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titi prédéterminée de sérum sanguin que l'on a déprotéiné et d'un indicateur qui comprend eaaentiellement un chélaté à bas.
de cuivre, presque complètement lié et à l'état cuprique, avec un élément faisant partie du groupe qui consiste des 2,2'-bi- quinolines et 1,10-phénanthroline substituées en 2,9- dana une solution aqueuse alcaline d'un volume prédéterminé et dans des conditions favorables à la réduction du cuivre, et en- nuite on mesure la quantité de cuivre réduit à l'état cuivreux en se basant aur la transmission de lumière de la solution aqueuse. Ainsi que le conçoit l'homme de l'art, on peut alors calculer la quantité de gluoose en se rapportant une solu- tion de glucose étalon que l'on traite de la même manière que la substance soumise à l'analyse.
Les procédés modernes pour le dosage du glucose san- guin ont commencé en 1920 aveo l'introduction de la technique bien connue proposée par Folin et wu à l'aide de laquelle le dosage du glucose au laboratoire est rendu suffisamment réa- lisable pour en faire un des procédée chimiques les plua cou- rants que l'on emploie en laboratoire clinique.
La contribu- tion la plus importante de ce procédé à l'étude du glucose dana les fluides du corps consiste en ce qu'il démontre en la- boratoire clinique que lea monosaocharides sont capables de réduire certaine ions métalliques en solution alcaline chaude et que l'on peut contrôler cette réduction avec une précision suffisamment acceptable pour la rendre utile aussi bien dans la médecine que dans l'industrie,
Bien qu'on ait démontré la réduction des ions mé- talliques autrea que le cuivre par le gluooae, l'utilisation de l'ion ourprique à cette fin est considérablement répandue ce qui cet démontré par une multitude de variations sur la
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technique de base.
Les objectifs principaux de la plupart des modifications du procédé de base ont été de réaliser un tout pour le dosage quantitatif du glucose qui serait plue spéci- fique pour le glucose, qui offrirait une stabilité accrue des réactifs, et une plus grande stabilité de la réaction colorée finale. On a proposé d'autres modifications qui représentent une tentative ayant pour objet de supprimer le tube à sucre comportant un étranglement qui était néoessaire dans les pre- miers procédés d'analyse du sucre pour contrôler la réoxyda- tion du ouivre.
En général, tous les chercheurs dans ce domaine se trouvaient en présence du problème de la conservation du cuivre en solution et avaient à empêcher sa réoxydation. A cet effet, il a été de pratique courante d'utiliser le tartrate et/ou le sult te en solution conjointement au ouivre et autres réactifs,
Plas réoemment, on a proposé de convertir en un oom- plexe, le ouiv: récuit dans une solution aloaline de tartrate renfermant des ion), de sulfate, à l'aide d'un composé à base de phénanthroline an logue à certains des corps actuellement utilisés. On cite à ce propos l'article par Maya E.
Broqn, M.S., "The Journal of the American Diabètes Association, Janvier- Février 1961, Vol, 10, N , Pages 60-62."Cea techniques ré- oentes comportent l'addition de l'agent de oomplexation pour le cuivre, d'une manière générale, à la solution alcaline de tartrate renfermant le cuiv. Il en résulte que tous les ions cupriques ne sont pas liés à 1,gent de oomplexation en raison de la présence du tartrate et à c@se d'un excès des ions cu- priques .
On trouve que la présence d'un excès d'ions cupriques et/ou la présence d'ions de tartrate et ou la présence d'ions
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de chlorure provoque la réoxydation des ions cupriques au oours du procédé de réduction primaire. Il en résulte que même avec ces efforts tous récents, pour neutraliser la réc- xydation, on ne peut pas utiliser un tube à essaie ordinaire.
Il faut avoir un tube à essais oomportant un étranglement et/ ou la présence d'ions de sulfate. Même en utilisant ces der- nières précautions, les résultats ne.sont pas homogènes.
La présente invention oomporte l'utilisation de ohélatés de ouivre qui suppriment la nécessité d'utiliser le tartrate ou autres acides hydroxylés dont on avait besoin an- térieurement pour suspendre en solution l'ion ouprique, et suppriment également la nécessité d'utiliser d'autres sels, tels que les sels de sulfate que l'on ajoute habituellement à la solution pour empêcher la réoxydation. On sépare tout l' excès de ou ivre de la solution avant le dosage de la substance oxydante ou réductrice et le restant de cuivre est presque complètement lié à l'agent de complexation,
Les phénomènes de réoxydation caractéristiques des procédés antérieurs sont éliminés au moyen de la présente in- vention.
