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Vaccin .
La présente Invention se rapporte à la production de vaccins antigéniques Mastiquée.
Les vaccins bactériens sont généralement des suspensions de bactéries ou de fractions de bactéries taies. Suivant le procédé classique, on prépare ces vaccins en cultivant des bactéries sur de l'agar-agar, en ajoutant à la culture une solution isotonique de chlorure de sodium en quantité suffisante pour donner la concentra- tion bactérienne désirée et en tuant les bactéries. On tue les bactéries en y ajoutant un bactéricide tel que le formol, le phénol ou le crésol et en chauffant} dans certains cas, le chauffage peut être omis* On prépare des cultures d'échantillons de vaccins, finis afin de s'Assurer que toutes les bactéries ont été tuées.
Un vaccin bactérien est dit stock-vaccin s'il a été
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préparé à partir de cultures bactériennes de laboratoire et vacoln ' autogène s'il a été obtenu au moyen de bactéries prélevées directe- ment sur un patient. On appelle vaccin polyvalent un vaccin prépare
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arec plusieurs l'Quch.fI dt b4ctér1eIJ de m5m6 espèce et vaccin mixte un vaccin provenant d'au moins deux espèces différentes de bactéries* Certaine vaccins ne contiennent pas la totalité des bactéries
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mais seulement leurs fractions antigéniques, c'est-à-dire les trac- tions qui provoquent la formation d'anticorps chez le patient : ce sont les vaccins antigéniques;
on distingue enfin les vaccins
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antigéniques soma tique , qui ont été préparés avec de la matière antigénlque provenant de l'ensemble du micro-organisme, On avait trouvé auparavant qu'on pouvait préparer des vaccins utiles par lyse à l'aide de désoxyribonucléase, à partir de Staphyloccus aureus et de Salmonella typhi tués. Cette enzyme, mieux connue sous le nom de do ma se, est une eadonucléase spécifique de l'acide désoxyribonucléique (ADN) polymérisé.
La présente invention concerne également la préparation
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de vaccins antigéniques soma tiques. Suivant l'invention, on procède à la lyse des cellules de bactéries pathogènes tuées en les soumet- tant à l'action d'une enzyme protéolytique ou d'un mélange d'enzymes de ce genre, ce qui provoque la lyse des cellules sans en détruire le pouvoir .s,ntigânique4 On choisit de préférence une ou plusieurs enzymes susceptibles d'être inactivées sans détruire le pouvoir anti- génique Après la lyse. L'inactivation de l'enzyme Apres la lyse des bactéries est une particularité essentielle de l'invention lorsqu'il s'agit de Staphylococci ou de Salmonella; dans le cas de bactéries Autres, l'inactivation est une particularité préférée.
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On a découvert qu'on peut préparer des vaccins antigeni- ques somatiques particulièrement utiles à partir de cellules de bactéries pathogènes tuées, en lyaant ces bactéries à l'Aide d'une enzyme protéolytique ou d'un mélange de telles enzymes susceptible
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d'effectuer la lyse des cellules sans détruire le pouvoir antiginl- que et d'être inactive sans détruire le pou1'01r ,ant1gin1que, et en Inactivant l'enzyme ou le mélange d'enzymes après que la lyse
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ait été achevée. 1,'inactivation des enzymes favorise la stabilité" des vaccins et atténue la réaction des animaux inoculés.
En effet, la réaction à des vaccins qui contiennent encore des enzyme. active* est parfois particulièrement vive si les animaux expérimentaux sont atteints d'une forme quelconque d'ulcère. On pourrait également supprimer l'effet préjudiciable d'enzymes résiduelles en les éli-
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minant des produits lyses au lieu de les inac tirer, nain comme cette élimination entraînerait des opérations de séparation compliquées, il est généralement préférable d'inactiver les enzymes.
Comme enzymes protéolytiques pouvant s'utiliser suivant
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l'invention, on peut citer la dornase, la trypsine et la laosym Comme les enzymes prot4olytiques ne se prêtent pas toutes à la lyse de tous les types de bactéries pathogènes, il, convient de procéder à des essais afin de déterminer les enzymes aptes à lyser un type particulier de bactéries sans détruire le pouvoir antigénique et à
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être inactivées sans détruire le pouvoir antigénique.
