiée

256889?

Pour élaborer en suivant le diagramme de procédure,

le bouillon complet de fermentation de Nocardioides sp.

souche NO C49 009 est tout d'abord extrait avec un solvant organique non miscible à l'eau et de préférence avec l'acétate d'éthyle. Un auxiliaire de filtre tel que Décalite (dénomination commerciale de Grefco Inc., Torrance, Californie, pour de la terre de diatomée) est de préférence ajouté au milieu d'extraction et le mélange est ensuite filtré pour enlever les insolubles. Après filtration, la

phase organique est séparée du filtrat de mélange d'extrac-

tion et concentrée par évaporation pour donner l'extrait brut dudit antibiotique. L'extrait brut est séparé entre un solvant hydrocarbure aliphatique tel que Skellysolve B (dénomination commerciale de Skelly Oil Co. pour des

hexanes isomères) et environ 10,% d'eau dans le méthanol.

La phase de méthanol aqueux est diluée avec une quantité additionnelle d'eau et la solution résultante d'environ ,% d'eau dans le méthanol est extraite avec un solvant organique tel que le tétrachlorure de carbone. La phase méthanol aqueux est encore diluée avec de l'eau et la solution résultante d'environ 35% d'eau dans le méthanol

est extraite avec un solvant organique tel que le chloro-

forme. Les extraits de tétrachlorure de carbone sont rassemblés et évaporés in vacuo pour donner le résidu A. Les extraits de chloroforme sont rassemblés et évaporés in vacuo pour donner le résidu B. Les résidus A et B peuvent être combinés et chromatographier sur une colonne contenant de la terre de diatomée telle que la Dicalite en utilisant des solvants organiques de polarité faible à élevée. Les fractions appropriées contenant l'antibiotique sont combinées et évaporées in vacuo pour donner le résidu C. Une purification supplémentaire peut être réalisée par chromatographie sur colonne liquide à basse pression à gel de silice du résidu C ou chromatographie liquide à haute performance de moyenne pression des résidus D, D', E et E' comme décrit ci-dessous à l'exemple 3, étape C, en utilisant un gradient linéaire de chloroforme à 5,% de

?56889'

méthanol dans le chloroforme comme 61éluant. Les fractions appropriées sont évaporées à sec pour donner la sandramycine,et la cristallisation à partir d'un système de solvant approprié donne la sandramycine cristalline pure. Structure de la sandramycine La sandramycine est un antibiotique anti-tumeur depsipeptide cyclique contenant un noyau 3- hydroxyquinoline

comme chromophore et une fraction d'acide pipécolique.

A partir de l'analyse de spectre et chimique, la sandramycine a été déterminée pour présenter la formule structurelle suivante

CH 3 CH3

CH CH CH

OûH CO-NHCH2-CO-N-CH2-CO-N- CH

N l ONH-CH -CO-N, CO

CH _

CO >N-_CO - CH-NHOC.r >N

CH-N-CO-CH2-N-CO-CH2NH-CO HO

2I1 2

JCH CH 3

CH

CH3 CH3

La sandramycine est un solide cristallin blanc ayant un point de fusion de 208-212 C, une formule molculaire de C60H76016N12 et un poids moléculaire de 1221,3312. Elle est composée des éléments carbone, hydrogène, azote et oxygène. Les données d'analyse élémentaire sont les suivants: Calc. pour C60H76016N12' 8H20 C, 52,78; H, 6,79;

N, 12,31; 0 (par diffé-

rence), 28,12 Trouvé: C, 52,58; H, 6,27; N, 12,29; 0 (par diffé-

rence), 28,86.

Le spectre de masse à haute résolution de la

sandramycine a été déterminé avec un spectromètre Kratos-

MS-50 et une ionisation FAB. La masse observée est la suivante: Calc. pour ion (M+H)+: 1221,5579

Trouvé pour ion (M+H)+: 1221,5571.

Le spectre d'absorption infrarouge de la sandramycine en comprimés dans KBR présente des bandes caractéristiques aux fréquences suivantes exprimées en centimètres inverses:

3500, 3340, 2970, 2940, 2880, 1748, 1660, 1640, 1598, 1520,

1468, 1445, 1420, 1336, 1290, 1265, 1235, 1172, 1138, 1092,

1055, 1018, 922, 885, 855 et 838.

