BE668563A

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Info

Publication number: BE668563A
Authority: BE
Priority date: 1964-09-22
Filing date: 1965-08-20
Publication date: 1965-12-16

Description


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  "Composition   à   base   d'extrait  parotidien à action anti-trypsiques, utilisable en particulier comme   cicatrisant"   
La présente invention a pour objet une composition thérapeutique possédant des propriétés inhibitrioes vis-à- vis de la trypsine, utilisable en particulier comme oica- trisant et reconstituant cellulaire. 



   Cette composition est caractérisée en ce   qu'elle ,   contient, à titre de principe actif, un extrait de parotide de mammifère, constitué par un mélange de polypeptides so- luble dans l'eau en milieu acide ou neutre,   préoipitable   par l'acétone et de poids moléculaire moyen inférieur à 10.000. 



   Les polypeptides constituant l'extrait sont identi- fiables par leur hydrolyse en acides aminés en milieu très acide, par les différentes réactions générales des polypep- 

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 tidoa t ultracxtriudati.on, éleotrophorèse, chromatographie et par les réactifs classiquose -toile la Ninhydrine, Il sont stables en-milieu, Elcidf. -ou nnttre! non déna , tur6a par l'alcool et p'r un chauffage a. 50"0, Ils sont facilement précipitables on milieu, neutre ou légèrement .acide, non xeulotaent pur l'acétone, mais également par l'alcool. 



  Outre les caractéristiques phyuioo-ahiniques énon- cées oi-dessus, le procédé de préparation de l'extrait paro- tidien permet de caractériser ce dernier, 
Ce procédé consiste en l'extraction   d'une   pulpe des- séchée et   dégraissée   de parotide par un miliou aqueux acide de pH inférieur à 3 contenant, une concentration on alcool   éthylique,   ou autre agent de précipitation des protéines 
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 xupéric s, au. moins 5Lnle à 66 environ, suivie de pi-6ci-   pitation     acétonique   ou   siwilaire   do la solution aqueuse   ob-   tenue et préalablement concentrée et de purification du précipitée 
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 On examinera plus on détail ci-dosoous les différents stades du procédu.

   !w départ, la glaride parotide d' un Dam- mifëro, boeuf par exomple, est hachéo et d68r,-ise(o 6J:'os- aiér1ment. On procède alors à lE déshydratation et au dé- graissage on mettant on contact la glande hachée avec de l'acétone ot en renouvelant l'opération avec de l'acétone ou un solvant chloré.

   La pulpe obtenue est ensuite   extraite,Le   pH très bas du milieu d'extraction est destiné à assurer la 
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 solubiliaction des polypeptides de poids moléculaire infé- rieur à 10.000 cherchés, cependant que la forte concentra- tion en   alco 0   1 ou agent similaire réalise la précipitation des polypeptides supérieurs et notamment de toutes les pro-   téines   de poids moléculaire supérieur à   20,000.Le   pH acide 

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 désiré peut âtre obtenu par l'acide acétique ou autre   acido   
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 volatil , L'extraction est effectuée à teripératilve modérée non supérioure à 50.0 pour ne pas dénaturer les polypeptides. 



  La solution aqtleuse obtenue est, après filtration, évaporée sous vide, avantat1:euSemollt jusqu'au 1/3 de son volwno ori- ginal. 



   On traite cette solution   concentrée   par l'éther ou autre solvant non polaire de manière à éliminer les   lipidos   
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 puis précipite du résidu pnr nddition d'acétone le méinyrgo de   polypeptides   désiré, qui est obtenu sous forme do produit brut, 'Pour purifier co produit brut, on la redissout   dans   da l'eau   légèrement   acidulée   (pH     inférieur   à   7,5)   ot le 
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 précipite par l'aoétonu ou l'alcool.

   On peut FLisi oporQï' plusieurs precipitstiona eucovecaivos, A partir d'un kiloLraG do glande sécha, on obtiont   s irlsi   environ 4 g do produit brut ot 1 g do produit purifié 
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 après trois précipitations éthanoliqucs, L'exmplo ci-ce;sous illustre la préparation du prin- cira actif aolou 1'invention. 



  :EXJ!W.li!'l. - - Déchiqueter coupur cn laiivila très minces un kilo do parotide do boct.1 àéoerniaaéo. 



  - Traiter par deux fois quatro litres d'acétono. 



  - Séparer la pulpe et l'extraire par un mélange d'étha- 
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 noi (80 -- 3 litres 5) et d'acide acétique (2,5 nornal - 0,5 litres) pendant deux heures et demie à 50 C. 
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 - Concentrer au tiers la solution éthanolique et l'agiter avec le même volume d'éther. 



