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Procédé d'isolement de nouveaux composés.
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La présente invention a trait à un procédé de sépara- tion et d'isolement des nouveaux composés à action antibiotique, verrucarine A, verrucarine et roridine A, à partir des liquides de culture et/ou des mycéliums des souches mycétiennes Myrothecium verrucaria (Albertini et Schweinitz) Ditmar ex ries et Myrothecium roridum Tode ex Fries.
Le présent procédé de séparation et d'isolement de la verrucarine A, de la verrucarine B et de la roridine A consiste à séparer en ses composantes le mélange d'antibiotiques par pré-
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cipitation, partage, adsorption ehroraatographique, chromatographie de partage ou partage à contre-courant (partage fractionné).'
On isole des colonies des mycètes Myrothecium verrucaria. et Myrothecium roridum à partir d'échantillons de sol d'origines
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les plus variées. Du point de vue morphologique, toutes ces souches correspondent aux descriptions telles qu'elles sont données par exemple dans Gilman, J.C. 1957, A Manual of Soil Fungi, 2ème éd.
The lova State College Fress, Ames, Iowa, U.S.A. Les différentes souches isolées, dont certaines sont obtenues à partir du même échantillon de sol, peuvent présenter des caractères différents, aussi bien au point de vue morphologique, par exemple par leur plus ou moins grande tendance à la formation de spores, qu'au point de vue physiologique, par exemple par la composition du milieu de culture dont elles ont besoin pour la production des antibio- tiques.
On peut utiliser comme matière première non seulement le liquide de culture ou le mycélium des souches des mycètes Myrothecium verrucaria et Myrothecium roridum, mais aussi le li- quide de culture et le mycélium de variants de ces organismes, comme par exemple ceux que l'on obtient par sélection de secteurs (variations sectorielles) ou de mutants, en particulier après ac- tion des rayons ultraviolets ou des rayons X.
On peut par exemple réaliser la culture en culture superficielle sans agitation, ou bien en culture submergée, dans des fermenteurs, en secouant ou en agitant avec de l'air ou de l'oxygène.
Il est possible de cultiver les souches de Myrothecium verrucaria et Myrothecium roridum sur des milieux très variés con- tenant les éléments nutritifs usuels. Cela signifie qu'elles peu- vent utiliser comme source de carbone le glucose, l'amidon, la dextrine, le lactose, le saccharose, etc... comme source d'azote des j composés azotés organiques et minéraux tels que la peptone, la levure ou les extraits de viande, le sulfate d'ammonium, le ni- trate d'ammonium, les amino-acides, etc, ainsi que les sels minéraux et éléments acides usuels.
La demanderesse a trouvé qu'il est possible d'isoler, à partir des liquides de culture de plusieurs souches de Myrothecium .
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verrucaria et Myrothecium rorldum, au moins 8 composantes sous une forme bien définie, pure et cristallisée. La présence et les rap- ports quantitatifs de ces composantes varient suivant les condi- tions de culture. Conformément au présent procédé on extrait les corps actifs du filtrat de culture avec du chloroforme* du dichlo- rom6thane ou de l'acétate d'éthyle. Apres réduction à un Moindre volume, les extraits ainsi obtenus sont lavés à la lessive de soude caustique et a. l'eau à 0 C, lorsque le pH du liquide de culture initial est inférieur à 3,5.
Les extraits obtenus à partir de li. quides de culture présentant un pH supérieur à 3,5 sont en outre lavés avec l'acide chlorhydrique binormal. Ceci permet d'éliminer les impuretés colorées inactives.
Après évaporation du solvant, on obtient un produit brut huileux d'une coloration allant du jaune au brun d'où l'on peut isoler un produit cristallisé brut, par addition d'éther, plus ou moins facilement suivant la quantité d'impuretés huileuses présentes. L'analyse par chromatographie en couche mince montre qu'il s'agit principalement de verrucarine A, mais qu'il contient également de la verrucarine B et parfois de la roridine B, comme constituants secondaires, lorsqu'il a été préparé à partir de cul- tures de M. verrucaria.
Lorsqu'on a opéré avec des cultures de M. roridum, le produit cristallisé brut obtenu est principalement constitué de roridine A.,mais il contient généralement aussi, comme produits accessoires, de la roridine B, de la verruoarine A et de la verrucarine B. La séparation eu composantes bien définies se fait par une ou plusieurs chromatographies d'absorption successives, effectuées soigneusement, sur des colonnes d'oxyde d'aluminium ou de gel de silice, et par recristallisations répétées dans des mé- langes acétone-éther, méthanol-éther, chloroforme-éther-éther de pétrole et dichlorométhane-éther; au cours de ces processus, il est nécessaire de contrôler la pureté des fractions par chromatogra- phie en couche mince.
C'est ainsi qu'enpartant des filtrats de culture de M. verrucaria on parvient généralement à isoler en quantités variable ,
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des fractions élevées par du chloroforme et par des mélanges 99/1 et 98/2 de chloroforme et de méthanol, les verrucarines C, D et 3 et les roridines A et B, à l'état pur et cristallisé, tandis que le domposé principale la verrucarine A, ne peut généralement pas être obtenu a l'état pur de cette façon, mais est toujours encore souillé de verrucarine il
On peut obtenir de la même manière, à partir des fil-
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trats de culture M.
roridum, la roridine A à l'état pur et cris- tallisé comme produit principal, et également comme produits accès** res les roridines B et C ainsi que les verrucarines A et B, elles aussi sous forme pure et cristallisée. Les premières fractions
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chromatographiques éludes au benzène abandonnent des constituants huileux qui sont rejetés. Les fractions suivantes, éluées au chloroforme-méthanol (98/2), (95/5) (9/1 (4/1) et (1/1)p donnent un produit amorphe.
La séparation du mélange cristallisé de verrucerines A et B en composantes bien définies se fait pas chromatographie de partage, avec l'eau comme phase stationnaire et, .
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comme phase mobile, des mélanges de benzine-chloroforme saturés d'eeui On utilise comme support de la phase stationnaire de la terre
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de diatomées. Il y a au début séparation de la verrucarine B à l'é- tot pur; dans les fractions ultérieures, on trouve uniquement de la verrucarine
Le tableau 1 suivant donne des indications sur les sub- stances isolées à partir de diverses souches de M. verrucaria et M. roridum.
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T A b L 3 A U 1 mir2lh2gium a) Souche 8 118 'exrttcar3.ne A Verrucarine B Verrucarine 0 Koridine B b) Souche S 750: Verrucarine A
Verrucarine B
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Roridine à
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c) Souche 8 833: Verrucarine A
Verrucarine B
Verrucarine D
Verrucarine E Myrothecium roridum a) Souche S 973: Roridine A
Substance A (non isolée à l'état pur) b) Souche 8 1135Roridine A
Roridine B
Roridine C Verrucarine A
Verrucarine B
Substance A (non isolée à l'état pur)
L'emploi de cultures des souches S 973 et S 1135 de M. roridum permet de mettre en évidence par chromatographie un autre composé qui est désigné sous le nom de substance A. La substance A n'a pas encore été isolée sous forme pure; elle n'existe que mélangée à la roridine A.
L'extraction du mycélium d'une culture de la souche S 118 de M. verrucaria par du méthanol aqueux donne, après puri- fication de l'extrait par partage entre eau et acétate d'éthyle, un produit brut contenu dans les portions solubles dans l'acétate d'éthyle, que l'on peut ensuite séparer, après vérification chroma- tographique sur colonne de gel de silice, en verrucarine A brute et cristallisée (contenant encore de la verrucarine B) et en rori- dine B.
A côté des méthodes classiques permettant de caractériser les composés cristallisés isolés, la chromatographie en couche mince se montre un instrument précieux de vérification de la pureté des fractions amorphes ainsi que des composés cristallisés. L'exemple 13 décrit en détail un mode d'exécution partiellement adapté à ce but. Il est par exemple très difficile de déterminer la pureté des verrucarines A et B sans utiliser l'analyse ohromatographique.
