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titi prédéterminée de sérum sanguin que l'on a déprotéiné et d'un indicateur qui comprend eaaentiellement un chélaté à bas.
de cuivre, presque complètement lié et à l'état cuprique, avec un élément faisant partie du groupe qui consiste des 2,2'-bi- quinolines et 1,10-phénanthroline substituées en 2,9- dana une solution aqueuse alcaline d'un volume prédéterminé et dans des conditions favorables à la réduction du cuivre, et en- nuite on mesure la quantité de cuivre réduit à l'état cuivreux en se basant aur la transmission de lumière de la solution aqueuse. Ainsi que le conçoit l'homme de l'art, on peut alors calculer la quantité de gluoose en se rapportant une solu- tion de glucose étalon que l'on traite de la même manière que la substance soumise à l'analyse.
Les procédés modernes pour le dosage du glucose san- guin ont commencé en 1920 aveo l'introduction de la technique bien connue proposée par Folin et wu à l'aide de laquelle le dosage du glucose au laboratoire est rendu suffisamment réa- lisable pour en faire un des procédée chimiques les plua cou- rants que l'on emploie en laboratoire clinique.
La contribu- tion la plus importante de ce procédé à l'étude du glucose dana les fluides du corps consiste en ce qu'il démontre en la- boratoire clinique que lea monosaocharides sont capables de réduire certaine ions métalliques en solution alcaline chaude et que l'on peut contrôler cette réduction avec une précision suffisamment acceptable pour la rendre utile aussi bien dans la médecine que dans l'industrie,
Bien qu'on ait démontré la réduction des ions mé- talliques autrea que le cuivre par le gluooae, l'utilisation de l'ion ourprique à cette fin est considérablement répandue ce qui cet démontré par une multitude de variations sur la
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technique de base.
Les objectifs principaux de la plupart des modifications du procédé de base ont été de réaliser un tout pour le dosage quantitatif du glucose qui serait plue spéci- fique pour le glucose, qui offrirait une stabilité accrue des réactifs, et une plus grande stabilité de la réaction colorée finale. On a proposé d'autres modifications qui représentent une tentative ayant pour objet de supprimer le tube à sucre comportant un étranglement qui était néoessaire dans les pre- miers procédés d'analyse du sucre pour contrôler la réoxyda- tion du ouivre.
En général, tous les chercheurs dans ce domaine se trouvaient en présence du problème de la conservation du cuivre en solution et avaient à empêcher sa réoxydation. A cet effet, il a été de pratique courante d'utiliser le tartrate et/ou le sult te en solution conjointement au ouivre et autres réactifs,
Plas réoemment, on a proposé de convertir en un oom- plexe, le ouiv: récuit dans une solution aloaline de tartrate renfermant des ion), de sulfate, à l'aide d'un composé à base de phénanthroline an logue à certains des corps actuellement utilisés. On cite à ce propos l'article par Maya E.
Broqn, M.S., "The Journal of the American Diabètes Association, Janvier- Février 1961, Vol, 10, N , Pages 60-62."Cea techniques ré- oentes comportent l'addition de l'agent de oomplexation pour le cuivre, d'une manière générale, à la solution alcaline de tartrate renfermant le cuiv. Il en résulte que tous les ions cupriques ne sont pas liés à 1,gent de oomplexation en raison de la présence du tartrate et à c@se d'un excès des ions cu- priques .
On trouve que la présence d'un excès d'ions cupriques et/ou la présence d'ions de tartrate et ou la présence d'ions
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de chlorure provoque la réoxydation des ions cupriques au oours du procédé de réduction primaire. Il en résulte que même avec ces efforts tous récents, pour neutraliser la réc- xydation, on ne peut pas utiliser un tube à essaie ordinaire.
Il faut avoir un tube à essais oomportant un étranglement et/ ou la présence d'ions de sulfate. Même en utilisant ces der- nières précautions, les résultats ne.sont pas homogènes.
La présente invention oomporte l'utilisation de ohélatés de ouivre qui suppriment la nécessité d'utiliser le tartrate ou autres acides hydroxylés dont on avait besoin an- térieurement pour suspendre en solution l'ion ouprique, et suppriment également la nécessité d'utiliser d'autres sels, tels que les sels de sulfate que l'on ajoute habituellement à la solution pour empêcher la réoxydation. On sépare tout l' excès de ou ivre de la solution avant le dosage de la substance oxydante ou réductrice et le restant de cuivre est presque complètement lié à l'agent de complexation,
Les phénomènes de réoxydation caractéristiques des procédés antérieurs sont éliminés au moyen de la présente in- vention.
A l'aide de ce contrôle de la réoxydation, on peut utiliser commodément un tube à essais ordinaire à parais droites ou autre réoipient convenable. Le contrôle de la réoxydation de l'ion ouivreux dont on fait usage par exemple dans l'ana- lyse du glucose permet un temps d'ébullition très court par comparaison aux procédés antérieurs. En outre, le oomplexe coloré final est stable pendant 5 jours ou plus, ce qui offre des avantages évidents dans les analyses colorimétriques.
Dans la mise en oeuvre de la présente invention, on complexe le ouivre aveo une phénanthroline substituée, et plus particulièrement une 1,10-phénanthroline substituée en 2,9-
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ou une 2,2'-biquinoline. D'une façon générale, on peut mettre en oeuvre, la présente invention avec n'importe quel composé organique qui comprend les éléments structures suivants :
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Dans cette structure, X peut être n'Importe quel radi- cal organique qui comprend des radicaux alcoyles tels que les groupements méthyle et éthyle, les radicaux aromatiques tela que le noyau benzénique, etc. etc.
Les valences libres sur les atomes de oarbone sont liées les unes aux autres d'une manière oonvenable par l'intermédiaire d'autres atomes de carbone formant ainsi des structures cycliques.
Plus particulièrement, l'agent de oomplexation est préférablement choisi dans le groupe constitué par la cuproïne (2,2'-biquinoline), la néoouprolne (2,9-diméthyl-1,10-phénan- throline), la bathocuproîne (2,9-diméthyl-4,7-diphényl-1,10- phénanthroline), et des sels solubles dans l'eau de ces der- niers tels que les sels chlorhydrates et hydrosulfatés. Des agents de oomplexation convenables comprennent également des corps tels que les corps précédents préférés dans lesquels ' les noyaux sont plus profondément substitués. Par exemple, la néocuproïne et la bathocuproîne citées ci-dessus peuvent avoir dans leur position 5/ou 6 des groupements substituée alcoyles, hydroxy, nitro, des atomes d'halogène, etc...
Le complexe à base de cuivre et de phénanthroline ou de biquinoline possède de nombreux pointe de similarité avec le système indicateur à base de fer et de phénanthroline.
Il apparaît que le système indicateur à base de cuivre est tout auseiutile que le système fer-phénanthroline et possede
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certains avantagea à l'aide desquels on obtient une plus grande stabilité du complexe coloré en solution aqueuse et ceci se produit particulièrement dans l'analyse de substances réductrices.
Par contraste au système fer-phénanthroline, les ions cupriques et cuivreux à la fois paraissent être forte- ment liée dans le chélaté et il y a très peu d'indications d'une détérioration de l'un ou l'autre des complexes en solu- tion chaude alcaline. En @ lorsqu'on a réduit, dans ces conditions, une fraction du chélaté cupr@ la forme cui- vreuse, le complexe coloré qui en résulte cet stable à la température ambiante pendant plus de quatre jours. Aucun agent supplémentaire de stabilisation n'est nécessaire et on n'a pas besoin d'autres agents de oomploxation pour la mise en suspension de l'ion ouprique.
