BE684858A

BE684858A -

Info

Publication number: BE684858A
Authority: BE
Priority date: 1965-07-30
Filing date: 1966-07-29
Publication date: 1967-01-30
Also published as: NL6610763A; FR5835M

Description


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  "Médicament à base de polypeptide de thyrocalcitonine". 



   La présente invention a pour objet une substance nouvelle présentant en particulier un intérêt physiologique pour le traitement de   l'ostéoporose   et des Etats- voisins. 



   La demanderesse a trouvé qu'il est possible   d'obtenir, à   partir de la glande thyroïde, un polypeptide manifestant une action marquée sur les os. Cette substance est désignée ici sous le nom de polypeptide de thyrocalci- tonine. Elle ne semble se produire dans la thyroïde que sous forme d'un complexe avec d'autres polypeptides, pro- téines ou matières macromoléculaires, mais elle peut en   ' être   facilement libérée comme on le décrit   ci-après:.   



   La nouvelle substance a les caractéristiques suivantes : 

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Le nouveau polypeptide de thyrocalcitonine peut être caractérisé, par son activité biologique, en ce qu'il provoque une diminution marquée du calcium et du phosphore du sérum des animaux expérimentaux, et également par ses caractéristiques chromatographiques sur une colomme   Séphadex   qui indiquent que son poids moléculaire est compris entre 7000 et 10 000. Sur une colonne Séphadex G-75 (une dextrane reticulé avec l'oxyde d'éthylène, solide commercialisé par A.B.

   Pharmacia de Uppsaala, Suède), on élue là nouvelle substance avec un tampon d'acétate d'ammonium à un pH de   4,7   et avec un dé- bit de 21 ml à l'heure, en utilisant toutes les 17 minutes, des fractions de 6 ml; la nouvelle substance se trouve princi- palement dans les fractions 65 à 140. On donne plus bas les détals de cette méthode et l'histogramme qui en résulte est représenté à la Fig; 1; le pic IV est celui   qui. contient   la plus grande partie de polypeptide de thyrocalcitonine. 



   La chromatographie sur une colonne Séphadex G-75 effectuée dans les conditions ci-dessus présente les carac- téristiques suivantes: un pic, tubes allant de 80 à 110 contenant spécifiquement de 20 à 30 mg de produit qui dimi- nue de   1,5   mg % la teneur en calcium du sérum avec une dose de 50 microgrammes, et un quatrième pic moins élevé, tubes 105 à environ   140,   contenant spécifiquement de 4 à 18 mg de produit qui diminue de 1,8 à 2,5 mg   %   la teneur en calcium du sérum avec une dose de 50 mierogrammes. Ce dernier pic est lié plus étroitement à la thyrocalcitonine pure ;   pour-tant le produit du premier pic est suffisamment pur pour   être utilisé. 



   Le polypeptide de thyrocalcitonine peut également 

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 être caractérisé par ses caractéristiques chromatographiques sur une colonne de carboxyméthyl-cellulose à l'aide   d'élue   tions à gradient' linéaire aveo de l'acétate d'ammonium à un pH de 4,6 et à l'aide d'un gradient linéaire de concen- tration de 0,02 M à 0,5 M. Avec une colonne de 50 cm x 1 cm et un débit de 0,5 ml/minute et en prenant 50 des fractions de 3 ml, le principe actif est contenu dans un pie compris entre les fractions 6 et 10 incluse. 



   La demanderesse a démontré que la thyrocalcitonine' de porc provoque une diminution de la teneur en calcium et en phosphore du sérum d'un rat intact, et diminue les   excré-   tions de calcium, de magnésium et de phosphore chez le rat intact et chez le rat privé de thyroïde et de   parathyroide.   



  L'augmentation de la teneur en calcium, phosphore et magné-      sium des excrétions obtenue par l'administration   d'hormone .     parathyroidienne   purifiée est annulée par l'administration simultanée de thyrocalcitonine. L'hypercalciurie est tota-   lement   surmontée par administration simultanée de   thyrocal-   citonine et d'hormone   par4thyroidienne,   tandis que l'hyper- phosphaturie et l'augmentation des excrétions de   magnésium .   sont seulement   surmontées   en partie, ce qui suppose que la thyrocalcitonine inhibe l'action de l'hormone   parathy-     roidienna   sur les   os,mais   non son action sur les cellules des   tissus   non-$osseux,

   L'augmentation de l'excrétion d'hy-      droxyproline provoquée par l'administration d'hormone part- thyroïdienne est supprimée par l'administration simultanée de thyrocalcitonine et d'hormone parathyroidienne. La mobi- lieation provoquée par l'hormone   parathyroidienne   de Ca45 et de Sr90 des os de rata intacts marquée au préalable, 60 à 90 jours avant les essais, au Ca45 ou Sr90, est également 

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 supprimée par l'administration simultanée de   thyrocaloitonine   et d'hormone parathyroidienne. Ainsi la thyrocalcitonine 
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 e,emble agir en empêchant la résorption osseuse et en empe- chant l'action de l'hormone parathyroidienne sur la résorption osseuse.      



   Bien'qu'on obtienne ordinairement l'activité avec 
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 une dose de 50 mîcrogrammes par animal, une courbe en fonc- tion de la dose du produit purifié, a montré que des doses 
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 inférieures à 5 miorogrammes ont un effet important. 



   Le'nouveau principe actif eat donc particulière- ment utile dans le traitement des états où la résorption essëuse est excessive. La substance purifiée est beaucoup plus efficace que l'extrait brut de thyroide dans lequel se produit le complexe protéinique et elle ne présente pas les effets secondaires dus aux autres protéines et polypeptides présenta dans l'extrait brut de thyroide.

