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"Procédé de production à partir d'hydrocarbures de produits ali- mentaires d'appoint riches en protéines".
La présente invention se rapporta un procédé écono- mique et perfectionné permettant la croissance de bactéries sur des produits hydrocarbures peu coûteux en vue de récupérer direc- tement un produit alimentaire d'appoint riche en protéines conte- nant par exemple; 70 à 75% de celles-ci pour la nourriture d'ani- maux et/ou de l'homme.
L'invention se rapporte particulièrement à un procédé continu d'introduction d'une charge hydrocarburée li-
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quide ou gazeuse, d'un milieu constitué par des -sels minéraux aqueux et liquides et par un gaz contenant de l'oxygène en excès ; . dans un racteur agité, qui contient le produit de charge précité, ' un milieu aqueux et une bactérie capable de se développer sur le milieu hydrocarbure précité;
cette bactérie représente une phase de croissance logarithmique (dont le développement augmente selon une fonction exponentielle) et étant présente en une concentra- tion égale ou supérieure à celle à laquelle l'acroisaement du développement exponentiel est égal à l'accroissement du soutira- ge continu; à soutirer en continu une partie du mélange réaction- nel à un taux permettant de maintenir les temps de séjour criti- ques à l'état liquide; à séparer les microorganismes du mélange soutiré et.finalement à sécher ces microoganismes pour obtenir directement l'aliment supplémentaire constitué par des bactéries riches en protéines.
Un mode de mise en oeuvre préféré de l'in- vention consiste à introduire des quantités critiques de la char- ge hydrocarburée en rapport avec le milieu aqueux contenant les sels. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, on effectue le procédé en utilisant comme charge une fraction sélec- tionnée constituée par une fraction paraffinique de pétrole allant de C11 à C30 qu'on a purifiée pour abaisser le niveau des pro- duits aromatiques en dessous de 1/2% en poids, ceci en utilisant comme batérie le "Micrococcus cerificans" et de préférence en utilisant des sels minéraux appropriés constituant des milieux de réaction non limitatifs, pour obtenir la sélectivité µlevée de la bactérie,
plut8t que des esters constituant des sous- produits.
La demanderesse a découvert maintenant qu'on peut pré- parer d'une façon extrêmement économique et avec un excellent rendement un aliment supplémentaire protéinique, à partir de produits pétroliers, grâce au procédé bien défini confrome à l'invention. La caractéristique la plus importante de ce pro- cédé consiste à utiliser un temps de séjour critique à l'état li-
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quide et court dans le réacteur.
Ou a découvert en effet d'une façon surprenante qu'en utilisant des temps de séjour à l'état liquide, qui se montent à 1,5 jusqu'à 4 fois, de préférence à 2 - 3 fois le temps Minimal de génération de l'organisme parti- culier, par exemple du Micrococcus certificans, on peut obtenir t une sélectivité très développée de la bzcérie, ceci selon les indications qui vont suivre.
1- 2.? fois le temps minimal de génération 77 kg de n-paraffine + 89 kg O2 + 22 kg sels minéraux, NH3, etc,donnent 100 kg de cellules sèches + 62 kg CO2 + 26 kg H2O; 2-¯,5,µ fois le temps minimal de génération !
89 kg de n-paraffine + 127 kg O2 + 22 kg sels minéraux, NH3, etc, donnent 100 kg de cellules sèches + 97 kg CO2 + 41 kg H2O.
Le terme -temps minimal de génération* désigne ici le c temps minimal pour doubler la concentration de la batérie en phase logarithmique (c'est-à-dire sur la ligne droite d'un graphique logarithmique) dans une fermentation en masse effectuée dans les conditions les meilleures concernant la température, le pH et l'introduction illimitée d'hydrocarbure, d'O2 et du milieu salin aqueux le plus profitable à la bactérie (ceci éventuelle- ment avec forte agitation). Quand on ajoute un promoteur de la croissance dans un procédé continu, l'expression ci-dessus englo- be également l'utilisation de ce promoteur.
Ce temps minimal de génération peut être déterminé pour chaque bactérie particulière selon la littérature ou empiriquement en laboratoire, en utili- sant avantageusement un appareil de fermentation avec un agita- teur à pale tournant à 1500 tours/minute.
Etant donné le caractère surprenant du perfectionnement qu'on obtient en limitant le temps de séjour à l'état liquide, on ne pouvait pas s'attendre que des temps aussi courte pour- raient améliorer la sélectivité, car habituellement les techni- .
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ciens n'utilisent pas des temps de séjour aussi courts en l'abs- cence de la sélectivité qui fait l'ojbet de l'invention.
Ainsi, (1) il est théoriquement impossible d'utiliser dans un procédé continu des temps de séjour à l'état liquide infrieurs à fois le temps minimal de génération, c' est-à-dire dans une réac- tion où la vitesse de formation du produit est proportionnelle à la quantité présente de celui-ci, et le temps de séjour mi- nimal dans un procédé continu se monte à ######### du 1,45 fois le temps minimal de génération d'une opération en masse et, d'autre part, (2) un procédé continu peut exiger, par suite des variations considérables comparativement aux conditions optima- les,
une marge de sécurité d'au moins 1 et de préférence 2 fois le tempe minimal de séjour pour un procédé en continu (c'eat-à- dire 1,45 fois le temps minimal de génération), ceci afin d'éviter l'épuisement de la reproduction de la bactérie, c'est-à-dire son élimination par lavagge à partir du réacteur. Il convient de no- ter que le seul. surplus de dépense pour ce facteur de sécurité est la dimension du réacteur, ce qui joue un r8le peu important dans le coût total du procédé.
On remarque qu'il est inattendu que des temps de séjour courts puissent améliorer sensiblement la sélectivité et que les avantages industriels qu'on obtient en utilisant ces tempe courts de séjour à l'état liquide sont extrêmement importants.