Par la combinaison du cuivre ionique avec la phénanthroline ou la biquinoline substituée dans un rapport moléoulaire de 1 : 2, il se trouve que le ohé- laté sert ensuite d'indicateur quantitatif d'oxydation ou de réduction, la couleur s'intensifiant ou s'affaiblissant en proportion au nombre d'ions cupriques ou cuivreux dans les conditions d'essai. En raison du fait que le chélaté est si fortement fixe, la réoxydation n'est plus évidente.
On peut utiliser le présent indicateur pour l'ana- lyse de substances oxydantes et réductrices en phase liquide.
Un domaine de grande utilité est la recherche de diverses substances réductrices présentes dans le sang. A cet effet, on envisage que le présent procédé sert à analyser à la fois des fractions cellulaires et des fractions de plasma du sang. Dans la fraction cellulaire du sang, par exemple, les présenta in- dicateurs sont utiles dans le dosage du glutathion. Dans la fraction de plasma que l'on utilise de préférence dans sa for- me sérique, on dose faoilement un certain nombre de substances,
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Celles-ci comprennent, le glucose, la oréatinine, l'acide urique, et l'acide ascorbique.
Dans la mise en oeuvre de l'invention on effeotue normalement les réaction d'oxydation et de réduction en phase liquide qui peut être l'eau ou un solvant organique convenable tel que l'acétone, l'éthanol, le chloroforme, l'acétate d'é- thyle, l'acétate d'amyle, le tétrachlorure de carbone, le ben- zène, le dioxanne, etc. On ajoute l'indicateur renfermant le cuivre sensiblement complètement lié à un agent de chélation convenable à base de phénanthroline ou de biquinoline au sol- vant renfermant la substance oxydante ou réductrice. On peut ajouter l'indicateur à l'état solide mais on l'ajoute de pré- férence sous forme de solution d'indicateur dans un des sol- vants adéquats.
Une solution d'indicateur de mise en oeuvre peut également renfermer d'autres substances telles que l'al- oali lorsque oeoi est nécessaire.
On utilise le cuivre à l'état cuprique ou ouivreux selon qu'on dose une substance réductrice ou oxydante respeo- tivoment. On reoherohe des oonditions convenables telles que la sélection correcte du pH et l'apport de chaleur de façon à provoquer selon le oas la réduction ou l'oxydation du cuivre.
Les indicateurs considérés dans cet exposé sont caractérisée par un virage de la couleur qui est brillant et net lorsqu'ils passent de l'état oxydé à l'état réduit wt in- versement. Par exemple, la cuprolne est pourpre à l'état cui- vreux et vert olair à l'état ouprique, On peut utiliser le virage de la couleur de l'indicateur pour doser la quantité de substance oxydante ou réductrice, dans la solution à analyser, par des teohniques classiques titrimétriques, gaaométriques et oolorimétriques bien connues des spécialistes.
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Dans le mode d'exécution préféré de la présente in- vention pour l'analyse du glucose dans le sérum sanguin, des conditions adéquates pour la réduction comprennent l'apprêt d'une solution alcaline à un pH de préférence au moins égal à 10. On peut effectuer oeoi en ajoutant un aloali tel que la soude caustique à une solution de l'indicateur. On obtient des conditions alcalines en ajoutant de préférenoe du carbonate par exemple du oarbonate de sodium.
Lorsqu'on utilise du oarbonate de sodium, la réduo- tion de l'indicateur a lieu, en général, plus rapidement dans une solution de plus forte concentration. Ainsi, l'achèvement de la réduction dans une solution de carbonate de sodium à 4% est plus rapide que dans une solution moins concentrée comme par exemple, une solution à une concentration de 0,1%. On note qu'une solution de carbonate à 1% est satisfaisante dans la plupart des applications pour l'achèvement rapide de la ré- action (2,5 minutes) et qu'il ne se produit aucune détériora- tion de la couleur développée dans le cas ou la durée de chauf- fage concomitante dépasse cette durée de temps de développe- ment maximal de la couleur.
Lorsqu'on recherche des substances oxydantes ou ré- ductroies autres que le glucose et dans des milieux autres que le uang ou le sérum sanguin, la sélection du pH sera faite selon les conditions, connues des spécialistes, propres à pro- voquer la réduction du cuivre par la substance. Dans tous les cas, y compris celui du glucose, il est possible qu'un apport de ohaleur (provenant d'un bain-marie par exemple) soit né- cessairs de façon.à accélérer le temps de réaction.
Dans le présent procédé on introduit l'indicateur à base de cuivre et de phénanthroline ou de biquinoline dans la solution à analyser en une quantité suffisante pour qu'il
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réagisse avec la totalité de la substance oxydante ou redue- trioe en solution, bien qu'un excès puisse avantageusement être présent. Toujours dans le oas de glucose dans le sérum sanguin, on note qu'une solution de l'indicateur qu'on addi- tionne à l'échantillon de sérum et dont la concentration en sel de cuivre hydraté est de 7,5 mg% est très satisfaisante.
Par exemple, l'utilisation d'une solution d'indicateur de mise en oeuvre qui contient environ 7,5 mg% de sulfate de cuivre hydraté est très satisfaisante pour la réduction d'une solution étalon de glucose à 300 mg% dans les conditions dé- crites dans cet exposé.
La oonoentration à utiliser fait l'objet de varia- tions considérables, selon les corps recherchée. Cependant, il faut éviter de préférence une concentration trop basse de l' indicateur étant donné qu'il se produit un certain degré d' inhibition sté/rique aux très faibles concentration. Ainsi, alors qu'une concentration de l'indicateur de 7,5 mg% en sel de cuivre est adéquate pour l'utilisation avec un étalon de glucose à 300 mg%, on peut encore obtenir des résultats adé- quate lorsque la concentration de l'indioateur tombe à 2,5 mg% en sel de cuivre.
Par oontre, l'empêchement sté/rique peut devenir un facteur dans le oas où la concentration de l'indi- oateur tombe considérablement en dessous de cette valeur no- tamment à environ 1-1,5 mg%
De toute façon, il importe de souligner qu'une quan- tité suffisante de l'agent de chélation doit être présente de façon à lier presque entièrement toute quantité de cuivre que l'on aura sélectionnée.
Ceci peut facilement être calculé é- tant donné qu'il faut deux molécules d'agent de chélation pour chaque atome de cuivre. âinsi qu'on l'a souligné précédemment, l'étendue de la surface du fluide en contact avec l'air n'est pas décisive
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dans le posent procédé et celà à rencontra des procédés an- térieurs qui exigeaient l'utilisation de tubes à sucre com- portant un étranglement ou d'autres techniques ayant pour but d'éviter la réoxydation de l'ien cuivraux du cours de l'ébul- lition et d'autres conditions réductrices. Ces conclusions se basent sur des expériences dans lesquelles on utilise trois récipients à essais différents présentant des superficies va- riables du fluide en contact avec l'air.
Tandis qu'on observe que les récipients, dont le contact avec l'air est inférieur, provoque plus t8t le développement d'une couleur dans l'indi- cateur, la réaction que se produit dans les récipients de n' importe quelle capacité provoque finalement le développement de la même densité de couleur lorsqu'on la laisse se pour- suivre jusqu'à la fin,, En conséquence, on conclut que la dit- férence dans la vitesse de développement de la couleur est en rapport avec la différence de temps nécessaire pour chauffer les solutions dans les différents récipfents à une température nécessaire pour effectuer la réduction du cuivre et que s'il se produit une réoxydation dans le présent procédé, elle ne se rapporte pas à la superficie du fluide exposé à l'air.