Les bactéries à partir desquelles on peut préparer des vaccins utiles suivant le procédé de l'invention comprennent
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des otreptococci et les pneumococoi, des cocci gram négatif tels que des Sonnococci et meningococci; des bacilles aérobies gram positif tels que Corynebacterium dlphteriae et Baccilus onthracis; des bacilles anaérobies gram positif tels que Clostrïdî= tltn1J des bacilles gram négatif tels que Salmonella typhou et Salmonella paratyphi, Shigella, Vibrio comma, Baemoph11uJ1ntluenu.., Bordetella pertuosis, Bocherichia coli, Bruoella et pltrel14J et M1obaottr:) tubercule ai s.
Jusqu'à, présent, la domase s'est avérée de loin la plus efficace des enzymes protéolytiques essayées. On a constate qu'elle permet de lyser toutes les cellules des bactéries qui ont fait
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l'objetdexpériences jusqu'à présent, et dans chaque cas la lyse a lieu sans détruire le pouvoir antigénique et lJ!1nactiY&tion subsé- quente de la domase peut se faire par chauffage sans détruire le
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pouvoir antigénique. P.ar ailleurs, l'inactivation de la darnaue est facile à effectuer sans chauffage* On * trouve qu'un traite-
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ment thermique à 56*C pendant 1 heure convient parfaitement* Ce traitement thermique n'affecte en rien les propriétés antigéniques du vaccin.
Suivant un mode d'exécution important de la présente invention, on prépare un vaccin contre la mastite destiné à immuni- ser les bovins. On peut préparer un vaccin staphylococcique utile à cette fin par un procédé sensiblement analogue à un procédé déjà décrit par la demanderesse, mais utilisant des proportions de souches de staphylocoques différentes de celles utilisées dans les vaccins décrits par la littérature. Cette modification des proportions vise à rendre le vaccin plus efficace contre les staphylocoques responsables de la mastite bovine.
On * d'ailleurs constaté à ce propos qu'il est essentiel de poursuivre le traitement par la domase jusqu'à ce que la lyse atteigne presque 100%, en que l'activité du vaccin soit réduite par un autre moyen. On a remarqué également qu'il était important d'assurer l'inactivation de la domase avant d'administrer le vaccin aux bovins, tant pour empêcher l'aggravation des ulcères des bovins que pour augmenter la stabili- té du vaccin. D'autre part, on a remarqué -aussi qu'on peut amélio- rer la stabilité du vaccin en le lyophilisant. Enfin, on a trouvé que la culture bactérienne doit exposer une grande surface à l'air pour se prêter au mieux à la préparation du vaccin,-
La mastite ne résulte pas toujours d'infections à staphylocoques.
Elle provient parfois d'infections dues à des streptocoques ou à des mélanges des deux. Le vaccin contre la masti- te conforme à l'invention est donc un vaccin staphylcoccique, un vaccin streptococcique ou un vaccin mixte streptococcique et staphylcoccique.
Les vaccins suivant l'invention sont soit monovalent... soit polyvalents, soit mixtes. Ils peuvent $tre des stock-vaccins ou des vaccins autogènes*
On peut lyser les cellules de certaines bactéries, les staphylocoques, par exemple, en les exposant uniquement à l'action ' de la domase. Cependant, dans certains cas, par exemple dans le ;
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cas de salmonella typhio la doraaae ne parvient pal 1 lyser les cellule.
Toutefois, on a trouvé que la lyse peut t'opérer Abus si la cellule est r4elot4nte à l'action de la dornale, à condition
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qu'on traite les bactéries par un mélange comprenant de la dornase et une petite quantité d'un aient souillant* En variante* on peut
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provoquer la lyre des cellules de bactéries par la 401'11&" en les exposant au préalable à une oscillation IonIque..Apparemment cette opération bris ou affaiblit la paroi de la cellule à un point tel que la dornate peut exercer son action lyomte sur un substrat 1 qui n'était Pi' susceptible d'être 11" ayant le traite en t par oscillations soniques.