1 - Coût du refroidissement. Tous les procédés de croissance de bactéries sont fortement exothermiques et développent, par exemple 2778 à 5556 calories par kg de cellules et ces procédés sent et- , fectués à des températures voisines de la température ordinaire.
On utilise par conséquent plutôt une réfrigération qu'un refroi- discernent par l'eau. Le coût de cette réfrigération dans le pro- cédé type avec un temps de séjour court (équation 1) se monte approximativement à 40% du coût de la fermentation (c'est-à-dire du total du coût de la matière première plus la fermentation plus la récupération du produit). Pour des temps de séjour plus, longs (équation 2), ce coût augmente d'environ 60% en proportion
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avec
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f1a quantité ât*plé xtaire d'1J,ène qu'il faut pour former 00 2. et H20.
2 -. Tous les précédée de croissance'dos bao- tériee C1Ul\JjS eoxpontênt la üluleluttol1 d'drocarb1H"'8 qu fade- ble conce.t":.ilon:4'un milieu aqueux de culture odntebeat dois sels aint.4ra.. comxe Iloxygèto est tq0s peu soluble dao vert il faut %ne rands,e 4at '18" ;i0fW 1'ag:b fis 10 sou#- ±loge, afin 4'e.f.iI 'bu.r le kµfµ4t% 'de .Jacyg&ne au e8- me. oett*, é' A4R pe?4t L t-44 :mf4e4tp par 4e8 1...1Ii\tIIIJ ,. par exemple *go émt3*ïfifat$ ,o 6* peut r4duïge uéd," lisant de l'air G2U'iehi en oxw" gWub8%¯¯q%o l'air 1Bout.
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3 "' Coût de .1'h1drocarbure. fi est évident que ce coût se trouve réduit de 15% en ùtilisant le,temps de réaction court. Cependant, il est faible comparativement à la dépense indiquée ci-dessus.
4 - coût de l'équipement du réacteur. Les dimensions du réacteur sont également réduites de 15% quand on utilise les tempes de réaction courts. Cependant, cette dépense est également faible comparativement à 1 et 2 ci-dessus.
Selon un mode de mise en peuvre préféré et quand on
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utilise comme charge un hydrocoarbure de 06 à a 301 on a découvert que la purification de cette charge est hautement désirable ou nécessaire dans le but d'exclure essentiellement tous les hydro- carbures aromatiques. La demanderesse a fait la découverte sur- prenante qu'aussi¯ bien les produits aromatiques monocycliques que polycycliques,normalement présents dans le pétrole ne sont pas utilisés par beaucoup de bactéries, mais que ces produits
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artat.ques sont adsorbés sur ou dans la bactérie, même quand les esters formant le-sous-produît et l'huile non convertie sont ré-
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duits au minimum selon le procède préfère de l'invention.
Ces produits sont donc difficiles à éliminer, c'est-à-dire que des essaie étendus sur les nourritures animales indiquent que des taux de n'importe quels composés aromatiques monocycliques ou polycycliques dans la nourriture dépassant 0,05% en poids abais- sent fortement la croissance animale. Même,si on élimine les composés aromatiques hétérocycliques éventuellement carcinogènes, les composés aromatiques monocycliques sont aussi extrêmement nuisibles à la croissance animale.
De ce fait, l'élimination sen- siblement complète des aromatiques dans 'le procédé de l'invention permet une récupération très économique'de la bactérie, étant donné qu'on a trouvé que la charge hydrocarburée résiduelle non convertie et les esters produits qui sont retenus sur la bactérie ne constituent pas un poison et ne sont pas autrement nuisibles à la croissance. Ces produits retenus sur la bactérie ne sont cependant pas avantageux et on les réduit intentionnellement au minimum, grâce aux techniques préférées de l'invention indiquées plus loin.
La demanderesse a donc découvert qu'en disposant de grandes quantités d'air comprises entre 0,5 et 4,0 et de préféren- ce 0,8 à 2,5 volumes d'air à introduire dans le réacteur/volume liquide du réacteur/minute par % en poids de la concentration de la bactérie sèche dans le réacteur/temps. de séjour à l'état li- quide en heures, améliorent sensiblement.la sélectivité. Dans une variante, on utilise de l'air enrichi en O2. Avec ce dernier, la quantité nécessaire est réduite proportionnellement à mesure que la teneur en O2 augmente. Dans cette variante, l'air enrichi contient plus de 70% et mieux encore plus de 90% de O2, étant don-" ' né les économies que permet la réduction du coût du compresseur.
La conversion initiale de l'oxygène présent dans les acides gras se produit de cette manière, ces acides gras étant utilisés pour ' la croissance avec production de CO2 et de H2O comme sous-pro- duits. En l'absence d'une quantité suffisante d'air, la réaction
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initiale produisant les acides continus, mais la bactérie ne dispose plus d'assez d'air pour utiliser ces acides pour sa crois- sance et les acides sont transformés en des esters qui s'accumulent dans les cellules.
Selon une autre variante avantageuse, on a découvert qu'en utilisant l'air enrichi d'oxygène, on peut utiliser des taux très élevés d'hydrocarbure, par exemple supérieurs à 2% en poids par rapport au milieu salin minéral aqueux (y compris NH4OH) et obtenir en même temps l'utilisation complète de cet hydrocarbure, c'est-à-dire des taux bas de ce dernier dans le mé- lange en équilibre qu'on soutire en continu. En outre, on a cons- taté avec surprise la sélectivité élevée des bacéties pour les esters dans le procédé de l'invention, sélectivité qui existe même aux taux élevés précités de l'hydrocarbure. Les taux préfé- rés sont de 1 à 5 et'mieux encore de 1 à 3% en poids par rapport au milieu aqueux contenant du sel minéral, quand on utilise de l'air enrichi en O2.