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Ci-dessous sont données les caractéristiques essentiel- les des substances isolées.
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L'antibiotique verrucarine A forme, après reoriltal11- sation dans des mélanges méthanol-éther, ecétone-dther ou chloro- forme-éther-éther de pétrole, des paillettes rectangulaires
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incolores qui ne fondent pas en dessous de 3SO C. Au voisinage de 280 C, les cristaux commencent à prendre une coloration jaune à brune due à un début de décomposition.
Ils sont insolubles dans
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l'eau, l'éther dléthyl1que, l'éther úi1sopropyllque et dans les hydrocarbures saturés liquides (pentane, hexane, heptane, cyclo- hexane); par contre, ils sont solubles dans les cétones inférieures (acétone, méthyléthylcétone, etc...), dans les alcools inférieurs (méthanol, éthanol, propanol, etc...); dans le diox&nne, dans les hydrocarbures halogènes à chaîne courte (dichlorométhane, chloro- forme, tétrachlorure de carbone), dans la pyridine, le benzène
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et le toluène. Les pouvoirs rotatoires spécifiques sont: a""2 + 206 20 (chloroforme) et L-Q-Ï2 . + 208 + 2 (dioxanne).
Les analyses élémentaires donnent les pourcentages suivantes Cri64,5? 64 64,2% H:6,9J 7,0; 6,7% et Os 29,0; 28e4; 28,7%.
L'antibiotique ne contient ni azote, ni soufre, ni halogène La détermination du poids moléculaire selon la méthode de hast (camphre) donne un poids moléculaire de 517 et la microdétermina-' tion thermoélectrique donne 527. Ces résultats sont en accord avec la détermination du poids moléculaire faite en mesurant la radioactivité du composé acétylé obtenu avec l'anhydride ecétique marqué par 14C, laquelle donne un poids moléculaire de 520. Cet faits permettent d'admettre comme formule brute la plus probable
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'C27H309 (502,5).
Le spectre d'adsorption UV dans l'éthanol présente un m.ri.mun à 260 a,u; log=4,25 (calculé pour un poids moléculaire de 502, 5) Le spectre IR d'une solution de l'antibiotique dans le dichlorométhane présente des bandes (les plus intenses sont souli-
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gnées ) à 0, 2970, 1,71&p A6?5f 5' ,1a75,, 1410, 1385p 1213, 1190, 1186, 9b8, 878 et 820 r,t"f. A l'état solide (suspension dans
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le nujol) on observe des bandes à 3 560-3580. 2930, z70, 1709. 1 22Z1, i621, 1587, 1457, 1377, 127$, 1213, 1195, 1123, 1103, 10S5, 1053e 1032, 1023, 9730 967, 887, 832 cm"i.
La verrucarine A ne | contient pas de groupe méthoxy, contient 5 de carbone méthy11- i: que (selon Kuhn .icoth, de 0,17 a. 0,25% d'hydrogène mobile r: (mesure faite par la méthode de Zerevitinov) , prend par micro hydrogénation 3 molécules d'hydrogène, ne donne, avec le tétrani- trométhane dans le chloroforme, aucune coloration jaune, décolore immédiatement les solutions de permanganate de potassium dans , l'acétone et de brome dans le chloroforme. Les réactions de Tollens,
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.f!'ehl1ng, Molisch, Légal, Zimmermann et Liebermann donnent des résultats négatifs. Il en résulte que la verrucarine A est un compo neutre lipoïdosoluble.
L'antibiotique verrucarine B a des propriétés très voisines de celles de la verrucarine A, qu'il a très souvent ten- dance à accompagner lors des cristallisations. Il cristallise dans l'acétone-éther sous forme d'aiguilles qui ne fondent pas au-dessous
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de j60 C. Aux environs de 280OU les cristaux commencent à. prendre une coloration allant du jaune au brun, ce qui indique une décom- position.
Ils sont insolubles dans l'eau, l'éther diéthylique,
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l'éther diisopropylique et dans les hydrocarbures saturés liquides (pentnne, hexane, heptane, cyclohexane), solubles par contre dans les cétones a bas poids moléculaire (actone, méthylthylcétone, etcta les alcools à bas poids moléculaire (méthanol, ôthanol, propanol, etc.), dans le dioxanne, dans les hydrocarbures halogènes à chaîne courte (dichlorométhane, chloroforme, tétrachlorure de carbone), dans la pyridine, le benzène et le toluène. Les pouvoirs rota- toires spécifiques dépendent beaucoup, ce qui est surprenant, de
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la nature du solvant. On trouve par exemple a"",D3 = + 94' + 2 #* ***22 dans le chloroforme; L c",%pz = + 10. + 10 dans le dioxanne et L a3 1470 20 dans le benzène.
Les analyses élémentaires donnent les résultats suivants: C:65,4 et 64,7%; H:6,5 et braz et 0:28,1 et 28,9%. La verrucarine B ne contient pas d'azote, de
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soufre ni d'halogènes. La détermination du poids moléculaire faite selon la méthode de Hast (camphre) donne les valeurs de 629 et 645; la mierodétermination thermoélectrique donne 490. D'après ces résultats on peut envisager les formules brutes Gx'2uy(5fl0,5)' et peut-être Cbdfll2 (662xl) et Ch,lab64,7). Le spectre d'absorption UV dans l'éthanol présente un maximum à 259 a/ut log - 4,35 (calculé pour un poids moléculaire de 4901. Le spectre IR d'une solution dans le dichlorométhane présente des bandes à 2880, 17.¯6.. 7.01, 1670. L621p IL81., 1419, 1240, 1100, 1080, 1038, 995, 965 et 877 ci-'.
A l'état solide (suspension dans le nujol), il existe des bandes a s 29300 2885, 1736. 17."2 1675. ;1, 590. j 1460, 1378, 1263, 1200, 1104, 1087, 1038, 97fil, 892, 825, 740 et 646 cm-1. Le composé ne contient pas de groupes mthoxy ni d'hydrogène mobile (Zerevitinov). Par mierohydrogénation, il absorbe 3 moles d'hydrogène(si l'on admet un poids moléculaire de 670) ou 4 moles d'hydrogène (si l'on se base sur un poids moléculaire de
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40). Il contient 219% de carbone méthylique (selon Kuhn-Hoth).
De même que la verrucarine A, la verrucarine B est un composé neu- tre lipoldosoluble.
La verrucarine C ne se forme que dans certaines cul- tures et toujours en très faibles quantités. Elle cristallise dans le méthanol-éther ou l'acétone-éther sous forme de prismes incolo- res fondant de 223 à 224 C.
11 en est de même pour la verrucarine D, qui n'est pas obtenue dans toutes les conditions de culture et, en tout cas, en quantités extrêmement faibles. Elle cristallise dans un mélange
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d'éther et d'éther de pétrole sous forme d'aiguilles j'ondwit entre 1270 et 1280C.
L'antibiotique roridine A s'obtient, après cristalli- sation dans l'acétone-éther, sous forme de cristaux incolores
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qui fondent soit entre 1910 et 196 C, soit entre 1980 et 204 C.
Ils sont facilement solubles, dans les cétones à bas poids molécu- laire (acétone, méthyléthyl-cétone)y dans les alcools à bas poids
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ddthanolp éthanol, propanol), dans le dioxanne,, dans "11\ ' 1) tttl' h les 'h;4toi IWI 'res halogènes à chaîne courte (dichlorométhane, chlo- reforma, tétrachlorure de carbone) et dans la pyridine. Le produit est difficilement soluble dans l'eau, l'éther dléthyllque, l'étH8 d!ljioP111qUe et dans les hydrocarbures saturas liquides
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(pentane, hexane, heptane, cyclohexane), le benzène et le toluène.
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Le pouvoir rotatoire spécifique est de 22 a + 129* ± 1.