Au lieu d'exposer les cellules bactériennes aux oscilla- tions soniques, on peut remplacer parfois ce traitement préliminaire
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- c#eot le cas notamment de Salmonella typhl - en mettant les cellu- les en présence d'un agent alcalin et en particulier d'un .alcali tel que la moud* caustique*
La durée pendant laquelle les cellules bactériennes
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taies sont exposées à l'action de la do 1'11& 88 dépend de plusieurs facteurs, en particulier de la nature des cellules, de la nature de
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l'en&1Jll et de l'importance du traitement préliminaire auquel les cellules ont été soumises et qui facilitera la lyse enxynMttique ultérieure des cellules, Ainsi,
1m dornaae lyse les cellules de BCG en environ 1 heure et celles de staphylocoques en 12 heures.. mais elle n'attaque pratiquement par les cellules de Salmonella typhi même au bout de plusieurs jours à moins qu'on les ait soumis à un traitement préalable.
On ne peut donc pas spécifier des durées de lyse applicables à tous les vaccins préparés suivant l'invention, main on déterminera aisément par expérience les conditions nécessai- res pour .atteindre les buts envisagés,,
L'utilisation des traitements préliminaires précités, dont le but est de faciliter la lyse ultérieure des cellules au moyen de la dornase, implique des expériences visant à déterminer les conditions opératoires les mieux appropriées à chaque cas* La lyse de Salmonella typhl constitue un cas de ce genre. On a
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appliqué plusieurs types de traitements préalables aux cellules
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de Salmonella typhi tuées afin d'exposer le substrat sujet à ,'.atta- que par la domase.
On constate que les vaccins résultants perdent une partie de leur activité antigénique si les cellules ont été surexposées lors d'un de ces traitements préalables* On aura une indication approximative de l'étendue de la dégradation des cellules en un temps donné lors des expériences relatives aux traitements préliminaires si on observe la diminution de la turbidité de la suspension des cellules traitées, La certitude que le traitement
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préliminaire nOa pas été poussé au point où il se produit une perte , d'activité antigénique ne peut être obtenue qu'en expérimentant les vaccins sur des .an1m.a.ux.
Lorsque le traituent préliminaire consiste en l'expos w tion des cellules à l'action de vibration* ultrasoniques, on * trouvé que le temps d'exposition minimum est de 1 à 1,5 heure dans le cas d'un oscillateur de 10 kilocycles sous x,,0 1,lS père* Quand l'hydroxyde de sodium est utilisé pour le traite.
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ment préliminaire, on constate qu'une exposition d'environ 15 minu- tes convient parfaitement si on ajoute fla cm3 de .aOH 1 10 ca3 de la suspension des cellules et si on a ramené le pH de 11 à 7,2
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après l'exposition par addition de 0,4 cm3 de HCl I1. Des conditions analogues sont généralement applicables dans le cas d'un troisième traitement où on utilise un agent mouillant alcalin ou cationique
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tel que du lauryloultate de sodium au lieu de la soude caustique.
Dans les trois cas, on a remarqué que les cellules tuées qui ont été conservées le plus longtemps avant l'exposition au traitement
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préliminaire sont lysées le plus rapidement. On .a noté aussi que les cellules de Salmonella typhi cultivées sur de l'agar-agar et non sur un milieu purement synthétique sont plus faciles à lyser.
Un autre mode d'exécution de la présente invention permet de se passer des prétraitements précités en vue d'affaiblir la paroi des cellules. Suivant ce mode d'exécution, on cultive les bactéries destinées à préparer le vaccin sur un milieu contenant un additif qui engendre la formation de protoplastes plutôt que des bactéries
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normales muies de parois cellulaires entières* Les protoplastes tuées sont très sensibles à la lyse, en particulier par la domase.
On connaît plusieurs types d'additifs aptes à produire des proto- plastes. Ce sont, notamment, des acides aminés tels que la glycine et l'alanine, antibiotiques tels que les pénicillines et des enzymes telles que la trypsine et la lysozyme.
Pour réaliser la présente invention, on préfère utiliser comme additifs des acides .aminés car ils risquent moins de former des résidus susceptibles de provoquer des effets secondaires lors de l'inoculation des vaccins. Il y aura lieu, éventuellement, d'et- . fectuer des essais afin de s'assurer si oui ou non un additif parti culier générateur de protoplastes connu produit des résidus préju- diciables aux vaccins. Par exemple, l'utilisation d'une pénicilline comme additif générateur de protoplastes n'est pas recommandée, car elle risque de provoquer de graves réactions chez un petit nombre de personnes auxquelles les vaccins sont administrés.