Ces faits sont représentés dans la figure 1 où trois échantillons désignés par A, B et C sont décrits graphiquement. A est exé- cuté dans un tube à essais de 13 x 100 mm, B dans un tube à essais de 17 x 150 mm, et C dans un ballon à fond rond "Kjeldahl" de 30 ml. Dans cette figure 1, les temps d'ébullition en minutée sont donnés en abscisses et les absorptions sont représentées en ordonnées, Dans chaque cas, on utilise un étalon de glucose de 300 mg% accompagné de témoins appropriés. On utilise l'indicateur et le mode opératoire général de l'exemple 1 décrit ci-après.
Le présent procédé et indicateur sont illustrés par les exemples suivants qui ont pour objet le dossage du glucose dans le sérum sanguin.
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EXEMPLE 1
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Dosage du glucose à, l'aide de l'indicateur au ouivre-néoouprolne - Solution concentrée d'indicateur
On ajoute 15 mg de sulfate de cuivre à l'état hydra- té à 50 ml d'une solution aqueuse renfermant 100 mg de chle- rhydraté de néocuprolne. On utilise pour cet usage de l'eau dépourvue d'ions métalliques et de substances réductrices.
Il se forme un ohélaté ouprique dont la couleur est verte.
L'ion ouprique reste en solution lorsqu'on l'ajoute à un mi- lieu alcalin. Ce concentré est stable à la température am- biante pendant au moins deux mois.
En cette forme, le chélaté sert d'indicateur quan- titatif de réduction que l'on peut alors ajouter à une solu- tion alcaline ou acide pour déterminer la présence (ou la con- centration) de substances réductrices dans les conditions d' utilisation. Dans le cas où l'on obtient le cuivre à l'état cuivreux. il peut être converti à l'état ouprique à l'aide d' un agent d'oxydation adéquat. Inversement, dans le cas où l'on obtient l'état ouprique et que l'on doit utiliser l'indicateur pour déterminer des substances oxydantes, on peut le convertir à l'état cuivreux à l'aide d'un agent réducteur adéquat.
- Réaction de mise en oeuvre pour l'analyse du glucose.
On ajoute 5 ml de la solution concentrée de l'indi- cateur 95,0 ml d'une solution aqueuse de carbonate de soude à 1%. Ce réactif est caractérisé par une teinte très faible bleue-verte et reste limpide, sans aucune auto-réduction im- portante de l'ion cuprique, pendant quelques jours à la tempé- rature ambiante. Le pH de la solution est de 10,8.
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Application au sérum sanguin.
On recueille du sang oxalaté de la manière habituelle.
On peut utiliser une goutte de sang provenant du doigt à oon- dition qu'elle soit immédiatement placée dans l'hydroxyde de sodium ou de baryum utilisé pour la précipitation des pro- téines. On prépare un filtrat dont le rapport hydroxyde de sodium ou baryum-sulfate de zinc est de 1:200 ou 1:100 à l'ai- de \.le réactifs convenablement équilibras de façon à assurer la neutralité. On utilise ces solutions pour obtenir un fil-
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trat déprotéind selon le procédé ue :3oH.o[yi, H.: liA Mothod for the Préparation of Blood Filtrâtes for the Ueterndnation of Sucar, J. Bol. Che. 86 655-663, 1930".
1, Oljoute 1 ml d'un filtrat à 1:200 (ou l'équi- valent d'un étalon de Glucose de valeur connue) à 6 ml d'un réactif itruic4tteur de mise en oeuvre, dans un tube à eaa.-ip propre. On utilise alen,errt un témoin approprié.
2 On olace les tubes à essais dans de l'eau en forte ébullition pendant 2,5 minutes après quoi on les refroidit à la température ambiante sous l'eau du robinet.
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3 On fait des lectures spectrophotométriques au voisinage de la longueur d'ondes d'absorption n,axiluule (454 mu).
La concentration er. glucose est i>roPyortipr.rrelle à la densité optique ceinte représenté sur la 1'4.,urne 2 où A aicnifie réaction rrac:yrvir.a, i'ilc,rt omoyyi 1:2UC, 2,5 Il,i1lUt.05 d'ébullition -* 454 mu, B stLdiîe glucose t'tg et C ::Ji:rdfie pourcer,tace de transmission,
Ainsi qu'on l'a représenta ci- dessus, on prépare les
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indicateurs e::Llats de la présente invention par la simple mise en contact en phase liquide du cuivre et de l'agent de chélation nélectionné.
EXEMPLE II Dosage du Glucose à l'aide de l'Indicateur
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à base de Cuivre et de 3athocuproine,
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- Solution Concentrée d'Indicateur
On ajoute 50 mg de sulfate de cuivre à l'état hydraté à 50 ml d.'une solution aqueuse renfermant 200 mg de bathoou- prolne sulfonate de sodium. L'eau doit être dépourvue de sub- stances réductrices et d'ions métalliques. Un ohélaté au cui- vre se forme à partir de cette combinaison et est d'une cou- leur jaune pâle. L'ion ouprique reste en solution lorsqu'on ajoute l'indicateur concentré à un milieu alcalin.
Le concen- trat est stable à la température ambiante pendant quelques jours et on peut l'ajouter à une solution alcaline ou acide de façon à déterminer la présence ou la concentration de substan- ces réductrices.
Réactif de mise en oeuvre.
On ajoute 5,0 ml de la solution concentrée de l'in- dioateur à 95,0 ml d'une solution aqueuse de carbonate de soude à 1%. Le réactif est d'une teinte jaune très pale et ne présente pas d'auto-réduction importante pendant 2 jours à la température ambiante. Le pH de la solution est de 10,8.
Mode Opératoire pour l'analyse
On recueille du sang veineux oxalaté de la manière habituelle. On peut utiliser une goutte de sang provenant du doigt à condition quelle soit immédiatement placée dans l'hy- droxyde de sodium ou de baryum utilisé pour la précipitation des protéines. On prépare un filtrat dont le rapport hydro- xyde de soude ou de baryum-sulfate de zino est de 1:400 de la manière enseignée par Somogyi (voir exemple 1), les réactifs étant équilibrés d'une manière adéquate de façon à assurer la neutralité.
1 On ajoute 1,0 ml de filtrat (ou l'équivalent d'un étalon de glucose de valeur connue) à 6,0 ml de réactif indi-
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cateur de mise en oeuvre, dans un tube à essais propre. On emploie également un témoin approprié.
2 On place les tubes à essais dans de l'eau en for- te ébullition pendant 2,5 minutes et on les refroidit ensuite à la température ambiante sous l'eau du robinet.
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3 On fait des lectures spectrophotométriques au voisinage de le longueur d'ondes d'absorption maximale (479 Mû*) La concentriàtion en glucose est proportionnolle à la densité optique coiiiie représenté sur la figure 3 où B oien1fio glucose mg ;6! C signifie pourcentage de transmission et D signifie réuctiofi buthocprolne, filtrat sonoiyi 1:400 - 2,5 iniriutes d'ébullition 479 mu.
EXEMPLE III
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Dosage du glucose à l'aide ue l'indicateur à buse de cuivre et ue Cuproïne On prépare une solution d'indicateur de rccise en
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oeuvre confortritirient aux exemples prJcédenta à cela près que l'on utilise le( cuprotne comme agent de chélation. On dépro- téine du sérun, sanguin à l'aide du procodé de Somoryi et on dose le glucose comme dans les exemples pr6cédento. Les ré- sultats sont représentés sur3.a figure 4 où B signifie glucose mg t'l, C siiiit'ie 1,ourceniuge de trul1smi8sion et à uter.1f'1e réaction cuprolne, filtrat Sofhocyi 1:25 - 5,0 minutas d'ébul- lition 5ra mu.