   La nouvelle sub- stance est, ainsi particulièrement utile dans le traitement de   l'ostéoporose,   y compris   l'ostéoporose   idiopathique et 
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 l'ostdoporose poot-mênopauae et,en particulier, l'ostéopo.. rose provoquée par l'adoinistraion de etéroides pour le traitement d'autres maladies, tels que l'administration de 
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 cortisone, de cor.tiaol, de prednisonet de prednisolone, de miidrol, de triamcinolone, de dexamèthaconst de bétamta80n, m<Sdroi, <ri-in0iOn-, roduit etc. On peut également utiliser le nbuveau7 de l'invention à titre préventif. pour le traitement des ostéoporoses eze. ni1es, pont-m(Inopauae et celles dues aux àtéroîdes.

   Il trou- ve également son utilité en général dans le traitement de l'hyperoalcüm1e et dans le traitement de l'hypercalciurie, y compris pour empêcher la formation de calculs rénaux. 



   Le nouveau prinoipe actif selon l'invention est 

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 -très actif à des doses aussi faibles que 0,1 mg. On pré- fère utilise  des doses journalières comprises entre 1 et 10 mg ou même supérieures, par exemple des doses de 5 à 20 mg   2 à 3   fois par semaine. C'est ainsi que, par exemple, dans le cas d'un':homme pesant 55 kg, on note une diminution de la teneur en calcium dans le sang aveo une dose intra- veineuse de 2 mg de polypeptide de thyrocalcitonine et une diminution beaucoup plus importante avec une dose de 5 mg. 



   Il est donc préférable que le polypeptide de thy-   rocalcitonine   soit formulé en doses unitaires contenant de 0,1 a du mg ue principe actif, et de préférence de 1   à   10 mg. En général, on   utilise   un support ou un excipient phar- maceutique et, dans ce cas, on administre de préférence   le ,   médicament de l'invention par injection. Le véhicule du mélange est de préférence un fluide injectable, stérile, acceptable par voie parentérale, tel qu'une émulsion hui- leuse, une huile stérile, ou de-l'eau stérile exempte de pyrogène. On préfère utiliser les préparations ou le vé- hicule ou l'excipient,prolonge l'aotion du polypeptide. 



     C'sat   ainsi que le véhicule contient avantageusement de la gélatine aqueuse ; l'utilisation de gélatine partielle- ment hydrolysée est particulièrement appropriée dans le produit cas d'injections contenant un dépôt. Le nouveau/ peut également être adsorbé par un adborbant, acceptable par voie parentérale, par exemple, l'hydroxyde de zinc, ou encore être additionné à du chlorure de   zino   et à de la globine; la globine est facilement obtenue à partir d'hy- drochlorure de globine provenant de sang de boeuf.

   Les préparations aqueuses contiennent avantageusement un oon- servateur, tel que le phénol, par exemple à une teneur 

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 de 1% en poids; le polypeptide de thyrocalcitonine peut éga- lement être formulé sous la forme d'une poudre lyophilisée pouvant être transformée en préparation aqueuse, quand cela est nécessaire. 



   On prépare le polypeptide de thyrocalcitonine en traitant la glande thyroïde avec un liquide. ayant une cons- tante diélectrique élevée en vue de libérer le polypeptide de la matière complexée, puis par fractionnement en vue de . le séparer des impuretés. 



   Par le terme "constante diélectrique élevée" on entend des valeurs de constante diélectrique de l'ordre de 
15 ou au-dessus, La glande thyroide utilisée peut être par exemple, une glande thyroïde de bovin, de singe, d'être   hu-        main ou de mouton ou de préférence de porc. 



   Le liquide à constante diélectrique élevée utilisé pour libérer le polypeotice du complexe dans lequel il est produit, est de préférence l'eau, contenant de préférence un agent de dissociation des protéines, par exemple, une solu- tion concentrée d'urée contenant avantageusement du chlorhy- drate d'urée. Ainsi, par exemple, de l'urée 8 M contenant de l'acide chlorhydrique   0,2 M   est particulièrement satisfai- . sant.

   D'autres liquides à constante diélectrique élevée sont les solutions aqueuses de composés hydroxy-aromatiques, par exemple celles contenant du phénol, du crésol, du   xylol,etc.;   une solution aqueuse d'acides minéral et organique, par exem. ple l'acide sulfurique ou chlorhydrique ou des acides alca- noiques inférieurs, tels que l'acide acétique, propionique etc. de préférence à un pH compris entre 4 et 6;

   des alca- namides et leurs dérivés N,N-disubstitués, tels que le for- mamide, le diméthylformamide, le diméthylacétamide et le 

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   diéthylaoétamide;   les diacoylsulfoxydes, telq que le dimé-   thyleulfoxyde,   des solutions aqueuses de sels d'amines hy-   drosolublea   aliphatiques, araliphatiques, aromatiques ou hétérocycliques, telles que la pyridine, la collidine, la triéthylamine, etc. 



   En général, il est conseillé d'ajouter un anti- oxydant dans le milieu, et des thiolo, tels que la cystéine. sont alora particulièrement appropriés. 



   Il est préférable de traiter la glande thyroide en vue d'éliminer la graisse, avant de la traiter avec le li- quide à constante diélectrique   élevée.D'une   manière commode, les glandes thyroides sont   homogénéisées   et extraites à plu- sieures reprises par de l'acétone froide ou autre   solvant     miscible   l'eau pour matières grasses. On ajoute de préféren ce l'acide éthylènediaminetétracétique (AEDT) aux glandes homogénéisées lord de la première extraction, mais pas pour les suivantes.