On a trouvé, dans le cas de vaccins antityphiques prépa- rés suivant le procédé de l'invention, que les formes préférées des vaccins injectables peuvent être obtenues en adsorban les vaccins sur des substances adsorbantes du type de la bentonite et en lavant le tout à l'eau pour éliminer toutes les substances exemptes d'antigènes.
En effet, la bentonite semble avoir une affi- nité spéciale pour la substance antigénique obtenue en exposant à la lyse, à l'aide d'une enzyme protéolytique, des cellules typhiques tuées. En plus de l'avantage qu'il y a à injecter à l'animal une préparation pratiquement exempte d'impuretés résiduelles, la bento- nite agit en tant qu'adjuvant utile car elle permet d'introduire la substance antigénique assez lentement dans les tissus de l'animal, et partant, d'Assurer une formation prolongée localisée d'anticorps.
Des essais effectués sur des souris ont montré qu'une préparation injectable de ce genre assure une bonne protection contre les in- fections typholdiques. On a utilisé également avec succès des prépa- rations comme réactifs pour la détection d'anticorps typhoîdques.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la
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limiter.
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TPÇFflPfrfi 1,1- v4LQQIG antixénique somatioue polyvalent mur I& prévention 1 tions à staphylocoques..
Milieu :Dans 50 fioles de Roux distinctes, on verse
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125 cm3 d'.agar-agar à 2, déganta nutritifs et on laisse durcir. On répand ensuite sur la surface du contenu de chaque fiole 50 ca3 d'une solution dpagar-agar à 2% dans l'eau distillée et on laisse durcir de nouveau. On inocule chaque fiole à l'aide de 5 cm3 d'une suspension de staph..aureus dans du sérum physiologique obtenue en lavant la totalité d'une culture inclinée de 24 heures sur un
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agar-agar nutritif. On utilise des cultures inclinées sur agaraagar et des pipettes distinctes pour chaque fiole. Les fioles sont alors incubéesà 37 C pendant 24 Heures.
L'humidité en excès qui s'accumule dans les fioles est éliminée et la culture est récoltée en lavant chaque fiole à l'aide de 10 cm3 de solution saline à
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0,85 pH 7,0. Les liqueurs de lavage de chaque fiole sont réunies (environ 500 cm3) et le volume total est amené à 1000 cm3 à l'aide de sérum. On prélève des échantillons pour effectuer des comptages bactériens. Le comptage moyen pour les vaccins donne 5 x 108 organis- mes par cm3. On ajoute alors du phénol de manière à obtenir une con-
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centration de z et la suspension est placée au bain-marie à 6C ' pendant 1-1,5 heure.
On prélève des échantillons pour des essais de stérilité "0,2 cm3 sur une plaque d'.agar-e.gar au sang sur deux, et 2 cm3 dans une fiole sur deux contenant 250 cm3 d'un bouillon au thioglycolate) et le vaccin est conservé au réfrigérateur jusqu'à l'utilisation. Quand l'essai de stérilité est terminé, chaque lot est
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divisé en deux portions de 500 ClI13. Une portion est conservée comme vaccin complet tandis qu'avec l'autre on prépare un vaccin antigéni- que somatique de la façon suivante : le vaccin est porté à 37'bye on y ajoute 100.000 unités de dornaaa et on incube au bain-marié (ou dans un incubateur à 37*C) Jusqu'à lyse complète.
La durée d'incubation moyenne est de 24 heures pour les vaccins provenant de souches de staph.aureus des groupes I, II et IV, et de 2 à 4
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jour* dans le cas de touches du groupe III. On peut accélérer la lyse en secouant ou en agitant continuellement* Lorsque la lyse est complet , le vaccin a un aspect ambre limpide, et une petite quan- tité de débris comprenant quelques cellules entière* s'est déposée.
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'inaotition de la domine est effectuée en lu chauffant à â6"C pendant 1 heure. Le vaccin est 4lors centrifuge à 3000 tour.- Minute pendant 30 a1nut.a, 1* couche aumageantfi est récoltée et conxervee à In t84p'r&tur. du réfrigérateur, Ayant chaque 12t111.... tion du radon, on vérifie la toxicité globale en injectent par voit Intramusculaire os *t ',0 Ctt3 du ao3a i des sourit et à de cobayes respectivement.. tandis que la détermination des toxines erythrogeniquet et deraonecrotiquew est effectuée en injectant à des lapins par voit lOua-ou tan.. 0,1 cn3 du y.coin. La présence d'heaolytinew dans le vaccin est recherchée à l'aide 4'417tbroo7- tes de lapin et de mouton, Tout les vaooins passent l'essai de toxicité et aucun d'eux ne contient de toxines.