..ans le c'rorforme). Les analyses élémentaires donnent les r6- sulUijsî . .st ç6,i! R 5,4d3 Ht7p4 et Ot27p4j 26,b,9. La détermina- tion du moléculaire selon Hast (camphre) donne les valeurs 3 t la microdétermination thermoélectrique donne 543.
U en ful1 que l'on peut proposer comme formule brute pour la roridine A UIHJUU7(406,,), BUs 49,6) et CUuy 53,b S36).. spectre d'absorption dans l'éthanol présente il spectre d'absorption OV dans l'ethanol présente un maximum à 263 m,uj .o 4,27 (basé sur un poids moléculaire.de *>.*.$, 6). Le spectre le de sa solution dans le dichlorom4thene pré- sente des bandes à zou, 370. 2970, ;i721-24, 11Q2, 637. 1600, il80, 11231 1100, 1085p 103, 1008, 970, 927, z.3, 813 et 650 cm"1* A 1'tat tSiiSe (soutenu dans KBr), on observe des bandes intenses à 1 K7.UJ I'b, 2860, 1742. 1704464, J94, 1482, 1418, 135, 1170-80, l1J,j 1103, 1082, 1037, 972, 815, 755 et 650 cai f.
On se trouve en irence d'un composé neutre lipoldosoluble. bh roridine a s'obtient, après recristallisation dans l' acét01:Ht...Clti1roro:-me..m;thanol, sous forme d'aiguilles ou de pail- 3 tteÉj tl 1.$kes fondant entre 14JO et 149*Co Les cristaux sont flSlilM (Ht s8;.ubles dans les cétones à chaîne courte (acétone, tkll H!tbtone), les alcools à chaîne courte (méthanol, éthanol, IropBHUi; 1M hydrocarbures halogènes à chaîne courte (dichloro- mèthanej ttft,oforme, tétrachlorure de carbone), dans le dioxine, 1. bonttioi it la pyridine. Ils sont peu solubles dans l'eau et dans
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les hydrocarbures saturés liquides (pentane, hexane, heptane, cycle-
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hexane). On trouve, pour le pouvoir rotatoire spécifiques les valeurs suivantes: /--C&-/ ,23 D a -1230 i 20 (chloroforme) et L-a-7' .
-126" + 20 (benzène). L'analyse élémentaire donne les valeurs sui- vantes! 0 m 83,8 H:ll,l et O:4,8. La détermination du poids mo- léculaire selon Hast (camphre) donne une valeur de 318 et la micro- détermination thermoélectrique donne 426. En partant de ces résul-
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tats, on peut admettre les formules brutes C21HJ20 *5) et C2SM4bU (?,6). Le spectre d'absorption UV dans l'éthanol est vide* Dans le spectre 111. (comprimé dans Sur) on trouve des bandes 4Ct?-,4,5,ü¯, 29èU# 2860, 1&&, , 1460, 1370, 1068, 1040,98$, 970, S.)3 et 804 cm*1, ear microhydrogénation, il y a absorption de 4 à 5 moles d'hydrogène (en admettant un poids moléculaire de 318).
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L'antibiotique verrucarine A possède une puissante action inhibitrice vis-à-vis de divers microorgan,s,nes. L'activi- té inhibitrice de la croissance de la verrucarine A a été évaluée par la méthode des dilutions couramment utilisée dans ce but.
On a mesuré la concentration la plus faible du composé possédant, pour chacun des germes, un effet inhibiteur total ou partiel, mais important, dans un milieu de culture approprié. On a utilisé des
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concentrations allant de 10.4,3 à 10" ou de 10-4 à 10 *"8, Le tableau suivant donne le résultat des diverses évaluations.
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-log de la concentration la plus basse ayant une action inhibitrice sur la croissance
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<tb> Organisme <SEP> totale <SEP> partielle <SEP> Durée <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> essayé <SEP> l'incuba*.
<tb>
<tb>
<tb>
, <SEP> tion <SEP> en
<tb>
<tb> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces
<tb>
<tb>
<tb> cerevisiae <SEP> 5,8 <SEP> 6,3 <SEP> 6
<tb>
<tb>
<tb> 5,8 <SEP> 6,3 <SEP> . <SEP> 20.
<tb>
<tb>
<tb>
5,3 <SEP> 5,8 <SEP> 40
<tb>
<tb>
<tb> Candide <SEP> albicans <SEP> 5,0 <SEP> 5,5 <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans
<tb>
<tb>
<tb> Souche <SEP> Dermat.univ.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Klinik <SEP> ZUrich, <SEP> Nr. <SEP> 5e5
<tb>
<tb>
<tb> 1101 <SEP> A <SEP> 5,5 <SEP> 6,0 <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> tropicalis <SEP> 6,3 <SEP> 7,8 <SEP> 6
<tb>
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Klinik Zurich Nr. 5,8 6,3 20
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<tb> 169/61 <SEP> 5,3 <SEP> 6,3 <SEP> 40
<tb>
<tb> Candida <SEP> krusei <SEP> 6,3 <SEP> 6,8 <SEP> 6
<tb>
<tb> A <SEP> Souche <SEP> Inst.trop. <SEP> 6,3 <SEP> 6,8 <SEP> 20
<tb>
<tb> med. <SEP> London <SEP> N . <SEP> 270 <SEP> 6,3 <SEP> 6,8 <SEP> 40
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> glabrata
<tb>
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Souche Cbe Nr.
18 4,0 5,0 20'
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<tb> Absidia <SEP> lichtheimi
<tb>
<tb> souche <SEP> CbS-Lendner <SEP> 5,0 <SEP> 5,5 <SEP> 20
<tb>
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> 5,5 <SEP> 6,0 <SEP> 20
<tb>
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laastomyces brasiliensis 5,5 6,0 20 richaph.gpseum 4,3 5,3 3
EMI11.7
<tb> 7
<tb>
EMI11.8
Achorion quinckeanum 4,3 5,3 3 Souche Derjuat.Univ.
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<tb>
Klinik <SEP> Zurich <SEP> Nr. <SEP> 4,3 <SEP> 7-
<tb>
<tb> 964 <SEP> 4,3 <SEP> 14 <SEP> . <SEP> , <SEP> , <SEP>
<tb>
<tb> {sarrette. <SEP> marcescens <SEP> 4,3 <SEP> 6
<tb>
<tb> 4,3 <SEP> 20
<tb>
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C t'roteus mirabilis 4,3 6 Souche NCWC 5887 4,3 20 Pî3eudomones aeruginosa 4,3 6
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<tb> 4,3 <SEP> 20
<tb>
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Mi 11 eUXI\Q11':Lt.1t.JU.
A c levures et autres champignons bouillon de wlture ifco sauf B (à l'exception de Saccharomyces cerevisiae ? bouillon maltoaé de Sabouraud; Torulopsis glabra- ta) .
B = dermatophytes Maltose-Agar de Sabouraud.
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C Il germes gram négatifs bouillon de culture D*f00 , L'activité de la verrucar1ne A, de la verrucarine B et de la roridine A, vis-à-vis des tumeurs animales, fut étudiée sur les tumeurs expérimentales d'inoculation chez la souris et chez le
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rat. Parmi les tumeurs animales qui se sont montrées s.ns1be' aux produits, figurent la tumeur ascitique d'Ehrlich, le sarcome " 180, le sarcome 37 de la souris et le sarcome Yoshida du rat.