A l'aide de ce contrôle de la réoxydation, on peut utiliser commodément un tube à essais ordinaire à parais droites ou autre réoipient convenable. Le contrôle de la réoxydation de l'ion ouivreux dont on fait usage par exemple dans l'ana- lyse du glucose permet un temps d'ébullition très court par comparaison aux procédés antérieurs. En outre, le oomplexe coloré final est stable pendant 5 jours ou plus, ce qui offre des avantages évidents dans les analyses colorimétriques.
Dans la mise en oeuvre de la présente invention, on complexe le ouivre aveo une phénanthroline substituée, et plus particulièrement une 1,10-phénanthroline substituée en 2,9-
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ou une 2,2'-biquinoline. D'une façon générale, on peut mettre en oeuvre, la présente invention avec n'importe quel composé organique qui comprend les éléments structures suivants :
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Dans cette structure, X peut être n'Importe quel radi- cal organique qui comprend des radicaux alcoyles tels que les groupements méthyle et éthyle, les radicaux aromatiques tela que le noyau benzénique, etc. etc.
Les valences libres sur les atomes de oarbone sont liées les unes aux autres d'une manière oonvenable par l'intermédiaire d'autres atomes de carbone formant ainsi des structures cycliques.
Plus particulièrement, l'agent de oomplexation est préférablement choisi dans le groupe constitué par la cuproïne (2,2'-biquinoline), la néoouprolne (2,9-diméthyl-1,10-phénan- throline), la bathocuproîne (2,9-diméthyl-4,7-diphényl-1,10- phénanthroline), et des sels solubles dans l'eau de ces der- niers tels que les sels chlorhydrates et hydrosulfatés. Des agents de oomplexation convenables comprennent également des corps tels que les corps précédents préférés dans lesquels ' les noyaux sont plus profondément substitués. Par exemple, la néocuproïne et la bathocuproîne citées ci-dessus peuvent avoir dans leur position 5/ou 6 des groupements substituée alcoyles, hydroxy, nitro, des atomes d'halogène, etc...
Le complexe à base de cuivre et de phénanthroline ou de biquinoline possède de nombreux pointe de similarité avec le système indicateur à base de fer et de phénanthroline.
Il apparaît que le système indicateur à base de cuivre est tout auseiutile que le système fer-phénanthroline et possede
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certains avantagea à l'aide desquels on obtient une plus grande stabilité du complexe coloré en solution aqueuse et ceci se produit particulièrement dans l'analyse de substances réductrices.
Par contraste au système fer-phénanthroline, les ions cupriques et cuivreux à la fois paraissent être forte- ment liée dans le chélaté et il y a très peu d'indications d'une détérioration de l'un ou l'autre des complexes en solu- tion chaude alcaline. En @ lorsqu'on a réduit, dans ces conditions, une fraction du chélaté cupr@ la forme cui- vreuse, le complexe coloré qui en résulte cet stable à la température ambiante pendant plus de quatre jours. Aucun agent supplémentaire de stabilisation n'est nécessaire et on n'a pas besoin d'autres agents de oomploxation pour la mise en suspension de l'ion ouprique.
Par la combinaison du cuivre ionique avec la phénanthroline ou la biquinoline substituée dans un rapport moléoulaire de 1 : 2, il se trouve que le ohé- laté sert ensuite d'indicateur quantitatif d'oxydation ou de réduction, la couleur s'intensifiant ou s'affaiblissant en proportion au nombre d'ions cupriques ou cuivreux dans les conditions d'essai. En raison du fait que le chélaté est si fortement fixe, la réoxydation n'est plus évidente.
On peut utiliser le présent indicateur pour l'ana- lyse de substances oxydantes et réductrices en phase liquide.
Un domaine de grande utilité est la recherche de diverses substances réductrices présentes dans le sang. A cet effet, on envisage que le présent procédé sert à analyser à la fois des fractions cellulaires et des fractions de plasma du sang. Dans la fraction cellulaire du sang, par exemple, les présenta in- dicateurs sont utiles dans le dosage du glutathion. Dans la fraction de plasma que l'on utilise de préférence dans sa for- me sérique, on dose faoilement un certain nombre de substances,
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Celles-ci comprennent, le glucose, la oréatinine, l'acide urique, et l'acide ascorbique.
