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"Procédé pour la préparation de produits de dissociation des acides nucléiques à partir de levure"
Lors de la préparation de produits de disso- ciation des acides nucléiques, en particulier de nucléotides et de nucléosides, on sait que l'on soumet des acides nucléiques à l'action d'enzymes. Dans ce but, on a isolé, à partir de le- vures, les acides nucléiques nécessaires comme matière première.
Il s'est cependant révélé que ces procédas pour la préparation
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des acides nucléiques prennent beaucoup de temps, sont coûteux et, également, sont réalisables avec des pertes importantes en produits dissociables de grande valeur.
Or. a maintenant trouvé que.l'on peut nettement simplifier la préparation de produits de dissociation des aci- des nucléiques, en particulier des nucléotides ot des nucléosides, à partir de la levure, en soumettant des suspensions aqueuses de levure directement à l'action d'enzymes, en solution aqueuse, la suspension étant ajustée à une valeur de pH, à laquelle l'en- zyme utilisée possède son$action optimale.
Conformément à l'invention, on peut utiliser- pour le présent procédé, toutes espèces de levures, comme la levure de boulanger, la levure de bière ou la levure "candida" (levure de croissance) sous forme de produits de centrifugation ou de levures comprimées, ainsi que de la levure sèche.
@ Dans le cas de l'utilisation de levure frai- che, 'il s'est révélé particulièrement avantageux, de chauffer ces levures pendant une courte durée, environ'5 à 60 minutes, de préférence 10 à 40 minutes, à des températures comprises entre 80 et 110 C, de préférence vers 90 C et de soumettre la suspen.- sion de levure refroidie, à la dissociation enzymatique.
Les solutions d'enzymes mises en oeuvre peu- vent être préparées selon des procédés connus.Ainsi, convien- rient des solutions contenant de la phosphodiestérase, qui ont
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été préparées a partir de .icroorganismes et également celles qui ont 'été obtenues à partir de matériaux animaux ou de préfé- rence végétaux) en particulier à partir de germes d'orge ou de germes d'huile de blé.
Le procédé conforme à l'invention n'offre pas seulement l'avantage que l'on peut obtenir, sans isoler les acides nucléiques, les produits de dissociation, mais il s'est
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@ révélé que l'on obtient un rendement en produits de 'dissociation'! de 30 à 60 % plus élevé, rapporté à la levure considérée comme matière première. Ceci pourrait être attribué en première ligne à ce que l'on peut soumettre également à une dissociation, se- lon le présent procédé, des produits qui ne peuvent être envi- , sagés simultanément lors de l'isolement des acides nucléiques à partir de la levure.
Ici il s'agit surtout de nucléotides à grosse molécule présents dans la collule de la levure,prove- nant du changement synthétique et analytique de la matière de l'acide nucléique.
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En outre est exclue, conformément à. l'invention une dégradation partielle des acides nucléiques dans la levure, par des enzymes spécifiques de la levure, conduisant à une dégra- dation non désirée des acides nucléiques. Le procédé cité en dernier lieu se.,Ion la forme de réalisation particulièrement préférée, dans le cas de l'utilisation de levures fraîches, est
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.fl'Qt6 on .Oum.11&nt las if01 f0k UA ,O&utt... à courte durée, qui, à côté de cela a encore pour but 'de détruire les parois des cellules.
Dans le cas de l'utilisation de levures sèches, le chauffage de courte durée peut être supprimé, du fait que les enzymes spécifiques de la levure ont déjà été, par le séchage sous vide, largement ou pratiquement
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complètement inaotivées et que les parois des cellules sont de- venues perméables.
Dans les exemples suivants, l'invention est expliquée avec plus de détails. Les valeurs données pour la te- neur en acide nucléiques ou en leurs produits de dissociation, ont été calculées à partir du spectre UV, à une longueur d'onde de 260 mu.
EXEMPLES
1. 6. 200 g de levure fratche, correspondant à 1000 g de substance sèche, sont maintenus, avec forte agita- tion par exemple par introduction directe de vapeur, pendant
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10 minutes à 90 . On refroidit ensuite la levure qui se liqué- fie, à une'température d'environ 47 , on ajuste le pH à 6,5 et l'on ajoute environ 3. 500 cm3 d'une solution diluée d'enzyme (phospliodiestérase) de même valeur de pH et l'on ajoute, le cas échéant, pour éviter la croissance non désirée de microbes, '.OU bien du chloroforme ou bien un autre désinfectant, n'influ- ençant ,pas les enzymes, par exemple du toluène.
Après une durée -de. dissociation d'environ 10 heures, la levure est séparée par centrifugation, lavée et les solutions, réunies sont ajustées au pH 10 avec de la lessive de soude et les protides qui préci- pitent ainsi, sont éliminés. Après purification à l'aide d'une colonne de charbon, on effectue la préparation à :.' état pur par chromatographie sur échangeur.
