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Procédé peMttt&nt d'isoler de nouveaux coapo.". 1 partir de cultu- res de atycete8.
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La preeente invention a pour objet un procédé de gr4p&. ration de nouveaux cOlDpos6. doués d'activités Antibiotique , ooapo- oda qui seront noauos verruearine H, verrucarine J et verrucarine Con nouvelles verrucarinte H, J et K se forsMnt lorsqu' on cultive dana une solution nutritive des ôuehet de 1'wepew mycétie=o Hyrothociua verrucarla (Albertini et Scb".1nl ta) Ditmar ex Prie." ou de leurs autant..
On les Isole de la solution nutritive par extraction, puis purification par chromatographie d'adsorption ou partage à contre-courant* On à isolé des colonies du mycôte Myrotheciua verrucaria a partir d'échantillons de 'sols d'or1:1n.. trèzs diverses* Du point de vue morphologique, toutes ces
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souches correspondent aux descriptions des espèces* telles qu'elle.
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ont été données par ex*,aple dans G1lmen, JàC- 195? A'' Unual of Soll Fungi, 2éme édition, thé lova State Collège Pros., A#el, lolwtp E.U.A.
Les divers ortan1r.#ea isolés, quelquefois à partir des rat:ncfi prélèvc;:1{'nts de terrain, peuvent différer entre eux *usai
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bien du point de vue morphologique, par exemple par leur aptitude
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plus ou moins grande à former des spores, que dU point dé vue physiologique, par excmple par les conditions imposé au ailitu nutritif pour la production des composts actifs. tes culture du micro -orCeni.-.1e vivuit Hyrotheciua verrucaria (Albertini et Ditmar ex Frics# isolées d'un échantillon de sol piouâ nnt de Bingerville, Afrique, et d'un échantillon de sol en pro1'.;4 nl,-ice de Ceylcnx ont 4té déposées à la "Ferttaentat1on. Division of the Korthem RcGional hesc'arch LaboratoryHj Peo:r1a. 111irto18, "t ont été classées tient? la collection permanente sous la désignation NRKL 3003 et NKdt 3019 respcct1v#ent.
Pour la préparation des nouveaux coepotat on p 4it aussi utillrer dop couches Qo1t1O'J coaae celles que l'on peut obtenir tc1lcont par eseaple par sélection ou mutation sous l'action d'un r.tV"om'1c.nt ultraviolet ou de rayons X, du par d'autre. méthodes, ps? exemple par frai lèsent de culturel de laboratoire avec des ,,,-mta chiaiquos appropriés.
La culture ne fait par 8xèpl. sous fora* d'une culture superficielle au repos ou d'une culture 1mm.rc4. qu'on secoue ou encore dans des fcrmenteurs avec introduction d'air ou d'oxygène et llc1t:.l:1on.. La tempe-rature est alors .1'antat.eU.emlnt coopritt entre ID et 33<'C.
On peut cultiver des Souche* de lf1rothec1U8 "'J'Ncam sur des milieu: de diverses sortes contenant les corpa nutritif uruels. C'cat ainsi que ces couchée utilisait de$ corps nutritifs
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ordinairement consolés par les organismes hétérotrophes, par
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ozcnplç, 00=39 source de carbone; le glucose, l'amidon, la 4utl'1n. la lactose, le saccharose* etc... et, edome source d'azote des
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composas azotés organiques ou minéraux, tôle que des peptones, des
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extraits de levure ou de viande, le sulfate 4'a:uon1wa, le nitrate c!l'Qn1um, des acides at\1nélS, etc., ainsi que les sels minéraux tit les o11eo-élt'Den ta usuels.
La demanderesse a trouva qu'on peut isoler les nouveaux composas, à savoir les verrucarines H, J et K, à l'état pur et crst4llizé à partir de solutions de culture d'une série de touches de Myrothecius ver1'Vcar1a.
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Une forme de réalisation du présent procédé* pour la pré-
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parution des nouvelles verrucarines H, J et K consistent à enseaen- eer un milieu nutritif liquide contenant les corps nutritifs usuels.. avec une suspension de conidies d'une souche de %(yrothecitta verru- cQrJ,.1!\ et à faire Incuber la culture sur une machina à secousses,, à une température de 21 à 3OC, pendant 3 à 30 Jours dans des ericnpcyerp de 500 m* Après quoi on utilise un certain nombre do
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ces cultures pour ensemencer des récipients de fermentation et on effectue la culture productive proprement dite. Pour cela on fait
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Incuber pendit 48 à 72 heures à une tempéruture de 27"Cp tout en agitant et en ra1ant passer un courant d'air ou d'oxyecne.