   Le résidu provenant de l'extraction finale'à l'acétode est ensuite avantageusement extrait à l'aide d'un solvant non miscible dans l'eau pour matières grasses, par exemple, un hydrocarbure ou un hydrocarbure chloré, tel que le   benzine,   le toluène, le chlorure de méthylène , le chloro- benzène, le chloroforme, etc. De préférence on répète paie- ment l'extraction plusieurs fois et l'excès de solvant   est        ensuite éliminé avantageusement, par exemple, par une extrac- tien ultérieure du produit par un solvant volatil, tel que l'acétone, suivie par un séchage, à l'air. 



   Toutes les opérations sont effectuées à basses températures afin d'éviter les pertes d'activité, et d'une   ,   manière appropriée à environ 4 C. 



   Après avoir traité le produit pour libérer le poly- 

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 peptide'désiré, la.;solution de polypeptide dans le solvant à constante diélectrique élevée est avantageusement traitée avec une concentration relativement basse d'un solvant orra- nique miscible à l'eau, par exemple, une cétone miscible à l'eau, telle que l'acétone, et/ou un acide alcanoique infé- rieur, tel que l'acide acétique, ceci afin d'éliminer les peptides et les   protéines à   poida moléculaire élevé qui sont ensuite jetées.

   On peut alors traiter la solution pour pré- cipiter le polypeptide désiré, de préférence en réduisant au minimum la précipitation dos impuretés constituées des protéines et des peptides restantes, Un agent de précipita- tion appropriée est, par exemple, un solvant éthéré, tel que le   diéthyléther.   



   On notera que les quantités exactes d'agents de précipitation dépendront de la nature de ces agents et de la nature des autres substances présentes, mais dans' chaque cas les quantités seront choisies en vue de précipiter autant que possible le polypeptide désiré tout en rejetant les im- puretés indésirées. En d'autres termes, à chaque stade de   f@   etionnement, on   rucueille   les fractions des substances désires à activité spécifique élevée et on rejette celles dont l'avtivité spécifique est basse ou nulle. 



   L activité spécifique peut être estimée à chaque stade en essay et le polypeptide, l'activité biologique du principe actif fornissant une base pour une méthode d'essai appropriée.   C'est   aiqui que, par   exemple,   le produit prove- nant d'une fraction   par@culière,   après une dilution appro- priée dans du sérum physicigique, peut être injecté par voie sous-cutanée à des souris ou es rats et le sang prélevé au coeur dosé après un laps de temp standard, pour en connai- 

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 tre la teneur en Ca et/ou en P. Les teneure normales en Ca et en P peuvent être déterminées chez des animaux témoins à qui on a seulement injecté du sérum physiologique. 



   Si on le désire, on peut effectuer d'autres stades de précipitation fractionnée,' par exemple, en précipitant le polypeptide à partir d'une solution d'acide acétique par l'ad- dition d'un agent de précipitation de   protéi-ne,   tel que l'a- cide trichloracétique. Le précipité peut être traité afin d'éliminer l'acide résiduel, puis ensuite être redissous. 



   Pour isoler le   polypeptide/on   peut le dissoudre dans un acide dilué, par exemple, de l'acide chlorhydrique 0,02 N, puis éliminer ensuite l'acide par traitement par une ' résine échangeuse d'ions basique. On obtient ensuite par luo philisation le polypeptide sous forme sèche. Même après pré- cipitation fractionnée, le polypeptide de thyrocalcitonine      peut être relativement impur, et il est recommandé d'effec- tuer une purification plus   poussée.-   En fait tous les modes opdratoires connue pour purifier des polypeptides peuvent généralement être utilisés les fractions étant à nouveau chipsies d'après leur activité spécifique élevée.

   Les modes de purification pouvant être utilisée'sont les suivants : 
1 - Chromatographie sur colonne contenant un tamis' moléculaire, telle qu'une colonne Séphadex constituée de dex- trane réticulé. C'est le mode opératoire préféré. La colonne est avantageusement traitée avec une substance, telle que l'albumine de sérum, en vue de réduire les pertes de   poypap-   tide dans la colonne. La qualité préférée de   Séphadex   est 
G-75, qui adsorbe les produits ayant un poids moléculaire in- férieur à 50.000 environ. 



   Le polypeptide est passé de préférence sur une co- 

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 lonne dans une solution tampon   légèrenent   acide, par exemple, d'acétate d'ammonium, à un   pH   de 4,7 et on utilise la même solution tampon pour développer la colonne. Le développement de la colonne s'effectue de préférence, relativement lente- ment, en vue de produire la séparation la plus efficace, par exemple, environ le volume d'un lit en 21 heuree. 



   2 - Chromatographie sur colonne contenant un pro- duit échangeur d'ions. On peut utiliser des échangeurs   d'iona        basiques ou légèrement acides, par exemple, les matières cel- lulosiques telles que la cellulose, la   diéthylaminoéthyl-cel-,   lulose ou la carboxyméthyl-cellulose. 



   3-   Electrophorèse,'de   préférence sur un milieu      solide, Comme exemples de milieux appropriée, on citeras la        cellulose,   le   chloru @   de polyvinyle, le polyacrylamide et le dextrane réticulés 
4 Distribution à contre courant. , 
5 - Sédimentation. 



   6 - Pénétratio- et   diffusion   à travers une   membrane   
On donnera ci-dessoue, à titre illustratif et non limitatif, des exemples,de préparation du principe actif du   médicament   de   l'invention,   
EXEMPLE 1 
Collection de   glandes   throides de chiens. 