Le spectre d'absorption ultraviolet de la sandramycine a été déterminé dans le méthanol (0,01798 g/g) dans des conditions neutre, acide et basique. Les maxima d'absorption et d'absorptivités observés sont comme suit: annm (a) max en nm (a) dans CH30H: 356(8,1), 296(7,5), 229(62,8), 217(63,7) dans CH30H-HCP: 356(8,3), 306(8,1), 228(58,4), 210(62,3)

dans CH30H-NaOH: 395(9,2), 301(7,2), 246(59,8).

Un spectre de résonance magnétique du proton de sandramycine dissous dans du chloroforme deutéré a été déterminé avec un spectromètre Bruker modèle WM-360 a 360 MHz et en utilisant du tétraméthylsilane comme standard Interne. Les déplacements chimiques observés (valeurs 5), et constantes de couplage (valeurs J en Hz)

et le-s descriptions de modèle sont comme suit:

11,75(s, 2H, Ar-OH), 9,58(d, J3=6,39, 2H, ser NH), 8,55(bs, 2H, gly NH), 7,82(bs, 2H, Ar-H8), 7,72 (m, 2H, Ar-H), 7,63(s, 2H, Ar-H4), 7,52(m, 4H, Ar-H6 et Ar-H7), ,60(m, 2H, < H de pip.), 5,56(d, J=17,58, 2H sar 0 CH), 5,28(m, 2H, ser o CH), 5,01(d, J=12,79, 2H, ser A CH), 4,88(d, J=12,79, 2H, val " CH), 4,45(bd, J=12,79, 4H, ser A CH et gly " CH), 4,07(bd, J=15, 99, 4H, H de pip. et gly O(CH), 3,76(bd, J=12,79, 2H, FúH de pip.), 3, 58(d, J=17,58, 2H, sar CH), 3,14(s, 6H, N-CH3), 2,96(S, 6H, N-CH3), 2, 06(m, 2H, val e CH), 1,82(bs, 4H, y3 CH de pip.), 1,68(bm, 4H, yCH de pip. ), 1,57 (bm, 4H, SCH de pip.), 0,94(d, J=6,37, 6H, val-CH3), 0,80 (d,

J=6,37, 6H, val-CH3).

Un spectre de résonance magnétique au carbone 13 de sandramycine dissous dans du chloroforme deutéré a été déterminé avec un spectromètre Jeol modèle FX90Q opérant à 22,5 MHz et utilisant du tétraméthylsilane comme standard interne. Les déplacements chimiques observés (valeurs ppm) dans lesquels chaque déplacement chimique représente deux atomes de carbone, et les attributions sont les suivantes: N Déplacement chimique (ppm) Attribution 1 171,73 carbonyle 2 168,54 carbonyle 3 168,37 carbonyle 4,5 166,91, 166,91 carbonyle 6165,39 carbonyle4 6 165,39 carbonyle N Déplacement chimique (ppm) Attribution 7 153,04 3-hydroxyquinoline C-3

8 140,64 C-2

59 133,87 C-8a 131,22 C-4a

11 128,61 C-8

12 127,64 C-7

13 126,23 C-5

14 125,58 C-6

119,45 C-4

16 61,43 N-méthyl valine A CH

17 27,90 ACH

18 18,58 YCH

19 17,82 3CH

29,42 NCH

21 49,79 glycine O<CH 22 41,02 sarcosine " CH

23 34,08 N-CH

24 51,74 sérine O CH

61,11 CH

H2 26 48,49 acide pipécolique o CH

27 27,90 A-CH

28 19,34 y-CH2

9 24,11 -CH

-.H29

43,07 $- CH2

Les caractéristiques structurelles clés de la sandramycine qui la distinguent des luzopeptines A, B et C sont la présence des fractions d'acide 3-hydroxyquinaldique et d'acide pipécolique au lieu des groupes d'acide

3-hydroxy-6-méthoxyquinaldique et d'acide 4-substitué-

tétrahydropyridazine-3-carboxylique, respectivement.