Les verrucarines U, J et X peuvent 6tre ieoloec du l1qu1- j de de fermentation par diverses méthodes. La at'thode qui t'est réytt. 14e la meilleure est l'extraction avec de 1#escence ou de l'acétate ;
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d'éthyle? malt; l'on peut aussi avoir recours à d'autres solvants
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org&n1ques, com.no par exemple le chlorure '6thYlèn., le benzène, l'acétate de butylee le chloroforme ou le but&nol. On sépare ensuite les extraits du solvant et, pour isoler les verrucarînes H, J et Kj, on chromatographie le résidu sur des agents adsorbimts, eoaae l'alumine activée, le gel de silice, le silicate de ma&nÓD1 etc.., ou on le soumet il un partage à contre-courant.
Les verrucarines H, J et 4 peuvent être oaraotdri8Ó" Ct)!1UnC il est décrit c1"'4près..
La Ycrrucarinp H forme., après rocristallitation dans un : in-51ance de benzène et d'dthor de pétrole, des aiguilles incolores, et, 4prb rcrita115atlon dans un mélange de dichloromdthane et
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d'éthanol, des plaques rectangulaires incolores qui ne fondent pas
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eu-dessous de 300"<!. A 2400C les cristaux coauaencent à jaunir et à brunir, signe d'une décomposition.
Ils sont insolubles dans l'eau, l'éther diéthyliquop l'éther d1isopropylique et dans les hydrocar- bures saturés liquides (pentane, hexane, heptane, eyclohexane) , par contre ils se dissolvent dans des cétones inférieures (acétone, méthyl-éthyl-cétone), des alcools inférieurs (méthanol.. éthanol, propanpl), dans le dioxanne, dans des hydrocarbures halogènes infé- rieurs (dichlorométhane,, chloroforme, tétrachlorure de carbone), dans la pyridine, le diéthylacétamide, le benzène et le toluène.
Les pouvoirs rotatoires spécifiques sont les suivants :
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2 +32" t 20 (chloroforme); C o.J2 = +590 + 2. (benzène); LP-72 . H39 t 2Q (dioxine).
Les analyses élémentaires ont donné les résultats sui- vents :
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67ege%; 67j,22 67e62%; 7,Q9& 6,99%; 7,17%; t 24,64%.
Le composé ne contient ni azote, ni soufre, ni halogènes.
La dicrodétermination thermoélectrique donne un poids moléculaire de 490 (dans le dichlorométhane). Sur la base de ces valeurs, la formule brute la plus probable est C29H6-3a08 (512,58 - 514,59).
Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet (figure 1 du dessin annexé) dans l'éthanol présente des maximums à 195 m/u
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(log t * 4,20); 22 m/n (log C " 4,35) et 259 =/u (lois t * 4,22) /calculs faits en prenant un poids moléculaire de 51,g7.
Le spectre infrarouge (figure 2 du dessin annexé) d'une solution du composé dans le dichlorométhane présente de.! bandes (les
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plus importantes sont soulignées) à 2900; 11lQ; 2&àli l±92.i 1375; 1350; 1220; 1175; 1115; 1100; 1035; 990; 960; 825 en -1
A l'état solide (dans KBr) il donne des bandes à 3425;
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2925; ILl-0;
JO.; 1600; 1440; 1375; 1350; 1220; 1180; 1150; 1115; 1100; 1085; 100; 1000; 970; 870; 835 cm-1. la verrucarine H n'a pas de groupes méthoxy (Zeisel) ni
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d'hydrogène actif (Zcrcvitinov), elle contient 9,S de carbone a6- Utyle (!Cuhn..1,)th) , elle absorbe 4 A 5 aolee d'hydrogène du\8 la micrQhld2r.ntlon, elle no donne pas de coloration jaune afec le t<!tr{itro3':.<tnc dur%3 le chloroforme et clic décolore aussitôt les solutions de jiormncftiujte d otacaiua dans ltacétone et de broae Jtttns In chloZ';'!01T.H'.'. Les rÚ.cÍ1on. de :&o11ms, J'ch11n, .110lircho Lue"l, KlK.-aor.3cn et Lib!'M&nn oont négatives La verrucarine Il# 8OU- îaJ.pe à une hySrol/?e fournit le vcrruc&rol.
Les rieurs 1.r obtenues d.ne 1a ohroou. to..r"ph1e en couche =.'.nue (t*chc. à l'iode) sont 0,63 (Gluant t aliénée 95' s 2 de chloroforme et de QétJ1&1no1 rupvort 1 ttlu::i1no).
0,69 (élubnt s :;.:bne' 97 t 3 de chloroforme et de adthanol; support ; gel de 3111cç)o 0,47 (êluúnt t atlungt 9î t 2 de chlorororme et de ndthool support j i eel de silice)*
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La verrucarine H est donc un corps neutre soluble dans
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loe 11!,o'Idetl, qui est t.l::alqucmt..p...rcnU 6. la verruurine A.