     On   collecte des glandes thyroïdes (poids humide de 9 g environ) pendant trois après-midis sur environ   1.500   chiens.   On   coupe les glandes 10 minutes environ après avoir tué les chiens et on les refroidit immédiatement dans de l'eau glacée,on les débarrasse de tout tissu, graisse, etc., on les homogénéise dans un broyeur à viande et on les refroi- dit par immersion dans un mélange de neige carbonique et 

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 d'acétone contenant environ 30 mg d'acide éthylène-diamine- tétracétique. La quantité totale de glandes recueillies est de 9 kg (poids humide), Préparation de poudre de glandedégraissée,      
On effectue toute l'opération dans une chambre      froide à 4 C.

   On refroidit au préalable les réactifs, les récipients en acier inoxydable et la verrerie. On ajoute à 450 g de glandes thyroïdes homogénéisées. 1 litre   d'acé-   tone qualité "réactif" et 30 mg de AEDT (dans H2O), on laisse reposer pendant une heure, on homogénéisé dans un mélangeur en acier inoxydable pendant 2 minutes, à petite      vitesse, et   onilaisse   finalement reposer le mélange ainsi obtenu pendant 15 - 25 minutes. On agite de temps en temps le mélange homogène puis on le filtre à travers 6   épais-     aeurs   de gaze.

   On met à nouveau le produit solide en sus- pension dans 600 - 800 ml d'acétone et on l'extrait à l'acétone 10 fois de suite ( on n'ajoute pas de AEDT dans les extractions à l'acétone 2 -   10);dans   chaque cas, on jette   l'acétone.   On extrait 6 fois le résidu, avec chaque fois 600 -   800   ml de chloroforme (qualité purifiée); on      jette le chloroforme.

   On extrait do nouveau 10 fois le résidu à l'aide d'acétone, on étale la poudre de glandes sur une surface propre (plateau en acier inoxydable) et on la sèche pendant une nuit dans une chambre froide, on obtient ainsi une poudre rose,   450   8 de glandes   thyroidet,   humides donnent 60 g de poudre   sèche     dégraissée.   On   con.   serve la poudre dans un flacon en verre brun dans une chambre congelée. On extrait les 8,6 kg restants de la même façon. Rendement total s 1300 g ,   Technique expérimentale    ¯pour     isoler   la thyrocalcionine. 

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   Toutes   Ion   opérations sont effectuées dans une chambre froide à 4 C. 



     On   ajoute à 200 g de poudre de glande dégraissée séchée 2 litres d'urne 8 M et de la cystéine 0,1 N dans de l'acide chlorhydrique   0,2   N, on laisse reposer le mélange pendant une heure en agitant de temps en temps. On ajoute 2 litres d'acide acétique glacial et 2 litres d'acétone en agitant constamment et on laisse reposer le mélange pendant   une heure ; ajoute ensuite 6 litres d'acétone et 56 ml   de NaCl 1 N, en agitant fortement. On laisse reposer le mélange jusqu'à ce que le précipité soit complètement déposé, on le filtre à travers 4 épaisseurs de gaze et on jette le précipité. 



   On partage le filtrat en deux parties et on l'in- troduit dans deux flacons de 12 litres. On ajoute dans cha- que flacon   5   litres de diéthyléther exempt de peroxyde, et on laisse le précipité se déposer, On sépare par décantation la partie surnageante et on la jette.

   On recueille le   préci-   pité par   centrifugation   et on le lave deux fois avec un mé- lange d'éther et d'aoétone   (lil),   On disperse le précipité dans 1 litre d'acide acétique   à   20% (v/v) contenant de la cystéine   0,01   N et on agite le tout dans un agitateur magné. tique pendant 30 - 40 minutes en vue d'obtenir une solution au maximum .(on n'obtient pas une solution   complète),   On ajoute du chlorure de sodium sec afin d'obtenir une solution finale de NaC1 à 5% et on agite jusqu'à ce que le sel se dissolve complètement* Il se forme un précipite fin que l'on centri- fuge à   6.000T   et on jette le précipité.

   On ajoute suffi- samment d'acide trichloracétique à 50% pour former une solu- tion 7,5 % d'acide trichloracétique, puis on agite pendant 

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 15 minutes. Tout le polypeptide précipite de cette façon, et on recueille le précipité par   oentrifugation,   on le lave à deux reprises avec de l'acide trichloracétique à 5 % et encore une fois avec de l'éther exempt de   peroxyde.   



  On dissout le produit dans 1,5 litre d'acide chlorhydrique 0,02 N et on l'extrait à trois reprises avec un volume   égal        d'éther exempt de peroxyde. On élimine de la solution l'éther dissous, à l'aide d'un évaporateur rotatif. On fait passer . la solution aqueuse sur une colonne (2 x 30 cm) constituée d'une résine échangeuse   d'ions,     "Amberlite   IRA 400" (passant au tamis 4 ouverture de maille 1,19   -0,297     mm)   en vue d'é- liminer   l'acide   chlorhydrique. On lyophilise l'éffluent et on obtient 530 mg de produit brut. On récupère encore 150 mg sur la plateau métallique et sur les instruments en verre utilises. 



   Essai   biologique' sur le   polypeptide de thyrocalcitonine brut. 