356889 =

Activité biologique de la sandramycine Les activités antibactériennes de la sandramycine ont été déterminées par un procédé double de dilution agar en série. Les résultats sont répertoriés au tableau 5 en comparaison avec les activités de la luzopeptine A et de l'échinomycine. Comme on peut le voir à partir du tableau 5, la sandramycine est fortement inhibitrice des microorganismes gram-positifs tels que Bacillus subtilis

et Staphylococcus aureus ainsi que Streptococcus faecalis.

Tableau 5 Activité antimicrobienne de la sandramycine Concentration inhibitrice minimum (MIC) ()g/ml) Organisme d'essai Sandramycine Luzopeptine Echinomycine A B. subtilis (Rec. +)

A22508-2 0,024 0,195 0,049

B. subtilis (Rec. -)

A22509-2-2 0,012 0,049 < 0,003

S. aureus 209P-A9497 0,012 0,098 0,012 5S aureus (résistant à l'échinomycine) A9628 0,098 0,098 0,78 Strep. faecalis A9611 0,024 0,195 0,012 E. coli A15119 12,5 12,5 12,5 E. coli (sensible à l'actinomycine)

A21780 (AS-19) 12,5 12,5 6,25

La sandramycine a également été testée contre la leucémie P-388 de tumeur de la souris transplantable et les résultats sont répertoriés au tableau 6. La méthodologie utilisée généralement suit les protocoles du National Cancer Institute [ Cancer Chemotherapy Rep. partie 3, 3, 1-103 (1972)3. Les détails expérimentaux essentiels sont donnés en bas du tableau 6. Deux régimes de dose différents ont été testés: une dose unique le jour 1 et journellement pendant 5 jours. Avec les deux schémas,

la dose optimum apparaît être d'environ 0,2 mg/kg/injection.

Tableau 6

Effet de la sandramycine sur la leucémie P-388 Effet

Schéma Dose IP MST MST AWC Sur-

Composé de trai- mg/kg/ T/C 9 vivants tement injection rs jour 4 jour 5 Sandramycine jour 1 3,2 Toxi- Toxi- -2,8 0/6 que que

1,6 11,5 128 -1,3 6/6

0,8 10,0 111 -1,6 6/6

0,4 11,0 122 -0,7 6/6

0,2 14,5 161 -1,4 6/6

0,1 11,0 122 -0,9 6/6

0,05 10,0 111 -0,6 6/6

0,025 9,5 106 -0,2 6/6

Sandramycine jour 1--'5 1,6 Toxi- Toxi- -1,7 2/6 que que

0,8 6,0 67 -1,4 5/6

0,4 11,0 122 -1,3 6/6

0,2 12,0 133 -1,7 5/6

0,1 11,5 128 -0,8 6/6

0,05 8,5 94 -1,8 6/6

0,025 10,0 111 -1,4 5/5

0,0125 10,5 117 -0,9 6/6

Contrôle salin 9,0 - 0,2 10/10

Inoculum de tumeur: 106 cellules ascites implantées i.p. Hôte: souris femelle CDF1 Evaluation; MST = durée de survivance moyenne

Effet: T/C >/ (MST traité/MST contrôle) x 100 Critère: T/C = 125 considéré activité anti-tumeur significative AWC: modification du poids moyen (traité-contrôle) en

grammes (le jour 4).

Comme indiqué par les données antimicrobiennes et de tumeur de la souris mentionnées ci-dessus, la sandramycine est utile comme antibiotique et également comme agent anti-tumeur pour l'inhibition de tumeurs malignes des

mammifères telles que la leucémie P-388.

L'invention inclut dans sa portée des compositions

pharmaceutiques contenant une quantité efficace anti-

microbienne ou inhibitrice de tumeur de sandramycine en combinaison avec un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable inerte. De telles compositions peuvent