Dans la mise en oeuvre de l'invention on effeotue normalement les réaction d'oxydation et de réduction en phase liquide qui peut être l'eau ou un solvant organique convenable tel que l'acétone, l'éthanol, le chloroforme, l'acétate d'é- thyle, l'acétate d'amyle, le tétrachlorure de carbone, le ben- zène, le dioxanne, etc. On ajoute l'indicateur renfermant le cuivre sensiblement complètement lié à un agent de chélation convenable à base de phénanthroline ou de biquinoline au sol- vant renfermant la substance oxydante ou réductrice. On peut ajouter l'indicateur à l'état solide mais on l'ajoute de pré- férence sous forme de solution d'indicateur dans un des sol- vants adéquats.
Une solution d'indicateur de mise en oeuvre peut également renfermer d'autres substances telles que l'al- oali lorsque oeoi est nécessaire.
On utilise le cuivre à l'état cuprique ou ouivreux selon qu'on dose une substance réductrice ou oxydante respeo- tivoment. On reoherohe des oonditions convenables telles que la sélection correcte du pH et l'apport de chaleur de façon à provoquer selon le oas la réduction ou l'oxydation du cuivre.
Les indicateurs considérés dans cet exposé sont caractérisée par un virage de la couleur qui est brillant et net lorsqu'ils passent de l'état oxydé à l'état réduit wt in- versement. Par exemple, la cuprolne est pourpre à l'état cui- vreux et vert olair à l'état ouprique, On peut utiliser le virage de la couleur de l'indicateur pour doser la quantité de substance oxydante ou réductrice, dans la solution à analyser, par des teohniques classiques titrimétriques, gaaométriques et oolorimétriques bien connues des spécialistes.
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Dans le mode d'exécution préféré de la présente in- vention pour l'analyse du glucose dans le sérum sanguin, des conditions adéquates pour la réduction comprennent l'apprêt d'une solution alcaline à un pH de préférence au moins égal à 10. On peut effectuer oeoi en ajoutant un aloali tel que la soude caustique à une solution de l'indicateur. On obtient des conditions alcalines en ajoutant de préférenoe du carbonate par exemple du oarbonate de sodium.
Lorsqu'on utilise du oarbonate de sodium, la réduo- tion de l'indicateur a lieu, en général, plus rapidement dans une solution de plus forte concentration. Ainsi, l'achèvement de la réduction dans une solution de carbonate de sodium à 4% est plus rapide que dans une solution moins concentrée comme par exemple, une solution à une concentration de 0,1%. On note qu'une solution de carbonate à 1% est satisfaisante dans la plupart des applications pour l'achèvement rapide de la ré- action (2,5 minutes) et qu'il ne se produit aucune détériora- tion de la couleur développée dans le cas ou la durée de chauf- fage concomitante dépasse cette durée de temps de développe- ment maximal de la couleur.
Lorsqu'on recherche des substances oxydantes ou ré- ductroies autres que le glucose et dans des milieux autres que le uang ou le sérum sanguin, la sélection du pH sera faite selon les conditions, connues des spécialistes, propres à pro- voquer la réduction du cuivre par la substance. Dans tous les cas, y compris celui du glucose, il est possible qu'un apport de ohaleur (provenant d'un bain-marie par exemple) soit né- cessairs de façon.à accélérer le temps de réaction.
Dans le présent procédé on introduit l'indicateur à base de cuivre et de phénanthroline ou de biquinoline dans la solution à analyser en une quantité suffisante pour qu'il
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réagisse avec la totalité de la substance oxydante ou redue- trioe en solution, bien qu'un excès puisse avantageusement être présent. Toujours dans le oas de glucose dans le sérum sanguin, on note qu'une solution de l'indicateur qu'on addi- tionne à l'échantillon de sérum et dont la concentration en sel de cuivre hydraté est de 7,5 mg% est très satisfaisante.
Par exemple, l'utilisation d'une solution d'indicateur de mise en oeuvre qui contient environ 7,5 mg% de sulfate de cuivre hydraté est très satisfaisante pour la réduction d'une solution étalon de glucose à 300 mg% dans les conditions dé- crites dans cet exposé.