   On réalise l'essai sur des rats mâles et femelles pesant 120 - 130 g. On injecte par voie sous-cutané à cinq animaux témoins, 0,5 ml de NaCl à 0,2 %. On anesthésie légèrement à l'éther les animaux pour les injections. On in- jecte d'une manière similaire par voie sous-cutanée, à cinq animaux d'essai, 0,5 ml d'hormone brute ( 1   mg/ml)   dans 
NaCl à 0,2 %. Au bout d'une heure, on recueille du sang chez   , les   animaux témoins et chez les animaux d'essai par une ponction dans le coeur. On analyse dans le sérum la teneur en Ca et en P. 



   Fractionnement de la thyrocalcitonine brute. a - ChroMathographie sur une colonne Séphadex G-75. 



   On   effectue   toutes les opérations de fractionne- ment à 4 C. On fractionne le produit brut sur une colonne 

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 Séphadex 0-75 ( 3 x 150 cm). On traite la colonne avec      300 mg d'albumine de sérum, puis on continue avec un tampon ' 
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 d'acétate d'ammonium 0,211., à pH 4,7 et à un débit de 35   40   ml/heure.   On laisse la colonne se développer pendant une 
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 nuit, et on étudie l'êrrluent, le lendemain on trouve qu'il ' ne contient pas de protéine.

   (Le développement de la colonne' à l'aide d'un tampon d'acétate d'ammonium se poursuit jus-      qu'à ce que   l'éffluent   ne contienne plus de protéine comme 
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 on le détermine en mesurant ltabsorption à une longueur d' onde de 277 m  dans un appareil du type   Beckman     DU).   



   L'hormone est préparée comme suit pour son utili- sation dans une colonne Séphadex on dissout 500 mg dans 7 ml d'un tampon d'acétate d'ammonium 0,2 M, on les   centri-     fuse   à 2 tours/minute pendant 6 minutes; puis on transfère 
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 la partie suvageante dans un tube à essai. On met à nouveau le précipité en sUBpen,lo dans 2 ml de tampon, on centri- fuge et on ajoute la part.1 t1t surnageante dans le tube à essai. 



  On met l'hormone dissoute sur la colonne Séphadex et  on élue à l'aide d'un tampon d'acétate d'arnmonium 0,2 M; on recueil- le des fractions de 6 ml toutes les   17   minutes. On   recueille   de cette manière un total de   180   fractions. 



  Résultats. 



    Essai sur l'hormone brute :   
Teneur   moyenne   en Ca du sérum (% en mg) Animaux témoins 10,6 Animaux ayant subi une injection   de 500  g d'hormone 7,9 (minimum de 2,7)   
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 Le résultat obtenu lors du fractionnement de la thyroaalci- 
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 o tonine brute sur une colonne SéPhadex G-75 est montré Pige 1* où sont   représentes   en ordonnées la densité du tube et en abscisses le nu- méro du tube, On lyophilise les fractions et on introduit le produit   sèche   dans des tubes \ essai de 5 ml, on redissout le produit et 

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 on le lyophilise à nouveau.

   Produit recueilli après   lyophi- ,     lisabion :   
 EMI15.1 
 
<tb> Fraction <SEP> Tube <SEP> n 
<tb> 
 
 EMI15.2 
 33-66 approximabivemenb 122 mg 2 67 - 86 15 mg '; 3 87 -107 15,7 ms 1 4 108-124 1,9 mz 5 125-160 6,9 rns 
 EMI15.3 
 Résultats des ennais biôleatgiie3 sur les I*raotton3 sortant de la colonne Séphadex n-75. 



  On injecte par voie sous-cutanée k quatre animaux ' témoins une solution oaline 1 02 %. On InJecte à des an1    maux     d'essai,   pour chaque fraction$ 0,5 ml d'une solution 
 EMI15.4 
 contenant 100 mierogrammes par ml de la fraction appropriée. 
 EMI15.5 
 
<tb> 
<tb> 



  Teneur <SEP> en <SEP> calcium <SEP> Différence <SEP> avec
<tb> 
<tb> du <SEP> sérum <SEP> % <SEP> en <SEP> mg <SEP> l'animal <SEP> témoin,
<tb> 
 
 EMI15.6 
 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ en mg. 
 EMI15.7 
 
<tb> 



  Animaux <SEP> témoins <SEP> la,5 <SEP> . <SEP> 
<tb> 
<tb> 



  Fraction <SEP> tube <SEP> N 
<tb> 
<tb> 2 <SEP> 67 <SEP> - <SEP> 86 <SEP> 9,3 <SEP> 1,0
<tb> 
<tb> 3 <SEP> 87 <SEP> - <SEP> 107 <SEP> 9,2 <SEP> 1,1
<tb> 
<tb> 4 <SEP> 108 <SEP> - <SEP> 124 <SEP> 7,8 <SEP> 2,5
<tb> 
<tb> 5 <SEP> 125 <SEP> - <SEP> 160 <SEP> 9,4 <SEP> 0,9
<tb> 
<tb> Taneur <SEP> en <SEP> phosphore <SEP> Différence <SEP> avec
<tb> du <SEP> sérum, <SEP> % <SEP> en <SEP> mg <SEP> l'animal <SEP> témoin
<tb> % <SEP> en <SEP> mg
<tb> 
 Animaux témoins 7,6 
 EMI15.8 
 
<tb> Fraction <SEP> Tube <SEP> N 
<tb> 
<tb> 2 <SEP> 67 <SEP> - <SEP> 86 <SEP> 7,6 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 3 <SEP> 87 <SEP> - <SEP> 107 <SEP> 6,6 <SEP> 1,0
<tb> 
 
 EMI15.9 
 4 o8 - 124 5,6 2#0 5 125 - lrio 7,6 0 
 EMI15.10 
 b   Chromatonph1e sur de la cnboxyméthyl-cel1uloe Produit :

   thyrocalcitonine de porc très purifiée (10 mg) 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 
 EMI16.1 
 