également contenir d'autres agents anti-tumeurs ou anti-

microbiens actifs et peuvent être réalisées sous toute-

forme pharmaceutique appropriée pour la route d'admi-

* nistration désirée. Des exemples de telles compositions incluent des compositions solides pour l'administration orale telles que comprimés, capsules, pilules, poudres et granules, des compositions liquides pour l'administration orale telles que solutions, suspensions, sirops ou élixirs et des préparations pour l'administration parentérale telles que solutions stériles, suspensions ou émulsions. Elles peuvent également être fabriquées sous la forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes dans de l'eau stérile, un salin physiologique ou quelque autre milieu injectable stérile immédiatement.avant l'emploi. Pour une utilisation comme agent antimicrobien, la sandramycine ou la composition pharmaceutique de celle-ci est administrée de sorte que la concentration de l'ingrédient actif est supérieure à la concentration inhibitrice minimum pour l'organisme particulier à traiter. Pour l'emploi comme agent anti-tumeur, des dosages optimum et des régimes de sandramycine pour un hôte mammifère donné peuvent être facilement déterminés par les spécialistes de l'art. On apréciera naturellement que la dose actuelle de sandramycine utilisée variera selon la composition particulière formulée, le mode d'application et le site particulier, l'hôte et la maladie à traiter. De nombreux facteurs qui modifient l'action du médicament seront pris en compte incluant

l'âge, le poids, le sexe, le régime, la durée d'adminis-

tration, la route d'administration, le taux d'excrétion, la condition du patient, les combinaisons de médicaments, les sensibilités de réaction et la sévérité de la

maladie.

Les exemples suivants sont fournis dans des buts d'illustration seulement et n'ont pas pour but de limiter la portée de l'invention. Le Skellysolve B est un solvant de pétrole commercialement disponible (Skelly Oil Co.) comprenant des hexanes isomères et ayant un point d'ébullition de 60-690C. La Dicalite est de la terre de diatomée fabriquée par Grefco Inc., Torrance, Californie. Sauf indication contraire, toutes les

températures ci-dessous sont en degrés centigrades.

EXEMPLE 1

Fermentation de la sandramycine A. Fermentation en flacon agité Une souche de Nocardioides sp. N C49 009, ATCC 39419, est maintenue et transférée dans des tubes

d'essai de culture sur des inclinés agar de agar levure-

extrait de mais. Ce milieu consiste de 4,0 g de glucose, 4,0 g d'extrait de levurej 10,0 g d'extrait de malt et

,0 g d'agar ajustés à 1 litre avec de l'eau désionisée.

Avec chaque transfert la culture inclinée agar est incubée pendant 7 jours à 27 C. Pour préparer un inoculum pour la phase de production, la croissance mycénienne de la culture inclinée est transférée à un flacon Erlenmeyer

de 500 mÀt contenant 100 mrt de milieu stérile consis-

tant de 30,0 g de glucose, 10,0 g de farine de soja, 10,0 g de farine embryonnaire de graines de coton et 3,0 g de CaCO3 amenés à 1 litre avec de l'eau désionisée. Cette culture végétative est incubée à 27 C pendant 48 heures sur un agitateur Gyrotory tier (modèle G53, New Brunswick Scientific Co., Inc.) réglé à 210 révolutions/minute décrivant un cercle avec un diamètre de 5,1 cm. Quatre millilitres de culture végétative sont transférées dans un flacon Erlenmeyer de 500 m2 contenant 100 m de milieu de production stérile consistant de 1,0 g de sucrose, 10,0 g de farine de soja 10,0 g de farine de graines de lin et 5,0 g de CaCO amenés à 1 litre avec de l'eau désionisée. La culture de production est incubée à 27 C sur un agitateur tel qu'utilisé pour la culture végétative réglé à 250 révolutions/minute. A 96 heures la culture de production est récoltée pour l'isolation

de la sandramycine.

B. Fermentation de sommet en banc Pour la production de sandramycine dans un fermenteur de sommet en banc, on transfère 400 mP- de culture végétative comme décrite à l'exemple 1A dans un fermenteur (Microgen modèle SF-116, New Brunswick

Scientific Co., Inc.) avec 10 litres de milieu de produc-

tion consistant de 40 g d'amidon de mais ou de blé, 20 g de farine de graines de lin, 1 g (NH4)2 S04 et 5 g de CaCO3 par litre d'eau désionisée. La température est maintenue à 27 C, la vitesse d'agitation est de 300 révolutions/minute et le débit d'écoulement d'air est de 8 litres/minute. Après 202 heures d'incubation, la

sandramycine est isolée à partir de la culture.