La oonoentration à utiliser fait l'objet de varia- tions considérables, selon les corps recherchée. Cependant, il faut éviter de préférence une concentration trop basse de l' indicateur étant donné qu'il se produit un certain degré d' inhibition sté/rique aux très faibles concentration. Ainsi, alors qu'une concentration de l'indicateur de 7,5 mg% en sel de cuivre est adéquate pour l'utilisation avec un étalon de glucose à 300 mg%, on peut encore obtenir des résultats adé- quate lorsque la concentration de l'indioateur tombe à 2,5 mg% en sel de cuivre.
Par oontre, l'empêchement sté/rique peut devenir un facteur dans le oas où la concentration de l'indi- oateur tombe considérablement en dessous de cette valeur no- tamment à environ 1-1,5 mg%
De toute façon, il importe de souligner qu'une quan- tité suffisante de l'agent de chélation doit être présente de façon à lier presque entièrement toute quantité de cuivre que l'on aura sélectionnée.
Ceci peut facilement être calculé é- tant donné qu'il faut deux molécules d'agent de chélation pour chaque atome de cuivre. âinsi qu'on l'a souligné précédemment, l'étendue de la surface du fluide en contact avec l'air n'est pas décisive
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dans le posent procédé et celà à rencontra des procédés an- térieurs qui exigeaient l'utilisation de tubes à sucre com- portant un étranglement ou d'autres techniques ayant pour but d'éviter la réoxydation de l'ien cuivraux du cours de l'ébul- lition et d'autres conditions réductrices. Ces conclusions se basent sur des expériences dans lesquelles on utilise trois récipients à essais différents présentant des superficies va- riables du fluide en contact avec l'air.
Tandis qu'on observe que les récipients, dont le contact avec l'air est inférieur, provoque plus t8t le développement d'une couleur dans l'indi- cateur, la réaction que se produit dans les récipients de n' importe quelle capacité provoque finalement le développement de la même densité de couleur lorsqu'on la laisse se pour- suivre jusqu'à la fin,, En conséquence, on conclut que la dit- férence dans la vitesse de développement de la couleur est en rapport avec la différence de temps nécessaire pour chauffer les solutions dans les différents récipfents à une température nécessaire pour effectuer la réduction du cuivre et que s'il se produit une réoxydation dans le présent procédé, elle ne se rapporte pas à la superficie du fluide exposé à l'air.
Ces faits sont représentés dans la figure 1 où trois échantillons désignés par A, B et C sont décrits graphiquement. A est exé- cuté dans un tube à essais de 13 x 100 mm, B dans un tube à essais de 17 x 150 mm, et C dans un ballon à fond rond "Kjeldahl" de 30 ml. Dans cette figure 1, les temps d'ébullition en minutée sont donnés en abscisses et les absorptions sont représentées en ordonnées, Dans chaque cas, on utilise un étalon de glucose de 300 mg% accompagné de témoins appropriés. On utilise l'indicateur et le mode opératoire général de l'exemple 1 décrit ci-après.
Le présent procédé et indicateur sont illustrés par les exemples suivants qui ont pour objet le dossage du glucose dans le sérum sanguin.
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EXEMPLE 1
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Dosage du glucose à, l'aide de l'indicateur au ouivre-néoouprolne - Solution concentrée d'indicateur
On ajoute 15 mg de sulfate de cuivre à l'état hydra- té à 50 ml d'une solution aqueuse renfermant 100 mg de chle- rhydraté de néocuprolne. On utilise pour cet usage de l'eau dépourvue d'ions métalliques et de substances réductrices.
Il se forme un ohélaté ouprique dont la couleur est verte.
L'ion ouprique reste en solution lorsqu'on l'ajoute à un mi- lieu alcalin. Ce concentré est stable à la température am- biante pendant au moins deux mois.
En cette forme, le chélaté sert d'indicateur quan- titatif de réduction que l'on peut alors ajouter à une solu- tion alcaline ou acide pour déterminer la présence (ou la con- centration) de substances réductrices dans les conditions d' utilisation. Dans le cas où l'on obtient le cuivre à l'état cuivreux. il peut être converti à l'état ouprique à l'aide d' un agent d'oxydation adéquat. Inversement, dans le cas où l'on obtient l'état ouprique et que l'on doit utiliser l'indicateur pour déterminer des substances oxydantes, on peut le convertir à l'état cuivreux à l'aide d'un agent réducteur adéquat.