<tb> Colonne <SEP> 50 <SEP> cm <SEP> x <SEP> l <SEP> cm
<tb> 
<tb> débit <SEP> 0,5 <SEP> ml <SEP> à <SEP> la <SEP> minute
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Fractions <SEP> 3 <SEP> ml
<tb> 
<tb> Elution <SEP> gradientlinéaire, <SEP> acétate <SEP> d'ammonium <SEP> à <SEP> un
<tb> 
<tb> 
<tb> pH <SEP> de <SEP> 4,6, <SEP> 0,02 <SEP> M <SEP> - <SEP> 0,5 <SEP> M.
<tb> 
 



   Le principe actif est contenu dans le pic 1 (tubes 6 à   10)   (4,75 mg). Le pic 2 (tubes 12 à 15)(2,3 mg) présen- te seulement une faible activité. 



   Activité, pic 1 : 50 microgrammes abaissent la
2 : 50 teneur en calcium du sérum de   1,8 %   en mg ; pic 2: 50 microgram mes abaissent la teneur en calcium du sérum de seulement en ordonnées   0,5 % en mg. Un graphique d'absorption à 277 m  en fonction en abscisses   du numéro des   fractions/est   représenté à la Fig. 2. 



   Le procédé de séparation de l'exemple 1 est appli- que également pour isoler la thyrocalcitonine d'une poudre acétonique de glandes thyroïdes de bovins et d'êtres humains. 



  EXEMPLE 2 
On dissout 200 g de poudre de glande thyroïde de chien, séchée et dégraissée, préparée comme décrit dans l'exemple 1, dans 2 litres d'acide ohlorhydrique 0,2 N con- tenant de la cystéine 0,1 N. On chauffe la solution à 60 C pendant 5 minutes puis on la garde à température ambiante pendant une heure. 



   On ajoute ensuite comme dans   l'exemple.1,   deux litres d'acide acétique glacial et 2 litres d'acétone, et on applique le procédé de séparation de l'exemple 1, pour obtenir de la   thyrooaloitonine   séchée par congélation. 



  EXEMPLE 3. 



   On dissout dans 2'litres d'une solution aqueuse de phénol à 70%, 200 g de poudre de glande séchée et dé-   graissée,   préparée comme décrit dans l'exemple 1. On laisse reposer le mélange à température ambiante pendant 90 minutes puis à 4 C pendant 30 minutes. On ajoute ensuite le mélange 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 à 10 libres d'une solution d'acide acétique à 20 % dans l'aoétone,   à   laquelle on ajoute   56   ml de NaC1 1M. On agite      pendant 30 minutes le mélange résultant, on le filtre sur de la gaze et on jette le précipité. On mélange le filtrat aveo un volume égal d'éther et on laisse le précipité dépo- ser, la partie surnageante étant éliminée par filtration puis jetée .

   On recueille ensuite le précipité par centrifugation, on le lave deux fois avec un mélange d'éther et d'acétone   (lil)   comme dans l'exemple 1 et on opère ensuite comme dans l'exemple 1. On obtient de la thyrocalcitonine séchée par congélation. 



   On effectue le fractionnement d'un nombre d'échan- tillons de thyrocalcitonine de différentes origines sur une colonne Séphadex G-75 en utilisant exactement le procédé décrit dans l'exemple 1.    



  La Fig. 3 représente un graphique de la densité en ordonnées en abscisses     optique/en   fonction du numéro des   tubes/-dans   le cas de   thyro-   calcitonine brute   d'être   humain, et on voit qu'il y a deux pics entre les tubes 70 et 120;   ceux-ci   contiennent le prin- cipe actif. 



   La Fig.   4   représente un graphique de la densité   en ordonnées en abscisses optique en fonction du numéro des tubes-/dans le cas de thy-     rocalcitonine   brute de bovin, et montre que le prinoipe actif se trouve dans les tubes 68 - 91   (19,2   mg; 50  g   abais-   sent la teneur en calcium du sérum de 1,3 % en mg) et dans les tubes 92 - 132 (4,45 mg; 50  g abaissent la teneur en cal- cium du sérum de 1,8 % en mg). 



   On effectue une analyse des   amino-aoides   sur un échantillon hydrolysé du produit préparé dans l'exemple 1, après chromatographie sur la   oarboxyméthyl-oellulose.   Le 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 chromatogramme est réalisé dans les conditions de Moor et Stein à l'aide d'un analyseur d'amino-acides Phoenix. Les Fige 5 à 7 représentent des enregistrements provenant de l'analyseur. chaque division correspondant à 5 ml d'effiuent. 



  L'échelle est logarithmique et   l'aire   sous chaque pio re- présente la proportion relative de chaque amino-aoide pré- sent. Les conditions de l'analyse et le procédé d'identifi- cation des   amino-aoides   sont décrite aveo détails dans le manuel fourni par "Phoenix Précision Instrument Co, de   '   
 EMI18.1 
 Philadelphia Pennsytvan1e,U.S.A., (qui fabrique l'appareil utilisé). D'autres références pour le procédé et les   condi-   tions utilisés peuvent être trouvées dans "J. Briol. Uhem. 



  192, 663   (1951),   211, 893 et 907   (1954)et   Analytical Chem. 



   30, 1190 (1958). Les Fig. 5 et 6 montrent les résultats d' essais réalisés à un pH de 3,25 et de 4,25 respectivement sur une colonne de 150 cm dans une solution tampon de citrate 
 EMI18.2 
 0,2 N et à 5t? C, 3t ms.rrat la distribution des amino-aa3 des neutres et acides. 