C. Fermentation en réservoir Pour la production d'usine pilote de sandramycine, 2 litres de culture végétative (préparée selon la procédure générale de l'exemple lA)sont transférés à un fermenteur contenant 30 litres de milieu de production consistant de g d'amidon de mais ou de blé, 20 g de farine de graines de lin, 1 g (NH4)2S04 et 5 g de CaC03 par litre d'eau désionisée. La température d'incubation est de 26,5 C, le débit d'écoulement d'air est de 80 litres/minute, la vitesse d'agitation est de 375 révolutions/minute et la pression arrière est de 1 atmosphère. Après 183 heures,

la fermentation en réservoir est recueillie pour l'iso-

lation de la sandramycine.

EXEMPLE 2

Isolation et purification de la sandramycine Etape A: Extraction Le bouillon complet de fermentation brut (environ 8 litres) est transféré dans un réservoir de polyéthylène de 20 litres (48 cm de diamètre au sommet, 44 cm de diamètre au fond, 55cm de hauteur) équipé avec un réservoir au fond. Un volume égal d'acétate d'éthyle est ajouté. Le mélange est agité avec un agitateur entraîné à l'air à une bonne vitesse de mélange pendant 30 minutes. Approximativement 6 litres (2 kg) de Dicalite est ajouté et mélangé. Le mélange est filtré sur un tampon de Dicalite qui est maintenu dans un entonnoir Buchner NO 12. Le filtrat est recueilli dans une bouteille de solution de 19 litres équipée d'une prise de vide. Le mat est lavé avec 2 litres d'acétate d'éthyle. Le filtrat est transféré dans un entonnoir de séparation de 20 litres et les phases sont laissées se séparer. L'extrait d'acétate d'éthyle est enlevé et concentré en approximativement 1 litre dans un évaporateur de circulation en verre de dimension de laboratoire équipé, d'une alimentation continue. Le concentrat est évaporé jusqu'à obtenir une huile visqueuse in vacuo dans un évaporateur rotatoire pour obtenir 1,94 g d'extrait brut. Etape B: Séparation liquide-liquide de l'extrait brut L'extrait brut de l'étape A (1,94 g) est dissous dans un mélange de 200 me de méthanol et 200 mû de Skellysolve B. La solution biphase est transférée dans un Z 56889 t

entonnoir de séparation de 1 litre et diluée avec 22m-

d'eau. Le mélange est agité et les phases résultantes sont laissées se séparer. Le méthanol aqueux (phase inférieure) est transféré dans un second entonnoir de séparation de 1 litre et extrait deux fois supplémentaires

avec 200 mû d'aliquotes de Skellysolve B. Le Skelly-

solve B a été précédemment saturé avec un volume égal de 10% d'eau dans le méthanol. La phase de méthanol aqueux est diluée avec 44 mP d'eau et extraite trois fois avec des parties de 200 mû de tétrachlorure de carbone. Le tétrachlorure de carbone a été précédemment

saturé avec un volume égal de 25,% d'eau dans le méthanol.

La phase de méthanol aqueux est diluée avec 41 m- d'eau et extraite trois fois avec des parties de 200 m- de chloroforme. Le chloroforme a été précédemment saturé avec un volume égal de 35,% d'eau dans le méthanol. Les extraits de tétrachlorure de carbone sont rassemblés et évaporés à sec in vacuo dans un évaporateur rotatoire pour obtenir 595 mg de résidu A. Les extraits de chloroforme sont rassemblés et évaporés à sec in vacuo dans un évaporateur rotatoire pour donner 458 mg de résidu B. Etape C: Trituration des résidus A et B Le résidu A (547 mg) et le résidu B (389 mg) obtenus à l'étape B sont rassemblés et dissous dans 30 m{ de 2 parties de chloroforme-l partie de méthanol. La Dicalite (17,4 g) est ajoutée à la solution, et ensuite une bouillie est produite par l'addition de 200 me de Skellysolve B. Les solvants sont évaporés in vacuo avec

un évaporateur rotatoire. La poudre résiduelle est trans-

formée en bouillie dans 500 ma. de toluène et emballée dans une colonne de chromatographie flash de 4,1 cm de diamètre interne x 45,7 cm. La Dicalite est emballée dans

un lit avec un écoulement sous pression (N2-N 39 kPa).

Lorsque le solvant d'emballage atteint la surface du lit,

l'écoulement est arrêté et la colonne est dépressurisée.