- Réaction de mise en oeuvre pour l'analyse du glucose.
On ajoute 5 ml de la solution concentrée de l'indi- cateur 95,0 ml d'une solution aqueuse de carbonate de soude à 1%. Ce réactif est caractérisé par une teinte très faible bleue-verte et reste limpide, sans aucune auto-réduction im- portante de l'ion cuprique, pendant quelques jours à la tempé- rature ambiante. Le pH de la solution est de 10,8.
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Application au sérum sanguin.
On recueille du sang oxalaté de la manière habituelle.
On peut utiliser une goutte de sang provenant du doigt à oon- dition qu'elle soit immédiatement placée dans l'hydroxyde de sodium ou de baryum utilisé pour la précipitation des pro- téines. On prépare un filtrat dont le rapport hydroxyde de sodium ou baryum-sulfate de zinc est de 1:200 ou 1:100 à l'ai- de \.le réactifs convenablement équilibras de façon à assurer la neutralité. On utilise ces solutions pour obtenir un fil-
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trat déprotéind selon le procédé ue :3oH.o[yi, H.: liA Mothod for the Préparation of Blood Filtrâtes for the Ueterndnation of Sucar, J. Bol. Che. 86 655-663, 1930".
1, Oljoute 1 ml d'un filtrat à 1:200 (ou l'équi- valent d'un étalon de Glucose de valeur connue) à 6 ml d'un réactif itruic4tteur de mise en oeuvre, dans un tube à eaa.-ip propre. On utilise alen,errt un témoin approprié.
2 On olace les tubes à essais dans de l'eau en forte ébullition pendant 2,5 minutes après quoi on les refroidit à la température ambiante sous l'eau du robinet.
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3 On fait des lectures spectrophotométriques au voisinage de la longueur d'ondes d'absorption n,axiluule (454 mu).
La concentration er. glucose est i>roPyortipr.rrelle à la densité optique ceinte représenté sur la 1'4.,urne 2 où A aicnifie réaction rrac:yrvir.a, i'ilc,rt omoyyi 1:2UC, 2,5 Il,i1lUt.05 d'ébullition -* 454 mu, B stLdiîe glucose t'tg et C ::Ji:rdfie pourcer,tace de transmission,
Ainsi qu'on l'a représenta ci- dessus, on prépare les
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indicateurs e::Llats de la présente invention par la simple mise en contact en phase liquide du cuivre et de l'agent de chélation nélectionné.
EXEMPLE II Dosage du Glucose à l'aide de l'Indicateur
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à base de Cuivre et de 3athocuproine,
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- Solution Concentrée d'Indicateur
On ajoute 50 mg de sulfate de cuivre à l'état hydraté à 50 ml d.'une solution aqueuse renfermant 200 mg de bathoou- prolne sulfonate de sodium. L'eau doit être dépourvue de sub- stances réductrices et d'ions métalliques. Un ohélaté au cui- vre se forme à partir de cette combinaison et est d'une cou- leur jaune pâle. L'ion ouprique reste en solution lorsqu'on ajoute l'indicateur concentré à un milieu alcalin.
Le concen- trat est stable à la température ambiante pendant quelques jours et on peut l'ajouter à une solution alcaline ou acide de façon à déterminer la présence ou la concentration de substan- ces réductrices.
Réactif de mise en oeuvre.
On ajoute 5,0 ml de la solution concentrée de l'in- dioateur à 95,0 ml d'une solution aqueuse de carbonate de soude à 1%. Le réactif est d'une teinte jaune très pale et ne présente pas d'auto-réduction importante pendant 2 jours à la température ambiante. Le pH de la solution est de 10,8.
Mode Opératoire pour l'analyse
On recueille du sang veineux oxalaté de la manière habituelle. On peut utiliser une goutte de sang provenant du doigt à condition quelle soit immédiatement placée dans l'hy- droxyde de sodium ou de baryum utilisé pour la précipitation des protéines. On prépare un filtrat dont le rapport hydro- xyde de soude ou de baryum-sulfate de zino est de 1:400 de la manière enseignée par Somogyi (voir exemple 1), les réactifs étant équilibrés d'une manière adéquate de façon à assurer la neutralité.