EXMPM il. - rréD&,,&1on du vaccin .anU±1QYt soaatiaue typholdioue.
Etudes biologiques d9 lYGat5 de S*4Hffnfllft Dh1t. f;dDa& t1oJ} au YJCQl1 . d.r4.
Pour toutes ces études on utilise du $, typha, souche Ty 2 provenant des Laboratoires Internationaux de Normes Biologique* de Copenhague. Chaque lot de vaccin est préparé en cultivant
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B. typhi dans 25 fioles de Roux contenant 150 ca3 d'agar-agar à 2,5% d'agents nutritifs pendant 16 heures à 37*C. La culture est récoltée en lavant la surface de chaque fiole de Roux à l'aide de 10 cm3 de sérum physiologique tamponné au pH 7,2. La suspension bactérienne
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est rassemblée et le volume est amené i 1000 CJa3 &Y80 du sérum tamponné.
La densité de la suspension est approximativement égale à 20 fois celle de la Préparation Internationale Etalon d'Opacité (10 unités d'opacité) et la suspension contient environ 20 x 109 cellules/ 3. Les cellules sont abandonnées en présence d'une aolu- tion de aerthiolate dans du sérum (concentration finale 1:5000) pendant 6 heures à la température ambiante puis pendant 4 jours
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en chambre froide. Après ces 4 jours on procède à des essais de
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ilabiliti sur des plaques d'agar-'agar nutritif et dans dois boulions de viande de veau.
Préparation de lysats.
Des études préliminaires, vérifiées par des mesures de
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turbidité et les colorations Grm# prouvent que la désoxyribaauQ3,ia-, se ne lyse pas les organismes de la typhoïde tués dans 1-*intervalle d'observation de 1 mois- C'est pourquoi on a entreprit de disloquer les cellules par des moyens physique , en l'occurrence des oscilla-
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tions soniques, afin de préparer ainsi le traitement ultérieur par l'snsyme.
Des volumes égaux de la suspension de vaccin standard sont traitée de diverses manières. Un lot est soumis pendant 1,5
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heure aux oscillations d'un oscillateur sonique Reytheon de 10 kilo- cycles. Ce lot est divisé en deux volumes égaux; le pH de l'un d'eux est réglé à 7#2 et de la domeee y est routée (100.000 unités/' 100 ca3 de fluide), l'outre lot étant laissé tel quel. Les deux , lots sont incubés à la température ambiante pendant 3 jours puis centrifugés à 4.000 tours/minute pendant 30 minutes,, Les solutions surnageantes sont conservées à 4*C Avant l'usage.
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Q>autres lots de vaccins standard sont traités par du Tween 80# du Triton (Marque déposée d'agents tensioactifs), en par- ( ticulier le Triton WR 1339, un polymère de tort.-octyl phénol oxy- " athyle - formaldéhyde, et le deaoxycholate de sodium en vue d'accé- lérer la désintégration bactérienne avec ou sans dornaut. Aucune de ces substances prise seule ne permet la lyse des organismes de la typhoïde tués. Par contre, chacun de ces Agents, combiné avec de la
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domase, produit la lyse dans les 10 a 14 jours. Dans chaque cas où la dornane est utilisée, cette enzyme est inactivée après la fin de la lyse par chauffage à 56"C pendant 1 heure.
Coma la lyae la plus rapide et la plus complète est obtenue au moyen de 1% de Triton plus la domase, on ne demera ci -après que les résultats relatif* au mélange Triton-doraaseo
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Un lot supplémentaire de vaccin standard est traité à la
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pyridine conformément au procédé de Labsoffsky et oollp , Can: J.
Kic1'Obiol, 6, 453 - 462, 1960, mais en utilisant 8 volumes de pyri- dîne par volume de suspension standard de S. typhi. Le mélange est abandonné pendant 1 heure à la température ambiante puis centrifugé à 3000 tours/minute pendant 20 minutes. Apres dialyse, le volume du fluide est ramené par évaporation au même volume que celui de la suspension standard initiale* On ajoute du chlorure de sodium
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de façon à obtenir une concentration finale de 0,8$%, et la solution est conservée à 4 C.