   - La solution aqueuse est   mélangea     à   l'ncétone jusqu'à pré- 
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 o ip itat .on,   - Le   précipita est dissous dans l'eau   acidulée   ot   ropré-   

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 oipité pcr l'acétone, L'extrait parotidien selon l'invention se or8ctÓrine, en ce qui concerne ses propriétés pharmaooloiquea, par sos propriétés 1111' 1:,i triaee vis-à-vis de 11' trypsine. Ces pro- 
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 priétés peuvent être mises en évidence on opérant sur un 
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 substrat tel que la 1-tosyl-e,r,.irxine-mthyloatex ou le sur- fate de protamine.

   Pour oo faire, on peut opérer comme anitt On prépare les -trois solu1ij ans suivantes s a) solution de trypsine à 10 /ml dates HOl io-3 M + C120a 1,f7 elle b) solution do ohloruro de potassium 0#2 M z91 8/1'; o) solation de }j-tosyl"Lu'8inire méthylestor (75,P. inoe) 
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 dons 20 ml de. solution (b). 
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  On introduit alors dans txr: vase à réaction 0, 5 ml de (a) et 19 ml de (b). En utilisaiit W1 pH mètre at ' 1/10OCèrao, on amené le pH avec de la potasse fil10 à etooo On ajoute 5 microlitrea de potasno IT/10 puis 0,5 ml du (0), 
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 Le moment où 10 mélange revient à pH 8,000 est pris 
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 pour temps 2éro. On ajoute ensuite la potasse par 5 micro- 
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 litres chaque fois que le pH se retrouve à pH 8,00, la 
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 dur6o à partir du. temps zéro étant déterr:lin13 ù. chaque re- prise. En. portunt en ordoru1ées les additions auocesRives de PQtan1e et en abscisses les durées correspondantes, on obtiGt. une droite illustrant la vitesse d'hydrolyse du 
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 substrat sous l'influence'de la. trypsine seule. 
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  Si à présent l' on a joute au méirneo 1' extri it I)rLro- tidien, la courbe ;?i6urat:Lve est toujours une droite mais de pente moins a,-,ceritu4oe ce qui traduit une inhibition de 1<.i trypsinG. pp:' l' e.>:trl it purotidien, En uccroissnnt ,+tl quantité d' eY;taat ,parotidieri, la courbe sliiioliiio vers 'l'axe di;? tibÉ;:1>#;>ea jusqu'à lui tr() pr:rtu.llv. L'inhibition 
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 de lil tI'Y'PSi1l0 (H3"t' sklorz totale. 

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  Ce test peut servir au dosage de   l'extrait   parotidien 
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 en unités anti-trypsiques, 41;e unité ±1nti-trypsiqe étant définie arbitrairement   cornue   la quantité d'extrait néces- saire pour inhiber   0, 625   Gammas de trypsine pure, 
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 Des propri6tés anti-trypsiques de l'extrait paroi- dien, qui, v'avorisa la reconstitution cellulaire, déoou-   lei.t   l'indication de choix do la   composition   solon l'in- vention en   trrit   que cicatrisant. 



   Dans cette indication, la composition est formulée pour   l'application   locale, le principe actif étant associé aux véhicules et excipients propres à ce mode   d'application,   C'est ainsi que la composition peut étre formulée en crèmes 
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 dermiç,uos,, porurudca, onguents, solutions, suspensions 3t aérosols.

   Une concentration avantageuse en principe actif dans ces diverses formulf-tions est celle correspond: ut si une {;C1nuna de 10 au, 1000 unités aiiti-trypsique par Lrainie, Une à t..'ois applicationa qll.oticlierJ1CS de la composition ur les surfaces à traiter r.o:ct.tuant ,tsncxlonezt une poealo- sie satisfaisante, On l'''X>P01''\;C3:r(1. oi-de:.:uk:, Ü.rJ3 oosarvotions oliniguos mettant or. lus vermr, uablon propriétés 01 catrisan- tos du. présent rn!3dioamont. l') Observation '- liri, Vooos l'nurioe pipieo pur bruuxori au bistouri élocbriquo " falado ayant été bxCi7,e par inflamma'" tien d'alcool iodé au contact d'un bistouri électrique - Brûlures au 2  degré- Guéri après 3 applications de pom- imide. 
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  2*) Observation - Mime Do,,* Anne - Malade souifrant d'une fistule anale, non cicatrisée après 3 ncmi;inox - Une seule application aboutit   à   la cicatrisation. 