1 On ajoute 1,0 ml de filtrat (ou l'équivalent d'un étalon de glucose de valeur connue) à 6,0 ml de réactif indi-
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cateur de mise en oeuvre, dans un tube à essais propre. On emploie également un témoin approprié.
2 On place les tubes à essais dans de l'eau en for- te ébullition pendant 2,5 minutes et on les refroidit ensuite à la température ambiante sous l'eau du robinet.
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3 On fait des lectures spectrophotométriques au voisinage de le longueur d'ondes d'absorption maximale (479 Mû*) La concentriàtion en glucose est proportionnolle à la densité optique coiiiie représenté sur la figure 3 où B oien1fio glucose mg ;6! C signifie pourcentage de transmission et D signifie réuctiofi buthocprolne, filtrat sonoiyi 1:400 - 2,5 iniriutes d'ébullition 479 mu.
EXEMPLE III
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Dosage du glucose à l'aide ue l'indicateur à buse de cuivre et ue Cuproïne On prépare une solution d'indicateur de rccise en
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oeuvre confortritirient aux exemples prJcédenta à cela près que l'on utilise le( cuprotne comme agent de chélation. On dépro- téine du sérun, sanguin à l'aide du procodé de Somoryi et on dose le glucose comme dans les exemples pr6cédento. Les ré- sultats sont représentés sur3.a figure 4 où B signifie glucose mg t'l, C siiiit'ie 1,ourceniuge de trul1smi8sion et à uter.1f'1e réaction cuprolne, filtrat Sofhocyi 1:25 - 5,0 minutas d'ébul- lition 5ra mu.
Ainsi qu'on 1a noté prdcderm,er,t, ieprocedés an.. térîeurs comportaient le problème de la rdoxyaation du cuivre.
Pour éviter l'utilisation du tube à sucre comportant un étran- glement, on a proposé antérieurement d'ajouter des ions de sulfate à la solution sous forme, par exemple, de -sulfate de
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sodium, Des étuu:J en rapport avec la présente invention dé- n,ontrent qu'en pr4Jence des indicateurs décrits au présent exposé, l'addition de plus ue 18% de sulfate ue sodium sert à aU±'II.enter lu uensite de la couleur finale obtenue.
On note que l'effet de l'ion de sulfate est de nature rdductriae et varie avec la concentration en sulfate de sodium en l'absence d'autres
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substances réductrices, eteet-A-dire, que plus la concentration
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en sulfate est élevée, plue l'effet réducteur sur l'indica- teur à base de cuivre est puissant. Etant donné que le pré- sent procédé n'exige pas la présence d'ions de sulfate, il est bien plus proche de l'idéal pour le dosage du glucose dans le sérum sanguin que les procédés antérieurs.
Les procédés antérieurs comportent également la pré- nonce d'ions de tartrate ou d'autres acides hydroxylés dont l'objet est de suspendre l'ion ouprique en solution pour le dosage du sucre sanguin, Ces corps sont eux-mêmes des sub- stances réductrices et ont tendance à rendre impossible le dosage direct du sucre sanguin lorsque leur concentration est augmentée. Etant donné que le présent procédé n'exige pas la présence de ces corps, il est doté d'avantage évidents par rapport aux procédés antérieurs en ce qui concerne la précis sion pour le dosage du gluoose.
De même, de nombreux chercheurs ont modifié les techniques de dosage du sucre sanguin en utilisant diverses substances en solution télis que le bisulfite de sodium, l'ala- nine, le chlorure de sodium, le sulfate d'ammonium, et des ions de phosphate. Ces substances ne sont ni avantageuses, ni nécessaires dans le présent procédé. On note que la présence de fortes quantités d'un grand nombre de ces substances réduisent l'indicateur et qu'il faut corriger cela dans les témoins ou par d'autres moyens, si possible.
On note que les ions d'acétate ont un effet parti- culier sur le développement de la couleur des présents indica- teurs du glucose. On trouve que le glucose ne réduit pas les présents indicateurs en présence d'ions d'acétate provenant de l'acétate de sodium par exemple, lorsqu'on substitue l'acétate au carbonate ou autre substance alcaline dans le procédé de
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dosage du glucose ainsi qu'on l'a illustré dans les exemples précédents. Par contre, l'acide urique et la créatinine ré- duisent les indicateurs à la température ambiante et à dea températures élevées également en présence de tampons à l'acé- tate ayant un pH allant environ de 5 à 8.