Désormais, pour la facilite, les lyaats et de l'extrait pyridique seront--appelés lysats de manière générale et individuelle- ment comme suit
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SO-typhi : t fraction traitée à l'oscillateur sonique SOD typhi 1 fraction traitée à l'oscillateur sonique et par la domase
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1'RD..typhi , fraction traitée par le Triton et la dornase. pY-typhi s fraction extraite par la pyridine 8 tandnrd-typhi fraction standard témoin non traitée.
Le pouvoir protecteur de chaque lysat est exprima tu. valeurs E.D. suivant le procédé De Reed et Muench, tam. J) 87s. 27, 493-497, (1938), en tenant compte du fait que les lysats non dilués sont l'équivalent de 20 x 209 bactéries par cm2.
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gssai de a de Souris âctixsas Des souris immunisées à l'aide de 80-typhi, SQD-'tr'ph.s TRD-typhï et PY-typhi sont soumises à des essais pour déterminer leur résistance à l'infection par des bacilles de la typhoïde.
Les résultats du Tableau I montrent que le pouvoir protecteur des SO-typhi et SOD-typhi est égal à celui de la suspension standard originale. Dans le cas de PY-typhi on n'a pas'déceler la moindre protection et dans le cas des vaccins K et L de la OMS et des vaccins TRD-typhi., on n'a constaté qu'une activité minimale. Les souris non-immunisée. des groupes témoins meurent dans les 24 heu-
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res.
On a constaté que les vaccins SOD et TRD sont moins tox1..
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ques que les vaccins centraux*
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1.'BLEA!! Il pouvoir protecteur des lysat, de S.h1 déterminé wr I*Uàâll de protection de SQUf1f 4 frHiejlK Dilutions des tée 50
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fraction Injectée lu 1JJ.i ..5,..t Expérience I 80-typhi 8/8z 8/8 2/8 0/8 214,272 SOD-typhi 8/8 6/8 2/8 2/8 195,120 TRD-typh1 4/g 2/8 0/8 0/8 1.999,920
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<tb> PY-typhi <SEP> 0/8 <SEP> 0/8 <SEP> 0/8 <SEP> 0/8
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<tb> Standard-typhi <SEP> 8/8 <SEP> 8/8 <SEP> 2/8 <SEP> 0/8 <SEP> 214,
272
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<tb> Vaccin <SEP> K+ <SEP> 3/12 <SEP> 2/12 <SEP> 2/12 <SEP> 1/12
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<tb> Vaccina <SEP> 4/12 <SEP> 2/12 <SEP> 1/12 <SEP> 0/12
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<tb> Expérience <SEP> II
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<tb> SO-typhi <SEP> 10/10 <SEP> 5/10 <SEP> 3/10 <SEP> 0/10 <SEP> 315.360
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<tb> SOD-typhi <SEP> 8/10 <SEP> 5/10 <SEP> 4/10 <SEP> 0/10 <SEP> 407.280
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<tb> TRD-typhi <SEP> 8/10 <SEP> 4/10 <SEP> 1/10 <SEP> 0/10 <SEP> 752.160
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py ..typh1 0/10 0/10 0/10 0/10 Standard-t,
yph1 10/10 5/10 1/10 0/10 486.720 * Survivantes traitées + Vaccin K provenant de l'Organisation Mondiale de la Santé # Vaccin L provenant de l'Organisation Mondiale de la santé
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D La dilution zéro sa rapporte à la suspension Standard-wph1 contenant 20 x 109 organisme s/cm3 et les lysats qui en dérivent. exemple !?*..- Vaccin, minocQçß1que.
Des couches de Neisseru 1ntracellularia (lIer;.1nococcu.) sont cultivées dans un milieu de Frantx modifie LWataon et Scherp, I!11D1UnOl, 81. page 331, (1958 ) J contenant un supplément de 0,1}é d'extrait de levure afin d'augmenter la teneur en gaz carbonique*
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L'incubation se fait à 37 C . Le développement de la culture atteint un maximum au bout de 24 à 30 heures.