Ainsi qu'on 1a noté prdcderm,er,t, ieprocedés an.. térîeurs comportaient le problème de la rdoxyaation du cuivre.
Pour éviter l'utilisation du tube à sucre comportant un étran- glement, on a proposé antérieurement d'ajouter des ions de sulfate à la solution sous forme, par exemple, de -sulfate de
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sodium, Des étuu:J en rapport avec la présente invention dé- n,ontrent qu'en pr4Jence des indicateurs décrits au présent exposé, l'addition de plus ue 18% de sulfate ue sodium sert à aU±'II.enter lu uensite de la couleur finale obtenue.
On note que l'effet de l'ion de sulfate est de nature rdductriae et varie avec la concentration en sulfate de sodium en l'absence d'autres
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substances réductrices, eteet-A-dire, que plus la concentration
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en sulfate est élevée, plue l'effet réducteur sur l'indica- teur à base de cuivre est puissant. Etant donné que le pré- sent procédé n'exige pas la présence d'ions de sulfate, il est bien plus proche de l'idéal pour le dosage du glucose dans le sérum sanguin que les procédés antérieurs.
Les procédés antérieurs comportent également la pré- nonce d'ions de tartrate ou d'autres acides hydroxylés dont l'objet est de suspendre l'ion ouprique en solution pour le dosage du sucre sanguin, Ces corps sont eux-mêmes des sub- stances réductrices et ont tendance à rendre impossible le dosage direct du sucre sanguin lorsque leur concentration est augmentée. Etant donné que le présent procédé n'exige pas la présence de ces corps, il est doté d'avantage évidents par rapport aux procédés antérieurs en ce qui concerne la précis sion pour le dosage du gluoose.
De même, de nombreux chercheurs ont modifié les techniques de dosage du sucre sanguin en utilisant diverses substances en solution télis que le bisulfite de sodium, l'ala- nine, le chlorure de sodium, le sulfate d'ammonium, et des ions de phosphate. Ces substances ne sont ni avantageuses, ni nécessaires dans le présent procédé. On note que la présence de fortes quantités d'un grand nombre de ces substances réduisent l'indicateur et qu'il faut corriger cela dans les témoins ou par d'autres moyens, si possible.
On note que les ions d'acétate ont un effet parti- culier sur le développement de la couleur des présents indica- teurs du glucose. On trouve que le glucose ne réduit pas les présents indicateurs en présence d'ions d'acétate provenant de l'acétate de sodium par exemple, lorsqu'on substitue l'acétate au carbonate ou autre substance alcaline dans le procédé de
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dosage du glucose ainsi qu'on l'a illustré dans les exemples précédents. Par contre, l'acide urique et la créatinine ré- duisent les indicateurs à la température ambiante et à dea températures élevées également en présence de tampons à l'acé- tate ayant un pH allant environ de 5 à 8.
On note que la ré- duction la plus favorable de l'acide urique se produit aux environs du point neutre, alors qu'en môme temps il y a une absence complète de l'effet du monosaooharide de glucose.
Ces découvertes conduisent à un aspect de la pré- sente invention qui permet le dosage de l'acide urique et de la créatinine en présence du glucose. Ainsi, dans le oas où l'échantillon à analyser contient du glucose, il suffit eau- lement d'ajouter une quantité suffisante d'ions d'acétate pour ramener le pH à environ 5 à 8 et ainsi le glucose ne présente aucune gène pour le dosage.
Par oontre, si l'analyse a pour but de doser le gluoo-. se et que l'échantillon, au départ, contient de la créatinine et de l'acide urique ainsi que d'autres substances réductrices, on peut éliminer oelles-oi d'une manière adéquate par la sé- lection du procédé de précipitation des protéines qui convient le mieux tel que celui de Somogyi. Le filtrat de Somogyi ne contient essentiellement que des agents réducteurs a base de monosaccharides et ne contient pas de quantités importantes d'autres agents réducteurs. En variante, il n'est pas néons- saire de séparer l'acide urique et la créatinine de la solu- tion lorsqu'on dose le glucose pourvu que le dosage du glucose N'effectue conformément au mode d'exécution préféré en solu- tion alcaline carbonatée.
On trouve que l'acide urique ou la créatinine n'apportent aucun effet important l'analyse des monosaccharides lorsqu'on ajoute ces deux substances en oon-
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centrations physiologiques directement à la solution de glu- cose qu'on analyse, On.se rapportera à la figure 5 qui repré- sente la réduction de l'indicateur par le glucose en présence d'acide urique et de créatinine, l'acide urique (5 mg %) et la créatinine (2 mg %) ayant été ajoutés au ême glucose norma- lisé à 100 mg %, pour les résultats graphiques des expériences dans lesquels on utilise un procédé analogue à l'exemple 1 à l'exception des ameuta réducteurs supplémentaires cités.
Dans cette figure 5, F signifie glucose, G signifie glucose et acide ' urique, H signifie glucose acide urique et créatinine et I si- gnifie absorption.
Lorsqu'on recherche la créatinine et l'acide urique on peut différencier les caractéristiques et réduction de l'un en présence de l'autre à l'aide des conditions particulières de réduction utilisées. Ainsi, lorsqu'un échantillon à analyser contient à la fois l'acide urique et la créatinine, on peut les combinerà un indicateur, comme dans l'exemple 1, et si on choisi convenablement les conditions de réduction, on peut déterminer sélectivement l'effet réducteur de l'acide urique seul.
On a mis au point certaines conditions adéquates pour la réduction sélective et préférentielle de l'acide uri- que qui comportent un ajustement du pH à environ 5-6. Si on applique de la chaleur, la réduction est accélérée. Si on ra- mène le pH à environ 7-8, l'acide urique et la créatinine pro- voquent le virage de l'indicateur. La quantité d'aciue urique, par conséquent, peut d'abord être déterminée en utilisant des conditions sélectives et si on détermine le total, la quanti- té de créatinine est facilement calculée en prenant la diffé- renée des deux valeurs.
On comprendra bien que les conditions ci-dessus pour la réduction sélective ne sont données qu'à titre d'illustration et que des variations considérables peu- vent être apportées conduisant au même résultat.
Lersou'on utilise le sérum sanguin pour le dosage du sucresanguin, il convient d'utiliser de préférence la technique ue Somogyi pour la déprotéinisation. On obtient à
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l'aide de cette technique un filtrat limpide qui cet très sa- tisfaisant pour l'exécution du présent procédé. Par contre, . ci on désire doser l'acide urique ou-d'autres substances ré- ductricer dans le sérum sanguin, il ne faut pas utiliser le filtrat de Somogyi, étant que ce dernier ne renferme essentiellement que des substances réductrices à base de mo- nosaccharides. En conséquence, dans ce cas, on peut obtenir un filtrat au moyen du procédé de Folin et Wu :J. Biol Ohem.,
38, 81 (1$19), dans lequel on utilise l'acide tungatique.
Cependant, on a noté que les filtrats confectionnée conformé- ment au procédé à l'acide tungstique de Folin et Vu sont par- fois troubles par comparaison au filtrat de Somogyi. On n' observe pas une telle turbidité lorsqu'on ajoute des solutions aqueuses d'étalons de glucose ou d'acide urique aux solutions de l'indicateur et d'acétate ou de carbonate.
On trouve que l'addition d'un agent de surface oa- tionique au filtrat d'acide tungatique élimine la turbidité.
