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"Médicament à base de polypeptide de thyrocalcitonine".
La présente invention a pour objet une substance nouvelle présentant en particulier un intérêt physiologique pour le traitement de l'ostéoporose et des Etats- voisins.
La demanderesse a trouvé qu'il est possible d'obtenir, à partir de la glande thyroïde, un polypeptide manifestant une action marquée sur les os. Cette substance est désignée ici sous le nom de polypeptide de thyrocalci- tonine. Elle ne semble se produire dans la thyroïde que sous forme d'un complexe avec d'autres polypeptides, pro- téines ou matières macromoléculaires, mais elle peut en ' être facilement libérée comme on le décrit ci-après:.
La nouvelle substance a les caractéristiques suivantes :
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Le nouveau polypeptide de thyrocalcitonine peut être caractérisé, par son activité biologique, en ce qu'il provoque une diminution marquée du calcium et du phosphore du sérum des animaux expérimentaux, et également par ses caractéristiques chromatographiques sur une colomme Séphadex qui indiquent que son poids moléculaire est compris entre 7000 et 10 000. Sur une colonne Séphadex G-75 (une dextrane reticulé avec l'oxyde d'éthylène, solide commercialisé par A.B.
Pharmacia de Uppsaala, Suède), on élue là nouvelle substance avec un tampon d'acétate d'ammonium à un pH de 4,7 et avec un dé- bit de 21 ml à l'heure, en utilisant toutes les 17 minutes, des fractions de 6 ml; la nouvelle substance se trouve princi- palement dans les fractions 65 à 140. On donne plus bas les détals de cette méthode et l'histogramme qui en résulte est représenté à la Fig; 1; le pic IV est celui qui. contient la plus grande partie de polypeptide de thyrocalcitonine.
La chromatographie sur une colonne Séphadex G-75 effectuée dans les conditions ci-dessus présente les carac- téristiques suivantes: un pic, tubes allant de 80 à 110 contenant spécifiquement de 20 à 30 mg de produit qui dimi- nue de 1,5 mg % la teneur en calcium du sérum avec une dose de 50 microgrammes, et un quatrième pic moins élevé, tubes 105 à environ 140, contenant spécifiquement de 4 à 18 mg de produit qui diminue de 1,8 à 2,5 mg % la teneur en calcium du sérum avec une dose de 50 mierogrammes. Ce dernier pic est lié plus étroitement à la thyrocalcitonine pure ; pour-tant le produit du premier pic est suffisamment pur pour être utilisé.
Le polypeptide de thyrocalcitonine peut également
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être caractérisé par ses caractéristiques chromatographiques sur une colonne de carboxyméthyl-cellulose à l'aide d'élue tions à gradient' linéaire aveo de l'acétate d'ammonium à un pH de 4,6 et à l'aide d'un gradient linéaire de concen- tration de 0,02 M à 0,5 M. Avec une colonne de 50 cm x 1 cm et un débit de 0,5 ml/minute et en prenant 50 des fractions de 3 ml, le principe actif est contenu dans un pie compris entre les fractions 6 et 10 incluse.
La demanderesse a démontré que la thyrocalcitonine' de porc provoque une diminution de la teneur en calcium et en phosphore du sérum d'un rat intact, et diminue les excré- tions de calcium, de magnésium et de phosphore chez le rat intact et chez le rat privé de thyroïde et de parathyroide.
L'augmentation de la teneur en calcium, phosphore et magné- sium des excrétions obtenue par l'administration d'hormone . parathyroidienne purifiée est annulée par l'administration simultanée de thyrocalcitonine. L'hypercalciurie est tota- lement surmontée par administration simultanée de thyrocal- citonine et d'hormone par4thyroidienne, tandis que l'hyper- phosphaturie et l'augmentation des excrétions de magnésium . sont seulement surmontées en partie, ce qui suppose que la thyrocalcitonine inhibe l'action de l'hormone parathy- roidienna sur les os,mais non son action sur les cellules des tissus non-$osseux,
L'augmentation de l'excrétion d'hy- droxyproline provoquée par l'administration d'hormone part- thyroïdienne est supprimée par l'administration simultanée de thyrocalcitonine et d'hormone parathyroidienne. La mobi- lieation provoquée par l'hormone parathyroidienne de Ca45 et de Sr90 des os de rata intacts marquée au préalable, 60 à 90 jours avant les essais, au Ca45 ou Sr90, est également
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supprimée par l'administration simultanée de thyrocaloitonine et d'hormone parathyroidienne. Ainsi la thyrocalcitonine
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e,emble agir en empêchant la résorption osseuse et en empe- chant l'action de l'hormone parathyroidienne sur la résorption osseuse.
Bien'qu'on obtienne ordinairement l'activité avec
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une dose de 50 mîcrogrammes par animal, une courbe en fonc- tion de la dose du produit purifié, a montré que des doses
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inférieures à 5 miorogrammes ont un effet important.
Le'nouveau principe actif eat donc particulière- ment utile dans le traitement des états où la résorption essëuse est excessive. La substance purifiée est beaucoup plus efficace que l'extrait brut de thyroide dans lequel se produit le complexe protéinique et elle ne présente pas les effets secondaires dus aux autres protéines et polypeptides présenta dans l'extrait brut de thyroide.
La nouvelle sub- stance est, ainsi particulièrement utile dans le traitement de l'ostéoporose, y compris l'ostéoporose idiopathique et
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l'ostdoporose poot-mênopauae et,en particulier, l'ostéopo.. rose provoquée par l'adoinistraion de etéroides pour le traitement d'autres maladies, tels que l'administration de
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cortisone, de cor.tiaol, de prednisonet de prednisolone, de miidrol, de triamcinolone, de dexamèthaconst de bétamta80n, m<Sdroi, <ri-in0iOn-, roduit etc. On peut également utiliser le nbuveau7 de l'invention à titre préventif. pour le traitement des ostéoporoses eze. ni1es, pont-m(Inopauae et celles dues aux àtéroîdes.
Il trou- ve également son utilité en général dans le traitement de l'hyperoalcüm1e et dans le traitement de l'hypercalciurie, y compris pour empêcher la formation de calculs rénaux.
Le nouveau prinoipe actif selon l'invention est
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-très actif à des doses aussi faibles que 0,1 mg. On pré- fère utilise des doses journalières comprises entre 1 et 10 mg ou même supérieures, par exemple des doses de 5 à 20 mg 2 à 3 fois par semaine. C'est ainsi que, par exemple, dans le cas d'un':homme pesant 55 kg, on note une diminution de la teneur en calcium dans le sang aveo une dose intra- veineuse de 2 mg de polypeptide de thyrocalcitonine et une diminution beaucoup plus importante avec une dose de 5 mg.
Il est donc préférable que le polypeptide de thy- rocalcitonine soit formulé en doses unitaires contenant de 0,1 a du mg ue principe actif, et de préférence de 1 à 10 mg. En général, on utilise un support ou un excipient phar- maceutique et, dans ce cas, on administre de préférence le , médicament de l'invention par injection. Le véhicule du mélange est de préférence un fluide injectable, stérile, acceptable par voie parentérale, tel qu'une émulsion hui- leuse, une huile stérile, ou de-l'eau stérile exempte de pyrogène. On préfère utiliser les préparations ou le vé- hicule ou l'excipient,prolonge l'aotion du polypeptide.
C'sat ainsi que le véhicule contient avantageusement de la gélatine aqueuse ; l'utilisation de gélatine partielle- ment hydrolysée est particulièrement appropriée dans le produit cas d'injections contenant un dépôt. Le nouveau/ peut également être adsorbé par un adborbant, acceptable par voie parentérale, par exemple, l'hydroxyde de zinc, ou encore être additionné à du chlorure de zino et à de la globine; la globine est facilement obtenue à partir d'hy- drochlorure de globine provenant de sang de boeuf.
Les préparations aqueuses contiennent avantageusement un oon- servateur, tel que le phénol, par exemple à une teneur
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de 1% en poids; le polypeptide de thyrocalcitonine peut éga- lement être formulé sous la forme d'une poudre lyophilisée pouvant être transformée en préparation aqueuse, quand cela est nécessaire.