Les tableaux suivants renseignent sur les donné" et 111 les r8Ultat. 1,: des essais effectués avec la verrucarine Ae t, T,,p.r1ne B }# , et la roridine A sur quelques tumeurs an11Ua+8' Verrucarine A --. ---
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:i9.1.ertUl\l.UD I
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<tb> Sature <SEP> de <SEP> Dose <SEP> Durée <SEP> Inhibi- <SEP> Nombre <SEP> Nombre <SEP> ;
<SEP>
<tb>
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Nature ,Dose D tion dsani- dyani-
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<tb> la <SEP> rois <SEP> en% <SEP> maux <SEP> maux <SEP> - <SEP> , <SEP>
<tb>
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tumeur par jour en uti- morte tumeur 3 ut1- morts lises ¯¯¯¯ î' 0,36 7 jour. 94 0 que d-Ibrlich O,38mg/kg jours
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<tb> de <SEP> la <SEP> souris
<tb>
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Sarcome 180 sarcome 180 0,12k, jour, de la souris Oxl25mg/kg jours 23
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<tb> Sarcome37
<tb>
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de la souris 0,75mg/kg 7 jour. 43 de la souri. ,,p mg/kg 8 jours 33 Yoshida du rat 0,05mg/kg 14 jours 35 ' Verrucarine B oéranc1 Nature de Dose Durée Inh1bi- Nombre Nombre la Dose Dure. tion dpani. d'mi.
tumeur par jour en maux maux tumeur uti- morts lises ¯¯¯¯ Tumeur tlsc1- dlich llümg/kg 6 jours 84 6 0 de la souris 3po'mg/kg 7 jours 95 6 1 Sarcome 37 1,0 mg/kg 7 jours 23 6 0
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<tb> Roridine <SEP> A
<tb>
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Sarcome 37 0,5mg/kg 8 jours 18 6
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La verrucarine A, la verrucarine B et la roridine A ont également une activité prononcée sur la culture cellulaire. L'ac tion sur des cultures de fibroblastes d'embryon de poulet donne le résultat suivant: lorsqu'elle agit pendant 6 heures, la verrucarine A a une
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DE-50 de 0,0025 y/ml (la DE-50 est lk, concentration qui arrête le déroulement de la moitié des mitoses).
A cette concentration et même à des concentrations 1000" fois supérieures, on n'observe pas de modifications morphologiques des cellules qui ne participent pas au phénomène de divisions cellulaires. Par contre, lescal- Iules qui se divisent tombent sous l'influence de la verrucarine A.
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L'action de la verrucarine B est quâltativement identi.. que à celle de la verrucarine Ap mais un peu plus faible; la DE-50 ! est de 0,01 ylml. L'action roridine A est qualitativement identique à celle de la verrucarine A. La DiS-50 est de 0,003 Y/ml.
On a étudié in vitro l'effet inhibiteur sur la multl- plication de cellules tumorales (cellules du mastocytome P-815 de la souris) et on a obtenu les résultats suivants;
Dans une solution nutritive appropriée ces cellules
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de tumeur se multiplient en zou heures jusqu'à atteindre z a 5 fois leur nombre primitif. La DE-50 (concentration qui Inhibe de 50% cet- te multiplication; de la verrucarine A vis-à-vis de ces cellules
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est de O,UQ06 y/ml (- 1:1.600.000.000).
La DE-50 de la verrucarine B vis-à-vis de ces cellules est de 0,003 Y/m7. et celle de la roridine A est de 0,001 Y/ml.
La toxicité de la verrucarine A, de la verrucarine B et de la roriaine A fut étudiée plus spécialement sur la souris.
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La toxicité aiguë, mesurée par la DL-50, rut déterûin6e par administre tion des produits par la voie intraveineuse.
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<tb> Verrucarine <SEP> A <SEP> DL-50 <SEP> i.v. <SEP> 1,5 <SEP> mg/kg
<tb>
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Verrucarine R DL-50 i.v. 7 mg/kg Roridine À DL-50 i.v. 1 mg/kg.
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<tb>
<tb>
De plus, la verrucarine A peut être utilisée pour le
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traitement de maladies du sang (par exemple leucémie myéloique ou lymphatique) et de maladies du système lymphatique (par exemple
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maladies de Hodgkine lymphosarcome).
Si l'on traite des chiens par des doses quotidiennes e 0,1 mg/kg de verrucarine A, administrées en une seule fois par la
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voie intraveineuse, on constate, au bout de plusieurs injections, une forte baisse du nombre de leucocytes dans le sang périphérique.
EXEMPLES*
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<tb> Avant <SEP> le <SEP> traitement <SEP> Après <SEP> le <SEP> traitement
<tb>
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Chien A 8900 leuccytes/mm' 2900 leucocyte"B/MM3 Chien B 125UQ leucocytes/MM3 100 leucocytes/=3 Chien C 9300 lrucoaytes/ulm3 5000 leucocYtes/rma3
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La verrucarine A, la verrucarine R et la roridine A peuvent trouver des applications comme médicaments, sous forme de préparations pharmaceutiques.
Ces préparations renferment les composes mentionnés en mélange avec un support organique ou minéral
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approprié pour l'application entérale, parentFrale ou locale, Ce support devra être un corps qui ne réagisse pas avec les nou- veaux composés, connue par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools
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benzyliques, des gommes, des polyal.kylâne..g.ycols, des vaselines, le cholestérol ou d'autres supports connus pour médicaments. Les médicaments peuvent se présenter par exemple sous forme de compri- més, de dragées, de poudres, de crèmes, de suppositoires ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions.
Eventuellement elles sont stérilisées et/ou elles contiennent des adjuvants, tels que des a;ents de conservation, des stabilisants,
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des mouillants ou des é"uls1onnnnts. Mais elles peuvent également contenir d'autres corps dou s d'activités thérapeutiques.
Les exenples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Les rapports relatifs aux solvants s'entendent toujours en volume.
EXEMPLE 1 :
Préparation et isolement de la verrucarine A, de la
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verrucarine B et de la verrucarine E A l'état brut.
Avec une suspension de conidies de la souche 8 833 3ro. thecium verrucia on ensemence 10U cultures agitées faites chacune dans un rlenme1er de '?u0 ml contenait 100 ml de solution nutritive
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de Richard, modifiée par G. Luz, (1934 z Phytopatho1. Z. 1, 589) et contenant, par litre, î>u,0 g de glucose extra pure (Ph.H.V), les sels suivants de qualité analytiquement pure; 10,0 g de nitra-
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te d'ammonium, 5,0 g de phosphate mono-potassique, 2e5 g de sulfate de magnésium (.7 H20) ope2 g de chlorure ferrique et la quantité suffisante d'eau déminéralisée.
Après incubation pendant 9 jours à
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.:.7 C sur une machine à secousses animée d'un mouvement de va-et-vient (fréquence: 100 par minute) on sépare le mycélium par essorage et on extrait deux fois le filtrat de culture limpide avec chaque fois 1 litre d'acétate d'éthyle.
Les extraits sont lavés avec de
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l'acide chlorhydrique binormale, de la lessive de soude caustique binormale et de l'eau, une fois avec chaque solvant, et ils sont évaporés sous pression réduite .On obtient 115 mg de produit brut
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brun qui, sur le chroatograr#me en couche mince (support; gel de silice; solvant d'lutï,ans chloroforme-méthanol dans le rapport 97 3f coloration des taches de substances dans une atmosphère d'iode (jaune-brun)) donnent deux taches qui correspondent à. la verrucarine A et à la verrucarine B. Pour purifier davantage on chromatographie sur 6 g de gel de silice. Pour l'élution on utilise 12 ml de solvant par fraction.
Les fractions 1 à 5 (éluées avec benzène,
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chloroforme et ohloroforme-methanol-'(99!l) donnent 3,6 mg de ma- tière amorphe que l'on jette. Les fractions 6 et 7 (26 mg, éluées avec chloroforme-méthanol-(99:l) donnent, après recristaliisation dans l'éther, 8 mg de verrucarine A brute cristallisée (contenant encore de la verrucarine B). Les fractions 9 et 10 (éluées avec
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chloroforme-méthanol-(99!l) donnent, après cristallisation dans l'éther, 13 mg de verrucarine E cristallisée et brute. Sur le chro matogramuie en couche mince, la vexrucar3.na donne en atmosphère d'azote, au bout de 10 minutes environ, une tache violet-rouge. Les fractions 16 à 24 (éluées avec chloroforme-méthanol-(99il) et (98:2) fournissent 15 mg de matière amorphe que l'on jette.