Il est recommandé d'en utiliser une quantité suffisante pour rendre la solution limpide. On note qu'on peut ajouter environ
1% de ohlorure de méthylbenzethonium (le chlorure d'ecyle crésoxy éthoxy éthyl diméthyl benzyl ammonium mono hydraté) pour obtenir cette limpidité du filtrat, maia on conçoit qu'on peut utiliser de la même manière d'autrea agents de surface cationiques, Des filtrats traités de cette manière ne pré- sentent aucune turbidité et peuvent être utilisés dans le do. nage de l'acide urique ou d'autres substances réductrices y compris le dosage du monosaccharide dans lequel on n'utillse paa le filtrat de Somogyi.
L'exemple suivant illustre lea pointal précédente dans le dosage de l'acide urique et de la créa- tinine :
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EXEMPLE IV
Dosage de l'Acide Urique et de la Créatinine dans le Sérum Sanguin - Solution d'Indicateur
N'importe lesquelles des phénanthrolines ou biqui nolinea substituées mentionnées dans cet expose peuvent elfe utilisées dans la réaotion. Dans cet exemple, on utilise le ohélaté ouprique du chlorhydrate de la néoouprolne que l'on ajoute à une solution d'acétate de sodium à 1% à une concen- tration identique à oelle utilisée dans le dosage du mono- saccharide dans l'exemple I.
- Réaotifs pour le Filtrat
On utilise de l'aoide sulfurique à 1/12 N pour le filtrat d'acide tungstique préparé conformément à 1'enseigne- ment de ?clin et Wu. On ajoute une quantité suffisante de chlorure de méthylbenzéthonium à l'acide pour obtenir une so- lution à 0,3%. On utilise du tungstate de sodium à 10% pour le filtrat d'acide tungstique.
- Mode opératoire
On prépare le filtrat d'acide tungstique par sddi- tion de 8 volumes de solution d'acide sulfurique à 1 volume de sérum sanguin. Après agitation, on ajoute 1 ml, de tungstate de sodium à 10% pour précipiter les protéines. On filtre le précipité de la manière habituelle.
1 On ajoute 2,0 ml de filtrat ainsi préparé à 5,0 al du réactif coloré en solution d'acétate. Les contrôlée et té- moins appropriés sont traités de la même manière.
2 On place le mélange dans l'eau bouillante pen- dant une minute, on refroidit à la température ambiante et on mesure dans un spectrophotomètre.
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On observe une relation linéaire entre la densité optique et la concentration en acide urique et créatinine.
Dans les conditions particulières utilisées, c'est-à-diro en présence d'ions d'acétate et si le pH est d'environ 7-8, la présence de glucose n'a pas d'effet sur les résultats observés.
On peut déterminer l'acide urique en ramenant le pH à environ 5-6 sans intervention du glucose ou de la créatinine. La con- centration en créatinine est calculée par la différence entre les deux valeurs,
Les exemples suivants sont donnés à titre d'illus- tration de l'applicabilité de l'invention à d'autres substan- ce* réductrices.
EXEMPLE V
Dosage de l'Acide Ascorbique
On prépare une solution d'indicateur de mise en oeu- vre avec la néccuproïne et l'ion cuprique en un rapport molé- culaire de 2:1, par un procédé similaire à l'exemple 1 A 1' exception que l'on acidifie la solution* On ajoute des échan- tillons de 2 ml. d'une solution étalon d'acide ascorbique di- luée à 1:10 à des portions de 5,0 ml de l'indicateur. On effec- tue des lectures apectrophotométriques après quatre minutes à 450 mu. en utilisant une cuvette de 10 mm. Les résultats sont représentés dans la figure 6 qui représente la réaction d'acide ascorbique. Dans cette figure, les concentrations sont données en abscisses et les absrptions en ordonnées.
Bien que l'on ait décrit ci-dessus d'une manière dé- taillée certaines applications de l'invention dans le but d'en faciliter sa compréhension, il est bien entendu que celle-ci n'est nullement limitée aux dispositions décrites et repré- sentées, et qu'elle en englobe toutes modifications de détail et variantes..
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The present invention relates to riaux for the purpose of measuring the presence or .Àé] ià 'Elià $ 4 oxidizing or reducing stances:'. "L '<.,. ,,.; I,;; ,, z ## t'i "." oxidative reduotricea susoeptible ..., t ,: '". Ó \ A.è. ' .... * # mi <;: -.,:. :,not a word, ;.....
More particularly, the invention relates to there'é6àlij,) ùë 8ub-. '' '*' '' ",; '' '.' oxidizing and reducing stances in dari solution.; la4èlle the assay is based on the detection of an ohangea9ht4 <t uleur "'.. ::".'.! '' '%' '; ..-' in a chelated compound , provoked in this deTéiÀ $ i1 / hùn 'ohan- ..., ;;, :::, = ;, = ;; i., j> j; ::. valence and triggered by the substance: ,, 1 / ". "',' or, reductive., g ,,:, 'ig'" i ''
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! .t, '<s (t invention is remarkable notaament in. "' avp <., ..., the use of certain helates of and jv 1,, 1 °, r,,.> j, oliiie at de copper and biquinoline <J,> <,. ui =, Laa special agents dr, aheat. or at h;
<<.ht '"i.uT no biquinoline used are sP- t <fl i'>> r) '- vru ut does not overlap with other: i.' ..i.'t .. <.) ,. t.- p! 't; icuii r used is preformat and it in: i to, .. f !.' <:, ..irw tint almost completely linked by r 4 - t ') r, e3glalil is used in a solution r << in ". : u: yar.
Suitable conditions ro., T,:. ..:; i, n ii what the oxidizing substance or re- 'a> i ,,,>. jh i r: a. .nc the change of the valence of c. -11.k, léu used as indicators te osa-> .i. aodifioation marked with 1 & color when; .i M "edification in its state of '" i4lsifi, til: ¯a =. further cry by the fact that the aou "'wr, i.:: ur in the solution does not oonf 0 = 0 to; Mind in the range of interest. 3n ul.' .. uHt the quantity of substance oxy- ¯., ,: F: a.nt conditions specific to the oxidation of the indicator, based on li,. ,, j or biquinoline, by the substance L) o, t measure the quantity of substance l ' using classical oolo- pi <J equivalent techniques.
<:> i 1: where; preferred execution, in which <i ;, for the quantitative oolorimetric analysis of dwi & 3 of deproteinized blood aeirum, one proceeds,, J .l: <>, ..,. at the contact of a yuan-
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predetermined amount of blood serum that has been deproteinized and an indicator that includes eaaentially a low chelate.
of copper, almost completely bound and in the cupric state, with one member being part of the group consisting of 2,2'-bi-quinolines and 1,10-phenanthroline substituted in 2,9- in an alkaline aqueous solution of a predetermined volume and under conditions favorable to copper reduction, and then the amount of copper reduced to the cuprous state is measured based on the light transmission of the aqueous solution. As will be understood by those skilled in the art, the amount of gluoose can then be calculated by referring to a standard glucose solution which is treated in the same way as the substance being analyzed.
Modern methods for the determination of blood glucose began in 1920 with the introduction of the well-known technique proposed by Folin and Wu by which the determination of glucose in the laboratory is made sufficiently feasible to make it possible. one of the most common chemical processes used in the clinical laboratory.
The most important contribution of this method to the study of glucose in body fluids is that it demonstrates in the clinical laboratory that monosaccharides are able to reduce certain metal ions in hot alkaline solution and that 'this reduction can be controlled with a sufficiently acceptable precision to make it useful both in medicine and in industry,
Although the reduction of metal ions other than copper by gluooae has been demonstrated, the use of the urpric ion for this purpose is considerably widespread, which is demonstrated by a multitude of variations on the
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basic technique.
The main objectives of most of the basic process modifications have been to achieve a whole for the quantitative assay of glucose which would be more specific for glucose, which would provide increased stability of reagents, and greater stability of the reaction. colorful finish. Other modifications have been proposed which represent an attempt to do away with the constricted sugar tube which was necessary in early methods of sugar analysis to control reoxidation of the fruit.