Finalement et surtout quand on utilise le milieu aqueux préféré de croissance qui contient la combinaison critique des sels minéraux, les sélectivités sont fortement augmentées, ce qui permet d'obtenir un abaissement 10 fois plus fort des esters produits, c'est-à-dire que le mélange en équilibre contient après séchage suelement 2% d'esters par rapport aux bacteries comparati- vement aux 20% qu'on obtient quand on fait seulement faiblement varier les sale minéraux du milieu réactionnel.
Toutes les particularités précitées abaissent, quand on les combine, fortement le coût de production des nourritures d'a- nimaux à partir d'hydrocarbures. Ainsi, par exemple, l'énergie nécessaire pour agiter le réacteur et injecter l'air se trouve fortement réduite, en plus de la très importante amélioration que permet la séparation de la bactérie par un procédé simple n'exi- geant aucun stade de purification extrêmement coûteux, comme le sont les lavages répétés avec des surfactants, les extractions, etc.
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De plus, il est préférable d'utiliser des coagulants, par exemple des surfactants cationiques, pour abaisser le coût de la séparation initiale, par exemple d'une centrifugation ou décantation.
La'mise en oeuvre de l'invention sera mieux comprises à. l'aide du dessin annexé et de la description qui va suivre se rapportannt à un appareil préféré pour le fonctionnement en con- tinu du procédé avec utilisation d'un hydrocarbure préféré en C6-C30 contenant des composés aromatiques. Selon ce dessins, on amène la charge de l'hydrocarbure par le conduit 1 dans le dis- positif 2 de purification où l'on élimina par le conduit 3 les produits non normaux et les impuretés. Cette purification est de préférence une absorption des hydrocarbures normaux, par exemple des paraffines, par un tamis moléculaire 5A, suivis d'une désorp... tion et d'une épuration des hydrocarbures normaux désorbés avec un tamis moléculaire 13X ou un gel de silice pour absorber les impuretés restantes y compris les aromatiques.
Les paraffines normales purifiées passent par un conduit 4 au stockage 9 des paraffinés normales. Elles sont amenées par le conduit 6 dans un réacteur ? contenant les bactéries et agitées à l'aide d'un agi- tateur 8. On introduit de l'acide phosphorique par le conduit 9, les sels minéraux par le conduit 10 et l'eau par le conduit 11 dans un mélangeur 12 comportant un agitateur 13. La solution mix- te des sels est introduite dans le réacteur par le conduit 14.
On introduit également dans ce réacteur de$'hydroxyde d'ammonium par le conduit 15. L'air ou l'air enrichi en oxygène est injecté dans le réacteur par le conduit 16. L'air, le CO2 et la vapeur d'eau se dégagent dans l'atmosphère par le conduit 17. On retire en continu par le conduit 18 un mélange des cellules produites, de la solution saline et de faibles quantités de l'hydrocarbure n'ayant pas réagi et on recycle une partie de ce mélange par le conduit 19, la colonne de refroidissement 20 et le conduit 21 pour refroidir l'intérieur du réacteur. Accessoirement ou comme
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variante, on peut aussi utiliser un serpentin de refroidissement 22 monté dans le'réacteur.
Le restant du mélange obtenu est amené par le conduit 23 dans des essoreuses ou à un décanteur 24 pour effectuer la séparation des cellules obtenues. On soutire le liquide surnageant par le conduit 25 et on le recycle dans le réacteur, Les cellules concentrées qu'on a séparées passent par le conduit 26 dans des séchoirs 27, de préférence à pulvérisation,; qui utilisent l'air chaud introduit par le conduit 28. Oa. retirs les cellules sèches obtenues par le conduit 29.
De préférence, la séparation par des essoreuses se fait de façon que le pods % de cellules sèches (sans compter l'eau intracellulaire) de la pite! d'essorage soit de 7 à 28% en poids de cellules sèches et de pré- férence de 10 à 15% en poids. On peut effectuer économiquement cette sépration et par suite des conditions de réaction critiques, le produit final des cellules contient après séchage seulement 7 à 10% en poids de matière grasse totale, dont environ 75% sont des esters, et 5 à 9% en poids de sels minéraux.
De ce fait, les per- tes de ces derniers, qui ne sont pas particulièrement avantageux pour la nourriture des animaux, ne sont pas excessives. On note qu'on peut utiliser au lieu de l'essorage d'autres procédés, de séparation, comma la filtration ou la décantation avec ou sans produits facilitant la filtration ou la coagulation pour effec- teur la séparation initiale des cellules et, bien entendu, on peut aussi utiliser divers procédés de séchage, Il convient de noter que le procédé est extrêmement économique du fait qu'il n'est pas nécessaire d'utiliser des sépérations compliquées et des lavages avec des surfactants pout enlever l'huile et les sous- produits (bien que leur utilisation puisse également être envisa- gée pour la mise en oeuvre de l'invention),
afin d'obtenir un produit final extrêmement riche en protéine et ne contenant pas d'impuretés qui seraient nuisibles à l'homme ou aux animaux.
Conformément à l'invention, les charges pour la mise en oeuvre du procédé sont des produits pétroliers en C1-C30, de
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préférence des gas-oils distillant entre 190 et 400 C, de préfé- rence entre 190 et 320 C. D'autres charges préférées sont des hy- drocarbures normaux en C1-C30 et des isoparaffines, cycloparaffi- nes, monoléfines, dioléfines et des composés aromatiques ainsi que les mélanges de ces produits. On préfère particulièrement les paraffines normales.
Les chargeaient on'dispose en grandes quan- titée et particulièrement appropriées sont les paraffines en C11-C30 normales qu'on tire du gas-oil, du naphta léger et des charges normales gazeuses, comme le méthane, l'éthane et le pro- pane ainsi que leurs mélanges, par exemple le gaz naturel, :Quand on utilise des charges normalement gazeuses, on les amène bien entendu de préférence directement à l'état gazeux dans le réac- teur à l'aide de tubes distributeurs.