On note que la ré- duction la plus favorable de l'acide urique se produit aux environs du point neutre, alors qu'en môme temps il y a une absence complète de l'effet du monosaooharide de glucose.
Ces découvertes conduisent à un aspect de la pré- sente invention qui permet le dosage de l'acide urique et de la créatinine en présence du glucose. Ainsi, dans le oas où l'échantillon à analyser contient du glucose, il suffit eau- lement d'ajouter une quantité suffisante d'ions d'acétate pour ramener le pH à environ 5 à 8 et ainsi le glucose ne présente aucune gène pour le dosage.
Par oontre, si l'analyse a pour but de doser le gluoo-. se et que l'échantillon, au départ, contient de la créatinine et de l'acide urique ainsi que d'autres substances réductrices, on peut éliminer oelles-oi d'une manière adéquate par la sé- lection du procédé de précipitation des protéines qui convient le mieux tel que celui de Somogyi. Le filtrat de Somogyi ne contient essentiellement que des agents réducteurs a base de monosaccharides et ne contient pas de quantités importantes d'autres agents réducteurs. En variante, il n'est pas néons- saire de séparer l'acide urique et la créatinine de la solu- tion lorsqu'on dose le glucose pourvu que le dosage du glucose N'effectue conformément au mode d'exécution préféré en solu- tion alcaline carbonatée.
On trouve que l'acide urique ou la créatinine n'apportent aucun effet important l'analyse des monosaccharides lorsqu'on ajoute ces deux substances en oon-
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centrations physiologiques directement à la solution de glu- cose qu'on analyse, On.se rapportera à la figure 5 qui repré- sente la réduction de l'indicateur par le glucose en présence d'acide urique et de créatinine, l'acide urique (5 mg %) et la créatinine (2 mg %) ayant été ajoutés au ême glucose norma- lisé à 100 mg %, pour les résultats graphiques des expériences dans lesquels on utilise un procédé analogue à l'exemple 1 à l'exception des ameuta réducteurs supplémentaires cités.
Dans cette figure 5, F signifie glucose, G signifie glucose et acide ' urique, H signifie glucose acide urique et créatinine et I si- gnifie absorption.
Lorsqu'on recherche la créatinine et l'acide urique on peut différencier les caractéristiques et réduction de l'un en présence de l'autre à l'aide des conditions particulières de réduction utilisées. Ainsi, lorsqu'un échantillon à analyser contient à la fois l'acide urique et la créatinine, on peut les combinerà un indicateur, comme dans l'exemple 1, et si on choisi convenablement les conditions de réduction, on peut déterminer sélectivement l'effet réducteur de l'acide urique seul.
On a mis au point certaines conditions adéquates pour la réduction sélective et préférentielle de l'acide uri- que qui comportent un ajustement du pH à environ 5-6. Si on applique de la chaleur, la réduction est accélérée. Si on ra- mène le pH à environ 7-8, l'acide urique et la créatinine pro- voquent le virage de l'indicateur. La quantité d'aciue urique, par conséquent, peut d'abord être déterminée en utilisant des conditions sélectives et si on détermine le total, la quanti- té de créatinine est facilement calculée en prenant la diffé- renée des deux valeurs.
On comprendra bien que les conditions ci-dessus pour la réduction sélective ne sont données qu'à titre d'illustration et que des variations considérables peu- vent être apportées conduisant au même résultat.
Lersou'on utilise le sérum sanguin pour le dosage du sucresanguin, il convient d'utiliser de préférence la technique ue Somogyi pour la déprotéinisation. On obtient à
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l'aide de cette technique un filtrat limpide qui cet très sa- tisfaisant pour l'exécution du présent procédé. Par contre, . ci on désire doser l'acide urique ou-d'autres substances ré- ductricer dans le sérum sanguin, il ne faut pas utiliser le filtrat de Somogyi, étant que ce dernier ne renferme essentiellement que des substances réductrices à base de mo- nosaccharides. En conséquence, dans ce cas, on peut obtenir un filtrat au moyen du procédé de Folin et Wu :J. Biol Ohem.,
38, 81 (1$19), dans lequel on utilise l'acide tungatique.
Cependant, on a noté que les filtrats confectionnée conformé- ment au procédé à l'acide tungstique de Folin et Vu sont par- fois troubles par comparaison au filtrat de Somogyi. On n' observe pas une telle turbidité lorsqu'on ajoute des solutions aqueuses d'étalons de glucose ou d'acide urique aux solutions de l'indicateur et d'acétate ou de carbonate.