In general, all researchers in this field were faced with the problem of keeping copper in solution and had to prevent its reoxidation. For this purpose, it has been common practice to use tartrate and / or sult in solution together with ouivre and other reagents,
More recently, it has been proposed to convert sulphate into an oom- plex, ouiv: annealed in an aloaline solution of tartrate containing ions), using a compound based on phenanthroline similar to some of the bodies. currently in use. We quote in this regard the article by Maya E.
Broqn, MS, “The Journal of the American Diabetes Association, January- February 1961, Vol, 10, N, Pages 60-62.” These recent techniques involve the addition of the complexing agent for copper, d 'in general, to the alkaline solution of tartrate containing copper. As a result, not all of the cupric ions are bound to complexation due to the presence of tartrate and to an excess of cupric ions.
It is found that the presence of an excess of cupric ions and / or the presence of tartrate ions and or the presence of ions
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of chloride causes reoxidation of copper ions during the primary reduction process. As a result, even with these very recent efforts, to neutralize the re-oxidation, an ordinary test tube cannot be used.
Must have a test tube with a constriction and / or the presence of sulfate ions. Even using these latter precautions, the results are not consistent.
The present invention features the use of lead ionelates which eliminate the need to use tartrate or other hydroxyl acids previously needed to suspend the lead ion in solution, and also eliminate the need to use tartrate or other hydroxyl acids previously needed to suspend the lead ion in solution. other salts, such as the sulfate salts which are usually added to the solution to prevent reoxidation. All excess of or drunk is separated from the solution before the determination of the oxidizing or reducing substance and the remainder of copper is almost completely bound to the complexing agent,
The reoxidation phenomena characteristic of prior processes are eliminated by means of the present invention.
With this re-oxidation control, an ordinary straight-faced test tube or other suitable container can be conveniently used. The control of the reoxidation of the olive ion which is used, for example, in the analysis of glucose allows a very short boiling time compared to the prior methods. Furthermore, the final color complex is stable for 5 days or more, which offers obvious advantages in colorimetric analyzes.
In the implementation of the present invention, the ouivre is complexed with a substituted phenanthroline, and more particularly a 1,10-phenanthroline substituted in 2,9-.
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or a 2,2'-biquinoline. In general, the present invention can be implemented with any organic compound which comprises the following structural elements:
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In this structure, X can be any organic radical which comprises alkyl radicals such as methyl and ethyl groups, aromatic radicals such as the benzene ring, etc. etc.
The free valences on the carbon atoms are bonded to each other in a convenient way through other carbon atoms thus forming ring structures.
More particularly, the complexing agent is preferably chosen from the group consisting of cuproin (2,2'-biquinoline), neoouprolne (2,9-dimethyl-1,10-phenanthril), bathocuproin (2, 9-dimethyl-4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline), and water soluble salts of the latter such as hydrochloride and hydrosulphate salts. Suitable complexing agents also include bodies such as the above preferred bodies in which the nuclei are more deeply substituted. For example, the neocuproin and the bathocuproin mentioned above may have in their 5 / or 6 position substituted alkyl, hydroxy, nitro groups, halogen atoms, etc.
The complex based on copper and phenanthroline or biquinoline has many points of similarity with the indicator system based on iron and phenanthroline.
It appears that the copper-based indicator system is just as useful as the iron-phenanthroline system and has
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certain advantages by means of which greater stability of the color complex in aqueous solution is obtained and this occurs particularly in the analysis of reducing substances.
In contrast to the iron-phenanthroline system, both cupric and cuprous ions appear to be strongly bound in the chelate and there is very little indication of deterioration of either complex in solu - hot alkaline tion. When a fraction of the copper chelate has been reduced under these conditions to the copper form, the resulting color complex is stable at room temperature for more than four days. No additional stabilizing agent is needed and no additional complementing agents are needed for the suspension of the lead ion.
By combining ionic copper with phenanthroline or substituted biquinoline in a molar ratio of 1: 2, it turns out that the ohelate then serves as a quantitative indicator of oxidation or reduction, the color intensifying or s 'weakening in proportion to the number of cupric or cuprous ions under the test conditions. Due to the fact that the chelate is so strongly fixed, reoxidation is no longer evident.
The present indicator can be used for the analysis of oxidizing and reducing substances in the liquid phase.
One area of great use is the detection of various reducing substances present in the blood. For this purpose, it is envisioned that the present method serves to analyze both cell fractions and blood plasma fractions. In the cellular fraction of blood, for example, the present indicators are useful in the assay of glutathione. In the fraction of plasma which is preferably used in its serum form, a number of substances are easily dosed,
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These include, glucose, oreatinine, uric acid, and ascorbic acid.
In the implementation of the invention, the oxidation and reduction reactions are normally carried out in the liquid phase which may be water or a suitable organic solvent such as acetone, ethanol, chloroform, acetate. ethyl, amyl acetate, carbon tetrachloride, benzene, dioxane, etc. The indicator containing the copper substantially completely bound to a suitable phenanthroline or biquinoline chelating agent is added to the solvent containing the oxidizing or reducing substance. The indicator can be added in the solid state, but it is preferably added in the form of an indicator solution in one of the suitable solvents.
A performance indicator solution may also contain other substances such as alcohol when needed.
Copper is used in the copper or ivy state depending on whether a reducing or oxidizing substance is dosed respectively. Suitable conditions such as correct selection of pH and heat input are reoherohe so as to cause reduction or oxidation of copper depending on the circumstances.
The indicators considered in this disclosure are characterized by a change in color which is bright and distinct as they pass from the oxidized state to the reduced state wt conversely. For example, cuprolne is purple in the coppery state and olive green in the orpric state. The color change of the indicator can be used to measure the amount of oxidizing or reducing substance in the solution to be analyzed. , by conventional titrimetric, gaaometric and oolorimetric teohniques well known to specialists.
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In the preferred embodiment of the present invention for the analysis of glucose in blood serum, conditions suitable for reduction include priming an alkaline solution at a pH preferably of at least 10. This can be done by adding an aloali such as caustic soda to a solution of the indicator. Alkaline conditions are obtained by preferably adding carbonate, for example sodium arbonate.
When sodium oarbonate is used, the reduction of the indicator generally takes place more rapidly in a solution of higher concentration. Thus, the completion of the reduction in a 4% sodium carbonate solution is faster than in a less concentrated solution such as, for example, a solution at a concentration of 0.1%. It is noted that a 1% carbonate solution is satisfactory in most applications for the rapid completion of the reaction (2.5 minutes) and that no deterioration of the developed color occurs. the case where the concomitant heating time exceeds this maximum color development time period.
When looking for oxidizing or reducing substances other than glucose and in media other than uang or blood serum, the selection of the pH will be made according to the conditions, known to specialists, suitable for causing the reduction of the pH. copper by the substance. In all cases, including that of glucose, it is possible that an addition of heat (from a water bath for example) is necessary in order to speed up the reaction time.
In the present method, the indicator based on copper and phenanthroline or biquinoline is introduced into the solution to be analyzed in an amount sufficient so that it
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reacts with all of the oxidizing or reductive substance in solution, although an excess can advantageously be present. Still in the amount of glucose in the blood serum, it is noted that a solution of the indicator which is added to the serum sample and whose hydrated copper salt concentration is 7.5 mg% is very satisfying.
For example, the use of a performance indicator solution which contains about 7.5 mg% hydrated copper sulfate is very satisfactory for reducing a standard solution of glucose to 300 mg% under conditions. described in this talk.