La condition critique pour mettre en oeuvre avec succès l'invention réside dans le fait qu'il faut purifier la charge en C6-C30 pour déduire le taux des produits aromatiques monooy- cliques et polycycliques en dessous de 0,5% en poids, de préfé- rence en dessous de 0,1% en poids et encore mieux en dessous de 100 parties par million. Cela est nécessaire parce qu'on a dé- couvert le fait surprenant que les produits aromatiques ne sont pas attaqués par les microorganismes et.,que lors de l'utilisation des procédés de séparation économiques conformes à l'invention sans une telle purification le produit est extrêmement dangereux pour les animaux et pour l'homme. Ce danger réside dans le fait que ces produits abaissent la croissance des animaux nourris avec ces aliments.
Cela est entièrement indépendant des faibles quan- tités de produits aromatiques polycycliques qu'on considère comme '' carcinogènes et qui doivent être éliminés de préférence du pro- duit final. On peut séparer sélectivement ces derniers produits de la charge par divers procédés, mais il est surprenant que la quantité des composés aromatiques monocycliques, qui constitue une partie notable du total des produits aromatiques, c'est-à- dire 20 à 50%, doit être éliminée pour permettre l'application.
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VIII Myxobacterales
IX Spirochaetales
X Mycoplasmatales
Les bactéries préférées pour la mise en oeuvre de l'invention sont Micrococcus cerificans, Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas fluorecens, Nocardia opaca, Nocardia rubra, Nocardia coralina, Pseudomonas methanica, Pseudomonas desmolytioum, Myco- bacterium phleie. On utilise de préférence le Micrococcus ceri- ficas, isolé et identifié par R.E.
Kallio et autres, Journal ot
Bacteriology, Vol. 78, No 3, pages 441-448 (Sept.1959). Des cul- tures de cet organisme sont déposées à L'American Type Culture
Collection, 212 M Street, N.W., Washigton 7, (D.C.) sous le n 14987. L'identification complète, de cette souche est la suivante
Morphologie :Petites cellules sphériques tendant à de- venir elliptiques dans les cultures anciennes et dans les mi- lieux riches en azote. Les cellules des milieux définis ont un diamètre moyen de 0,5 à 1,0 , dans des milieux complexes un dia- métre de 1,0 à 2,0 . Les cellules se présentent isolément ou par parquets. On n'observe pas de granules immotiles, métachroma- tiques et sudanophiles.
Réaction au gram t négative.
Les colonies sur agar-agar sont petites ( 1 mm), circu- laires, convexes, à bord entier. Les colonies sur agar-agar nutri- tif sont plus grandes (2 à 5 mm) généralement rondes avec mu- corde surélevé.
Pigmentation blanc, beige ou brunâtre.
La culture est obligatoirement aérobie. Une large va- riété de produits favorisant la croissance ; l'extrait de levure, l'hydrolysat de caséine, les alcools et les acides à longue chat- ne, les alcanes normaux à longue chatne et les oléfines.
Fermentation des hydrates de carbone ! Ces dernière ne subissent pas de fermentation. En culture aérobie, beaucoup d'hy-
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avec succès du procédé de l'invention. On remarque également que de nombreux autres procédés de 'la littérature, signalés comme étant industriels ou pouvant le devenir; demmandent des opéra-, tions extrêmement coûteuses de lavage avec un surfactant, d'ex- traction ou autres opérations pour obtenir un bon produit alimen- taire pour les animaux.
Le meilleur procédé de purification de l'hydrocarbure, qui est de préférence un gas-oil, consiste à utiliser un tamis moléculaire. Grâce à ce procédé, on peut absorber sélecti- vement les hydrocarbures à chaîne droite sur le tamis moléculaire et éliminer ainsi complètement les produits aromatiques. Un pro- cédé préféré pour une telle purification des gas-oil est décrit
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dans le brevet des Etats-Unis d'âmérique n 3.0?0.542, ce brevet étant cité ici comme indiquant la technique préférée pour purifier les charges utilisées conformément à la présente invention.
Ce brevet repose sur la découverte qu'en chargeant tout d'abord le tamis moléculaire par un milieu de déplacement, de préférence de l'ammoniac, et en introduisant le milieu de déplacement en même temps que la charge, on augmente le taux d'adsorption et on faci- lite ensuite grandement la désorption, en particulier pour des produits de poids moléculaire élevé. On préfère aussi utiliser une manipulation d'épuration additionnelle, telle quelle est dé-
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crite dans les brevets belges Nos 63?.262 et 637.515, ces bre- vets étant également cités ici à titre de référence.
Les bactéries appropriées au procédé de l'invention sont celles qui se dévelop- et pent sur des hydrocarbures/qui ne sont pas toxiques pour les
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animaux, c'est-à-dire de la catégorie des Schisonycètest avec les sous-groupes ci-après
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1 Paeudomouadales II Chiamydrotacteriales III Hyphomicro-ales IV ùbacter1ales V Act1nomyoetales VI Caryopho ales VII Beggiatoales
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drateeide carbone sont assimilés, par exempt les glucose, na1- toge, aa.nn1tol, sucrose, lactoae, arabinose, rhamnose, sorbitol,
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dUlclLt"'3ft l'inuline.
En culture aérobie, le glucose est utili- sé avec production d'acide et on a pu identifier l'acide gluco- nique.
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Rêtuct;1.on des nitrates négative Liquéfaction de la gélatine : généralement négative, mais une liquéfaction lente peut se produire avec certaine .OU- ches.
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: hydrolyse de l'urée < négative.
Production d'une ce;tia8'.
Wbodùation d'une Pas d'utilisation d6 l'hydrogène.
Température optimale 25 C.
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pG. optintaà pour la croissance t ',0 à 8,5.
Source-, terre de l'état de Iowa.
Habitat ! les sols terreux.