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,u"'Lb: Préparation et isolement de la verrucarine A et de la verxyuaa,rine b brutes.
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La souche 8 833 est cultivée à 270C dane
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10 litres de la solution nutritive décrite à l'exemple 1, dans un fermenteur de 14 litres (New Brunswick Co., New Brunswick,E.U.A. type FS 314), pendant 6 jours, à 450 tours par minute de l'agita-, teur et sous aération (10 litres d'air par minute).On filtre 1 li- tre du bouillon de culture sur une couche de kieselguhr (Celite) et on extrait deux fois le filtrat limpide avec chaque fois 1 litre d'acétate d'éthyle. Les extraits d'acétate d'éthyle sont lavés une fois avec 100 ml d'acide chlorhydrique binormal, deux fois avec chaque fois 50 ml d'une solution binormale de soude caustique et deux fois avec chaque fois 50 ml d'eau, et ils sont évaporés sous pression réduite.
On obtient 277 mg d'un extrait brut de tein- te brune qui présente, sur le chromatogramme en couche mince, trois taches qui correspondent à la verrucarine A, à la verrucarine B et à la verrucarine E. On chromatographie la quantité totale sur 14 g de gel de silice. Pour l'élution on utilise 30 ml de solvant par fraction. Les fractions 1 a 11 (éluées avec benzène, chlorure de méthylène et chlorure de méthylène-méthanol-(99:1)) fournissent 127 mg d'une matière amorphe dans laquelle on peut déceler, sur le chromatogramme en couche mince, de la verrucarine A et de la verrucarine B.
Les fractions 12 et 13 (11 mg, éluées avec un mé. lange 99:1 de chlorure de méthylène et de méthanol) donnent, après recristallisation dans l'éther, 3,5 mg de verrucarine E cristalli- sée. Les fractions 14 à 22 (éluées avec un mélange 99:1 de chlorure de méthylène et de méthanol) fournissent 30 mg de matière amorphe.
La matière des fractions 6 à 11 et 14 à 17, ainsi que les liqueurs-. mères des fractions 12 et 13 sont mélangées (125 mg) et elles sont chromatographiées encore une fois de manière analogue sur 13 g de gel de silice. A partir des fractions éludes avec un mélange 99,5:0,5 de chlorure de méthylène et de méthanol on isole, après cristalli- sation dans l'éther, un total de 3 mg de verrucarine A cristallisée et brute qui contient encore un peu de verrucarine B.
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EXEMPLE 3.-
Préparation et isolement de la verrucarine A et de la verrucarine B brutes.
La souche S 833 est incubée dans les conditions de l'exemple 1 dans la solution nutritive de Weindling (H. Weindling, Phytopathol.24, 1155, R. weindling et A. Emerson, ibid. 26, 1068) contenant, pour 1 litre, 25,0 g de glucose extra pur (Ph.
H.V.), les substances suivantes de qualité analytiquement pure: 2,0 g de tar- trate d'ammonium, 2,0 g de phosphate mono-potassique, 1,0 g de sul- fate de magnésium (.7H2O), 1,0 mg de sulfate de fer (.7H2O), 0,15 mg de sulfate de cuivre (.5H2O), 1,0 mg de sulfate de zinc (.7H2O), 1,0 mg de sulfate de manganèse (.H20), 0,1 mg de manganate de sodium et la quantité suffisante d'eau déminéralisée* On ex- trait 1 litre du bouillon de culture avec de l'acétate d'éthyle, comme décrit a l'exemple 2. Les extraits sont lavis deux fois avec chaque fois 50 ml d'une solution blnormale de soude caustique et deux fois avec chaque fois 50 ml d'eau, et ils sont évaporés cous pression réduite.
Il reste 142 mg d'extrait brut qui, sur le chro- matogramme en couche mince, présente trois taches dont deux corres- pondent a la verrucarine A et a la verrucarine B. Pour parfaire la purification on chromatographie sur 7 g de gel de silice en utilisant pour l'élutlon 15 ml de solvant par fraction. Les frac- tions 1 à 8 (éluées avec benzène, chlorure de méthylène et chlorure de méthylène-méthanol-(99:1)) donnent 54 mg d'une matière amorphe que l'on jette. La fraction 9 (6,5 mg, éluée avec un mélange 99:1 de chlorure de méthylène et de méthanol) fournit, dans l'éther, 0,5 mg de verrucarine A cristallisée (contenant encore de la verru- earine B).
Les fractions 10 à 14 (éluées avec un mélange 99 :1 de chlorure de méthylène et de mthanol) et 15 à 20 (éluées avec un mélange 98:2 de chlorure de méthylène et de méthanol) fournissent 28 mg d'une matière amorphe dans laquelle, à l'aide du chromato- gramme en couche mince, on peut encore déceler des quantités supplé- mentaires de verruoarine A et de verrucarine B.
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4t.
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Préparation et isolement de la verrucarine A et de la verrucarine B brutes.
La souche S 118 est incubée dans les conditions de
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l'exemple 1, mais dans la solution nutritive de Vlelndling (voir l'exemple 3). Après quoi, pour éliminer le mycélium on filtre 39?ma. du bouillon de culture, on extrait deux fois le filtrat limpide avec chaque fois 1 litre d'acétate d'éthyle, on lave les extraits une fois à l'eau, deux fois avec une solution binormale de soude caustique et deux fois à l'eau et on les évapore sous pression réduite.
Il reste 428 mg d'un produit brut de teinte jaune qui, sur le chromatogramme en couche mince (.réalisa comme décrit l'exemple 1), donne deux taches qui correspondent à la verrucarine A et à la verrucarine B. Pour purifier davantage on chromatographie le produit brut sur 25 g de gel de silice pour l'exécution voir la description donnée à l'exemple 1). On obtient, 3,5mg de verru-
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carine A brute et cristallisée (contenant encore de la verrucarine # , BXJdtPLtt b,- .
Préparation et détection de la verrucarine A et de la verrucarine B. la souche S 118 est incubée dans les conditions de l'exemple 1. L'extraction et le traitement complémentaire, effec- tués sur 78U ml de bouillon de culture, se font exactement comme décrit a l'exemple 1. On obtient 44 mg d'extrait brut dans l'acétate
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d'éthyle (de teinte brune) qui montre, sur le chromatogramme en couche mince (réalisé comme à l'exemple 1), deux taches dont les distances de parcours correspondentàl& verruccarine A et à la verru-' carine B. EXEHPLE 6.-
Préparation et isolement de la verrucarine A, de la verru- carine B et de la roridine A brutes.
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La souche 8 750 est cultivée z, 27*C dans un fermenteur de 7 litres (New Brunswick Co., New Prunswick, E.U.A. type 8 304)
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avec 5 litres d'une solution nutritive (solution de Richard, voir exemple 1), sous aération et sous agitation (300 tours par minute).
Après élimination du mycélium par filtration on extrait 4, 1 litres du filtrat de culture, de teinte jaune claire, à trois reprises avec chaque fois 5 litres d'acétate d'éthyle, on lave les extraits réunis une fois avec 1 litre d'eau et on concentre la solution ob- tenue sous pression réduite jusqu'à ce que son volume ne soit plus que de 500 ml. La solution concentrée est ensuite lavée à 0 C a trois reprises avec chaque fois 100 ml d'une solution binormale de soude caustique et a trois reprises aveo chaque fois 100 ml d'eau, et elle est évaporée sous pression réduite. On obtient 680 mg d'un produit brut de teinte jaune. Pour le purifier davanta- ' ge on chromatographie ce produit sur 30 g de gel de silice.