La Ytrrucorlne Jt erlotallisdi ûbtiê des mélanges de C:llororor-.At ot. tjfét..1cr ou d'ac<5ton* et d'éther$ donne des cristaux J.ncJlorc:: qui ne fondât iout &u-des3oue de 320*Co A 270*C les CZ';1lthU% coajionccnt à et fritte!* et Il$ jaunissent à partir de 305"Co La verrucarine J est Insoluble dans 1#eaup l'ther d1cit.h111- que, 3.'<*U>er <llit<opropyil(juc! et dans les hydrocarbures saturés (FontAine, hcxànop hep Une, cycichexw); par contre elle '0 dis fout .' dans des cZtone3 inférieures, des alcools Inférieurs, le C10IAnD', dos hydcrburp ha10[:':n'::: inft'-riwrw, la Vyridlnop le c1Ut.h11.. acdtanlde* Le kouyoir mtatolre spécifique est t ''7 " +188 (c 1 23 dtlnll le chlorofor:1e).
Les analyses lb.:1cnt.t..ll'.' ont donné les valeurs au1'fan- tes C : t 66e4é*'; 65.7J 6,7%) 6,8%.
La verrucnr1ne J ne contient ni azote, ni soufre, ni *104
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halogènes* Le Spectre d'absorption dans l-ultreviolet (figura 3 du dfsrin annexe) dans 1'éUianol pruscnte des mndauats à 21'it ti/u (l-:'; c:n ;a 51.5) et à 26lo5 m/u (l:.-' # . 404h Le spectre d'absorption dans 1'ultraviolet (r1rur. 4 dU dessin annvx4) d'une solution de verrucarîne J dans le 11orur. de méthylène présente des bandée à 2950, 1715 (palier) 1 1'70', 1645# 1590, 1430, 1410e 13301 1355, 1225x 1205, 11Et5, li5Oe lO,5, 1045, 1035, 1000, 970, 925, 97 51 $70e 820 .
Les ,1'vtActions de 1011cns, Fehllnr, "dolisth) Legal ?.liiuncttaann et Licbcraann pont négatives. Par contre, la substance décolore aussitôt des solutions de brome dang le chloroforaei ou de persangunate de potassium dans l'acétone* Les valeurs Kf obtenues d&hs la ch:ro:u.to&rph1. en t-ouet mince (taches rvlcc à l'iode) sont t 0,83 (dlUaht t 1t161ane 98 : 2 de chloroforme et de l11út.htAnolJ support 2 &.l\U1\1ne).
0,69 (dlunnt : s nôlnngc 97 9 3 de chlorototue et de aèthanolj
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support : gel de silice)
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0,47 (diluant : cé1cn:c 98 <2 de chloroforme et de lUéthlt101J
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.- apport t gel do silice)*
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La verrucarlne K, en cristallisant dans un aÓ1a.nc' d'éther et de pentuno, forme deo aiguilles Incolores tondant! l77-l7SoC. Une forme isomorphe fond à 21l-212-C.
Les cristaux de verruearino e sont insolubles dons l'e&u, l'ettter dléthylique l'tilcr û11soptopr11quc et dans les hydrocarbure saturé liquides (pentbnc, hexane, hoptanop cyclohex&ne) par contre il, sont <tolu*< bics ù8 des c'tones inférieures (acétone, QthYlw4th11-côton'), des alcools inférieurs (méthanolp 4th&noli propanol)., 1 dar" le d1ox'-..'iIlo, dans des hydrocarbures halogènes ihNtifUrs Cd1ChlorolltÓ- thanc, chloroforme, tétrachlorure de carbone), dans la pyrid1ne, le diëthîl-acêtamideo le benzène et le toluène* Son pouvoir rotatoi- re spécifique est 1 CaJ7t) * *27<' (0 m 1>3 dans le chloMfoyae)t Les analyses 'lé.:1cntl.ires ont donné le résultats suivants s C t 67,1 H : 7,6 0 : t 2g, l±. Le compose ne contint
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ni azote, ni soufre, ni halogènes.
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La m1cfQdétcr:dna. tion thermo:l,ct.r1quo dans le dichloro- imidthane donne un poids moléculaire de 519. D'après les résultat* ci-dessus on considère coe la plus probable la forsule brute '283b..38 (poids r.1oéculaire 1& 500,6 ou 02,6).
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Le spectre d'absorption UV (rieur. , 5 du dessin annexa)
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dans l'éthanol présente des mnx1:nl.:1c 222,5 ./u (log C. # 4,39) t!,t à 263 mu (log é :;: 4,26).
W spectre d'absorption dans l'infrarouge (figure 6 du dessin annexa) d'une solution du composé dans le âlchlo rosé thune
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présente des bandes à 3550, 2950, 2350, 1700, 1640, 1600, 1220,
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1180, 114', 3.090, 1080, 1030, 990, 960, 920, 810 c "1.
La -verrucarine K nia pas de groupe aéthoxy (Zolool) et el11t absorbe 4 à 5 noies d'hydrogène lors de la mioroh1dro/t4nat10n.