On prépare le polypeptide de thyrocalcitonine en traitant la glande thyroïde avec un liquide. ayant une cons- tante diélectrique élevée en vue de libérer le polypeptide de la matière complexée, puis par fractionnement en vue de . le séparer des impuretés.
Par le terme "constante diélectrique élevée" on entend des valeurs de constante diélectrique de l'ordre de
15 ou au-dessus, La glande thyroide utilisée peut être par exemple, une glande thyroïde de bovin, de singe, d'être hu- main ou de mouton ou de préférence de porc.
Le liquide à constante diélectrique élevée utilisé pour libérer le polypeotice du complexe dans lequel il est produit, est de préférence l'eau, contenant de préférence un agent de dissociation des protéines, par exemple, une solu- tion concentrée d'urée contenant avantageusement du chlorhy- drate d'urée. Ainsi, par exemple, de l'urée 8 M contenant de l'acide chlorhydrique 0,2 M est particulièrement satisfai- . sant.
D'autres liquides à constante diélectrique élevée sont les solutions aqueuses de composés hydroxy-aromatiques, par exemple celles contenant du phénol, du crésol, du xylol,etc.; une solution aqueuse d'acides minéral et organique, par exem. ple l'acide sulfurique ou chlorhydrique ou des acides alca- noiques inférieurs, tels que l'acide acétique, propionique etc. de préférence à un pH compris entre 4 et 6;
des alca- namides et leurs dérivés N,N-disubstitués, tels que le for- mamide, le diméthylformamide, le diméthylacétamide et le
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diéthylaoétamide; les diacoylsulfoxydes, telq que le dimé- thyleulfoxyde, des solutions aqueuses de sels d'amines hy- drosolublea aliphatiques, araliphatiques, aromatiques ou hétérocycliques, telles que la pyridine, la collidine, la triéthylamine, etc.
En général, il est conseillé d'ajouter un anti- oxydant dans le milieu, et des thiolo, tels que la cystéine. sont alora particulièrement appropriés.
Il est préférable de traiter la glande thyroide en vue d'éliminer la graisse, avant de la traiter avec le li- quide à constante diélectrique élevée.D'une manière commode, les glandes thyroides sont homogénéisées et extraites à plu- sieures reprises par de l'acétone froide ou autre solvant miscible l'eau pour matières grasses. On ajoute de préféren ce l'acide éthylènediaminetétracétique (AEDT) aux glandes homogénéisées lord de la première extraction, mais pas pour les suivantes.
Le résidu provenant de l'extraction finale'à l'acétode est ensuite avantageusement extrait à l'aide d'un solvant non miscible dans l'eau pour matières grasses, par exemple, un hydrocarbure ou un hydrocarbure chloré, tel que le benzine, le toluène, le chlorure de méthylène , le chloro- benzène, le chloroforme, etc. De préférence on répète paie- ment l'extraction plusieurs fois et l'excès de solvant est ensuite éliminé avantageusement, par exemple, par une extrac- tien ultérieure du produit par un solvant volatil, tel que l'acétone, suivie par un séchage, à l'air.
Toutes les opérations sont effectuées à basses températures afin d'éviter les pertes d'activité, et d'une , manière appropriée à environ 4 C.
Après avoir traité le produit pour libérer le poly-
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peptide'désiré, la.;solution de polypeptide dans le solvant à constante diélectrique élevée est avantageusement traitée avec une concentration relativement basse d'un solvant orra- nique miscible à l'eau, par exemple, une cétone miscible à l'eau, telle que l'acétone, et/ou un acide alcanoique infé- rieur, tel que l'acide acétique, ceci afin d'éliminer les peptides et les protéines à poida moléculaire élevé qui sont ensuite jetées.
On peut alors traiter la solution pour pré- cipiter le polypeptide désiré, de préférence en réduisant au minimum la précipitation dos impuretés constituées des protéines et des peptides restantes, Un agent de précipita- tion appropriée est, par exemple, un solvant éthéré, tel que le diéthyléther.
On notera que les quantités exactes d'agents de précipitation dépendront de la nature de ces agents et de la nature des autres substances présentes, mais dans' chaque cas les quantités seront choisies en vue de précipiter autant que possible le polypeptide désiré tout en rejetant les im- puretés indésirées. En d'autres termes, à chaque stade de f@ etionnement, on rucueille les fractions des substances désires à activité spécifique élevée et on rejette celles dont l'avtivité spécifique est basse ou nulle.
L activité spécifique peut être estimée à chaque stade en essay et le polypeptide, l'activité biologique du principe actif fornissant une base pour une méthode d'essai appropriée. C'est aiqui que, par exemple, le produit prove- nant d'une fraction par@culière, après une dilution appro- priée dans du sérum physicigique, peut être injecté par voie sous-cutanée à des souris ou es rats et le sang prélevé au coeur dosé après un laps de temp standard, pour en connai-
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tre la teneur en Ca et/ou en P. Les teneure normales en Ca et en P peuvent être déterminées chez des animaux témoins à qui on a seulement injecté du sérum physiologique.
Si on le désire, on peut effectuer d'autres stades de précipitation fractionnée,' par exemple, en précipitant le polypeptide à partir d'une solution d'acide acétique par l'ad- dition d'un agent de précipitation de protéi-ne, tel que l'a- cide trichloracétique. Le précipité peut être traité afin d'éliminer l'acide résiduel, puis ensuite être redissous.
Pour isoler le polypeptide/on peut le dissoudre dans un acide dilué, par exemple, de l'acide chlorhydrique 0,02 N, puis éliminer ensuite l'acide par traitement par une ' résine échangeuse d'ions basique. On obtient ensuite par luo philisation le polypeptide sous forme sèche. Même après pré- cipitation fractionnée, le polypeptide de thyrocalcitonine peut être relativement impur, et il est recommandé d'effec- tuer une purification plus poussée.- En fait tous les modes opdratoires connue pour purifier des polypeptides peuvent généralement être utilisés les fractions étant à nouveau chipsies d'après leur activité spécifique élevée.
Les modes de purification pouvant être utilisée'sont les suivants :
1 - Chromatographie sur colonne contenant un tamis' moléculaire, telle qu'une colonne Séphadex constituée de dex- trane réticulé. C'est le mode opératoire préféré. La colonne est avantageusement traitée avec une substance, telle que l'albumine de sérum, en vue de réduire les pertes de poypap- tide dans la colonne. La qualité préférée de Séphadex est
G-75, qui adsorbe les produits ayant un poids moléculaire in- férieur à 50.000 environ.
Le polypeptide est passé de préférence sur une co-
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lonne dans une solution tampon légèrenent acide, par exemple, d'acétate d'ammonium, à un pH de 4,7 et on utilise la même solution tampon pour développer la colonne. Le développement de la colonne s'effectue de préférence, relativement lente- ment, en vue de produire la séparation la plus efficace, par exemple, environ le volume d'un lit en 21 heuree.
2 - Chromatographie sur colonne contenant un pro- duit échangeur d'ions. On peut utiliser des échangeurs d'iona basiques ou légèrement acides, par exemple, les matières cel- lulosiques telles que la cellulose, la diéthylaminoéthyl-cel-, lulose ou la carboxyméthyl-cellulose.
3- Electrophorèse,'de préférence sur un milieu solide, Comme exemples de milieux appropriée, on citeras la cellulose, le chloru @ de polyvinyle, le polyacrylamide et le dextrane réticulés
4 Distribution à contre courant. ,
5 - Sédimentation.
6 - Pénétratio- et diffusion à travers une membrane
On donnera ci-dessoue, à titre illustratif et non limitatif, des exemples,de préparation du principe actif du médicament de l'invention,
EXEMPLE 1
Collection de glandes throides de chiens.
On collecte des glandes thyroïdes (poids humide de 9 g environ) pendant trois après-midis sur environ 1.500 chiens. On coupe les glandes 10 minutes environ après avoir tué les chiens et on les refroidit immédiatement dans de l'eau glacée,on les débarrasse de tout tissu, graisse, etc., on les homogénéise dans un broyeur à viande et on les refroi- dit par immersion dans un mélange de neige carbonique et
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d'acétone contenant environ 30 mg d'acide éthylène-diamine- tétracétique. La quantité totale de glandes recueillies est de 9 kg (poids humide), Préparation de poudre de glandedégraissée,
On effectue toute l'opération dans une chambre froide à 4 C.