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Les fioles sont retirées de l'incubateur) on ajoute 0,,% l de phénol et on tue les bactéries par chauffage à 56.C. Le pH *# est alors réglé à 7,2 et on Introduit de la doma.e (100.000 unités/, 500 cm3). L'évolution de la lyse est suivie au microscope par com- para:.son avec un témoin.
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Après avoir désactivé la d01'l1&" par chauffage on oon-
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serve le vaccin pendant au coins 4 semaines au réfrigérateur afin d'en atténuer la toxicité*
Des essais préliminaires sur des souris montrent qu'un
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vaccin préparé de la sorte confère une protection de 50% contre une ;;' attaque létale alors qu'un, vaccin non lysé n'assure qu'une prot - tion de 30%.
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L IY. - Vaccin D.rtul1I1t.
Des touches de Bordetella portuignit sont cultivées de Xa manière classique et tuées au moyen de aerthlolate à la concentra- i tion de 1/10.000. i Il seavére que la dornase ne lyse pas sensiblement les I bactéries tuées et un traitement préliminaire s'impose donc. Dans le prêtent cas, le traitement préliminaire consiste à exposer le
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bactéries pendant 1 heure aux vibrations ultrasoniques d'un Olc1l.la.. teur de 10 kilocycles opérant à 1,0 à 1,15 -ampère. Dans un autre cas on traite les bactéries à l'aide de laurylsulfate de sodium à
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la concentration de 0,625%. transformant ainsi rapidement les #oi- , rien en une masse gélatineuse.
La dornase est alors ajoutée à la substance prétraitée
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à raison de 100.000 unités par 500 cm3 et l'incubation à 37C est poursuivie pendant 3 à 6 heures. La dornase est alors désactivé* par chauffage,
Dans le cas où le prétraitement est effectue à l'aide de
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laurylsultate de sodium, on note qu'au repos le sel cristallise à froid et peut être séparé par centrifugation.
Yft9?ilifl Antigénloue poaatjQUe pour prévention des infections Vaccin An1(ly.iQu OIlaO\l,t. RQMZ JA preven tion des Ing2±tlgng à Streptocoques,
Le vaccin précité est prépare comme sut ;
On utilise un milieu synthétique pour préparer des cultu- res de souches de streptocoques T12, T19 et T36 et on s'en sert pour produire des vaccins monovalents et polyvalents,
L'inoculum pour lesportions de 500 cm3 du milieu est
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constitué par 0,5cm3 de culture lyophilisée et reconstituée contenant environ 5 x 108 organismes par cm3. Les fiole* sont main- tenues dans l'incubateur à 87 C pendant 24 heures.
Des échantillons sont prélevés en vue d'évaluer la population bactérienne totale et , de déceler les toxines et le reste est additionné de phénol en quantité suffisante pour donner une concentration de 0,5%. On le place alors au bain-marie à 56 C pendant 1 heure. On prélève ensuite% des échantillons pour des essais de stérilité de (0,5 cm3 d'une plaque d'agar-agar au sang sur trois,, et 0,5 cm3 dans un tube sur six, les tubes contenant un milieu au thioglycolate et un bouillon de soya-trypticase contenant des particules de viande et mis à incuber à 30-32"C pendant 7 jours),
et le vaccin est refroidi à 4 C husqu'à l'usage. Le nombre total de streptocoques varie de 5 x 106 à 15x106 organismes avec une moyenne de 10x106 organismes par cm3.
Des que les résultats de stérilité sont considérés comme satisfaisants, le vaccin phénolé tué par la chaleur est réchsuffé à 37 C, on y ajoute 50.000 unités de dornase par portion de 500 cm3 de vaccin et l'incubation se fait à 37*C pendant environ 12 heures, ce qui .assure la lyse presque totale des streptocoques* On Inactive la dornase en la chauffant à 56 C pendant 1 heure.
Essayés sur des lapins, en utilisant diverses souches, les vaccins obtenus s'avèrent assurer une bonne protection contre les Infections à streptocoques.
EXEMPLES VI. - $Vaccin BCG Antigéniqe Somatique,
Ce vaccin est préparé en traitant une suspension de BCG (30 mg/cm3) dans un oscillateur sonique Baytheon de 10 kilo- cycles pendant 1 à 1,5 heure et en y ajoutant de la dornase pour effectuer la lyse de cellules de BCG (100.000 unités de dornase par portions de 500 cm3 de suspension de BCG). La dornase est alors Inactivée en maintenant la suspension d'abord à la température ambiante pendant 4 jours puis à 56 C pendant 1 heure; le lysat résultant est alors centrifugé et la couche surnageant* est dialysée pendant 2 jours à l'aide d'eau de distribution pour obtenir le vaccin.