   La Fig. 7 montre les résultats d'un essai réalisé à un pH de 5,29 sur une colonne de 15 cm dans une solution tampon de citrate 0,35 N et   à   50 C, et montre la distribu- tion des amino-acides basiques, le large pic étant dû à l'am-   , moniao.    



   On soumet le produit de l'exemple 1 à une éleotro- phorèse sur disque en   polyaorylamide   en utilisant l'appareil 
 EMI18.3 
 de "Canal Inàunsrlal (;vrra\;10n" de Bethesda, Maryland, U SsA.# la solution A étant à un pH de bzz - 9.0, la solu- tion   B   à un pH de b, b -   6,8,   le tampon étant à un pH de 8,2- 8,4.

   L'activité biologique est principalement associée a une bande à Rf   0,8   par rapport au colorant standard. 

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 EMI19.1 
 Le produit.. " do l'invention est adminiatrablo par voie parentérale et les exemples 4 à 11 qui suivent présentent des   compositions   contenant le principe actif   associa   à divers véhicules ou excipients   pharmaoeutiquement   administrables,   EXEMPLE 4*,     Thyrocalcitonine     pour   injection. 



   On introduit dans des ampoules de 2 ml de la poudre de thyrocalcitonine lyophilisée stérile préparée comme à l'exemple 1, à raison de 5 mg par ampoule, et on complète en ajoutant du sérum physiologique stérile. 
 EMI19.2 
 



  EXEMPLE 5. Thyrocalcitoninv¯¯¯dnns de la gélatine épais- se. 



   On disperse dans une solution stérile aqueuse à 16% de gélatine (2 litres) 2 g de poudre de thyrocalcitonine ' lyophilisée stérile préparée comme à l'exemple 1. Ce produit doit être chauffé Jusqu'à environ 50 C immédiatement avant l'injection en vue d'assurer une liquéfaction complète à ' la température du corps. On remplit des   capsules   de 2 ml avec la solution de gélatine, chaque capsule contenant 2 mg de substance active. 
 EMI19.3 
 EXEMPIJE 6... Thyrocalcitonine dans de la gélatine peu épaisse. 



   La composition de l'exemple 5 peut être modifiée, en passant à l'autoclave la solution de gélatine à 16% afin d'abaisser le point de liquéfaction à la température am- 
 EMI19.4 
 biante, avant l'addition de thyrooa7.oitonine. 



    EXEMPLE 1.     Thyrocalcitonine   dans du solde zinc. 



   On ajoute une suspension stérile d'hydroxyde   de   zinc (0,25 mg de Zn par   ml), à   un pH de 7 - 8, à de la thy- rocalcitonine lyophilisée stérile afin d'obtenir un rapport et on verse le mélange dans des ampoules de 2 ml, chaque 
 EMI19.5 
 de 0,1 mg de zinc par mg de thyrooalo1ton1nejWmpoule conte- nant 5 mg de thyrocalcitonine! une seule dose de ce produit 

 <Desc/Clms Page number 20> 

 ne doit pas contenir plus de 1 mg de zinc, 
 EMI20.1 
 EXEMPLE 8. ThYooalo1ton1ne dans du gel d'alumin1. 



   On ajoute à pH 6 - 7,5 une suspension stérile de phosphate d'aluminium (0,8 mg d'Al par   ml) à   de la thyro- calcitonine lyophilisée stérile afin d'avoir un rapport de 0,8 mg d'Al pour 10 mg de thyrocalcitonine. On remplit de cette suspension des ampoules de 2 ml, chaque ampoule conte- nant 10 mg de   thyrocalcitonine,     EXEMPLE 9.   Complexe de thyroide et de thyrocalcitonine 
On ajoute une suspension stérile de protéine.de glande thyroïde dénaturée par chauffage (20 mg/ml) à de la   thyrooaloitonine   lyophilisée stérile afin d'avoir un rap- port de 20 mg de protéine de glande thyroïde pour 1,0 mg de   thyrocalcitonine,   On remplit de cette suspension des ampou- les de 2 ml, chaque ampoule contenant 2 mg de   thyrocalci-   tonine. 
 EMI20.2 
 



  EXEMPLE 10. Composition Thyrocalciton1ne-lobin 
On mélange de la thyrooaloitonine lyophilisée sté- rile avec une solution stérile de globine de boeuf (6 mg par ml) afin d'obtenir une concentration finale de 2,0 mg 
 EMI20.3 
 de globine pour 1,00 thyrocalcitonine, On remplit de cette solution des ampoules de 2ml, chaque ampoule contenant 6 mg 
 EMI20.4 
 de thyrocalcitonine, EXEMPLE 11.

   Thyrocaloitonine dans la carboxyméthyl- cellulose (CMC) On met en suspension de la thyrocaloitonine lyo- 
 EMI20.5 
 philisée stérile dans une solution de carboxyméthyl-cellu- lose   (Type.70,   qualité   supérieure !  30   mg/ml)   à un pH de 6 - 7, afin d'obtenir un rapport de 10 mg de CMC pour 1,0 mg 
 EMI20.6 
 de thyrocalcitonines On remplit de cette solution des am- poules de 1 m1; chaque ampoule contenant 3 mg de   thyrocalci-   tonine. 

 <Desc/Clms Page number 21> 

 



   Dans les exemples 7 - 10, l'eau du milieu peut être remplacée par une quantité égale de solution stérile de géla- tine à 16% utilisée dans l'exemple 2 ou 3. 