Une couche de sable d'Ottawa (environ 2--cm) est ajoutée

2 5688

en surface. La colonne est ensuite éluée avec un écoulement d'azote sous pression avec les séries élutropes suivantes: toluène (500 mQ-); diéthyléther (500 mZ); chlorure de méthylène (500 mL); chloroforme (500 me); acétate d'éthyle (500 mL); acétonitrile (500 m); tétrahydrofuranne (500 mL) et méthanol (500 me). L'éluant de toluène et le filtrat d'emballage sont combinés (environ 1 litre) et évaporés à sec in vacuo sur un évaporateur rotatoire pour donner 0,699 g de résidu C. Etape D: Chromatographie sur colonne du résidu C Une colonne de diamètre interne 2, 0 cm x 30 cm Glenco est emballée sous forme de bouillie avec 37 g de gel de silice Woelm (0,060-0,200 mm, dimension de maille

selon le standard américain 70-230) dans du chloroforme.

Le résidu C (0,699 g) de l'étape C est dissous dans 5 mt

de chloroforme et appliqué au sommet de la colonne.

L'échantillon est laissé percoler dans le lit emballé.

Le vide entre le sommet de la colonne et le lit de gel

de silice est rempli avec du sable d'Ottawa standard.

La colonne est connectée à un appareil d'élution à gradient Glenco et on commence l'élution avec un gradient linéaire de 2 litres de chloroforme à 5%0 de méthanol dans le chloroforme en recueillant vingt fois des fractions de 100 mt. Chaque fraction est évaporée à sec in vacuo dans un évaporateur rotatoire. Le résidu est dissous dans

3 mL de 2 parties de chloroforme-1 partie de méthanol.

Des aliquotes (2"e-) de chaque fraction sont déposées sur des plaques de chromatographie en couche mince (CCM) GHLF de gel de silice Analtech. Les plaques sont éluées avec 5% de méthanol dans le chloroforme et visualisées avec une lumière ultraviolette à 254 nm et 366 nm. La fraction 6 est jugée homogène. Le résidu cristallin à partir de la fraction 6 est recristallisé à partir de

chloroforme-méthanol pour donner 215 mg de sandramycine.

Ce matériau est recristallisé à partir de chloroforme-

méthanol pour donner 180 mg de sandramycine pure, point

de fusion 208-212 C.

Anal. Calc. pour C60H76016N12 8H20: C, 52,78; H, 6,79

N, 12,31

Trouvé: C, 52,58; H, 6,29

N, 12,29

EXEMPLE 3

Isolation à plus grande échelle et purification de la sandramycine Etape A: Extraction et séparation liquide de l'extrait brut Lorsqu'on répète les procédures d'isolation générales décrites à l'exemple 2, étapes A et B, on obtient 1,12 g de résidu A et 3,03 g de résidu B à partir

du bouillon de fermentation total (environ 8 litres).

Etape B: Trituration des résidus A et B Le résidu A (1,12 g) obtenu à l'étape A est dissous dans approximativement 300 ml de 2 parties du chloroforme-l partie de méthanol. La Dicalite (20 g) est ajoutée à la solution. Le solvant est évaporé à sec in vacuo dans un évaporateur rotatoire. Le résidu est transformé en bouillie dans 300 m- de toluène et évaporé encore à sec. Ceci est répété une seconde fois. Le résidu résultant est transformé en bouillie dans 300 mR de Skellysolve B-et évaporé à sec dans un évaporateur rotatoire. Ceci est répété une seconde fois. Le résidu de Dicalite est transformé en bouillie dans 300 mR de

Skellysolve B et emballé dans une colonne de chromato-

graphie flash de 4,1 cm de diamètre interne x 45,7 cm La Dicalite est emballée dans un lit avec un écoulement sous pression (N2- N 39 kPa). Une couche de sable d'Ottawa (environ 2 cm) est emballée sur le lit. L'élution commence avec un écoulement d'azote sous pression avec les séries élutropes suivantes: Skellysolve B (500 me); toluène (500 mk); diéthyléther (500 mt); chlorure de méthylène (500 mQ.); chloroforme (500 ml); acétate d'éthyle (500 m--); acétonitrile (500 mû); tétrahydrofuranne (500 mL) et méthanoI (500 mt). L'éluant de toluène est évaporé à sec in vacuo dans un évaporateur rotatoire pour