On refroidit au préalable les réactifs, les récipients en acier inoxydable et la verrerie. On ajoute à 450 g de glandes thyroïdes homogénéisées. 1 litre d'acé- tone qualité "réactif" et 30 mg de AEDT (dans H2O), on laisse reposer pendant une heure, on homogénéisé dans un mélangeur en acier inoxydable pendant 2 minutes, à petite vitesse, et onilaisse finalement reposer le mélange ainsi obtenu pendant 15 - 25 minutes. On agite de temps en temps le mélange homogène puis on le filtre à travers 6 épais- aeurs de gaze.
On met à nouveau le produit solide en sus- pension dans 600 - 800 ml d'acétone et on l'extrait à l'acétone 10 fois de suite ( on n'ajoute pas de AEDT dans les extractions à l'acétone 2 - 10);dans chaque cas, on jette l'acétone. On extrait 6 fois le résidu, avec chaque fois 600 - 800 ml de chloroforme (qualité purifiée); on jette le chloroforme.
On extrait do nouveau 10 fois le résidu à l'aide d'acétone, on étale la poudre de glandes sur une surface propre (plateau en acier inoxydable) et on la sèche pendant une nuit dans une chambre froide, on obtient ainsi une poudre rose, 450 8 de glandes thyroidet, humides donnent 60 g de poudre sèche dégraissée. On con. serve la poudre dans un flacon en verre brun dans une chambre congelée. On extrait les 8,6 kg restants de la même façon. Rendement total s 1300 g , Technique expérimentale ¯pour isoler la thyrocalcionine.
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Toutes Ion opérations sont effectuées dans une chambre froide à 4 C.
On ajoute à 200 g de poudre de glande dégraissée séchée 2 litres d'urne 8 M et de la cystéine 0,1 N dans de l'acide chlorhydrique 0,2 N, on laisse reposer le mélange pendant une heure en agitant de temps en temps. On ajoute 2 litres d'acide acétique glacial et 2 litres d'acétone en agitant constamment et on laisse reposer le mélange pendant une heure ; ajoute ensuite 6 litres d'acétone et 56 ml de NaCl 1 N, en agitant fortement. On laisse reposer le mélange jusqu'à ce que le précipité soit complètement déposé, on le filtre à travers 4 épaisseurs de gaze et on jette le précipité.
On partage le filtrat en deux parties et on l'in- troduit dans deux flacons de 12 litres. On ajoute dans cha- que flacon 5 litres de diéthyléther exempt de peroxyde, et on laisse le précipité se déposer, On sépare par décantation la partie surnageante et on la jette.
On recueille le préci- pité par centrifugation et on le lave deux fois avec un mé- lange d'éther et d'aoétone (lil), On disperse le précipité dans 1 litre d'acide acétique à 20% (v/v) contenant de la cystéine 0,01 N et on agite le tout dans un agitateur magné. tique pendant 30 - 40 minutes en vue d'obtenir une solution au maximum .(on n'obtient pas une solution complète), On ajoute du chlorure de sodium sec afin d'obtenir une solution finale de NaC1 à 5% et on agite jusqu'à ce que le sel se dissolve complètement* Il se forme un précipite fin que l'on centri- fuge à 6.000T et on jette le précipité.
On ajoute suffi- samment d'acide trichloracétique à 50% pour former une solu- tion 7,5 % d'acide trichloracétique, puis on agite pendant
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15 minutes. Tout le polypeptide précipite de cette façon, et on recueille le précipité par oentrifugation, on le lave à deux reprises avec de l'acide trichloracétique à 5 % et encore une fois avec de l'éther exempt de peroxyde.
On dissout le produit dans 1,5 litre d'acide chlorhydrique 0,02 N et on l'extrait à trois reprises avec un volume égal d'éther exempt de peroxyde. On élimine de la solution l'éther dissous, à l'aide d'un évaporateur rotatif. On fait passer . la solution aqueuse sur une colonne (2 x 30 cm) constituée d'une résine échangeuse d'ions, "Amberlite IRA 400" (passant au tamis 4 ouverture de maille 1,19 -0,297 mm) en vue d'é- liminer l'acide chlorhydrique. On lyophilise l'éffluent et on obtient 530 mg de produit brut. On récupère encore 150 mg sur la plateau métallique et sur les instruments en verre utilises.
Essai biologique' sur le polypeptide de thyrocalcitonine brut.
On réalise l'essai sur des rats mâles et femelles pesant 120 - 130 g. On injecte par voie sous-cutané à cinq animaux témoins, 0,5 ml de NaCl à 0,2 %. On anesthésie légèrement à l'éther les animaux pour les injections. On in- jecte d'une manière similaire par voie sous-cutanée, à cinq animaux d'essai, 0,5 ml d'hormone brute ( 1 mg/ml) dans
NaCl à 0,2 %. Au bout d'une heure, on recueille du sang chez , les animaux témoins et chez les animaux d'essai par une ponction dans le coeur. On analyse dans le sérum la teneur en Ca et en P.
Fractionnement de la thyrocalcitonine brute. a - ChroMathographie sur une colonne Séphadex G-75.
On effectue toutes les opérations de fractionne- ment à 4 C. On fractionne le produit brut sur une colonne
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Séphadex 0-75 ( 3 x 150 cm). On traite la colonne avec 300 mg d'albumine de sérum, puis on continue avec un tampon '
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d'acétate d'ammonium 0,211., à pH 4,7 et à un débit de 35 40 ml/heure. On laisse la colonne se développer pendant une
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nuit, et on étudie l'êrrluent, le lendemain on trouve qu'il ' ne contient pas de protéine.
(Le développement de la colonne' à l'aide d'un tampon d'acétate d'ammonium se poursuit jus- qu'à ce que l'éffluent ne contienne plus de protéine comme
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on le détermine en mesurant ltabsorption à une longueur d' onde de 277 m dans un appareil du type Beckman DU).
L'hormone est préparée comme suit pour son utili- sation dans une colonne Séphadex on dissout 500 mg dans 7 ml d'un tampon d'acétate d'ammonium 0,2 M, on les centri- fuse à 2 tours/minute pendant 6 minutes; puis on transfère
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la partie suvageante dans un tube à essai. On met à nouveau le précipité en sUBpen,lo dans 2 ml de tampon, on centri- fuge et on ajoute la part.1 t1t surnageante dans le tube à essai.
On met l'hormone dissoute sur la colonne Séphadex et on élue à l'aide d'un tampon d'acétate d'arnmonium 0,2 M; on recueil- le des fractions de 6 ml toutes les 17 minutes. On recueille de cette manière un total de 180 fractions.
Résultats.
Essai sur l'hormone brute :
Teneur moyenne en Ca du sérum (% en mg) Animaux témoins 10,6 Animaux ayant subi une injection de 500 g d'hormone 7,9 (minimum de 2,7)
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Le résultat obtenu lors du fractionnement de la thyroaalci-
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o tonine brute sur une colonne SéPhadex G-75 est montré Pige 1* où sont représentes en ordonnées la densité du tube et en abscisses le nu- méro du tube, On lyophilise les fractions et on introduit le produit sèche dans des tubes \ essai de 5 ml, on redissout le produit et
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on le lyophilise à nouveau.
Produit recueilli après lyophi- , lisabion :
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<tb> Fraction <SEP> Tube <SEP> n
<tb>
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33-66 approximabivemenb 122 mg 2 67 - 86 15 mg '; 3 87 -107 15,7 ms 1 4 108-124 1,9 mz 5 125-160 6,9 rns
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Résultats des ennais biôleatgiie3 sur les I*raotton3 sortant de la colonne Séphadex n-75.
On injecte par voie sous-cutanée k quatre animaux ' témoins une solution oaline 1 02 %. On InJecte à des an1 maux d'essai, pour chaque fraction$ 0,5 ml d'une solution
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contenant 100 mierogrammes par ml de la fraction appropriée.
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<tb>
<tb>
Teneur <SEP> en <SEP> calcium <SEP> Différence <SEP> avec
<tb>
<tb> du <SEP> sérum <SEP> % <SEP> en <SEP> mg <SEP> l'animal <SEP> témoin,
<tb>
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¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ en mg.