Elle décoloro aussitôt uno solution de pCr.:In.nCDJ1& to de po ta ut \LI
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dans 1'acétone, et une solution de brome dans le chloroforme. Les
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réactions de Tollen1 F.hlint;, Molisch, Local, Z1m::8nW1n et ,tber:nnnn sont né:l1 ti ves.
Lt: verrucarine K est un corps neutre, soluble dans les 1pde5, c:u1 fournit la vcrrucarol lorsqu'on le soumet à l'hydroly- te alcaline.
Le-3 nouvelles vorrucurinen J, il eut , ont des propriétés thérapeutiquec peu cv.a.unca. Leurs effets anti-fongiques et cytc- ,,1;n t1q'H':i t>ont til1 rtlcu11rc.:1cn t .1n t!JrNullIn ta.
Les vernâcarlnen :1, J et K exercent in vitro une action ,n t1 fOI1Clquf:' prononcée (voir le tableau suivant).
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<tb>
Organisée <SEP> sou- <SEP> Verrucarines <SEP> Verrucarine <SEP> J <SEP> Méthode
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mis <SEP> à <SEP> l'essai, <SEP> K <SEP> H <SEP> d'essai
<tb>
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type, souche 1:.:55.11 sur de dilution plaques t. p.
Blastomyces
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<tb> brasiliensis.
<tb>
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ZUrich 20 14 18 x 5,0 B Dotrytis elli EïH-M 5016 16 il 22 x Botrytis cinerea El'H-H -4291 20 13 22 îl 3t B Cundida elbloans R1H 5897 10 7 11 x x A Candida krusel Londres Z 70 15 11 19 4,5 6,0 A C4ndida tropienlis.Zurich 169 20 7 23 x x A
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<tb> Candida <SEP> tropica-
<tb>
<tb> lis <SEP> S <SEP> 1063 <SEP> ' <SEP>
<tb>
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('J.11a1la.nd1a Candida) 10 0 13 4,5 # A Cryptococcus neoforniana Zurich 30 13 28 5,0 5,5 D fiidothia para..
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<tb> si <SEP> tien <SEP> ETH-M
<tb> 162 <SEP> 28 <SEP> 10 <SEP> 24 <SEP> # <SEP> 5,0 <SEP> C
<tb>
<tb> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> S <SEP> 1345 <SEP> 13 <SEP> 17 <SEP> 21 <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
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Zhecharomyces cerfJvis1ao Lili-M
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<tb> 108 <SEP> 15 <SEP> 5,0 <SEP> 6,5
<tb>
<tb> Spore <SEP> tricha <SEP>
<tb> schenckii
<tb>
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Londres S 432 - 8 10 x x B
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3t aucune action inhibitrice jusque 10 ''.
Souches < ZUrich " DQQtoloe18che Universitltsk11n1k, Zurich.
Londres= Institute of tropical Aed1c1no Londres.
L't a 1r.cn6cz1Gchc Technische Hochschule, Zurich.
= Sandoz A.G., Baie.
Méthodes d'essais: A = Températuro d'incubation 37 C, évaluation au bout'd'environ
20 heures.
B= Température d'incubation 27 C, évaluation au bout d'environ
72 heures dans l'essai sur plaques, évaluation au bout d'environ
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4 heures dune 1.'uni de dilution.
C * icapûrâturu d'incubation 2' C" 6v.u.lu.t.1on nu bout d'environ 9C heures Juin l'essai sur plaques, et tu bout d'environ 48 heure, dans 7.'axzi de dilution.
1) la Tezpér4Àtaro d'incubation 27'oct 4viluatlon (ou bout l:1'on,,1ron I.'! htturus.
L'..ct.lv1 t,ú des rarruear,nae tir J et 1: sur les tueurs 'In1::1&lcn a élu t.udlÚ: sur la Uutrur .xpcSr1'Uenl. char, la sourit.
{'tirai les tu.3uurs W1.1...1,1<::;'. qui ont ru6i;i aux nouveaux CO,yoAÓa, 1'li;ure la t.U:3CI. r useitique d' U1rl1ch.. Les rru3,tr.t a obtenu font indiques (1.3 le t.l;lc..u w7u,ivr..st
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Dose une Durée du Inhibi- Tolérances fois par traite- tion en Noabre Nombre Jour acnt d'anl" d't;.nli'1M1X 12.LUX uU'" morts Verrucarine H 0,63 mc/kC 7 jours S4 6 " .,16 Á 7 jours 61 6 0 W 2i() :x=;,%iC", 7 Jours 82 6 2 Verrucarine J put maki; 7 jours 81 6 0 Verrucarine K 0,8 x;,j;
7 Jour, 52 6 ....--.."]?"..........,.. '1. 'f'"""""""-" ',-"-######. '''i.'i' ln Ji r1 'L 1
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Les verrucarines H, J et e sont également très actives sur les cultures cellulaires* Les esstia effectuée your déterminer
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l'inhibition qu'elles exercent sur la multiplication de cellules du
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miistocyto.ue P-315 de la souris ont donné Ion résultats suivants s dans une solution nutritive approprie*, ces cellules buwriles et multiplient en 40 heures Jusqu'à atttlndre 4 à 5 rois leur nombre ûe départ.