5688 9

donner 912,7 mg de résidu D. La procédure générale soulignée ci-dessus est répétée sauf que le résidu A utilisé est remplacé par 3,03 g de résidu B, et on produit ainsi 766,7 mg de résidu E à partir de l'éluant de toluène. Les procédures générales décrites ci-dessus à l'exemple 3, étapes A et B, sont répétées sauf que les résidus A et B obtenus et utilisés sont remplacés par 1,5 g et 1,97 g des résidus A' et B', respectivement, et O10 on produit ainsi 993,9 mg de résidu D' et 693 mg de résidu E', respectivement, à partir de l'éluant de toluène. Etape C: Chromatoqraphie sur colonne des résidus D et E Une colonne Glenco de 2,0 cm de diamètre interne x 30 cm est emballée en bouillie avec 40 g de gel de silice Woelm (0,063-0,200 mm, dimension de maille standard 70-230) dans du chloroforme. La colonne est insérée dans le système HPLC à moyenne pression et équilibrée avec du chloroforme. Les résidus D, D', E et E' à partir de l'étape B sont rassemblés (approximativement 3,366 g) et dissous dans 6 mQ de chloroforme. La solution est tirée dans une boucle d'échantillonnage de mt. La bouele d'échantillonnage est insérée dans le système HPLC de moyenne pression, et l'échantillon

est pompé sur la colonne avec 200 mQ- de chloroforme.

L'élution commence avec un gradient linéaire de 2 litres de chloroforme à 5% de méthanol dans le chloroforme en recueillant 17 fois des fractions de 117 mt. Des aliquotes (6t) de chaque fraction sont essayées sur CCM en utilisant 5% de méthanol dans du chloroforme comme éluant et visualisées avec de la lumière ultraviolette à 366 nm. Les fractions 5 et 6 sont rassemblées et évaporées à sec pour donner 2,166 g de résidu F. Les fractions 7 à 12 sont rassemblées et concentrées à sec in vacuo avec un évaporateur rotatoire. Le résidu (953 g) est dissous dans 6 ml de chloroforme et rechromatographié comme ci-dessus en utilisant un gradient linéaire de 2 litres de chloroforme à 1,5% de méthanol dans le chloroforme en recueillant 20 fois des fractions de 100 mi Les fractions 9 à 20 sont rassemblées et évaporées à sec dans un évaporateur rotatoire pour donner 860 mg de résidu G.

Les résidus F et G sont combinés et recristal-

lisés à partir du chloroforme-méthanol pour donner 1,985 g de sandramycine pure, qui est identique au

produit isolé à l'exemple 2.

256889-

RE V E ND I CA T IONS

1.- Nouveau composé, caractérisé en ce qu'il s'agit de la sandramycine ayant la formule structurelle suivante:

-H3 J3

CH

CH CH I

CO-NHCH -CO-I- H -CO- CH

LkCONH- C H- C -Nil- 2CO CH

CH- 2 CH

H12

0 Mû N-CO- CH-NHCO N

CH-N-CO-CH2-N-CO-CH 2NH-CO

CH3 CH3

CH

CH3 CH3

2.- Procédé de préparation de la sandramycine, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une souche

productrice de sandramycine de Nocardioides sp. nov.

ayant les caractéristiques d'identification de ATCC 39419, ou d'une souche mutante de celle-ci, dans des conditions aérobies submergées dans un milieu de culture contenant des sources de carbone et d'azote assimilables jusqu'à ce qu'une quantité sensible de sandramycine soit produite

et accumulée dans le milieu de culture.

3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire

d'isoler la sandramycine du milieu de culture.

4.- Culture biologiquement pure du microorganisme Noeardioides sp. ATCC N 39419, qui est capable de produire 356889k la sandramycine-en une quantité récupérable par culture dans un milieu de culture contenant des sources de carbone et d'azote assimilables dans des conditions

aérobies submergées.

5.- Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend de la sandramycine à titre

d'ingrédient actif.

6.- Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend des quantités antibactériennes efficaces de sandramycine en combinaison avec un

support ou diluant pharmaceutique inerte.

7.- Composition pharmaceutique, -caractérisée en ce qu'elle comprend des quantités inhibitrices de tumeur efficaces de sandramycine en combinaison avec

un support ou diluant pharmaceutique inerte.