Pour l'élution on utilise à chaque fois 60 ml de solvant par frac* tion. Les fractions 1 a 10 (éluées avec du benzène et du chloroforma fournissent 318 mg d'huile, d'une huile que l'on jette. La frac- tion 11 (81 mg éluée avec un mélange 99:1 de chloroforme et de métha. nol) donne, dans l'éther, 34 mg de verrucarine A cristallisée qui, d'après le chromatogramme en couche mince (voir exemple 1), se révèle être de constitution unique. A partir des liqueurs-mères on obtient, par cristallisation dans l'éther, encore 11 mg d'un mélange constitué de verrucarine A et de roridine A.
Les fractions 12 à 16 (152 mg éluées avec un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol) fournissent, après cristallisation dans l'éther, 61 mg d'un mélanga cristallin qui, d'après le chromatogramme en couche mince, est principalement constitué de verrucarine A, mais contient encore de la verrucarine B et de la roridine A. Les liqueurs-mères réunies des fractions 11 à 16 (125 mg) renferment encore environ 30 mg de verrucarine A et 30 mg de roridine A. Les fractions 17 à 23 $(luées par des mélanges 99:1, $98 :2 et 1:1 de chloroforme et de méthanol) fournissent 79 mg d'une matière amorphe que l'on jette* EXEMPLE 7. -
Préparation et isolement de la roridine A.
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Sous aération ('litres par minute) et sous agitation (300 tours par minute) on cultive la souche S 973, Myrothecium roridum, dans 5 litres de solution nutritive (20 g de glucose extra pure, Ph. H.V., 2,0 g d'extrait de malt, Schweiz. Ferment AG, 2,0 g de Xeast extract Difco' 2,0 g de pepton Cudahay, 2,0 g de phosphate - mono-potassique, 2,0 g de sulfate de magnésium (.7H20), 0,2 g de sulfate de fer (.7H2O)), dans un fermenteur (New Brunswick Co., New Brunswick E.U.A. type FS 307). Après élimination du mycélium par filtration on extrait à trois reprises la solution lipide, de teinte jaune et de pH 6, avec chaque fois 5 litres d'acétate d'éthy- le.
La solution obtenue en mélangeant les extraits est lavée une fois avec 1 litre d'eau, puis elle est concentrée jusqu'à un volume de 700 ml sous pression réduite, elle est lavée, à 0 C, trois fois avec chaque fois 80 ml d'une lessive de soude caustique binor- male et deux fois avec chaque fois 80 ml d'eau et elle est évaporée.
On obtient 5,7 g de produit brut de teinte jaune qui, par cristal- lisation dans un mélange d'acétone et d'éther, donne 105 mg de roridine A cristallisée fondant à 190-195 C (le chromatogramme en couche mince montre que ce produit est de constitution unique).
Les liqueurs-mères (5,6 g) sont chromatographiées sur 250 g de gel de silice. Pour l'élution on utilise 250 ml de solvant par frac- tion. Les fractions 1 a 10 (éluées avec du benzène, du chloroforme et un mélange 99,5:0,5 de chloroforme et de méthanol) fournissent 2,32 g d'un produit huileux que l'on jette. Les fractions 11 à 21 (2,45 g, éluées par un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol) donnent, par cristallisation dans un mélange 97:3 de chlororoforme et de méthanol, 1,2 g de roridine A cristallisée brute qui, d'après le chromatogramme en couche mince, renferme encore un peu de verru carine A et une substance A non identifiée.
Après cristallisa- tion dans un mélange d'acétone, d'éther et d'éther de pétrole on obtient 428 mg de roridine A cristallisée fondant à 191-196 C, 166 mg de roridine A cristallisée contenant encore des traces de la substance A, ainsi que 218 mg d'un mélange cristallisé de roridine
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A et de la substance A dans le rapport 1:1.
Après recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther, la roridine A s'obtient sous forme de prismes incolores fondant à 191-196 C ou 198-204 C.
EXEMPLE 8. -
Préparation et isolement de,la verrucarine A de la ver- rucarine B et de la roridine A.
La souche 8 1135 (variation sectorielle de la souche S 973) est cultivée dans la solution nutritive décrite à l'exemple 7, dans un fermeneur de 50 litres (système Ultramix type FB 005,Hch.
Bertrams A.G., Bâle, Suisse, nous agitation (1450 tours par minute), sous aération (50 litres par minute) et sous une surpression de 0,4 atmosphère. Après avoir ajouté du kieselguhr (colite) qui sert d'auxiliaire de filtration, on filtre le bouillon de culture (50 li- tres), on extrait à six reprises le filtrat de culture limpide, de teinte jaune avec chaque fois 40 litres d'acétate d'éthyle et on lave les extraits a l'eau. Le mélange de mycélium et de kiesel- guhr est additionné d'eau, homogénéisé et extrait trois fois par agitation avec chaque fois 10 ml d'acétate d'éthyle.
Les extraits Obtenus après filtration et lavage à l'eau sont réunis aux extraits d'acétate d'éthyle provenant du filtrat de culture, et la solution globale est concentrée sous pression réduite jusque un volume d'environ litres. Après avoir lavé avec 1 litre d'une solution binormale de soude caustique et deux fois avec chaque, fois 0,5litre d'une solution binormale de soude caustique et avec 0,5 litre d'eau on évapore à siccité sous pression réduite.
Le résidu obtenu (206 g) fournit, après addition d'éther, 78 g d'un produit cristal- lisé brut qui, d'après le chromatogramme en couche mince (réalisé comme décrit a l'exemple 1), est principalement constitué de rori- dine A, mais contient encore de la roridine C, de la verrucarine A et de la verrucarine B comme produits secondaires. Il reste 128,5g d'un résidu 1 de liqueurs-mères. On reprend le cristallisât brut (78 g) dans du méthanol et on filtre. Les'fractions insolubles dans
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le mthanol (2, g) constituent un cristallisant où S'est concentrée principalement la roridine C mais qui renferme encore de la vexrut carine A comme impureté.
Les fractions solubles dans le méthanol sont évaporées et le résidu est soumis à une cristallisation
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fractionnée dans lilétha.nol-éther. On obtient 1) 33,9 g de roridlne A cristallisée pure, 2) 26,0 g de roridine A cristallisée conte- nant encore un peu de roridine C, de verrucarine A et de substance
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A et i) 15,6 g de résidu de liqueurs-mères II. Ce dernier est joint au résidu de liqueurs-mères 1 (144 g) et le tout est dissous dans 520 ml d'un mélange 3:1 de chloroforme et de benzène. On chromato- graphie, de même qu'a l'exemple 1, 260 ml de cette solution (oor- resrondant à 72 g de résidu de liqueurs-mères) sur 3,77 kg do gel de silice.
Des fractions eluées avec un mélange 95:5de chloro- forme et de méthanol on isole, par cristallisation avec de l'éther, 1,2 g de verrucarine A cristallisée pure.
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EXJmPLfc. 9.
Préparation et isolement de la roridine A, de la rori- dine B, de la roridine C, de la verrucarine A et de la verrucarine C.
La souche 8 1135 de Myrothecium roridun est incubée dans
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un fermenteur de 10 litres (système U.tranix, type FU 001, Roh. Bertrams A.G., Baie, suisse) avec 10 litres d'air par minute, sous une pression relative de 0,4 atmosphère et a une température de 27 C, dans la solution nutritive ayant la composition suivante!
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30,0 g de glucose extra pur (Ph. ti.ir), zou g de leest extract Disco, 4,0 g de nitrate d'a,runanium, 2,72 g ae phosphate mono-potassique, 1,2 g de sulfate de magnésium (.7 H20), 0,028 g de sulfate ferreux (.7 H20), 0,003 g de sulfate de zinc (.7 H 20).
Le bouillon de cul- ture (10 litres) est filtré sur une couche de Kieselguhr (Cellte) et le filtrat de culture limpide, de teinte jaune, est extrait à
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trois reprises avec chaque fois 10 litres d îie6t*<te a'thyle. Les extraits, lavés avec 1 litre d'eau, sont évaporés complètement sous pression réduite. On dissout le resicu dans 1 litre de chloro- forme et on lave la solution à troit reprises avec chaque fois 100 m1 d'une solution binormale de soude caustique et a quatre reprises
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avec chaque fois 100 ml d'eau.