La Dh.-$0 (c'est-à-dire 1* concentration à laquelle cette multiplication est inhibée de $0) de la verrucarine Il vis-à-vis de ces cellules est de 0,0010 /u,/m.y celle de 1* verrucarine J cet de 0,0012 /ug/ml et. celle de la verrucarine K est de 0,001 /ug'.L L'action sur des cultures de fibroplastes d'eabryons de poulets se traduit, dW1s le cas de la verrucarino If et de la verrucurlne J, par un arrêt total de la mitose jusqu'à une concentration de 0,01 /UC/=1.
A la concentration de 0,003 lutez on observe encore une faible
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action*
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La toxicité aiguee exprimée par La DL-5O, des vetruoar1- non 11 et K sur la souris blanche est de 3 t:1g!kg par 1* voie 1ntra" veineuse, et celle de la verrucarine J est dû .4 mg/kg par la voie intraveineuse.
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La verruear,ne H, essayée sur la leUcJue L-1210 de là souris, à une dose do 2,0 mg/Kg (appliquée chaque joue par la voie intraveineuse) conduit à un allongement du temps de survie de 31% par rapport aux animaux témoins.
De plus, les verrucarines H et J doivent servir pour
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le traitement d'hémopathies, comme par exemple la leuedaie ayéloïdé et la leucémie ly.npholde.. et de maladies du système lymphatique, par exmeple la lymphogranulomatose maligne (maladie de Hodgkin) ou le lymphosarcome.
Si l'on injecte à des chiens une fois par jour, pa la voie intraveineuse, des doses de 0,1 mg/kg de verrucarine J, on observe, après plusieurs injections, une forte diminution du nombre des leucocytes dans le sang périphérique.
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.Ex'!1.p.le Avant le traitement J?2'::! .le txsit Chien A 11600 leucOCytes/mm3 1700 leUooc1tes/mm3 Chien B 15800 " 2000 Chien C 18400 " 1500 c "
Les verrucarines H, J et K peuvent être utilisées comme
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médicaments, par exemple sous forme de préparationspharaaceutiques.
Ces dernières contiennent les composes mentionnés en mélange avec un support minéral ou organique approprié pour l'administration
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par la voie entdraleo parentérale ou localu. Cooi-ne supports on peut envisager des corps qui ne réagissent pas avec les nouveaux compo- ses, comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéa-
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rate de aagnesiea, le talc, des huiles végétales, l'alcool bêntY:1;1. que, la gomme arabique, des polyalkylène"&lycols., la vaseline, le cholestérol ou d'autres supports connus pour médicaments.
Les préparations pharmaceutiques peuvent se présenter par exemple sous forme de comprimés, dragées, poudres, crèmes ou suppositoires, ou, à l'état liquide, sous forme de solutions; suspensions ou
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c$:x1uls1onth Eventuellement elles sont stérilisées et/ou elles con- tiennent de!: adjuvants, tels qu? des agents de conservation, des stabilisants, des mouillants ou des é1lu1l1onnanta. kilos peu. vent également contenir d'êtres corps doués d'activités thérapeu- tiques.
Les exemples suivants illustrent la présenta invention mono aucunement en limiter la portée* Les nombres indiquant les rapports des constituants dans les mélanges de solvants attendent. toujours en volume.
Verrucarine H.
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l'ans des erlenaeytrs de 500 ml on introduit, dans chacun,! 100 ml d'une solution nutritive contenant par litre
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Phosphate 4onopotassique pour analyse 2,0 8 !-tgt30 4 . 7H 2 pour anulyse 2,0 s Entrait dg malt Scliweiz, Ferment A.0 2,0 1 :$Acto Yeast Ex tract Difco 2,0 g
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<tb> Peptone <SEP> Cudahy <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb>
<tb> Glucose <SEP> pur. <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb>
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et do l'eau ddmlnêralladep on stérilise à 120 C pendant 20 Minutes sous une surpression de
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une at4osphèrc$ on ensemence les solutions nutritives avec une sus. pension de conidies de Kyrothcciua verrucarla NhhL 3019 et on fait incuber pendant 6 jours à 27*C sur une :
auchine à secousses travail- lant en va-et-vient* On utilise une culture secouée et bien lavée pour cnso-
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mencer un ftwenteur de 10 litres (systèae Ultr1x, type ru 001 Roll. J3ert,l't".U A&G.p bal*) contenant 10 litres du milieu décrit ci- donsus ainsi que 3 0 g de nitrate de sodium p.a!11tre et 10 ml d'un agent anti"!ac'us9e à base de tillconcs (Dov Corning Emu1J10f& A)' La stérilisation du ailleu se fuit dans les snè-ies conditions que c.1....dCDJfh On fait incuber la culture à 279C pendant 71 heures ' sous une surpression de 004 atno5phbro) en secouunt à une vitesse de 1450 tour, par minute et en faisant passer 10 litres d'air
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par minute*
On utilise litres de ce mélange pour ensemencer un fermenteur de 50 litres (système Ultramix, type FU 005,
Echo Bertrams A.G., Bâle) qui contient 50 litres d'un milieu ayant la même composition que celui que renferme le fermenteur de 10 litres, sauf qu'il contient 50 ml de logent anti-mousse à base de sili- cones. On fait Incuber à 27 C pendant 49 heures sous une surpres. sion de 0,4 atmosphère, en faisant fonctionner la machine de sccous- ces à 1400 tours par minute et en envoyant 50 litres d'air par minu- te. Ensuite on refroidit à 4 C la bouillie très épaisse, légèrement rougeâtre, constituée du mycélium et de la solution de culture.