Au lieu ou en combinaison avec la séparation par échangeur d'ions, on peut effectuer une séparation des nu- cléotides de purine et de pyrimidine par une précipitation à l'aide du cuivre. A partir des éluats de la colonne échangeuse,
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à Q'10.' les xutl4otid44 pap .e.,;,;tt. À '48 de aitguu lourds ou de baryum ou, après dialyse préalable, par évaporation directe et cristallisation.
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Le calcul des quantit.-més des produits de dis- sociation à été effectué, dans les stades intermédiaires de préparation, par mesures spectrophotométriques à 260 mu;
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<tb> Produits <SEP> de <SEP> dissociation <SEP> solubles <SEP> dans <SEP> les <SEP> acides <SEP> 102,2 <SEP> g.
<tb>
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Les mêmes, après séparation par centrifugation
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<tb> et <SEP> lavage <SEP> de <SEP> la <SEP> levure <SEP> 96,5 <SEP> g.
<tb>
<tb>
Les.mêmes, <SEP> après <SEP> purification <SEP> préalable <SEP> par
<tb> traitement <SEP> avec <SEP> le <SEP> charbon <SEP> 88,2 <SEP> g.
<tb>
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.Idononucléotides après séparation sur échangeur AI'.':" + GIF 21,4 g.
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<tb>
CLIP <SEP> + <SEP> UMP <SEP> 20,8
<tb> Nucléotides <SEP> totaux <SEP> 42,2 <SEP> g.
<tb>
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2. 1.080 g de levure sèche, correspondant à 1000 g de substance sèche, ont été bien agités aveo 6.700 om3 d'eau, la valeur du pH de la suspension a été ajustée à G,5 et 2. 220 om3 de solution d'enzyme (phoaphadiestérase) de méme pH ont été ajoutés* Ensuite, on a continué l'opération comme décrit dans l'exemple 1.
Après traitement, on a obtenu:
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<tb> Produits <SEP> de <SEP> dissociation <SEP> solubles <SEP> dans <SEP> les <SEP> acides <SEP> 106,0 <SEP> g
<tb>
<tb> Les <SEP> mêmes, <SEP> après <SEP> séparation <SEP> par <SEP> centrifugation <SEP> et
<tb> lavage <SEP> de <SEP> J.a <SEP> levure <SEP> 76,5 <SEP> g
<tb>
<tb> Les-mêmes, <SEP> après <SEP> purification <SEP> préalable <SEP> par <SEP> traitement
<tb> avec <SEP> le <SEP> charbon <SEP> 47,8 <SEP> g
<tb>
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làonqnualéotiàes après séparation sur échangeur X, Ale + GMP " 12,2 g CLIP + UMP .....¯... 10,9 g Mononucléotiaes totaux 23,1 g.
3. L'exemple 1 a été répété, mais on a main- ' tenu la levure pendant 40 minutes à une température de 90 C.
Après le traitement et la séparation sur échangeur d'ions, on a déterminé à l'aide de mesures spectométriques.à 260 mu;
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<tb> Produits <SEP> de <SEP> dissociation <SEP> solubles <SEP> dans <SEP> les <SEP> acides <SEP> 123, <SEP> 4 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> .,,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Les <SEP> mêmes, <SEP> après <SEP> séparation <SEP> par <SEP> centrifugation <SEP> et
<tb>
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lavage dp la levure 1. ,1";
115,8 g
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<tb>
<tb>
<tb> Les <SEP> mêmes, <SEP> après <SEP> purification <SEP> préalable <SEP> par'traitement
<tb>
<tb> avec <SEP> le <SEP> charbon <SEP> 105,3 <SEP> g
<tb>
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Mononuoléotides après séparation sur éc1i.-
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<tb> AMP <SEP> + <SEP> GMP <SEP> 25,1 <SEP> g <SEP>
<tb>
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Cl±P + MT 23,7 g
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<tb> Nucléotides <SEP> totaux <SEP> 46,8 <SEP> g
<tb>
4. Dissociation en nucléosides de l'acide ribonucléique contenu dans la levure fraîche comme dans l'exem- ple 1, mais @ , on a pris, au lieu d'une solution d'en-
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zyme contenant de la DhosDhodïesteraseg une solution d'enzyme, qui contenait encore, à coté de la phouphodisbérase, don nu- cléotides.
Les rendements se sont élevés, après la colonne échangeus à partir de 1000 g de substance sèche de levure,à
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nucléosides totaux REVENDICATIONS.
1, Procédé pour la préparation de produits de dissociation des acides nucléiques, en particulier de nucléo- tides et de nucléosides, à partir de levure, caractérisé en ce que l'on fait agir, sur une suspension de levure dans l'eau, directement une solution d'enzyme et que l'on traite ensuite la solution d'une manière connue.