The oonoentration to be used is subject to considerable variations, depending on the desired body. However, one should preferably avoid too low a concentration of the indicator since some degree of steric inhibition occurs at very low concentrations. Thus, while a concentration of the indicator of 7.5 mg% copper salt is adequate for use with a 300 mg% glucose standard, adequate results can still be obtained when the concentration of the indiator drops to 2.5 mg% copper salt.
On the other hand, steric hindrance may become a factor in the event that the concentration of the indicator falls considerably below this value, particularly to about 1-1.5 mg%.
Either way, it is important to emphasize that a sufficient amount of the chelating agent must be present so as to bind almost completely any amount of copper selected.
This can easily be calculated since two molecules of chelating agent are required for each copper atom. As pointed out previously, the extent of the surface area of the fluid in contact with air is not decisive
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in the present process and this encountered previous processes which required the use of sugar tubes comprising a constriction or other techniques intended to avoid reoxidation of copper during the course of boiling and other reducing conditions. These conclusions are based on experiments using three different test vessels with varying areas of the fluid in contact with air.
While it is observed that vessels having less contact with air cause earlier color development in the indicator, the reaction which occurs in vessels of any capacity causes finally the development of the same color density when allowed to continue to the end ,, Accordingly, it is concluded that the dif- ference in the rate of color development is related to the difference in time required to heat the solutions in the various vessels to a temperature necessary to effect reduction of copper and that if reoxidation occurs in the present process, it does not relate to the area of the fluid exposed to air.
These facts are shown in Figure 1 where three samples denoted by A, B and C are depicted graphically. A is run in a 13 x 100 mm test tube, B in a 17 x 150 mm test tube, and C in a 30 ml "Kjeldahl" round bottom flask. In this figure 1, the boiling times in minutes are given on the abscissa and the absorptions are represented on the ordinate. In each case, a 300 mg% glucose standard is used, accompanied by appropriate controls. The indicator and the general procedure of Example 1 described below are used.
The present method and indicator are illustrated by the following examples which relate to the plating of glucose in blood serum.
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EXAMPLE 1
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Determination of glucose using the drunken-neoouprolne indicator - Concentrated indicator solution
15 mg of hydrated copper sulfate is added to 50 ml of an aqueous solution containing 100 mg of neocuprolne hydrochloride. Water free of metal ions and reducing substances is used for this purpose.
An ohelate or pearl is formed, the color of which is green.
The orpric ion remains in solution when added to an alkaline medium. This concentrate is stable at room temperature for at least two months.
In this form, the chelate serves as a quantitative indicator of reduction which can then be added to an alkaline or acidic solution to determine the presence (or concentration) of reducing substances under the conditions of use. . In the case where the copper is obtained in the cuprous state. it can be converted to the raw state with the aid of a suitable oxidizing agent. Conversely, in the case where the orpric state is obtained and the indicator is to be used to determine oxidizing substances, it can be converted to the copper state using a suitable reducing agent.
- Implementation reaction for glucose analysis.
5 ml of the concentrated indicator solution 95.0 ml of a 1% aqueous sodium carbonate solution are added. This reagent is characterized by a very faint blue-green tint and remains clear, without any significant self-reduction of copper ion, for a few days at room temperature. The pH of the solution is 10.8.
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Application to blood serum.
Oxalated blood is collected in the usual manner.
A drop of blood from the finger can be used as long as it is immediately placed in the sodium or barium hydroxide used for the precipitation of the proteins. A filtrate is prepared in which the sodium hydroxide or barium-zinc sulfate ratio is 1: 200 or 1: 100 with the reagents suitably equilibrated so as to ensure neutrality. These solutions are used to obtain a wire-
EMI13.1
deproteind trat according to the process ue: 3oH.o [yi, H .: liA Mothod for the Preparation of Blood Filtrates for the Ueterndnation of Sucar, J. Bol. Che. 86 655-663, 1930 ".
1, Add 1 ml of a 1: 200 filtrate (or the equivalent of a Glucose standard of known value) to 6 ml of an effective processing reagent, in an eaa tube. clean ip. We use alen, errt an appropriate witness.
2 The test tubes are olaced in boiling water for 2.5 minutes after which they are cooled to room temperature under tap water.
EMI13.2
3 Spectrophotometric readings are taken in the vicinity of the absorption wavelength n, axiluule (454 mu).
Concentration er. glucose is i> roPyortipr.rrelle at the circled optical density shown in 1'4., urn 2 where A indicates rrac reaction: yrvir.a, i'ilc, rt omoyyi 1: 2UC, 2.5 Il, i1lUt.05 boiling point - * 454 mu, B stLdiîe glucose t'tg and C :: Ji: rdfie pourcer, tace de transmission,
As shown above, we prepare the
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e :: Llats indicators of the present invention by simply bringing the copper into contact in the liquid phase with the selected chelating agent.
EXAMPLE II Determination of Glucose Using the Indicator
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based on Copper and 3athocuproine,
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- Concentrated Indicator Solution
50 mg of copper sulphate in the hydrated state are added to 50 ml of an aqueous solution containing 200 mg of sodium bathoou-prolne sulphonate. The water must be free of reducing substances and metal ions. A copper ohelate forms from this combination and is a pale yellow color. The powder ion remains in solution when the concentrated indicator is added to an alkaline medium.
The concentrate is stable at room temperature for a few days and can be added to an alkaline or acidic solution to determine the presence or concentration of reducing substances.
Implementation reagent.
5.0 ml of the concentrated solution of the initiator is added to 95.0 ml of a 1% aqueous sodium carbonate solution. The reagent is very pale yellow in color and does not exhibit significant self-reduction for 2 days at room temperature. The pH of the solution is 10.8.
Operating mode for analysis
Oxalated venous blood is collected in the usual manner. A drop of blood from the finger can be used as long as it is immediately placed in the sodium or barium hydroxide used for protein precipitation. A filtrate is prepared in which the sodium hydroxide or barium-zino sulfate ratio is 1: 400 as taught by Somogyi (see Example 1), the reactants being adequately equilibrated to ensure neutrality.
1 1.0 ml of filtrate (or the equivalent of a glucose standard of known value) is added to 6.0 ml of the appropriate reagent.
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test tube, in a clean test tube. An appropriate witness is also used.
2 The test tubes are placed in high boiling water for 2.5 minutes and then cooled to room temperature under tap water.
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3 Spectrophotometric readings are taken in the vicinity of the wavelength of maximum absorption (479 Mû *) The glucose concentration is proportional to the optical density as shown in FIG. 3 where B oien1fio glucose mg; 6! C means transmission percentage and D means buthocprolne reuctiofi, sonoiyi filtrate 1: 400 - 2.5 iniriutes boiling 479 mu.
EXAMPLE III
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Determination of glucose using the copper nozzle indicator and Cuproin A solution of rccise indicator is prepared by
EMI15.3
This work is consistent with the previous examples except that the protein is used as a chelating agent. Serum is deprotated, blood serum using the Somoryi process and glucose is assayed as in the previous examples. - results are shown on 3.a figure 4 where B means glucose mg t'l, C siiiit'ie 1, ourceniuge of trul1smi8sion and uter.1f'1e reaction cuprolne, filtrate Sofhocyi 1:25 - 5.0 minutes of ebul - lition 5ra mu.
As noted above, er, t, previous procedures involved the problem of redoxyaation of copper.
In order to avoid the use of the sugar tube having a restriction, it has previously been proposed to add sulfate ions to the solution in the form of, for example, sodium sulfate.
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Studies in connection with the present invention show that in view of the indicators described herein, the addition of more than 18% of sodium sulfate serves to increase the uensity. of the final color obtained.