Il convient de noter qu'une identification plus récente effectuée dans les laboratoires de la demanderesse montre que l'
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organisme est probablement un "arthrobacter" plutôt qu'un mcrococ eus et ressemble étroitement à l'"Arthrobacter ur,safacens". Les qualités indiquées ci-après indiquent les raisons pour cette iden- tification préférée detL'organisme comme arthrobacter
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Miorocoocus "M.Cerificans" Jlrthrobacter Tous sont gram-n6ei- Toujours gram- Gram-négatif ou variable
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<tb> tifs <SEP> dès <SEP> le <SEP> début:
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Pas de changement,de "' Des cellules coccol4es dimension us ran es ue a itu..
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Comme on l'a indiqué, on injecte en continu de l'air . dans la culture, de préférence au fond du. récipient defermenta- tion, par un tube distributeur ou un autre dispositif mécanique pour produire des bulles fines de l'air.
Comme on l'a mentionné, on agite de préférence le réacteur au mayen d'une pale ou d'un autre dispositif pour répartir complètement l'oxygène dans tout le milieu de culture. On peut, par exemple, utiliser un agitateur à pale ou plusieurs agitateurs d'une force de 1 à 100 chevaux et de préférence de 5 à 30, pour 3785 litres de milieu de culture liquide.
La vitesse de l'agitation avec 'un agitateur à pale est de préférence supérieure à 1000 tours/minute et même 1500 tours/ minute,. pn utilise de préférence une aération tourbillonnaire, c'est-à-dire un cylindre vertical, qui s'étend depuis juste sous ., la surface du liquide jusqu'au tond du récipient, pour obtenir, un meilleur mélange et enlever la pousse,qui se forme à la sur- face du liquide par fementation et la ramener à travers le tube jusqu'au fond de ce récipient.
La source d'azote peut être constituée par un dérivé organique ou minéral contenant de l'azote. Parmi les produits organiques, on peut mentionner les protéines, les protéines.hydro... lysées par l'acide, les protéines digérées par une enzyme, les mono-acides, l'extrait de levure, l'asparagine et l'urée, Pour des raisons d'économie, on préfère habituellement utiliser un composé minéral, comme l'ammoniac, ou des sels d'ammonium, comme le phosphate d'ammonium, le citrate d'ammonium, etc. Un procédé très pratique consiste à introduire l'azote sous forme d'ammoniac. '
De cette façon, on obtient un pH compris entre 5,5 et7,5 et la quantité d'azote nécessaire. A cet effet,- on peut aussi faire bar- boter directement dans la culture de l'ammoniac gazeux.
Selon une variante, on peut ajouter de temps en temps un acide ou une base supplémentaire, si cela est nécessaire, par exemple de l'aci-
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de sulfurique.On note que le procédé de l'invention n'exige pas des stimulants coûteux pour la croissance, tels que des vitami-
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nes, etc.
En plus de l'énergie del'agitation et des sources d'azo- te, le milieu éxige également des quantités critiques d'agents nutritifs minéraux sélectionnés pour porter la sélectivité au maximum. Ainsi, la présence de potassium, de soufre et de phos- phore est nécessaire. On peut introduire ces éléments sous forme de sels , par exemple le potassium sous forme de chlorure, de phos- phate, de sulfate, de citrate, d'acétate, de nitrate, etc. Le soufre et le phosphore sont fournis sous forme de sulfate ou de ' phosphate, par exemple de phosphates de métaux alcalins ou d'ammo- nium.
Les quantités critiques préférées des produits minéraux servant à obtenir le maximum de sélectivité sont les suivantes (les quantités pour les diverses concentrations cellulaires étant obtenues par multiplication avec le pourcentage particulier)
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<tb> pour <SEP> la <SEP> croissance <SEP> de <SEP> 1% <SEP> le <SEP> milieu <SEP> aqueux <SEP> pour
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<tb>
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, , eoles des cellules HPC P quoi - z.,0 0,05 - 0,25 Na2S04 S et Na o,01 - 0,5 0,025 - 0,05 KOI X et Cl 0,01 - 0,05 0,05 - 0,10 MgS04 Mg 0,005 - Q.5' 0,02 - 0,05 ceci2 Ca 0,
005 - oe5 0,02 - 0,05
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<tb> En <SEP> outre, <SEP> les <SEP> produits <SEP> minéraux <SEP> ci-après <SEP> sont <SEP> également
<tb>
EMI15.7
nécessa;ipes, mais leurs quantités sont moins critiques,
EMI15.8
<tb> Brodait <SEP> minéras@ <SEP> laide <SEP> % <SEP> préféré <SEP> de <SEP> sol <SEP> Poids <SEP> % <SEP> particulièrement
<tb> pour <SEP> 1% <SEP> en <SEP> poids <SEP> de <SEP> préféré <SEP> de <SEP> sel <SEP> pour <SEP> 1% <SEP> en
<tb> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> cellules <SEP> poids <SEP> de <SEP> cellules¯¯¯¯¯
<tb>
EMI15.9
9es0y Fe Obool - 0,1 0,005 - 0,02 Mna 4 min 0,001 - 0,1 0,005 - 0,02 Dans ce qui précède,
les ions indiqués introduite noua forme d'autre sels et en des quantités stoechiométriquement iden-
EMI15.10
tiques (établies par taleul) peuvent aussi Otre utilisée, mais moins prée6rables.
<Desc/Clms Page number 16>
On doit fournir de l'azote supplémentaire nous forme
EMI16.1
d'un seul, d'ammoniac, d'un sel d'ammonium ou d'hyùox;y4e dtammo- nium, ce produit étant de préférence l'hdrnrs 4''''.', une quantité de 0,08 à 0,20 et mieux encore de.0,1 à 0,15 gr d'azote par gr des cellules sèches produites.
On peut faire varier la température de la culture entre
EMI16.2
environ 20 et 45 0, de préférence entre 25 et 4000* Pour mainte- nir la température appropriée, il est généralement nécessaire de chauffer la masse pendant les premiers stades du démarrage, tandis
EMI16.3
qu'au cours de la culture, on observe un déga<gnt de chaleur dans celle-ci et on peut alors avoir besoin de refroidir peur maintenir la température désirable. On réalise économiquement ce à travers un réfrigérant ou en utilisant des serpentins
EMI16.4
refroidissement en recyclant le produit/de etoid18.ement dans le réacteur, comme mentionné ci-dessus.