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<tb>
Animaux <SEP> témoins <SEP> la,5 <SEP> . <SEP>
<tb>
<tb>
Fraction <SEP> tube <SEP> N
<tb>
<tb> 2 <SEP> 67 <SEP> - <SEP> 86 <SEP> 9,3 <SEP> 1,0
<tb>
<tb> 3 <SEP> 87 <SEP> - <SEP> 107 <SEP> 9,2 <SEP> 1,1
<tb>
<tb> 4 <SEP> 108 <SEP> - <SEP> 124 <SEP> 7,8 <SEP> 2,5
<tb>
<tb> 5 <SEP> 125 <SEP> - <SEP> 160 <SEP> 9,4 <SEP> 0,9
<tb>
<tb> Taneur <SEP> en <SEP> phosphore <SEP> Différence <SEP> avec
<tb> du <SEP> sérum, <SEP> % <SEP> en <SEP> mg <SEP> l'animal <SEP> témoin
<tb> % <SEP> en <SEP> mg
<tb>
Animaux témoins 7,6
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<tb> Fraction <SEP> Tube <SEP> N
<tb>
<tb> 2 <SEP> 67 <SEP> - <SEP> 86 <SEP> 7,6 <SEP> 0
<tb>
<tb> 3 <SEP> 87 <SEP> - <SEP> 107 <SEP> 6,6 <SEP> 1,0
<tb>
EMI15.9
4 o8 - 124 5,6 2#0 5 125 - lrio 7,6 0
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b Chromatonph1e sur de la cnboxyméthyl-cel1uloe Produit :
thyrocalcitonine de porc très purifiée (10 mg)
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<tb> Colonne <SEP> 50 <SEP> cm <SEP> x <SEP> l <SEP> cm
<tb>
<tb> débit <SEP> 0,5 <SEP> ml <SEP> à <SEP> la <SEP> minute
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fractions <SEP> 3 <SEP> ml
<tb>
<tb> Elution <SEP> gradientlinéaire, <SEP> acétate <SEP> d'ammonium <SEP> à <SEP> un
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> de <SEP> 4,6, <SEP> 0,02 <SEP> M <SEP> - <SEP> 0,5 <SEP> M.
<tb>
Le principe actif est contenu dans le pic 1 (tubes 6 à 10) (4,75 mg). Le pic 2 (tubes 12 à 15)(2,3 mg) présen- te seulement une faible activité.
Activité, pic 1 : 50 microgrammes abaissent la
2 : 50 teneur en calcium du sérum de 1,8 % en mg ; pic 2: 50 microgram mes abaissent la teneur en calcium du sérum de seulement en ordonnées 0,5 % en mg. Un graphique d'absorption à 277 m en fonction en abscisses du numéro des fractions/est représenté à la Fig. 2.
Le procédé de séparation de l'exemple 1 est appli- que également pour isoler la thyrocalcitonine d'une poudre acétonique de glandes thyroïdes de bovins et d'êtres humains.
EXEMPLE 2
On dissout 200 g de poudre de glande thyroïde de chien, séchée et dégraissée, préparée comme décrit dans l'exemple 1, dans 2 litres d'acide ohlorhydrique 0,2 N con- tenant de la cystéine 0,1 N. On chauffe la solution à 60 C pendant 5 minutes puis on la garde à température ambiante pendant une heure.
On ajoute ensuite comme dans l'exemple.1, deux litres d'acide acétique glacial et 2 litres d'acétone, et on applique le procédé de séparation de l'exemple 1, pour obtenir de la thyrooaloitonine séchée par congélation.
EXEMPLE 3.
On dissout dans 2'litres d'une solution aqueuse de phénol à 70%, 200 g de poudre de glande séchée et dé- graissée, préparée comme décrit dans l'exemple 1. On laisse reposer le mélange à température ambiante pendant 90 minutes puis à 4 C pendant 30 minutes. On ajoute ensuite le mélange
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à 10 libres d'une solution d'acide acétique à 20 % dans l'aoétone, à laquelle on ajoute 56 ml de NaC1 1M. On agite pendant 30 minutes le mélange résultant, on le filtre sur de la gaze et on jette le précipité. On mélange le filtrat aveo un volume égal d'éther et on laisse le précipité dépo- ser, la partie surnageante étant éliminée par filtration puis jetée .
On recueille ensuite le précipité par centrifugation, on le lave deux fois avec un mélange d'éther et d'acétone (lil) comme dans l'exemple 1 et on opère ensuite comme dans l'exemple 1. On obtient de la thyrocalcitonine séchée par congélation.
On effectue le fractionnement d'un nombre d'échan- tillons de thyrocalcitonine de différentes origines sur une colonne Séphadex G-75 en utilisant exactement le procédé décrit dans l'exemple 1.
La Fig. 3 représente un graphique de la densité en ordonnées en abscisses optique/en fonction du numéro des tubes/-dans le cas de thyro- calcitonine brute d'être humain, et on voit qu'il y a deux pics entre les tubes 70 et 120; ceux-ci contiennent le prin- cipe actif.
La Fig. 4 représente un graphique de la densité en ordonnées en abscisses optique en fonction du numéro des tubes-/dans le cas de thy- rocalcitonine brute de bovin, et montre que le prinoipe actif se trouve dans les tubes 68 - 91 (19,2 mg; 50 g abais- sent la teneur en calcium du sérum de 1,3 % en mg) et dans les tubes 92 - 132 (4,45 mg; 50 g abaissent la teneur en cal- cium du sérum de 1,8 % en mg).
On effectue une analyse des amino-aoides sur un échantillon hydrolysé du produit préparé dans l'exemple 1, après chromatographie sur la oarboxyméthyl-oellulose. Le
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chromatogramme est réalisé dans les conditions de Moor et Stein à l'aide d'un analyseur d'amino-acides Phoenix. Les Fige 5 à 7 représentent des enregistrements provenant de l'analyseur. chaque division correspondant à 5 ml d'effiuent.
L'échelle est logarithmique et l'aire sous chaque pio re- présente la proportion relative de chaque amino-aoide pré- sent. Les conditions de l'analyse et le procédé d'identifi- cation des amino-aoides sont décrite aveo détails dans le manuel fourni par "Phoenix Précision Instrument Co, de '
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Philadelphia Pennsytvan1e,U.S.A., (qui fabrique l'appareil utilisé). D'autres références pour le procédé et les condi- tions utilisés peuvent être trouvées dans "J. Briol. Uhem.
192, 663 (1951), 211, 893 et 907 (1954)et Analytical Chem.
30, 1190 (1958). Les Fig. 5 et 6 montrent les résultats d' essais réalisés à un pH de 3,25 et de 4,25 respectivement sur une colonne de 150 cm dans une solution tampon de citrate
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0,2 N et à 5t? C, 3t ms.rrat la distribution des amino-aa3 des neutres et acides.
La Fig. 7 montre les résultats d'un essai réalisé à un pH de 5,29 sur une colonne de 15 cm dans une solution tampon de citrate 0,35 N et à 50 C, et montre la distribu- tion des amino-acides basiques, le large pic étant dû à l'am- , moniao.
On soumet le produit de l'exemple 1 à une éleotro- phorèse sur disque en polyaorylamide en utilisant l'appareil
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de "Canal Inàunsrlal (;vrra\;10n" de Bethesda, Maryland, U SsA.# la solution A étant à un pH de bzz - 9.0, la solu- tion B à un pH de b, b - 6,8, le tampon étant à un pH de 8,2- 8,4.
L'activité biologique est principalement associée a une bande à Rf 0,8 par rapport au colorant standard.
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Le produit.. " do l'invention est adminiatrablo par voie parentérale et les exemples 4 à 11 qui suivent présentent des compositions contenant le principe actif associa à divers véhicules ou excipients pharmaoeutiquement administrables, EXEMPLE 4*, Thyrocalcitonine pour injection.
On introduit dans des ampoules de 2 ml de la poudre de thyrocalcitonine lyophilisée stérile préparée comme à l'exemple 1, à raison de 5 mg par ampoule, et on complète en ajoutant du sérum physiologique stérile.
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EXEMPLE 5. Thyrocalcitoninv¯¯¯dnns de la gélatine épais- se.