Après quoi on extrait 50 litres de la bouillie de fer- mentation avec 3 fois 15 litres d'essence (zone d'ébullition : 65-80 C) puis avec 3 fois 15 litres d'acétate d'éthyle. Les ex- traits sont lavés chacun une fois à l'eau, séchés sur sulfate de sodium et débarrassés du solvant sous pression réduite* Le résidu de l'extraction à l'essence donne deux phases ;1 on sépare la plus fluide.
12 g de l'extrait épais dans l'essence sont chromatogra- phies sur 600 g de gel de silice. Pour l'élut Ion de chaque fraction on utilise 1 litre de solvant. Les fractions 1 à 18, éludes avec du benzène, du chlorure de méthylène et un mélange 99:1 de chlorure de méthylène et de méthanol, fournissent 5,0 g d'une huile que l'on jette.
Les fractions 19 à 24, éluées avec un mélange 99:1 de chlorure de méthylène et de méthanol, donnent 5,61 g de résidu d'évaporation, lequel, additionné d'éther, fournit la verrucarine A cristallisée brute qui contient encore de la verrucarino H..
Les fractions 25 à 33, éludes avec un mélange 98:2 de chlorure de méthylène et de méthanol, donnent 1,9 g d'une huile que l'on jette.
Le résidu de l'extraction par l'acétate d'éthyle donne également deux phases dont la plus fluide est à nouveau séparée.
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On ehro71ntogr"ph18 sur 1 kg de gel de silice 2ü,5 g de 14. fraction <Ípn1uo de l'cxtrult dans ltacdtâte d'ét.'111e. Pour l J Ólu tlon de c:huqua fraction on utilise 1 litre de solvant.
Le:! fractions 1 à 11, éludes par du benzène., du chlorure de. méthylène ut un :;túlange 99 t 1 de chlorure de réltylrie et do edthanol, fournissent 6,0 g d'une huile que l'on jette.
Le;? fractions 12 à 18, dluêes par des mdlangeo 99 1 et 93 2 de chlorure de t,hy.lna et de :4ÓUumol, donnent 466 mye d'une matière naorphe dont on n'n pas approfondi la nature.
Le fractions 19 à 22, éluées par un mélange 98 t 2 de chlorure de méthylène et de mdthanolp donnent z2 g d'un résidu d'évaporation qui, rcr1stallisú dans un mélange de chlorure de méthylène et de ,'anr,, conduit à la. verruearine H'êrii%talliedo.
Le.-s fractions 23 iL bzz cluses par un a<!l<nEe 94 s 2 de chlorure de tI2;th)"lène et de :n6thW101, donnent 4,0 i d'une huile que
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l'on jette*
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JESSSJ.2 Verrucl1r1ne J.
Avtc une suspension de conidie de rothcc1W1 "ernacar1a de la couche li" 3003 on onsemence, après stérilisation à 120*C pendant 20 alnutos et sous une surpression de une atmosphère, 8 fila- cons à pénicilline renfermant chacun 250 al d'une solution nutriti-
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va, laquelle contient p6r litre s Extrait de m< Sch\o'o1z.
Perient A.G,, 20,0 a Yeast Extract DIrco Bacto 400 g Gélose 30,0 e et eau déminérAlisée,
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et on fait incuber les flacons a 27*C pendant 10 jours Jusqu'la et qu-9 la formation de spores ait atteint un stade convenable* On met le.! conidies en suspension dans 1600 mil d'eau démincSral1.úe et on en:
2eaencc avec .La suspension, après stérilisation 1 120'C pendant 20 ainutes sous une surpression de 1 a tao sphère, un feraenteur don- tenant 1500 litres d'une solution nutritive renfera&nt par litre s
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Chlorure d'lLl1on1um pur 3,,0 g
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<tb> Phosphate <SEP> mono <SEP> po <SEP> taosique <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb>
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HCO.HO pur 2,0 Extrait de malt Schweité Forment At0< 2po i
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<tb> Peptono <SEP> Cudahy <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb>
<tb> Glucose <SEP> pur <SEP> 20,- <SEP> g
<tb>
<tb> et <SEP> eau <SEP> déminéralisée.