Après évaporation de la solution chloroformique lavée on obtient 12,0 g d'un produit brut de teinte ' jaune que l'on Chromatographie sur 250 g de gel de silice pour continuer la séparation. -Chromatographie I.
Pour l'élution on utilise 500 ml de solvant par fraction.
Les fractions 1 et 2 (éluées avec du benzène) contiennent 7,88 g d'une huile que l'on jette. Les fractions 3 à 6 (482 mg, éluées avec du chloroformer fournissent, dans l'éther ou l'éther de pétro- le, 23 mg de roridine B cristallisée fondant à 140-147 C, produit qui diaprés le chromatogramme en couche mince, se révèle parfaite- ment bien défini. Les fractions 7 et 8 (éluées avec un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol) fournissent 101 g d'une matière amorphe que l'on jette. Les fractions 9 et 10 (1,48 g, éluées avec un nélange 99 :1 de chlororforme et de méthanol) donnent,, par cris- tallisation dans l'ether, 646 mg de cristaux fondant à 122-143 C.
Après recristallisation dsns un mélange d'acétone et d'éther on obtient 400 mg d'un produit cristallisé fondant à 130-138 C qui est principalement constitué de roridine A, ainsi que de ver- rucarine A et de roridine C. La séparation ultérieure du produit cristallisé se fait dans la chromatographie II (voir ci-dessous)., La fraction 11 (.305 mg éluée avec un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol), donne dans l'éther, 106 mg de roridine A cristal- lisée qui contient encore des traces d'impuretés. La purifica- tion ultérieure se fait par la chromatographie III, et celle des liqueurs-mères se fait parla chromatographie II. les fractions 12 à. 20 (éluées avec des mélanges 99:1, 98t2 et 1:1 de chloroforma et de méthanol) ne donnent pas de cristaux.
La purification ulté- rieure des fractions 12 et 13 (330 mg) se fait dans la chromatogra- phie II.
-Chromatographie II.
Les résidus de liqueurs-mères des fractions 9, 10 et 11, ainsi que les fractions 12 et 13, soit au total 1,39 g de matière,' sont réuniset le tout est soumis à une chromatographie de partage avec, pour phase stationnaire, 700 g d'un mélange de partie.
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égales de kieselguhr et d'eau et, pour phase mobile, les slovants saturés d'eau indiquée ci-dessous (200 ml par fraction). Les frac- : tions 1 à 19 Rivées avec du benzène et avec un mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) fournissent 269 mg d'une matière amor- phe que l'on jette. Les fractions 20 à 25 (91 mg, éluées avec un mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) donnent, dans l'éther, 13 mg de verrucarine B cristallisée et pure.
Les fractions 26 à 30 (éluées avec un mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) four- nissent 62 mg d'une matière amorphe que l'on jette. Les fraction)! 31 à 38 (130 mg, éludes avec un mélange 95:5 de benzène et de chlo- roforme) donnent, dans l'éther, 12 mg de verrucarine A cristallisée et pure. A partir des liqueurs-mères on obtient, dans l'éther, 20 mg de roridine C cristallisée et pure qui fond à 117-121 C.
Les fractions 39 à 43 (60 mg, éluées avec un mélange 95:5de ben- zène et de chloroforme) fournissent, dans l'éther, après cristalli- sation fractionnée, 28 mg de verrucarine A cristallisée et pure et 17 mg de roridine C cristallisée et pure. Les liqueurs-mères con- tiennent de la verrucarine B et de la roridine C. Les fractions 44 à 75 (269 mg, éluées avec des mélanges 95:5, 9:1 et 4:1 de benzène et de chloroforme) fournissent, après cristallisation fractionnée, 48 mg de verrucarine A cristallisée pure. Les liqueurs-mères con- tiennent de la verrucarine B et de la roridine C.
Les fractions 76 à 125 (éluées avec un mélange de parties égales de benzène et de chloroforme et avec du chloroforme) donnent 526 mg d'une matière amorphe que l'on jette. Les fractions 126 à 133 (250 mg, éluées avec un mélange 9:1 de chloroforme et d'acétate d'éthyle) four- nissent dans l'éther, 305 mg de roridine A cristallisée et pure qui fond à 194-202 C. Les fractions 134 â 159 (éluées avec des mélangea 9:1 et 4:1 de chloroforme et d'acétate d'éthyle et avec de l'acétate d'éthyle) donnent 278 mg de matière amorphe que l'on ' jette.
-Chromatographie III.
On chromatographie sur 80 g d'alumine 800 mg du mélan-
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ge cristallisé des fractions 9 à Il de la chromatographie I. Pour l'élution on utilise 100 ml de solvant par fraction. Les fractions 1 à Il (éluées avec du chloroforme) donnent des traces de matière amorphe que l'on jette. Les fractions 12 à 21 (éluées avec un mélange 95,5:0,5 de chloroforme et de méthanol) fournissent, dans l'éther, 200 mg d'un mélange cristallisé de roridine A et de roridine C. Les fractions 22 à 51 (éluées avec un mélange 99 il de chloroforme et de méthanol) fournissent, dans l'éther, 432 mg de roridine A cristallisée de constitution unique.
Les fractions 52 à 67 (éluées avec des mélanges 95:5 9:1 et 4:1 de chloroforme et de méthanol) donnent 46 mg de matière amorphe que l'on jette.
EMI25.1
hXtMPL, 10. -
Préparation et isolement de la verrucarine A et de la verrucarine B brutes ainsi que de la verrucarine C et de la roridi- ne B.
La souche S 118 est incubée à 27 C sous forme d'une culture en surface au repos dans un Erlenmeyer de 500 ml avec cha- que fois 100 ml de solution nutritive, dans le milieu nutritif décrit à l'exemple 7 et complété par addition de 3,0 g de chlo- rure d'ammonium par litre; Le liquide de culture est débarrassé du mycélium par filtration. Par extraction de 30 litres du bouil- lon de culture avec de l'acétate d'éthyle on obtient 14 g d'extrait brut. On dissout 12,7 g de cet extrait dans 1,5 litre de chloro- forme, on lave la solution, à 0 C à trois reprises avec chaque foie 150 ml d'une solution binormale de soude caustique et à deux reprises avec chaque fois 150 ml d'eau et on évapore.
On obtient 9,5 g d'un produit brut neutre que l'on chromatographie sur 250 g de gel de silice.
Pour l'élution on utilise chaque fois 400 ml du solvant par fraction. Les fractions 1 à 10 (éluées avec du chloroforme et avec un mélange 99,5 :0,5 de chloroforme et de méthanol) fournissent 1,46 g de matière amorphe que l'on jette. Les fractions 11 à 20 (4,324 g, éludes avec un mélange 99 il de chloroforme et de méthanol)
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donnent 200 mg de verrucarine A cristallisée et pure qui contient encore de la verrucarine B. Les fractions 21 à 30 (éluées avec des mélanges 98:2 et 9:1 de chloroforme et de méthanol) donnent 4e2l g de matière amorphe que l'on jette.
Les résidus de liqueurs- mères des fractions 11 à 20 (3,56 g) sont chromatographiés, pour être purifiés davantage, sur alumine neutre de degré d'activité Il* Pour l'élution on utilise 400 ml de solvant par fraction. La frac- tion 1 (1,54 g, éluée avec un mélange 4:1 de chloroforme et de benzène) fournit dans l'éther, 25 mg de verruoarine A cristallisée et brute (contenant encore de la verrucarine B). Les fractions 2 à 19 (éluées par 'un mélange 4:1 de chloroforme et de benzène, par du chloroforme et par des mélanges 99:1, 98:2 et 95:5 de chloroforme et de méthanol) fournissent 1,54 g de matière amorphe que l'on jette.