On disperse dans une solution stérile aqueuse à 16% de gélatine (2 litres) 2 g de poudre de thyrocalcitonine ' lyophilisée stérile préparée comme à l'exemple 1. Ce produit doit être chauffé Jusqu'à environ 50 C immédiatement avant l'injection en vue d'assurer une liquéfaction complète à ' la température du corps. On remplit des capsules de 2 ml avec la solution de gélatine, chaque capsule contenant 2 mg de substance active.
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EXEMPIJE 6... Thyrocalcitonine dans de la gélatine peu épaisse.
La composition de l'exemple 5 peut être modifiée, en passant à l'autoclave la solution de gélatine à 16% afin d'abaisser le point de liquéfaction à la température am-
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biante, avant l'addition de thyrooa7.oitonine.
EXEMPLE 1. Thyrocalcitonine dans du solde zinc.
On ajoute une suspension stérile d'hydroxyde de zinc (0,25 mg de Zn par ml), à un pH de 7 - 8, à de la thy- rocalcitonine lyophilisée stérile afin d'obtenir un rapport et on verse le mélange dans des ampoules de 2 ml, chaque
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de 0,1 mg de zinc par mg de thyrooalo1ton1nejWmpoule conte- nant 5 mg de thyrocalcitonine! une seule dose de ce produit
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ne doit pas contenir plus de 1 mg de zinc,
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EXEMPLE 8. ThYooalo1ton1ne dans du gel d'alumin1.
On ajoute à pH 6 - 7,5 une suspension stérile de phosphate d'aluminium (0,8 mg d'Al par ml) à de la thyro- calcitonine lyophilisée stérile afin d'avoir un rapport de 0,8 mg d'Al pour 10 mg de thyrocalcitonine. On remplit de cette suspension des ampoules de 2 ml, chaque ampoule conte- nant 10 mg de thyrocalcitonine, EXEMPLE 9. Complexe de thyroide et de thyrocalcitonine
On ajoute une suspension stérile de protéine.de glande thyroïde dénaturée par chauffage (20 mg/ml) à de la thyrooaloitonine lyophilisée stérile afin d'avoir un rap- port de 20 mg de protéine de glande thyroïde pour 1,0 mg de thyrocalcitonine, On remplit de cette suspension des ampou- les de 2 ml, chaque ampoule contenant 2 mg de thyrocalci- tonine.
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EXEMPLE 10. Composition Thyrocalciton1ne-lobin
On mélange de la thyrooaloitonine lyophilisée sté- rile avec une solution stérile de globine de boeuf (6 mg par ml) afin d'obtenir une concentration finale de 2,0 mg
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de globine pour 1,00 thyrocalcitonine, On remplit de cette solution des ampoules de 2ml, chaque ampoule contenant 6 mg
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de thyrocalcitonine, EXEMPLE 11.
Thyrocaloitonine dans la carboxyméthyl- cellulose (CMC) On met en suspension de la thyrocaloitonine lyo-
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philisée stérile dans une solution de carboxyméthyl-cellu- lose (Type.70, qualité supérieure ! 30 mg/ml) à un pH de 6 - 7, afin d'obtenir un rapport de 10 mg de CMC pour 1,0 mg
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de thyrocalcitonines On remplit de cette solution des am- poules de 1 m1; chaque ampoule contenant 3 mg de thyrocalci- tonine.
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Dans les exemples 7 - 10, l'eau du milieu peut être remplacée par une quantité égale de solution stérile de géla- tine à 16% utilisée dans l'exemple 2 ou 3.
Dans les exemples 7 et 8. l'eau du milieu peut être avantageusement remplacée par une solution stérile à 20 - 30 % de polyvinyl-pyrrolidone.
Toutes les préparations des exemples 4 à 11 peuvent avantageusement contenir un agent bactériostatique,, par exemple, 0,1 à 0,2 % en poids de phénol ou de crésol et un anti-oxydant par exemple 0,01 % en poids de cystéine ou 0,002 % en poids de thiodiglycol.
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"Thyrocalcitonin polypeptide drug".
The present invention relates to a new substance having in particular a physiological interest for the treatment of osteoporosis and neighboring states.
The Applicant has found that it is possible to obtain, from the thyroid gland, a polypeptide exhibiting a marked action on the bones. This substance is referred to herein as the thyrocalcitonin polypeptide. It appears to occur in the thyroid only as a complex with other polypeptides, proteins or macromolecular materials, but it can be readily released therefrom as described below :.
The new substance has the following characteristics:
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The new thyrocalcitonin polypeptide can be characterized, by its biological activity, in that it causes a marked decrease in calcium and phosphorus in the serum of experimental animals, and also by its chromatographic characteristics on a Sephadex column which indicate that its molecular weight is between 7000 and 10 000. On a Sephadex G-75 column (a dextran crosslinked with ethylene oxide, solid marketed by AB
Pharmacia de Uppsaala, Sweden), the new substance is eluted with ammonium acetate buffer at pH 4.7 and at a flow rate of 21 ml per hour, using every 17 minutes, 6 ml fractions; the new substance is found mainly in fractions 65 to 140. The details of this method are given below and the resulting histogram is shown in FIG; 1; peak IV is the one that. contains most of the thyrocalcitonin polypeptide.
Chromatography on a Sephadex G-75 column carried out under the above conditions has the following charac- teristics: a peak, tubes ranging from 80 to 110 specifically containing from 20 to 30 mg of product which decreases by 1.5 mg % the calcium content of the serum with a dose of 50 micrograms, and a fourth lower peak, tubes 105 to about 140, specifically containing 4 to 18 mg of product which decreases the content from 1.8 to 2.5 mg% in serum calcium with a dose of 50 mierograms. This latter peak is more closely related to pure thyrocalcitonin; however the product of the first peak is sufficiently pure to be used.
The thyrocalcitonin polypeptide can also
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be characterized by its chromatographic characteristics on a carboxymethyl cellulose column using linear gradient elutions with ammonium acetate at a pH of 4.6 and using a linear gradient of concentration of 0.02 M to 0.5 M. With a column of 50 cm x 1 cm and a flow rate of 0.5 ml / minute and taking 50 of the 3 ml fractions, the active principle is contained in a pie between fractions 6 and 10 inclusive.
The Applicant has demonstrated that pig thyrocalcitonin causes a decrease in the calcium and phosphorus content of the serum of an intact rat, and decreases the excretion of calcium, magnesium and phosphorus in the intact rat and in the rat. rat deprived of thyroid and parathyroid.
The increase in the calcium, phosphorus and magnesium content of the excretions obtained by the administration of hormone. Purified parathyroid gland is reversed by simultaneous administration of thyrocalcitonin. Hypercalciuria is completely overcome by simultaneous administration of thyrocal- citonin and par4thyroid hormone, while hyperphosphaturia and increased excretion of magnesium. are only partially overcome, which assumes that thyrocalcitonin inhibits the action of parathyroid hormone on bones, but not its action on non-bone tissue cells,
The increased excretion of hydroxyproline caused by administration of parathyroid hormone is suppressed by simultaneous administration of thyrocalcitonin and parathyroid hormone. Parathyroid hormone Ca45 and Sr90 induced mobilization of pre-labeled intact rat bones 60-90 days prior to testing with Ca45 or Sr90 is also
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suppressed by simultaneous administration of thyrocaloitonin and parathyroid hormone. Thus thyrocalcitonin
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e, emble to act by preventing bone resorption and by preventing the action of parathyroid hormone on bone resorption.
Although the activity is usually obtained with
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a dose of 50 micrograms per animal, a curve as a function of the dose of the purified product, showed that doses
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less than 5 miorograms have a strong effect.
The new active ingredient is therefore particularly useful in the treatment of conditions in which excessive absorption is excessive. The purified substance is much more effective than the crude thyroid extract in which the protein complex is produced and it does not exhibit the side effects due to other proteins and polypeptides present in the crude thyroid extract.