   Dans les exemples 7 et 8. l'eau du milieu peut être avantageusement remplacée par une solution stérile à 20 - 30 % de polyvinyl-pyrrolidone. 



   Toutes les préparations des exemples 4 à 11 peuvent avantageusement contenir un agent bactériostatique,, par exemple,   0,1 à   0,2 % en poids de phénol ou de crésol et un anti-oxydant par exemple 0,01   %   en poids de cystéine ou 0,002   %   en poids de thiodiglycol.

Claims

REVENDICATIONS.

1,- Procédé de préparation de polypeptide de thyrocal- citonine, caractérisé en ce qu'on traite la glande thyroïde par un liquide cyrat une constante diélectrique élevée en vue de libérer la polypeptide de la matière complexée où il ae trouve, puis on effectue un fractionnement en vue de le séparer des impuretés associées.

2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la glande thyroïde est une glande thyrotde d'être humain, de bovin, de mouton ou de porc.

3.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 1 et Si) caractérisé en ce que le liquide 1 constant* diélectrique élevée et l'eau.

4.- Procédé suivant larevendication 3, caractérisé en ce que le liquide @ @@@te diélectrique élevée cet une solution aquause s'orèe @enant un sel d'urée, 5.- Procédé suivant l'@ ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le liquide à constante dié- lectrique élevée est une solution aqueuse d'un composé hy- droxyaromatique, d'un acide minéral ou organique ou d'une amine aliphatique, araliphatique, aromatique ou hétérocycli- que ou un alcanamide non substitué), un alcanamide N-sub- stitué ou un dialcoyl-sulfoxyde.

6.. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le liquide à constante diélectrique élevée est une solution aqueuse de phénol, de crésol ou de xylol, une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, d'acide sulfurique, d'acide acétique ou d'acide propionique, le formamide, le diméthylformamide, le diméthylacétamide, le diéthylacétamide, le diméthyl-sulfoxyde ou une solution aqueuse de pyridine, de collidine ou de triéthylamine. <Desc/Clms Page number 23>

7.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que le liquide à con- stante diélectrique élevée contient un anti-oxydant.

8. - Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que l'anti-oxydant est la cystéine.

9.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que la glande thyroïde est dégraissée avant son traitement par le liquide à con- stante diélectrique élevée.

10. - Procédé suivant la revendication 9, caractérise en ce que la glande thyroïde est broyée et extraite avec un solvant pour matières grasses miscible à l'eau.

11.- Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que le solvant pour matières grasses et l'acétone.

12.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 10 et 11, caractérisé en ce qu'après avoir effectué une première extraction à l'aide de solvant miscible à l'eau, on extrait la glande thyrolde avec un solvant pour Matières grasses non miscible à l'eau.

13.- Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que le solvant non miscible à l'eau est un hydro- carbure ou un hydrocarbure chloré.

14.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que la solution de polypeptide désiré et de liquide à constante diélectrique élevée est traitée par un agent de précipitation de proté- ines pour éliminer les polypeptides et les protéines indé- sirables à poids moléculaire élevé.

15.- Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent de précipitation des protéines est un acide alcanoique ou une cétone miscible à l'eau. <Desc/Clms Page number 24>

16.- Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'on précipite le polypeptide désiré en ajoutant un agent de précipitation des protéines qui retient en même temps au moins une partie des impuretés à bas poids molécu- laire présentes.

17. - Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce que l'agent de précipitation de protéines est le diéthyléther.

1 8.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que le polypeptide est soumis à une précipitation fractionnée ultérieure utilisant, comme agent de précipitation, l'acide trichloroacétique.

19.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que le polypeptide est soumis à une purification par chromatographie, électro- phorèse, partage à contrecourant, sédimentation ou péné- tration et diffusion à travers une membrane.

20.- Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce que le polypeptide est soumis à une chromatographie sur un tamis moléculaire ou sur une résine échangeuse d'ions basiques ou légèrement acide.

21.- Procédé, en substance, tel que décrit plus haut, notamment dans les exemples.

22.- Polypeptide de thyrocalcitonine, préparé par le procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 à 21.

23.- Polypeptide de thyrocalcitonine, telle qu'elle est caractérisée plus haut par ses caractéristiques physiques, chimiques et biologiques.

24.- Composition pharmaceutique comprenant un polypep- tide de thyrocalcitonine et un ou plusieurs supports ou excipients pharmaceutiques, caractérisée en ce qu'elle se <Desc/Clms Page number 25> présente sous forme de dose unitaire.

.25.- Composition suivant la revendication 24, caracté- risée en ce que chaque dose unitaire contient de 0,1 à 2,0 mg de polypeptide de thyrocalcitonine.

26.- Composition suivant la revendication 24, caracté- risée en ce que chaque dose unitaire contient de 1 à 10 mg de thyrocalcitonine.

27. - Composition suivant l'une ou l'autre des revendi- cations 24 à 26, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme d'injections.

28.- Composition suivant la revendication 27, caracté- risée en ce que le support ou l'excipient de polypeptide de thyrocalcitonine en injections est de l'eau stérile exempte de pyrogène, une émulsion huileuse ou une huile stérile ac- ceptable par voie parentérale.

29.- Composition sous forme d'injections suivant l'une ou l'autre des revendications 27 et 28, caractérisée en ce qu'elle contient un vhicule ou un excipient qui retarde la libération du polypeptide.

30.- Composition suivant la revendication 29, caracté- risée en ce que le véhicule ou l'excipient contient de la gélatine partiellement hydrolysée ou de l'hydroxyde de zinc et de la globine.

31.- Compositions, en substance, telles que décrites plus haut, notamment dans les exemples,