La quantité de l'hydrocarbure qu'on introduit (y com- pris le recyclage) par rapport au milieu aqueux salin (y compris
EMI16.5
NH40H) se monte à lu 10% en poids, de préférence de 1 à 5% en poids et mieux encore à 0,5 à 2% en poids, quand on utilise de ' l'air.
EMI16.6
Le temps de séo\1\J' à l'état liquide pour 4a beerie préférée, qui est le "Merocacue coriftoa4jîu (.\)e.cteJd. otet:!p...' à-dire le volume de liquide dans le réacteur divisé par la quan-
EMI16.7
tité des produits de charge introduits (ainsi. que des preduita retirés pour maintenu un 4yMag liq4de' e mps le ,*40c- ' , teur) par' heure se zotte f8 g.éiLiJ141 ,- J,"4r.:t 4te plité- renC;8 de 1 à 3 beQe4l1 et f;è\1Z eao ';
,f,e 4pmmo* ces temps de séjour pr#tfiq9éà aâiprsat nµ% hayÀyi0#À, 3@> ,#b0a%1#1µfj, mais réduisent a spi te besoin d' X:V:$èn, ,;.' 1 La ni.* n ':peuvre de 5.'li.nv.tion q#qa mieux comprise
EMI16.8
Ajou%é, mo>s, b. 1'"aide des aixemptes non limitatif décrits 3-arès. àpprôUvµ1j% , 1
<Desc/Clms Page number 17>
EXEMPLE 1 Effet des différentes charges sur le rendement en bactéries et la croissance animale.
EMI17.1
on produit la croissance du Micrococcus cerificans sur un milieu aqueuse salin contenant une fraction de gas-oil "Lirik" comme seule source de carbone.
On recueille par essorage lea cel- lules produites et on les lave Une fois avec de l'eau, on les centrifuge & nouveau et on les lave deux fais avec de 1'acétone,
EMI17.2
puis on 3s sá par Illtration., On obtient les résultats ei- après 'qui µrHVi1Énmt de,l'utilisation'des cellw-' ' les de bat; coe seule noitot P"téïne pour la nourrie turc de wà%0 ïolo4 11 çjai 4 1 èwaéuatiëtl de la praté.nr . ,erit dans l'ouvrage "Officiai Méthode of analysis, 96 édition, 160 Sec. 39.133 (e)"et (t), Dans cet essai, l'échantillon en quoâ- tion est ajoutés une nourriture de façon que celle-ci aontion- ne 9,09% de protéine.
On maintient les rats à ce régime pendant quatre semaines; On note chaque semaine l'augmentation de poids et la consommation de la nourriture. Le poids gagné par unité de nourriture consommée est calculé à la fin de la quatrième semaine , et on compare le résultat avec celui d'un essai témoin, dans lequel la caséine sert de source de protéine. Pour chaque essai à la caséine et avec l'échantillon, on utilise dix rata.
EMI17.3
<tb>
Produit <SEP> de <SEP> charge,Poids <SEP> % <SEP> Rendement <SEP> , <SEP> Valeur <SEP> nutritive <SEP> biologi-
<tb>
<tb>
<tb> paraffine <SEP> en <SEP> que <SEP> (caséine <SEP> - <SEP> 100) <SEP> mé-
<tb>
<tb>
<tb> cellules <SEP> thode <SEP> de <SEP> croissance <SEP> des
<tb>
<tb>
<tb> rats
<tb>
<tb>
<tb> Gas-oil <SEP> "Lirik" <SEP> 60 <SEP> 59 <SEP> 59
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cire <SEP> melle <SEP> 76 <SEP> 97 <SEP> 53
<tb>
EMI17.4
Hexadécane 100 105 76
On peut-probablement attribuer l'amélioration de la va- leur nutritive au.fait que les résidus hydrocarbures n'ayant pas
EMI17.5
réagi du ga8-il qt de la cire molle inhibent la croissance des animaux, tandis que les paraffines pures ou relativement pures (c'est-à-dire purfiées comme indiqué au cours de la présente des- cription)
ne présentent pas d'effet contraire. Cela est illustré
<Desc/Clms Page number 18>
par les résultats expérimentaux supplémentaires indiqués ci-après.
On concentre les lavages acétoniques du. gas-oil "Lirik" en chas- sant l'acétone par ébullition d'abord à la pression atmosphérique, puis sous vide. On extrait le résidu huileux avec du NaOH à 5% pour enlever tous les acides organiques', on soumet la fraction neutre à l'analyse au spectromètre -de masse et en trouvera com- position : paraffines - 31,4%, naphtène = 19,2%, aromatique. 49,4%.
On mélange alors le produit avec de la caséine type "ANRC" (American Nutritional Research Council) à raison de 1, 3 et 5% en poids et on utilise cette caséine comme seule source de pire- téine dans la nourriture des rats en évaluant la protéine selon l'essai "Official Méthode ot Analysis, è Ed., 1960, Sec.
39.133(c) et (f). De la même manière, on prépare un certain nom- bre d'échantillons à la caséine contenant 1, 3,5, 7 et 10% de praffines purifiées (avec un tamis moléculaire 5A et épuration), qui sont constituées par des paraffines'normales essentiellement pures contenant approximativement 70 parties par million de pro- duits aromatiques.
On compare la croissance moyenne des rats soumis à ce régime avec la croissance de ceux qui reçoivent de la caséine non mélangée (10 rats pour chaque essai) pendant une période de quatre semaines. Les résultats obtenus correspondent au tableau ci-après !