The new substance is thus particularly useful in the treatment of osteoporosis, including idiopathic osteoporosis and
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poot-mnopauae osteoporosis and, in particular, osteoporosis caused by the addition of eteroids for the treatment of other diseases, such as the administration of
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cortisone, cor.tiaol, prednison and prednisolone, miidrol, triamcinolone, dexamethaconst of betamta80n, m <Sdroi, <ri-in0iOn-, product etc. The nbuveau7 of the invention can also be used as a preventive measure. for the treatment of osteoporosis eze. ni1es, pont-m (Inopauae and those due to ateroids.
It is also generally useful in the treatment of hyperalcum and in the treatment of hypercalciuria, including in preventing the formation of kidney stones.
The new active principle according to the invention is
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-very active at doses as low as 0.1 mg. It is preferred to use daily doses of between 1 and 10 mg or even higher, for example doses of 5 to 20 mg 2 to 3 times per week. Thus, for example, in the case of a man weighing 55 kg, there is a decrease in the calcium content in the blood with an intravenous dose of 2 mg of thyrocalcitonin polypeptide and a decrease. much larger with a dose of 5 mg.
It is therefore preferable that the thyrocalcitonin polypeptide is formulated in unit doses containing from 0.1 mg to mg of the active principle, and preferably from 1 to 10 mg. In general, a pharmaceutical carrier or excipient is used and, in this case, the medicament of the invention is preferably administered by injection. The vehicle for the mixture is preferably an injectable, sterile, parenterally acceptable fluid, such as an oily emulsion, sterile oil, or sterile pyrogen-free water. It is preferred to use the preparations or the vehicle or the excipient, prolonging the action of the polypeptide.
This as well as the vehicle advantageously contains aqueous gelatin; the use of partially hydrolyzed gelatin is particularly suitable in the product case of injections containing a deposit. The new / can also be adsorbed by an adborbant, acceptable by the parenteral route, for example, zinc hydroxide, or alternatively be added to zino chloride and to globin; globin is readily obtained from globin hydrochloride obtained from beef blood.
The aqueous preparations advantageously contain an oon- server, such as phenol, for example at a content
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1% by weight; the thyrocalcitonin polypeptide can also be formulated as a lyophilized powder which can be made into an aqueous preparation, when necessary.
The thyrocalcitonin polypeptide is prepared by treating the thyroid gland with a liquid. having a high dielectric constant to release the polypeptide from the complexed material, followed by fractionation to. separate it from impurities.
By the term "high dielectric constant" is meant dielectric constant values of the order of
Or above, the thyroid gland used can be, for example, a bovine, monkey, human or sheep thyroid gland or preferably a pig.
The high dielectric constant liquid used to liberate the polypeotice from the complex in which it is produced is preferably water, preferably containing a protein dissociating agent, for example, a concentrated urea solution preferably containing urea hydrochloride. Thus, for example, 8 M urea containing 0.2 M hydrochloric acid is particularly satisfactory. health.
Other liquids with high dielectric constant are aqueous solutions of hydroxyaromatic compounds, for example those containing phenol, cresol, xylol, etc .; an aqueous solution of inorganic and organic acids, e.g. ple sulfuric or hydrochloric acid or lower alkanoic acids, such as acetic acid, propionic etc. preferably at a pH between 4 and 6;
alkamides and their N, N-disubstituted derivatives, such as formamide, dimethylformamide, dimethylacetamide and
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diethylaoetamide; diacoylsulfoxides, such as dimethyl sulfoxide, aqueous solutions of salts of aliphatic, araliphatic, aromatic or heterocyclic hydrosoluble amines, such as pyridine, collidine, triethylamine, and the like.
In general, it is advisable to add an anti-oxidant in the medium, and thiolo, such as cysteine. are particularly suitable.
It is preferable to treat the thyroid gland with a view to removing fat, before treating it with the high dielectric constant fluid. Conveniently, the thyroid glands are homogenized and repeatedly extracted by several cold acetone or other water miscible solvent for fat. Ethylenediaminetetraacetic acid (AEDT) is preferably added to the homogenized glands during the first extraction, but not for the following ones.
The residue from the final acetode extraction is then advantageously extracted using a water-immiscible fat solvent, for example, a hydrocarbon or a chlorinated hydrocarbon, such as benzine, toluene, methylene chloride, chlorobenzene, chloroform, etc. The extraction is preferably repeated several times and the excess solvent is then advantageously removed, for example, by subsequent extraction of the product with a volatile solvent, such as acetone, followed by drying, in the air.
All operations are carried out at low temperatures in order to avoid loss of activity, and suitably at around 4 C.
After processing the product to release the poly-
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The desired peptide, the solution of the polypeptide in the high dielectric constant solvent is advantageously treated with a relatively low concentration of a water-miscible organic solvent, for example, a water-miscible ketone, such as. as acetone, and / or a lower alkanoic acid, such as acetic acid, in order to remove peptides and proteins with high molecular weight which are then discarded.
The solution can then be processed to precipitate the desired polypeptide, preferably with minimal precipitation of the impurities consisting of the remaining proteins and peptides. A suitable precipitating agent is, for example, an ethereal solvent, such as. diethyl ether.
It will be appreciated that the exact amounts of precipitating agents will depend on the nature of these agents and the nature of the other substances present, but in each case the amounts will be chosen in order to precipitate as much as possible the desired polypeptide while rejecting the substances. unwanted impurities. In other words, at each stage of the operation, fractions of the desired substances with high specific activity are collected and those with low or no specific activity are discarded.
The specific activity can be estimated at each stage by assay and the polypeptide, the biological activity of the active ingredient providing a basis for an appropriate test method. This is how, for example, the product from a particular fraction, after suitable dilution in physicigic serum, can be injected subcutaneously into mice or rats and the blood. sampled from the dosed heart after a standard time lapse, to know
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be the content of Ca and / or P. The normal contents of Ca and P can be determined in control animals which have only been injected with physiological serum.
If desired, other stages of fractional precipitation can be carried out, for example, by precipitating the polypeptide from an acetic acid solution by the addition of a protein precipitating agent. , such as trichloroacetic acid. The precipitate can be treated to remove the residual acid, and then be redissolved.
To isolate the polypeptide, it can be dissolved in a dilute acid, for example, 0.02N hydrochloric acid, followed by removal of the acid by treatment with a basic ion exchange resin. The polypeptide in dry form is then obtained by luo philisation. Even after fractional precipitation, the thyrocalcitonin polypeptide can be relatively impure, and further purification is recommended. In fact, all known procedures for purifying polypeptides can generally be used with the fractions out. new chipsies based on their high specific activity.
The purification modes that can be used are as follows:
1 - Column chromatography containing a molecular sieve, such as a Sephadex column consisting of crosslinked dextran. This is the preferred mode of operation. The column is advantageously treated with a substance, such as serum albumin, to reduce losses of poypaptide in the column. The preferred grade of Sephadex is
G-75, which adsorbs products with a molecular weight less than about 50,000.
The polypeptide is preferably passed over a co-
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It is left in a mildly acidic buffer solution, for example, ammonium acetate, at pH 4.7 and the same buffer solution is used to develop the column. Preferably, column development proceeds relatively slowly to produce the most efficient separation, eg, about the volume of a bed in 21 hours.
2 - Column chromatography containing an ion exchange product. Basic or mildly acidic ion exchangers can be used, for example, cellulose materials such as cellulose, diethylaminoethyl-cell-, pulp or carboxymethyl-cellulose.
3- Electrophoresis, 'preferably on a solid medium, Examples of suitable media include cellulose, polyvinyl chloru @, polyacrylamide and crosslinked dextran
4 Counter current distribution. ,
5 - Sedimentation.
6 - Penetration and diffusion through a membrane
Examples of the preparation of the active ingredient of the medicament of the invention will be given below, by way of illustration and without limitation,
EXAMPLE 1
Collection of throid glands of dogs.
Thyroid glands (about 9 g wet weight) were collected for three afternoons from about 1,500 dogs. The glands are cut off about 10 minutes after killing the dogs and immediately cooled in ice water, stripped of any tissue, grease, etc., homogenized in a meat grinder and cooled. by immersion in a mixture of dry ice and
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acetone containing about 30 mg of ethylenediaminetetraacetic acid. The total amount of glands collected is 9 kg (wet weight), Preparation of degreased gland powder,
The entire operation is carried out in a cold room at 4 C.