<tb>
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Dans un fermenteur k deux agitateurs k turbine comportant a paies (turbin mixer impcller) on agite à raison de t5 tours par minute, on fait passer 1500 litres d'air par minute sous une sur,.-
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pression de Ojt5 atmosphère et on fait incuber à 7 pendant 4â heu- res* Par suite de l'abondante formation de cousue, il ost ntessai re d'ajouter, avant la stérilisation, 7,5 litres d'un agent anti-
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mouase se base de s111cono (Dow Corning Lnulsion B), et den ajouter encore chaque heure 270 m1 au cours de la fermentation, soit au total 19,0 litres. On refroidit à 12 C la bouillie très visqueuse, légèrement grise, constituée de la solution de culture et de mycélium, Après quoi on sépare le mycélium de la solution (le culture
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par ccntrifucation.
Le liquide de culture limpide est trait à deux reprises avec chaque fois 750 litres d'acétate d.fêthylCt. Les extraite sont lavés une fois avec 300 litres d'eau et ils sont débarrassai complètement du solvant sous pression réduite* Le résidu est soumis à un partage par dissolution à contre-courant entre 3 foie 10 li-
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turcs d'éttcr de pétrole et 3 fois C$5 litres de méthanol aqueux .
90,. Los phases aqueuses mtharol2quea sont concentrée : fortement sous pression réduite, puis extraites à trois reprises avec chaque fois 3 litres de chloroforme. Les extraits chlorormiq.\1es sont lavés success1veent avec 1 litre d'eau, , fois avec chaque fois 1 litre d'une solution aqueuse à 5ji de bicarbonate de ..Od:1.WZ1* et avec 1 litre d'eau ; après quoi on sèche sur sulfate de sodium et on évapore à siccité sous pression réduite.
Le résidu est soumis à un partage à contre-courant à 10 @ stades (d'après Craig) dans un système de parties égales en volume
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de mth:anai aqueux à 70/e et de tétrachlorure de carbone* A partir
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des fractions 5 à 8 on obtient la verruoarine A cristallisée et brute, et 4 partir des fractions 9 et 10 on obtient la verrucarine J cristallisée et brute.
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On fait passer 1,0 g de verrucarine J brute sur 50 g de gel de elice (4MeroX$ 0,2*0,5 ) à l'aide de chlorure de Méthylène, et l'on obtient ainsi, après cristallisation dans un mélange de Chloroforme et d'éther, 700 mg de verrucarine J pure.
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jjgEffiLF, . ¯ Verrucarine K.
Dans ur feraenteur de 14 litres (New Brunswick Co, New tirun,swtçkm &0 A , type FS 314) on fait incuber pendant 96 heures à 27 C tout en faisant tourner l'agitateur à 450 tours par minute et
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titn envoyant IQ litres d'air par minute, la souche NKRL 3003 au soin d'une solution nutritive (10 litres) contenant par litre 20 g de glucose (cernas pur UND07,)j, 2 g d'extrait de malt (Sch....1z" Ferment A G ), 2 g de Bacto yeast extract Ditcq, 2 . de peptone Ciudahy, 2 C do phosphate taonopotassique technique, 2 g de NgS047H20 et de l'eau ddin6ra11se.
On ajoute à la bouillie de culture 500 C de Ueselgubr (Celite) et on filtre, Le filtrat limpide de culture est extrait avec 2 fois 10 litres d'acétate d'éthyle.
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Les extraits lavtfs, une fois avec 5 litres d'une solution à 3,i de bicarbonate et sodiua et une fois avec 10 litres d'eau sont fte1chcSa i sur sulfate de sodium et évaporés sous pression réduite, Le résidu, qui se présente sous forae d'une huile brun rouge, est soumis à un
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partage à contro-eourant à 30 stades d'après Craig.
Comme système on utilise un mélance 1 ; 1 de méthanol aqueux à eo% et de totra- chloinire de carbone 1 c'est alors la phase la moins dense qui aigre* @ par phase et par stade on utilise 40 ml du mélange précédent. A partir des fractions des stades 13 à 17 on peut obtenir par cristal- lisation directe, la verrucarine A à l'état pur.
Les fractions 10 à 12, ainsi que les liqueurs-mères provenant des fractions 13 et 14.
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sont chroautographides sur gel de silice (0,05'-0,X mm)e La chromato- graphie d'adsorption sur gel de silice (dimension des particules :
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0,15-0,30 mm, Bender et Hobein, ZUrich) se fait par la méthode de traversée (voir T. Reichstein & C.W. Shoppee, Disouss, Farad. Soc.