EMI18.1
<tb> Taux <SEP> d'hydrocarbure <SEP> dans <SEP> Croissance <SEP> des <SEP> rats <SEP> en <SEP> % <SEP> du <SEP> témoin
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> la <SEP> caséine <SEP> (poids <SEP> %) <SEP> à <SEP> la <SEP> caséine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Résidu <SEP> du <SEP> gas-oil <SEP> Paraffines <SEP> trairees
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> "Lirik" <SEP> au <SEP> tamis <SEP> moléculaire
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 77,5 <SEP> le?
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 75,
0 <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> 61,9 <SEP> 104
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 94 <SEP> '
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> 103
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Une <SEP> autre <SEP> preuve <SEP> de <SEP> l'effet <SEP> d'inhibition <SEP> des <SEP> produite
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
qu'on peut extraire à l'écatone réside dans le fait que si le
EMI19.1
Micrococcua Cersficans HO-1 cultivé sur de la cire molle n'est pas ir,v6 avec de l'acétone, il est pratiquement sans valeur comme supplément protéinique, car des rats nourris avec un produit
EMI19.2
contenant cette matière comme seule source dejprotéine ne gagnent que 15 gr en deux semaines, ce qui se monte à seulement 14% com-
EMI19.3
pa:
t'ativement à ceux qui ont reçu le témoin de caséine pendant la même période.
EMI19.4
EXEI.U?LE 2 Effet.critique du temps de séjour.
EMI19.5
On cultive en continu le Micrococcus cer-iticans dans le milieu ci-après t Grammes/litre
EMI19.6
<tb> Cire <SEP> molle <SEP> 10-20
<tb>
EMI19.7
"Spann 60 - Tweens 60" 0$6-li2
EMI19.8
<tb> H3PO4 <SEP> 5
<tb> KCl <SEP> 1
<tb>
<tb> CaCl2 <SEP> 0,5
<tb>
EMI19.9
"SS04'7"ào .0,2 UnS0y.4Ez0 0,2 FeSO4-7112 0,2
EMI19.10
<tb> NaCl <SEP> 0,2
<tb>
On ajoute la quantité nécessaire de NH4OH concentré pour régler
EMI19.11
le Pu à 7- Les produits nutritifs ci-dessus sont dissous ou dis-
EMI19.12
POrOde dans de l'eau de ville pour obtenir au concentrations dêgi- rées,
EMI19.13
On maintient la température de réaction 3000 et on effectue la fermentation dans un appareil type "New F3runsxilc" de 7,5 litres présentant une capacité utile de 4 litres. Le débit d'introduction de l'air et la vitesse de l' agitateur sont réglés
EMI19.14
de façon à obtenir une efficacité de l'aération de 3t5 à 7*0 mil- limoles Uz/'2.tra/minute! mesurée par le procédé d'oxydation du
<Desc/Clms Page number 20>
sulfite de Cooper et Fernstrom (Ind. & Eng.Chem. 36, 405-509 (1944).
On fait varier le temps de séjour dans l'appareil de fermentation entre 1,3 et 4,0 heures, les résultats étant les ' suivants !
EMI20.1
<tb> Temps <SEP> de <SEP> séjour <SEP> Sélectivité
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (heures) <SEP> Poids <SEP> % <SEP> de <SEP> cellules <SEP> séchées <SEP> par <SEP> rapport <SEP> à <SEP> la <SEP> ci-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> neures <SEP> re <SEP> molle <SEP> transformée <SEP> en <SEP> des <SEP> cellules <SEP> et <SEP> en <SEP> CO2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,0 <SEP> 107
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4,0 <SEP> 102
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,0 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,0 <SEP> 128
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,0 <SEP> 134
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,0 <SEP> 133
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,0 <SEP> 121
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1,
3 <SEP> 138
<tb>
On doit noter que cette amélioration est importante non seulement en raison de la sélectivité augmentée, mais aussi le fait que l'amélioration de 30% réduit à la fois le besion en O2 et de 50% le besoin de dissipation de la chaleur.
On répète l'expérience en utilisant une paraffine nor- maie pure, par exemple le n-hexadécane., et on effectue les ana- lyses pour déterminer l'hydrocarbure n'ayant pas réagi au moyen de la fractométrie à l'état de vapeur. Dans ce cas, il est pos- sible de calculer les sélectivités en % nets de produits formé par unité d'hydrocarbure consommé. Ces résultats sont les suivante
EMI20.2
<tb> Temps <SEP> de <SEP> séjour <SEP> Sélectivité
<tb> (heures) <SEP> (poids <SEP> % <SEP> de <SEP> cellules <SEP> sèches <SEP> par <SEP> rapport <SEP> à <SEP>
<tb> l'hydrocarbure <SEP> consommé)
<tb>
<tb> 4 <SEP> 105 <SEP> ¯ <SEP> 2
<tb>
<tb> 2 <SEP> 116 <SEP> + <SEP> 6
<tb>
Chacune de ces valeurs représente la moyenne de 5 à 6 semaines.
EXEMPLE 5 Importance critique du débit de l'air.
On cultive du Micrococcus cerificans comme indiqué dans
<Desc/Clms Page number 21>
l'exemple 2 en utilisant une concentration de cire molle de 20 g/litre. On fait varier dans deux expériences la vitesse de l'agitateur et le débit de l'air, les résultats étant les sui- vants :
EMI21.1
<tb> Efficacité <SEP> Séjour <SEP> Débit <SEP> Poids% <SEP> d'hydro- <SEP> Vitesse <SEP> % <SEP> de <SEP> cellules
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'aération <SEP> dans-le <SEP> d'air <SEP> carbure <SEP> par <SEP> d'agita- <SEP> par <SEP> rapport
<tb>
EMI21.2
(millimolat réacteur (VIVI rapport au ai- tion à la cire
EMI21.3
<tb> 0/litre/ <SEP> (heures) <SEP> min) <SEP> lieu <SEP> aqueux <SEP> (tours/ <SEP> ajoutée
<tb>
EMI21.4
min) salin minéral min ¯
EMI21.5
<tb> 4,8 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 1200 <SEP> 44,4
<tb>
EMI21.6
7,0 4. 1,5 2 1400 98,i EXEMPLE 4
EMI21.7
Effet du temps de séjour réduit sur l'utilisation de os ot1- 1 dégagement de chaleur.