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EXEMLE VII. - VAccin antigénique somatique de la typhoïde.
On prépare des vaccins contre la typhoïde par un procédé pratiquement identique à celui de l'exemple II. Toutefois, les bactéries sont cultivées dans un milieu de Frantx modifié Watson et Scherp, J. Immunol, [81, page 331 (1958)], contenant en outre 1,5% de glycine. Cette addition provoque la formation de proto- plastes plutôt que de bactéries normales a. paroi cellulaire.
Ces protoplastes sont tuées en y ajoutant du merthoiate dans du sérum et la lyse est opérée à l'aide de dornase comme décrit dans l'exemple II, maïs sans exposer les protplastes ni aux oscilla- tions soniques, ni à l'action d'agents tensio-actifs, ni à un autre traitement destiné à affaiblir les parois cellulaires. La lyse est complète au bout de 24 heures. Les essais indiquent que le vaccin est efficace pour les animaux de laboratoire.
Dans le procédé décrit ci-dessus, la glycine peut être remplacée par d'autres acides aminés, par exemple par l'alanine, ou par tout autre agent capable de former des protoplastes. On connaît divers agents de ce genre; ce sont par exemple les antibio- tiques tels que la pénicilline, ou les enzymes telles que la lysozyme et la trypsine. D'une façon générale, on préfère utiliser comme formateurs de protoplastes les acides aminés, car ils risquent moins de produire des résidus susceptibles d'engendrer des effets secondaires lorsqu'on se sert du vaccin* Bien entendu, tout agent formateur de protoplastes envisagé pour exécuter cette forme de l'invention doit être vérifié afin de s'assurer qu'il ne produit pas de résidus préjudiciables de ce genre.
La quantité d'additif formateur de protoplastes qu'il y à lieu d'ajouter au milieu peut être dé terminée par expérience* Dans le cas de la croissance de S.typhi, il s'est avéré que les proportions de glycine dans le milieu varient de 0,5 à. 3%.
EXEMPLE VIII. - Immunisation des bovins contre la mastite.
La mastite bovine provient généralement d'une in-
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faction à staphylocoques et/ou à streptocoques. On a essayé un vaccin antigénique somatique polyvalent en vue de protéger les bovins contre la mastite produite par des staphylocoques* Ce vaccin est obtenu par un procédé qui comporte la lyse à l'aide de dornase de diverses souches de Staphylcocoous aureus sélectionnées et qui est en substance analogue au procédé décrit dans l'exemple I.
Les souches et les proportions de Staphylococcus aureus qui servent à préparer ce vaccin sont les suivantes :
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Dans la préparation de ce vaccin, on prend soin de réaliser unelyse de 100% pour obtenir ainsi un vaccin de puissance maximum.
En outre, avant d'utiliser le vaccin, la domase est inactivée par la chaleur en chauffant le vaccin à environ 56 C pendant 1 heure. Cette opération améliore la stabilité et évite la production éventuelle d'effetsnéfastes lorsqu'on essais le vaccin sur le bétail. En outre, la culture des bactéries est effectuée dans des conditions telles que les bactéries soient largement expo- odes à l'air. Enfin, le vaccin est lyophilise pour en augmenter la stabilité.
Des essais opérés sur des vaches atteintes de mastite à staphylocoques montrent que cette maladie peut être prévenue en vaccinent les vaches .au préalable à l'aide d'un vaccin de ce genre préparé suivant le procédé de la présente invention. La vaccination primaire consiste à administrer 2 doses d'antigène (5 cm3) à un mois d'intervalle. L'étude de la réaction des anticorps indique qu'il est parfois recommandable d'administrer une dose de rappel dans un délai de 6 mois.
Si la mastite bovine provient d'une infectionàstrepte- coques, le vaccin à administrer est similaire à celui qu'on vient
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de d4crires ucepte que 100 bactérie. de d6pxr sont des ttropto. coques tu4 * Si lu 1I&8ti t. est provoquée par une infection 1I1xt. , Staphylocoques et à streptocoques on utilisera un rtccin eixtw.