The reagents, stainless steel containers and glassware are pre-cooled. 450 g of homogenized thyroid glands are added. 1 liter of "reactive" grade acetone and 30 mg of AEDT (in H2O), left to stand for one hour, homogenized in a stainless steel mixer for 2 minutes, at low speed, and finally allowed to stand. thus obtained for 15 - 25 minutes. The homogeneous mixture is occasionally stirred and then filtered through 6 layers of gauze.
The solid product is again suspended in 600 - 800 ml of acetone and extracted with acetone 10 times in a row (no AEDT is added in the acetone extractions 2 - 10 ); in each case, the acetone is discarded. The residue is extracted 6 times, each time with 600-800 ml of chloroform (purified quality); we throw in the chloroform.
The residue is extracted 10 times with acetone, the gland powder is spread out on a clean surface (stainless steel tray) and dried overnight in a cold room, thus obtaining a pink powder. , 450 8 of wet thyroid glands give 60 g of defatted dry powder. We con. serve the powder in a brown glass vial in a frozen chamber. The remaining 8.6 kg are extracted in the same way. Total yield s 1300 g, Experimental technique ¯ to isolate thyrocalcionine.
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All operations are carried out in a cold room at 4 C.
2 liters of 8 M urn and 0.1 N cysteine in 0.2 N hydrochloric acid are added to 200 g of dried defatted gland powder, the mixture is left to stand for one hour, stirring occasionally. time. 2 liters of glacial acetic acid and 2 liters of acetone are added with constant stirring and the mixture is left to stand for one hour; then add 6 liters of acetone and 56 ml of 1N NaCl, stirring vigorously. The mixture is allowed to stand until the precipitate is completely deposited, it is filtered through 4 layers of gauze and the precipitate is discarded.
The filtrate is divided into two parts and introduced into two 12 liter flasks. 5 liters of peroxide-free diethyl ether are added to each flask, and the precipitate is allowed to settle. The supernatant is separated by decantation and discarded.
The precipitate is collected by centrifugation and washed twice with a mixture of ether and aoetone (ll). The precipitate is dispersed in 1 liter of 20% (v / v) acetic acid containing 0.01 N cysteine and stirred in a magnetic stirrer. tick for 30 - 40 minutes in order to obtain a maximum solution. (a complete solution is not obtained), Dry sodium chloride is added to obtain a final 5% NaCl solution and the mixture is stirred until 'so that the salt dissolves completely * A fine precipitate forms which is centrifuged at 6,000 T and the precipitate is discarded.
Sufficient 50% trichloroacetic acid is added to form a 7.5% trichloroacetic acid solution, followed by stirring for.
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15 minutes. All of the polypeptide precipitates in this way, and the precipitate is collected by centrifugation, washed twice with 5% trichloroacetic acid and again with peroxide-free ether.
The product is dissolved in 1.5 liters of 0.02 N hydrochloric acid and extracted three times with an equal volume of peroxide-free ether. The dissolved ether is removed from the solution using a rotary evaporator. We pass. the aqueous solution on a column (2 x 30 cm) made of an ion exchange resin, "Amberlite IRA 400" (passing through a sieve 4 mesh opening 1.19 -0.297 mm) in order to eliminate the hydrochloric acid. The effluent is lyophilized and 530 mg of crude product are obtained. Another 150 mg is recovered on the metal tray and on the glass instruments used.
Bioassay on crude thyrocalcitonin polypeptide.
The test is carried out on male and female rats weighing 120-130 g. Five control animals are injected subcutaneously with 0.5 ml of 0.2% NaCl. Animals are lightly anesthetized with ether for injections. In a similar manner, five test animals were injected subcutaneously with 0.5 ml of crude hormone (1 mg / ml) in
0.2% NaCl. After one hour, blood was collected from the control animals and from the test animals by a puncture in the heart. The serum is analyzed for the content of Ca and P.
Fractionation of crude thyrocalcitonin. a - ChroMathography on a Sephadex G-75 column.
All the fractionation operations are carried out at 4 C. The crude product is fractionated on a column.
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Sephadex 0-75 (3 x 150 cm). The column is treated with 300 mg of serum albumin, then one continues with a buffer.
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0.211 ammonium acetate, pH 4.7 and a flow rate of 40 ml / hour. The column is allowed to develop for a
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night, and we study the erluent, the next day we find that it 'does not contain protein.
(Column development with ammonium acetate buffer continues until the effluent no longer contains protein as
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it is determined by measuring the absorption at a wavelength of 277 m in an apparatus of the Beckman DU type).
The hormone is prepared as follows for its use in a Sephadex column 500 mg are dissolved in 7 ml of 0.2 M ammonium acetate buffer, centrifuged at 2 revolutions / minute for 6 minutes; then we transfer
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the next part in a test tube. The precipitate is again dissolved in sUBpen, 10 in 2 ml of buffer, centrifuged and the supernatant part added to the test tube.
The dissolved hormone is placed on the Sephadex column and the elution is carried out with the aid of 0.2 M ammonium acetate buffer; 6 ml fractions are collected every 17 minutes. A total of 180 fractions are collected in this way.
Results.
Crude hormone test:
Mean serum Ca content (% in mg) Control animals 10.6 Animals injected with 500 g of hormone 7.9 (minimum 2.7)
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The result obtained during the fractionation of the thyroaalci-
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o crude tonin on a Sephadex G-75 column is shown Pige 1 * where the density of the tube is represented on the ordinate and the tube number on the abscissa. The fractions are freeze-dried and the dry product is introduced into test tubes of 5 ml, the product is redissolved and
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it is freeze-dried again.
Product collected after lyophi-, lisabion:
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<tb> Fraction <SEP> Tube <SEP> n
<tb>
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33-66 approximately 122 mg 267 - 86 15 mg; 3 87 -107 15.7 ms 1 4 108-124 1.9 mz 5 125-160 6.9 rns
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Results of biôleatgiie3 enemies on the I * raotton3 leaving the Sephadex n-75 column.
Four control animals were injected subcutaneously with a 10% oalin solution. Test animals are injected for each fraction $ 0.5 ml of a solution
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containing 100 mierograms per ml of the appropriate fraction.
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<tb>
<tb>
Calcium <SEP> <SEP> content <SEP> Difference <SEP> with
<tb>
<tb> of the <SEP> serum <SEP>% <SEP> in <SEP> mg <SEP> the control animal <SEP>,
<tb>
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¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ in mg.
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<tb>
Animals <SEP> controls <SEP> la, 5 <SEP>. <SEP>
<tb>
<tb>
Fraction <SEP> tube <SEP> N
<tb>
<tb> 2 <SEP> 67 <SEP> - <SEP> 86 <SEP> 9.3 <SEP> 1.0
<tb>
<tb> 3 <SEP> 87 <SEP> - <SEP> 107 <SEP> 9.2 <SEP> 1.1
<tb>
<tb> 4 <SEP> 108 <SEP> - <SEP> 124 <SEP> 7.8 <SEP> 2.5
<tb>
<tb> 5 <SEP> 125 <SEP> - <SEP> 160 <SEP> 9.4 <SEP> 0.9
<tb>
<tb> Taneur <SEP> in <SEP> phosphorus <SEP> Difference <SEP> with
<tb> of the <SEP> serum, <SEP>% <SEP> in <SEP> mg <SEP> the <SEP> control animal
<tb>% <SEP> in <SEP> mg
<tb>
Control animals 7.6
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<tb> Fraction <SEP> Tube <SEP> N
<tb>
<tb> 2 <SEP> 67 <SEP> - <SEP> 86 <SEP> 7.6 <SEP> 0
<tb>
<tb> 3 <SEP> 87 <SEP> - <SEP> 107 <SEP> 6.6 <SEP> 1.0
<tb>
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4 o8 - 124 5.6 2 # 0 5 125 - lrio 7.6 0
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b Chromatonph1e on cnboxymethyl-celluloe Product:
highly purified pork thyrocalcitonin (10 mg)
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<tb> Column <SEP> 50 <SEP> cm <SEP> x <SEP> l <SEP> cm
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<tb> flow rate <SEP> 0.5 <SEP> ml <SEP> to <SEP> per <SEP> minute
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fractions <SEP> 3 <SEP> ml
<tb>
<tb> Elution <SEP> linear gradient, <SEP> ammonium acetate <SEP> <SEP> to <SEP> a
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> of <SEP> 4.6, <SEP> 0.02 <SEP> M <SEP> - <SEP> 0.5 <SEP> M.