On effectue des fermentations en continu selon les exemples 2 et 3 dans des conditions identiques,sauf le ternes moyen de séjour dans le réacteur. On opère comme ci-après :
EMI21.8
<tb> Composition <SEP> du <SEP> milieu <SEP> litre
<tb>
<tb> n-hexadécane <SEP> 10,9
<tb>
EMI21.9
H 3 P04 85ip 2,5
EMI21.10
<tb> KCl <SEP> 1,0
<tb>
EMI21.11
Na2S04' ü,5 MgS 4: 0,25 âiinS04,.HQ O,()4.
FeS44.jH4 0,04
EMI21.12
<tb> CaCl2 <SEP> 0,5
<tb>
EMI21.13
Oomplément eau de. ville que Réacteur de 7,5 litres, volume du liquide 4 litrea Débit de l'air 3,0 litre/minute pH 7,0 par addition de NH40H Vitesse'de l'agitateur 1500 tours/minute Température 35 C.
<Desc/Clms Page number 22>
]Résultats t
EMI22.1
<tb>
<tb>
<tb> Temps <SEP> de <SEP> Sélectivité <SEP> (% <SEP> en <SEP> poids <SEP> Consommation <SEP> d'oxy- <SEP> Production
<tb>
<tb>
<tb> séjour <SEP> de <SEP> cellules <SEP> sèches <SEP> par <SEP> gène <SEP> (kg/kg/de <SEP> cel- <SEP> de <SEP> CO2 <SEP> kg/kg
<tb>
<tb>
<tb> (heures) <SEP> rapport <SEP> à <SEP> l'hexadécane <SEP> lule& <SEP> sèches <SEP> de <SEP> cellules
<tb>
<tb>
<tb> consommé)
<tb>
<tb>
<tb> 1,13 <SEP> 1,27 <SEP> 0,97
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 1,30 <SEP> 0,89 <SEP> 0,62
<tb>
D'autres essais similaires donnent sensiblement le même résultat* Bien que la sélectivité et la consommation de O2 puissent varier quelque peu dans d'autre conditions, les rapports avec le temps de séjour sont toujours les mêmes.
EXEMPLE 5
A On a observé de façon répétée'avec le Micrococcus ceri- ficans et des milieux salins appropriés-(voir exemples 2 et 6) une croissance "logarithmique" dans des réacteurs de 7,5 litres agités à 1500 tours/minute avec une charge suffisante d'air pour maintenir dans le gaz sortant une presseion partielle de O2 supé- rieure à 0,07 kg/cm2. La mesure habituelle de la croissance loga- rithmique est exprimée par la concentration en CO2 du gaz sortant, qui double toutes les 45 minutes avec plus ou moins 10 minutes d'écart. Dans certains cas, la concentration des cellules est éga- lement notée et les résultats confirment la mesure du CO2. Ainsi, le temps minimal de génération pour le Micrococcus précité est de 45 ¯ 10 minutes.
EXEMPLE 6 Influence critique du milieu de réaction salin minéral.
On cultive le Micrococcus cerificans par opération dis- tinctes dans des flacons de sacouage d'Erlenmeyer de 500 cm3 con- n tenant 50 cm3 de liquide sur une secoueuse rotative tour ant à 250 tours/minute, avec un temps de fermentation de 70 heures pour le n-hexadécane.
<Desc/Clms Page number 23>
EMI23.1
<tb>
NaNO3 <SEP> G/LITRE/2,0
<tb>
EMI23.2
KaHi,4, 110 MgS04-7H2o 0,5 ?8<:SO) 0,01 .MnC124H20 0,008
EMI23.3
<tb> ZnSO4.H2O <SEP> 0,002
<tb>
On règle le pH à 7,2 avec de l'acide chlorhydrique 1 N. On ob- tient une concentration des cellules de 2,0 mg/cm3, ce qui indi- n .
EMI23.4
que dans ces conditions un rèfe11lent de 12,9% par rapport à la quantité d'hexadécane chargé. Quand on augmente la concentration
EMI23.5
de NelïO3jusqu'à 12 g/litre, la concentration des cellules aug- mente 4 4,5 mg/cm3 pour/un rendement de 29%. Dans des conditions identiques, on obtient avec le milieu indiqué dans l'exemple 2 des concentrations des cellules de 9,4 mg/cm3 et.un rendement dd 60,6%.
EXEMPLE 7
En utilisant les conditions del'exemple 2, un temps de séjour de 2 heures, on cultive le Micrococcus cerificana sur du n-hexadécane avec environ 1 à 2% en poids de celui-ci et de l'air. ainsi que de l'oxygène pur 'comme sources d'oxygène. Pour un taux de 1% d'hydrocarbure, l'utilisation de l'oxygène pur ne produit guère d'effet.
A un taux d'hydrocarbure de 2%, l'oxygène pur amé-
EMI23.6
liore cependant de façon significative l'utilisation de 1 hydrocar bure comme l'indique les résultats ci-après.
EMI23.7
<tb> r
<tb>
EMI23.8
Concentration Boqhe 2 Sélectivité (gr de col- Conversion de n-hexadécane Iules/sc,6 transformé) 1'hexadécane (R!litre) ¯¯¯¯¯¯¯L ¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI23.9
<tb> 9,3 <SEP> air <SEP> 1,14 <SEP> 96
<tb>
EMI23.10
10,9 0a 1,20 91
EMI23.11
<tb> 19,1 <SEP> O2 <SEP> 1,13 <SEP> 85
<tb> 19,1 <SEP> air <SEP> 1,12 <SEP> 73
<tb>
Il est bien entendu que l'invention n'est aucunement limitée aux exemples particuliers dédits ci-dessus et qu'elle peut recevoir de nombreuses modifications et variantes sans qu'on sorte de son cadre.