No 7, 305 (1949))* L'élution des substances est effectuée avec un mélange 99 :1 de chlorure de méthylène et de méthanol. Chaque fraction en absorbe 10 ml. Les fractions 121 à 180 donnent la verru- carine A cristallisée, les fractions 181 à 216 fournissent, dans un mélange d'éther et de pentane, la verrucarine K cristallisée à l'état pur.
EXEMPLE 4. -
Verrucarines J et K.
Dans un fermenteur de type FV 01 (Hch. Bertrams A.G., Baie, Suisse) on fait incuber à 27 C pendant 113 heures, en faisant tourner l'agitateur à 200 tours par minute et en faisant passer 100 litres d'air par minute, la souche NRRL 3003 au sein d'une solution nutritive (100 litres) contenant par litre 20 g de glucose (cerelose pur SANDOZ). 2 g d'extrait de malt (Schweiz. Ferment A.G.) 2 g de Bacto yeast extract. Difco. 2 g de peptone Cudahy, 2 g de phosphate monopotassioue technique, 2 g de MgSO4.7H2O et de l'eau déminerai!- sée. La bouillie de culture épaisse et jaune est clarifiée par centrifugation et la solution limpide est extraite à 4 reprises aveo chaque fois 25 litres d'acétate d'éthyle.
Les extraits sont évaporés sous pression réduite et le résidu huileux est soumis à un partage à contre-courant entre 3 fois 200 ml de méthanol aqueux à 90 et 3 fois 200 ml d'éther de pétrole, Les phases éthers de pétrole sont jetées. Les extraits méthanoliquen sont réunis et ils sont concentrés fortement sous pression réduite. Après avoir ajouté 100 ml d'eau on extrait le résidu avec 200 ml de chloroforme. Les extraits lavés à l'eau et séchés sur sulfate de sodium sont évaporés sous pression réduite. Le résidu est soumis à un partage à contre-courant à 10 stades selon Craie. Comme système on utilise un mélange 1 :1 de méthanol aqueux à 80% et de tétrachlorure de carbone : la phase la plus dense migre.
Par phase et par stade on utilise 100 ml du mélan- ge précédent.
Les fractions 1 à 4 donnent 280 mg de verrucarine A @
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cristallisée, Les fractions 5 à 7 ne donnent que des Balances
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cristallises constitues des vcrrucarincs A, J et X.
Les fractions 3 et 9 sont chromo togrephiées sur sel de silice (0,2-0,5 Nm)* a chroatogrbh1e d'adsorption sur gel de silice (grnI1ulhr1té : 0,15-0,30 as, Bender et Hobein, Zurich) se fait par la méthode de traversée (voir To hcichetein et C.W.Fhoppee, Discutes. Farad. Poe. or. 7, 305 (1949 ,. La fraction 8 <5luxée avec un mél.!.nco 99:1 do chlorure de r:U1Ylno et doéthanol donne la verrucurine J crinltllisée. Les fractions 9 et 10 donnent, dane un adiange cS 'é t.'1.-r et de pcnttne, la verrucarine K cr3.stx,.l.ise.
]ou fraction 10 donne la vorrucarine J orilt.al11r.do. h K m M h.
La présente invention comprend notttaaent s 1.- Un procédé d'obtention de nouveaux composés, . sa** voir la verrucarine fiv, la verrucarine J et la verrucerina K, pro- cédé selon ecuei on cultive da.na une solution nutritive des sou- ches de lpeiipèce :ycpt1enno Myrothec1w:t verrucarit (Albertini tt Schweinits) Ditmar ex Friec ou le-urs mutants, puis on Isole de la solution nutritive les composés en question, Terruearine H,
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verrucarine J et verrucarine K.
2.- Des iodez d'exécution du procédé spécifié noua 1,
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présentant les particularités suivantes 1 z) pour préparer la verrucarine H on cultive dans une 5 solution nutritive la souche de l'espèce aycétienne Myrothec1w:a rerrucarle (Albertini et Scbwe1nl tz) Ditoar ex Friee NftI. 3019, puis on extrait de la solution nutritive la vercacarine Ruz
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b) pour préparer la verrucarine K on cultive dans une
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solution nutritive la touche de l'espèce oycétienne Myrothee1um verrucaria (Albertini et Seh\ofe1ni ta:
) Di 1'.11181" ex Frle8 NhhL 3003 puis on extrait de la solution nutritive la verrucarine Ka
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c) pour préparer la verrucarine J on cultive dans une
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solution nutritive la souche de l'espèce M1c't1cnne Myrothcciua
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4rerrucaria (Albertini et Schwe1ni ta) Ditmar ex Fries 11100, 30030
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puis on extrait de la solution nutritive la verrucatine J.
3.- A titre de produits industriels nouveau:* : a) la verrucarine H; b) la verrucarine K; c) la verrucarine J.