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  5  ) Observation - Mme bi .... Yvonne : Bacarres provo- quées par lui, contention d' un plâtre s,-r une fracture de la jambe - Une saule application *boatit à lu Laérison, 4*) Observation " Enfunt B .... Madeleine : panics de la m;,in par coupure - Une seule application - cicf.tric:lt1on 
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 au bout de 24 heures. 
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  5   ) Observation - Ylne 3 .. , Marie - 65 ans - R6mipHgie r3ucxie . Ulcère vai'iqaeax - $ applications par jour - Gut- rison in 2 mois, 6  ) Observation - Urne Y... Odette 49 alise ulcère vari- queux - 3 applications p4r jour - Gu-eriaon en 6 semaines. 



  7  ) - observr tion - Mmo B... Renée 51 anx - 3saarres do decub.tus installées depuis 1 mois - 3 applications - Cica- trisation complète i,,a boa.t du grr, jour, 80 , Observation - Enfant 0..., Yonique - 6 nnS bruloo par vrpour d'c.'iu sur une étendue de 15ni, (faooa interne ut externe dos doux jambon et du. oou.-de-picd) '- Une evtllo np- p7..caion a panaocient renouvela n.u bout do 6 jours - 010"'-" trisn:t1.on oomplëto "' L" mr'lrda cet reyirtis enfla aucun po..m1\.:n1unt.

Claims

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RXIE±lWIcàfllI01IS 1, - Composition à action antitrypsàg ae utilisable EMI7.2 en particulier couse cicatrisant, ladite composition étant caractérisée en ce qu'elle contient, à titra de principe EMI7.3 actif, un extrait de parotide de maanifère, constitua par un m6lariGe àe polypeptidea soluble dans l'enu en milieu acide ou neutre, pxc>cipi-:114 p..a, l'acétone et de poids mo- léoula ice moyen inférieure 10,000.

2. - Composition selon la revendication 1, cerecté- risé 4!. ce que la principe fictif résulte de l'extraction d'une pulpe desséchée! ost c;rs.ssc:o da parotide par un mi- lieu aqueux acide t e pH ilLf,:rleu.r . 3 contc3nrtt une concon- tration en alcool étilyliqtte, ou nut*rc aiiit de pe6cipit,ition des pi'otéini;s supérieures, au moins égale a 66f environ, suivie de prlci'J:Jit:..,'r.iol.L a.H01.iqu.e ou similaire de la solu- tion aqueuse o1:;1.ulJUO et pr&rÙ:tl1181!!ent concentrée et de pu- riïicr tion du précipité.

3. - Coùjiosiuion selon le rc-venlictition 1 ou 2, r.;rt - téris6o mi Ci: que lo principe actif nE3't un extrait do pc<ro- EMI7.4 tide de bovin; 4. - Composition selon l'une quelconque dos revendi- EMI7.5 cations précédente"; caractérise: en c, qu'elle est formulée pour l'application ,océilee le principe r.ctif et.' nt associe aux véhicules at 0: t..' ipiohts usuols propres à co mode d'rp- plioation.

5. - Composition selon l'lUll quelconquo dou r(lvc,>ndiop- tiOlS précédentes, caractérisée on ce qu'ollu ost formulée en crèmes d.rmiquoi3, po,;-1and<n, cxl.4nt, solutions, suspen- sions et r:rosul;7.

6. - Composition solon l'unu quelconque d....o rc'vundi- cations préc±ù,;i,t,¯à-, caractérisée en oc qu'ulifj contient du 10 à 1.000 unitt's mti--'Lryp..iquu.j de principe t.otif prr h- <Desc/Clms Page number 8> gramme, l'unité antitrypsique étant définie comme la quanti- té de principe actif nécessaire pour inhiber 0,625 gammas de trypsine pure, 7.

- Procdé de préparation d'un extrait de parotide de mammifèro, caractérisé en ce qu'il consiste à convertir la parotide en pulpe, à déshydrater et dégraisser cette pulpe, à extraira cette pulpe par un milieu aqueux rcide de pH inférieur à 3 contenant une concentration en alcool éthy- lique ou autre agent de précipitation dos protéines suspé- rieures, au moins égale à 66% environ, à concentrer la solu- tion, à précipiter de cette solution l'extrait de parotide cherché au moyen d'acétone ou produit similaire et à puri- fier le précipité obtenu.

8. - Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que la parotide est une parotide de bovin, 9. - Composition à action anti-trypsique, utilisable en particulier comme cicatrisant, en substance comme décrit en se référant à l'exemple.

10. - Procédé de préparation d'un extrait de parotide de mammifère, en substance comme décrit en se référant à l'exemple.