<tb>
The active principle is contained in peak 1 (tubes 6 to 10) (4.75 mg). Peak 2 (tubes 12-15) (2.3 mg) shows only low activity.
Activity, peak 1: 50 micrograms lower
2: 50 serum calcium content of 1.8 mg%; peak 2: 50 micrograms lower the serum calcium content by only 0.5 mg on the ordinate. A graph of absorption at 277 m as a function of the abscissa of the fraction number / is shown in FIG. 2.
The separation process of Example 1 is also applied to isolate thyrocalcitonin from acetone powder of thyroid glands of cattle and humans.
EXAMPLE 2
200 g of powdered dog thyroid gland, dried and defatted, prepared as described in Example 1, are dissolved in 2 liters of 0.2 N hydrochloric acid containing 0.1 N cysteine. solution at 60 C for 5 minutes and then kept at room temperature for one hour.
Then, as in Example 1, two liters of glacial acetic acid and 2 liters of acetone are added, and the separation process of Example 1 is applied to obtain freeze-dried thyrooaloitonin.
EXAMPLE 3.
200 g of dried and degreased gland powder, prepared as described in Example 1, are dissolved in 2 liters of a 70% aqueous solution of phenol. The mixture is left to stand at room temperature for 90 minutes then. at 4 C for 30 minutes. Then add the mixture
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to 10 free of a solution of 20% acetic acid in aoetone, to which is added 56 ml of 1M NaCl. The resulting mixture is stirred for 30 minutes, filtered through gauze and the precipitate discarded. The filtrate is mixed with an equal volume of ether and the precipitate is allowed to settle, the supernatant being removed by filtration and then discarded.
The precipitate is then collected by centrifugation, washed twice with a mixture of ether and acetone (III) as in Example 1 and the operation is then carried out as in Example 1. Thyrocalcitonin is obtained dried by freezing.
The fractionation of a number of thyrocalcitonin samples of different origins was carried out on a Sephadex G-75 column using exactly the method described in Example 1.
Fig. 3 is a graph of the density on the optical abscissa / as a function of the number of tubes / -in the case of crude human thyro- calcitonin, and we see that there are two peaks between tubes 70 and 120 ; these contain the active principle.
Fig. 4 is a graph of the density on the optical abscissa as a function of the number of tubes- / in the case of crude bovine thy- rocalcitonin, and shows that the active principle is found in tubes 68 - 91 (19.2 mg ; 50 g lowers the calcium content of serum by 1.3% in mg) and in tubes 92 - 132 (4.45 mg; 50 g lowers the calcium content of serum by 1.8% in mg).
Amino-acid analysis is carried out on a hydrolyzed sample of the product prepared in Example 1, after chromatography on arboxymethyl-cellulose. The
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Chromatogram is performed under Moor and Stein conditions using a Phoenix amino acid analyzer. Figs 5-7 represent recordings from the analyzer. each division corresponding to 5 ml of effiuent.
The scale is logarithmic and the area under each pio represents the relative proportion of each amino acid present. The conditions of the analysis and the method of identification of amino acids are described in detail in the manual provided by "Phoenix Precision Instrument Co., de '
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Philadelphia Pennsytvan1e, U.S.A., (Which manufactures the device used). Further references for the process and conditions used can be found in "J. Briol. Uhem.
192, 663 (1951), 211, 893 and 907 (1954) and Analytical Chem.
30, 1190 (1958). Figs. 5 and 6 show the results of tests carried out at a pH of 3.25 and 4.25 respectively on a 150 cm column in a citrate buffer solution.
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0.2 N and at 5t? C, 3t ms.rrat the distribution of amino-aa3 of neutrals and acids.
Fig. 7 shows the results of a test carried out at pH 5.29 on a 15 cm column in 0.35 N citrate buffer solution and at 50 C, and shows the distribution of basic amino acids, the wide peak being due to am-, moniao.
The product of Example 1 was subjected to polyaorylamide disk eleotrophoresis using the apparatus.
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of "Canal Inàunsrlal (; vrra \; 10n" from Bethesda, Maryland, U SsA. # solution A being at a pH of bzz - 9.0, solution B at a pH of b, b - 6.8, buffer being at pH 8.2-8.4.
Biological activity is mainly associated with a band at Rf 0.8 relative to the standard dye.
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The product .. "of the invention is administered parenterally and Examples 4 to 11 which follow present compositions containing the active principle combined with various vehicles or pharmaceutically administrable excipients, EXAMPLE 4 *, Thyrocalcitonin for injection.
Sterile lyophilized thyrocalcitonin powder prepared as in Example 1 is introduced into 2 ml ampoules, at a rate of 5 mg per ampoule, and is completed by adding sterile physiological saline.
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EXAMPLE 5. Thyrocalcitoninv¯¯¯dnns of thick gelatin.
2 g of sterile lyophilized thyrocalcitonin powder prepared as in Example 1 are dispersed in a sterile 16% aqueous gelatin solution (2 liters). This product should be heated to approximately 50 ° C. immediately before injection. view to ensure complete liquefaction at body temperature. 2 ml capsules are filled with the gelatin solution, each capsule containing 2 mg of active substance.
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EXEMPIJE 6 ... Thyrocalcitonin in thin gelatin.
The composition of Example 5 can be changed by autoclaving the 16% gelatin solution to lower the liquefaction point to room temperature.
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biante, before the addition of thyrooa7.oitonin.
EXAMPLE 1. Thyrocalcitonin in zinc balance.
A sterile suspension of zinc hydroxide (0.25 mg Zn per ml), pH 7 - 8, is added to sterile lyophilized thyrocalcitonin to obtain a ratio and the mixture is poured into containers. 2 ml ampoules, each
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0.1 mg of zinc per mg of thyrooalo1ton1nejWmpoule containing 5 mg of thyrocalcitonin! a single dose of this product
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must not contain more than 1 mg of zinc,
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EXAMPLE 8. Thyooalo1ton1ne in aluminum gel.
A sterile suspension of aluminum phosphate (0.8 mg Al per ml) is added at pH 6 - 7.5 to sterile lyophilized thyro-calcitonin in order to have a ratio of 0.8 mg of Al. for 10 mg of thyrocalcitonin. 2 ml ampoules were filled with this suspension, each ampoule containing 10 mg of thyrocalcitonin, EXAMPLE 9. Thyroid Thyrocalcitonin Complex
A sterile suspension of heat-denatured thyroid gland protein (20 mg / ml) is added to sterile lyophilized thyrooaloitonin in order to have a ratio of 20 mg of thyroid gland protein to 1.0 mg of thyrocalcitonin, 2 ml ampoules are filled with this suspension, each ampoule containing 2 mg of thyrocalcitonin.
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EXAMPLE 10. Thyrocalcitonin-lobin composition
Sterile lyophilized thyrooaloitonin is mixed with sterile beef globin solution (6 mg per ml) to obtain a final concentration of 2.0 mg.
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of globin for 1.00 thyrocalcitonin, We fill with this solution 2ml ampoules, each ampoule containing 6 mg
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of thyrocalcitonin, EXAMPLE 11.
Thyrocaloitonin in carboxymethylcellulose (CMC) Thyrocaloitonin lyo-
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filtered sterile in a solution of carboxymethyl cellulose (Type 70, top quality! 30 mg / ml) at a pH of 6 - 7, in order to obtain a ratio of 10 mg CMC to 1.0 mg
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of thyrocalcitonins. 1 ml ampoules are filled with this solution; each ampoule containing 3 mg of thyrocalcitonin.
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In Examples 7-10, the water in the medium may be replaced with an equal amount of sterile 16% gelatin solution used in Example 2 or 3.
In Examples 7 and 8. the water in the medium can advantageously be replaced by a sterile 20-30% solution of polyvinyl-pyrrolidone.
All the preparations of Examples 4 to 11 can advantageously contain a bacteriostatic agent, for example, 0.1 to 0.2% by weight of phenol or of cresol and an antioxidant, for example 0.01% by weight of cysteine or 0.002% by weight of thiodiglycol.