La fraction 20 (61 mg, éluée par un mélange 3:1 de chloroforme et de méthanol) donne, dans méthanol-éther, 8 mg de cristaux fon- dant à 226-228 C. Après recristallisation dans acétone-éter on obtient la verrucarine C pure sous forme de prismes fondant à 223- 224 C.
-Extraction du mycélium.
On extrait le mycélium séché, à trois reprises, avec chaque fois 2 litres de méthanol et 200 ml d'eau pendant 45 minu- tes à 40-50 C, on filtre et on évapore. Le résidu (12,8 g) est ensuite partagé (par dissolution) entre 500 ml d'eau et 1 litre d'acétate d'éthyle et la phase aqueuse est extraite encore.trois fois avec chaque fois 1 litre d'acétate d'éthyle. Les extraits dans l'acétate d'éthyle, après évaporation du solvant, laissent 5,20 g d'une huile brune que l'on chromatographie, comme décrit plus haut, sur 120 g de gel de silice.
A partir des fractions (.157 mg) éluées par un mélange 99,5:0,5 de chloroforme et de mé- thanol on obtient, dans l'éther, 41 mg de roridine B cristallisée et pure sous forme d'aiguilles fondant a l47-152- C Les fractions éluées plus tard avec un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol fournissent, par cristallisation dans l'éther, 16 mg de verrucarine A brute (contenant encore de la verrucarine B).
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EXEMPLE 11. -
Préparation et isolement de la verrucarine A, de la ver- rucarine B et de la roridine B brutes.
La souche 8 118 est incubée pendant 63 heures dans la, solution nutritive qui a été décrite à l'exemple 10, dans'un fer- menteur de 50 litres(voir exemple 7), sous agitation (1450 tours' par minute) et sous aération constante (0,8 litre par minute et par litre de solution nutritive). Après avoir ajouté du kieselguhr (Celite) on extrait le bouillon de culture avec un total de 22 li- très d'acétate d'éthyle (la séparation des phases se fait à la centrifugeuse). Après concentration de l'extrait à 4 litres sous pression réduite on lave à quatre reprises avec chaque fois 400 ml d'une solution binormale de soude caustique et à trois reprises avec chaque fois 300 ml d'eau, et on évapore.
On obtient 19,5 g d'extrait pur provenant de l'acétate d'éthyle. Dans l'éther, on isole par cristallisation 2,31 g de verrucarine A cristallisée et brute (contenant encore de la verruoarine B). On chromatogra- phie les liqueurs-mères (17,2 g) sur 850 g de gel de silice. Four - le lavage ultérieur des fractions on utilise 1,7 litre de solvant par fraction. La fraction 1 (7,u g, éluée par du benzène) fournit, dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole, 19 mg de cristaux fondant A 237-239 c (produit non identifié). Les fractions 2 à 6 (4,15 g, éludes par du chloroforme) donnent, dans éther-éther de pétrole, 60 mg de roridine B cristallisée sous forme d'aiguilles fondant à 139-143 C.
Les fractions 7 à 10 (éluées par un mélange; 99:1 de chloroforme et de méthanol) donnent 1,09 g d'une matière amorphe que l'on jette. Les fractions 11 à 18 (3,25 g, éluées par un mélange 98:2 de chloroforme et de méthanol) donnent, dans l'éther 2,18 g de verrucarine A cristallisée et brute (contenant encore à de la verrucarine B). Les fractions suivantes sont jetées.
EXEMPLE 12 : -
Préparation et isolement de la verrucarine A, de la ver- rucarine B et de la verrucarine D.
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La souche S 833 est incubée sous forme d'une culture secouée comme à l'exemple 1, dans un milieu qui contient, par litre, 30 g de saccharose, 2,5 g de chlorure d'ammonium, 1,0 g de phosphate monopotassique, 0,5 g de sulfate de magnésium (.7 H2O), 0,5 g de chlorure de potassium, 0,01 g de sulfate de fer (.7 H2O) et la quantité suffisante d'eau. On extrait 900 ml du bouillon de culture avec 2 litres d'acétate d'éthyle. Après lavage & l'eau, avec une solution binormale de soude caustique et encore à l'eau et après évaporation sous pression réduite, l'extrait fournit 24J mg d'un produit brut huileux que l'on chromatographie sur 12 g de gel de silice.
A partir des fractions éluées par du chloroforme on obtient, dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole, 2 mg de verrucarine D pure sous forme d'aiguilles fondant a 127-128 C.
Sur le chromatogramme en euche mince, la verrucarine D migre à peu près aussi vite que la verrucarine A. A partir des fractions suivantes éluées avec un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol on obtient 38 mg de verrucarine A cristallisée et brute qui contient encore de la Verrucarine B.
EXEMPLE 13 ;-
Séparation de la verrucarine A cristallisée et brute (contenant de la verrucarine B) en verrucarine A pure et en verru- carine B pure.
On soumet 9,53 g de verrucarine A cristalline et brute (contenant de la verrucarine B) à une chromatographie de partage sur 5,4 kg d'un mélange de parties égales de kieselguhr et d'eau, Les solvants qui servent pour l'élution sont saturés d'eau (1,2 li- tre par fraction). Les fractions 1 a 20 (éluées avec du benzène et avec un mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) donnent 445 mg d'une matière huileuse que l'on jette. Les fractions 21 à 34 (1,20 g, éluées avec un mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) donnent, dans acétone-éther, 747 mg de verrucarine B cristallisée et pure qui, au chromatogramme en couche mince, se révèle être un produit bien défini.
Les fractions 35 à 37 (172 mg, éluées avec un
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mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) donnent, dans acétone- éther, 126 mg d'un mélange cristallisé constitué d'environ 50% de verrucarine A et d'environ 50% de verrucarine B. Les fractions
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38 à 40 (éludes avec un mélange 95 5 de benzène et de chloroforme) fournissent 406 mg d'une matière qui est principalement constituée de verruoarine A (produit principal) et de 3 ou 4 autres produits secondaires non identifiés.
Les fractions 41 à 84 (8,6 g, éluées
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avec des mélanges ytl, 8:., >:2 et 7:3 de benzène et de chloroforme et avec du chloroforme) donnent, dans acétone-éther, 6,13 g
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de Verrucarine A cristallisée et pure qui, au chromatogramme en couche mince, se révèle être un produit bien défini. t.J1Pl:. Mu -, .
Chro11lstogrph1e en couche mince des verrucarines et des roridines. t
La chromatographie en couche mince est effectuée par des Méthodes connues.
Valeurs Rf
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<tb> Substance <SEP> Valeur <SEP> Rf <SEP> réaction <SEP> Couleur <SEP> à
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<tb> Substance <SEP> colorie <SEP> la <SEP> lumière
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<tb> avec <SEP> ultra-
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<tb> 12 <SEP> violette
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Verrucarine A 0,70 u26 U9 brun jaune claire Verrucarine b ù,8j$ 0,47 0,69 brun jaune claire Verrucarine C Oe74 0,28 0,59 brun jeune brillante
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<tb> claire
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<tb> Verrucarine <SEP> D <SEP> 0,70 <SEP> 0,28 <SEP> 0,59 <SEP> brun <SEP> jaune <SEP> foncée
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<tb> Verrucarine <SEP> E <SEP> -- <SEP> 0,91 <SEP> violet <SEP> foncée
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<tb> 12 <SEP> violette
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<tb> Roridine <SEP> A <SEP> 0,70 <SEP> 0,18 <SEP> 0,55 <SEP> brun <SEP> jaune <SEP> foncée
<tb>
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roridine li 0,55 0,36 0,41 noir vert foncée
EMI29.8
<tb> Horidine <SEP> C <SEP> -- <SEP> 0,42 <SEP> brun <SEP> jaune <SEP> foncée
<tb>
EMI29.9
1) Support: alumine, filuants chlorofnrAe-méthanol-(98:2) 2) Support: gel de silice. Gluant: chloroforme-méthanol-(98:2) 3) Support: gel de silice. Eluant: chloroforae-raéthanol-(97$3).