On trouve que l'addition d'un agent de surface oa- tionique au filtrat d'acide tungatique élimine la turbidité.
Il est recommandé d'en utiliser une quantité suffisante pour rendre la solution limpide. On note qu'on peut ajouter environ
1% de ohlorure de méthylbenzethonium (le chlorure d'ecyle crésoxy éthoxy éthyl diméthyl benzyl ammonium mono hydraté) pour obtenir cette limpidité du filtrat, maia on conçoit qu'on peut utiliser de la même manière d'autrea agents de surface cationiques, Des filtrats traités de cette manière ne pré- sentent aucune turbidité et peuvent être utilisés dans le do. nage de l'acide urique ou d'autres substances réductrices y compris le dosage du monosaccharide dans lequel on n'utillse paa le filtrat de Somogyi.
L'exemple suivant illustre lea pointal précédente dans le dosage de l'acide urique et de la créa- tinine :
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EXEMPLE IV
Dosage de l'Acide Urique et de la Créatinine dans le Sérum Sanguin - Solution d'Indicateur
N'importe lesquelles des phénanthrolines ou biqui nolinea substituées mentionnées dans cet expose peuvent elfe utilisées dans la réaotion. Dans cet exemple, on utilise le ohélaté ouprique du chlorhydrate de la néoouprolne que l'on ajoute à une solution d'acétate de sodium à 1% à une concen- tration identique à oelle utilisée dans le dosage du mono- saccharide dans l'exemple I.
- Réaotifs pour le Filtrat
On utilise de l'aoide sulfurique à 1/12 N pour le filtrat d'acide tungstique préparé conformément à 1'enseigne- ment de ?clin et Wu. On ajoute une quantité suffisante de chlorure de méthylbenzéthonium à l'acide pour obtenir une so- lution à 0,3%. On utilise du tungstate de sodium à 10% pour le filtrat d'acide tungstique.
- Mode opératoire
On prépare le filtrat d'acide tungstique par sddi- tion de 8 volumes de solution d'acide sulfurique à 1 volume de sérum sanguin. Après agitation, on ajoute 1 ml, de tungstate de sodium à 10% pour précipiter les protéines. On filtre le précipité de la manière habituelle.
1 On ajoute 2,0 ml de filtrat ainsi préparé à 5,0 al du réactif coloré en solution d'acétate. Les contrôlée et té- moins appropriés sont traités de la même manière.
2 On place le mélange dans l'eau bouillante pen- dant une minute, on refroidit à la température ambiante et on mesure dans un spectrophotomètre.
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On observe une relation linéaire entre la densité optique et la concentration en acide urique et créatinine.
Dans les conditions particulières utilisées, c'est-à-diro en présence d'ions d'acétate et si le pH est d'environ 7-8, la présence de glucose n'a pas d'effet sur les résultats observés.
On peut déterminer l'acide urique en ramenant le pH à environ 5-6 sans intervention du glucose ou de la créatinine. La con- centration en créatinine est calculée par la différence entre les deux valeurs,
Les exemples suivants sont donnés à titre d'illus- tration de l'applicabilité de l'invention à d'autres substan- ce* réductrices.
EXEMPLE V
Dosage de l'Acide Ascorbique
On prépare une solution d'indicateur de mise en oeu- vre avec la néccuproïne et l'ion cuprique en un rapport molé- culaire de 2:1, par un procédé similaire à l'exemple 1 A 1' exception que l'on acidifie la solution* On ajoute des échan- tillons de 2 ml. d'une solution étalon d'acide ascorbique di- luée à 1:10 à des portions de 5,0 ml de l'indicateur. On effec- tue des lectures apectrophotométriques après quatre minutes à 450 mu. en utilisant une cuvette de 10 mm. Les résultats sont représentés dans la figure 6 qui représente la réaction d'acide ascorbique. Dans cette figure, les concentrations sont données en abscisses et les absrptions en ordonnées.
Bien que l'on ait décrit ci-dessus d'une manière dé- taillée certaines applications de l'invention dans le but d'en faciliter sa compréhension, il est bien entendu que celle-ci n'est nullement limitée aux dispositions décrites et repré- sentées, et qu'elle en englobe toutes modifications de détail et variantes..