It is noted that the effect of the sulfate ion is of a redductriae nature and varies with the concentration of sodium sulfate in the absence of other
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reducing substances, and that is, the higher the concentration
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in sulfate is high, the stronger the reducing effect on the copper-based indicator. Since the present method does not require the presence of sulfate ions, it is much closer to ideal for the assay of glucose in blood serum than previous methods.
The prior methods also involve the proclamation of tartrate ions or other hydroxylated acids the object of which is to suspend the orpric ion in solution for the determination of blood sugar. These bodies are themselves substances. reducing and tend to make direct measurement of blood sugar impossible when their concentration is increased. Since the present method does not require the presence of these bodies, it has obvious advantages over the prior methods with regard to the accuracy for the dosage of gluoose.
Likewise, many researchers have modified the techniques for assaying blood sugar by using various substances in solution such as sodium bisulfite, alanine, sodium chloride, ammonium sulfate, and phosphate ions. . These substances are neither advantageous nor necessary in the present process. It is noted that the presence of large amounts of many of these substances will reduce the indicator and this should be corrected in controls or by other means, if possible.
It is noted that acetate ions have a particular effect on the color development of the present glucose indicators. Glucose is found not to reduce the present indicators in the presence of acetate ions from, for example, sodium acetate, when acetate is substituted for carbonate or other alkaline material in the process.
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dosage of glucose as illustrated in the preceding examples. In contrast, uric acid and creatinine reduce the indicators at room temperature and at elevated temperatures also in the presence of acetate buffers having a pH of about 5 to 8.
It is noted that the most favorable reduction in uric acid occurs around the neutral point, while at the same time there is a complete absence of the effect of the glucose monosaooharide.
These findings lead to an aspect of the present invention which allows the assay of uric acid and creatinine in the presence of glucose. Thus, in the case where the sample to be analyzed contains glucose, it suffices to add a sufficient quantity of acetate ions to bring the pH to about 5 to 8 and thus the glucose does not present any gene for it. the dosage.
On the other hand, if the purpose of the analysis is to measure the gluoo-. and the sample initially contains creatinine and uric acid as well as other reducing substances, they can be adequately removed by the selection of the protein precipitation method which is most suitable such as Somogyi's. Somogyi's filtrate contains essentially only reducing agents based on monosaccharides and does not contain significant amounts of other reducing agents. Alternatively, it is not necessary to separate uric acid and creatinine from the solution when dosing glucose as long as the glucose dosing is not carried out in accordance with the preferred embodiment in solution. alkaline carbonate tion.
Uric acid or creatinine was found to have no significant effect in monosaccharide analysis when these two substances were added together.
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physiological centrations directly to the glucose solution which is analyzed. Reference will be made to FIG. 5 which represents the reduction of the indicator by glucose in the presence of uric acid and creatinine, uric acid (5 mg%) and creatinine (2 mg%) having been added to the same glucose standardized to 100 mg%, for the graphic results of the experiments in which a method similar to Example 1 is used with the exception of ameuta additional reducers cited.
In this figure 5, F means glucose, G means glucose and uric acid, H means glucose uric acid and creatinine, and I means absorption.
When looking for creatinine and uric acid, the characteristics and reduction of one in the presence of the other can be differentiated using the particular reduction conditions used. Thus, when a sample to be analyzed contains both uric acid and creatinine, they can be combined with an indicator, as in Example 1, and if the reduction conditions are properly chosen, the reduction can be selectively determined. reducing effect of uric acid alone.
Some suitable conditions for the selective and preferential reduction of uric acid have been developed which involve adjusting the pH to about 5-6. If heat is applied, the reduction is accelerated. If the pH is brought back to around 7-8, uric acid and creatinine cause the indicator to change. The amount of uric acid, therefore, can first be determined using selective conditions and if the total is determined, the amount of creatinine is easily calculated by taking the difference between the two values.
It will be understood that the above conditions for the selective reduction are given only by way of illustration and that considerable variations can be made leading to the same result.
If blood serum is used for blood sugar assay, the Somogyi technique should preferably be used for deproteinization. We get to
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using this technique a clear filtrate which is very satisfactory for carrying out the present process. On the other hand, . If it is desired to measure uric acid or other reducing substances in the blood serum, Somogyi's filtrate should not be used, since the latter essentially only contains reducing substances based on monosaccharides. Accordingly, in this case, a filtrate can be obtained by the method of Folin and Wu: J. Biol Ohem.,
38, 81 ($ 1.19), in which tungatic acid is used.
However, it was noted that the filtrates made according to the tungstic acid method of Folin and Vu are sometimes cloudy compared to the Somogyi filtrate. Such turbidity is not observed when aqueous solutions of glucose or uric acid standards are added to the indicator and acetate or carbonate solutions.
The addition of an oationic surfactant to the tungatic acid filtrate has been found to eliminate turbidity.
It is recommended that you use a sufficient amount to make the solution clear. Note that we can add approximately
1% of methylbenzethonium chloride (ecyl cresoxy ethoxy ethyl dimethyl benzyl ammonium chloride monohydrate) to obtain this clarity of the filtrate, but it is understood that one can use in the same way other cationic surfactants. treated in this way have no turbidity and can be used in the do. nage of uric acid or other reducing substances including the assay of the monosaccharide in which the Somogyi filtrate is not used.
The following example illustrates the previous point in the determination of uric acid and creatinine:
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EXAMPLE IV
Determination of Uric Acid and Creatinine in Blood Serum - Indicator Solution
Any of the substituted phenanthrolines or biqui nolinea mentioned in this disclosure can be used in the reaction. In this example, we use the ohelate orpric of neoouprolne hydrochloride which is added to a 1% sodium acetate solution at a concentration identical to that used in the assay of the monosaccharide in Example. I.
- Reagents for the Filtrate
1/12 N sulfuric acid was used for the tungstic acid filtrate prepared according to the teaching of Clin and Wu. Sufficient methylbenzethonium chloride was added to the acid to obtain a solid content. - 0.3% lution. 10% sodium tungstate is used for the tungstic acid filtrate.
- Operating mode
The tungstic acid filtrate is prepared by adding 8 volumes of sulfuric acid solution to 1 volume of blood serum. After stirring, 1 ml of 10% sodium tungstate is added to precipitate the proteins. The precipitate is filtered off in the usual manner.
1 2.0 ml of the filtrate thus prepared is added to 5.0 µl of the colored reagent in acetate solution. Appropriate controls and witnesses are treated in the same way.
2 The mixture is placed in boiling water for one minute, cooled to room temperature and measured in a spectrophotometer.
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There is a linear relationship between optical density and the concentration of uric acid and creatinine.
Under the particular conditions used, that is to say in the presence of acetate ions and if the pH is approximately 7-8, the presence of glucose has no effect on the results observed.
Uric acid can be determined by reducing the pH to about 5-6 without the intervention of glucose or creatinine. The creatinine concentration is calculated by the difference between the two values,
The following examples are given by way of illustration of the applicability of the invention to other reducing substances.
EXAMPLE V
Determination of Ascorbic Acid
A performance indicator solution with neccuproin and cupric ion was prepared in a 2: 1 molecular ratio by a method similar to Example 1 except that it was acidified. the solution * 2 ml samples are added. of a standard solution of ascorbic acid diluted 1:10 to 5.0 ml portions of the indicator. Apectrophotometric readings were taken after four minutes at 450 µm. using a 10mm cuvette. The results are shown in Figure 6 which shows the reaction of ascorbic acid. In this figure, the concentrations are given on the abscissa and the absrptions on the ordinate.
Although certain applications of the invention have been described in detail above with the aim of facilitating its understanding, it is understood that the latter is in no way limited to the arrangements described and shown, and that it includes all modifications of detail and variations.