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Prfoarat.o: :J 'J.Ct..:!,- #an.incpenl;.o"
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.Li:.! .0,', .'::"! '.,..; e ; n ..-. r: .. ; , '."": . :( ..¯ , , ¯ un r:OUV0±J.'..... .. >..r i - c,5d5 à.# fJ='pê\=.J.t-:)!' d'<1,i,-",; '')-..-''1'' ,:, ',':'....1¯',''': e;. P"-,.1S bzz Lic.r###. ,j u;. t-'l'GC'c!'2 <\:," ,:,.,.. >U':-: zrt .-e= de l'acih 1,:'-:,111:10-' p'2ni.Cllla:1iq\!e par une .. :>:,'1' :.c\'..,, cie pénicilline L'acide -am:op>7LC? :ir¯i'â-. est un composé connu d'une utilité proue ii tirre d'lnte!:".10r1idl.!'C dans la préparation
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des pénicillines . La conversion en pénicillines bout être réa-
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lisée simplement en traitant l 'aciJJ û-.:l:ni:1o:', ) -: ,:.:;1i.:r.:e :wcc l'agent acylant désira en présence d'un alï30r . Avant la présente invention, on a préparc l'acide 6-ami: opénici.llaniqi:e par l'hydrolyse enzymatique de pénicillines .
Malheureusement, cependant, les micro-orgamsmes antérieurement connus CC ;63' lisant cette conversion présentent un ou plusieurs délava'.' @@es, tels que leur aptitude à n'hydrolyser que difficilement les péni- cillines hydrolysables, telles que la pénicilline G, leur produc- tion de l'enzyme pénicillinase qui détruit le noyau pénicilline,
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et La difficulté de la séparation de l'enzyme p6nicilliQ 'n '.to (p6nicitlle acyla3c) dé3irà partir du mycélium du 11icro.orga nisme par lequel il a été formG.
On a maintenant trouve qu'en utilisant deux souches
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inconnues jusqu'à présent do l'espace 3.Acji.Lj3. meq ,1 t:-:!:: 1. um . loua les désavantages précitée sont éviter , et ;,.:'on peut obtenir un procédé praticable industriellement pour la préparation de
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l'acide 6-aminopénicillanLque à partir de p6nic!.ll:ne3.. L'une da-s nouvelles souches est i.dentifiée sous Le nom 3az.lu5 11eq1+':'3}:'i'.n var. penicillalvt1cum .
Ce micro-organisme a ét0 dû-'osë Jans la "Ancrican Type Culture Collection " ', washi,;-:- 3.C,, 2' ¯ dans laquelle ce micro-organisme a rcç'¯ le r: .";i' 1-:-+S, :¯'aui: nouvelle souche est identifiée sous le nom jù#1y; 2J:]-1,:..:l2 '.'3r. i.0'lCir¯'pV0=t:!1 Ce nlcrO-Orl}.J.nS2 ,.1 ;0ç.il<,.;?vut .0;" .,1,:p.e=' dans la " American Tl': Culture 310ct;on", 1 .=oll.::c.i:\:l dans la- quelle on lui a attribua le :; A'rcc 1-"946.
Ces nouvelles souches de Bacillus marater!um peuvent être distinguées des souches connues de cette espèce par les comparaisons suivantes : Bacillus Meqaterium var. Penicillalyticum Morphologie
Le grand diamètre des bâtonnets (1,0 à 1,3 micron),
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la formation de graisse , l'aspect granulaire dè la cellule, la forme des sporanges , et le caractère de la croissance sont les mêmes que dans le B. megaterium connu, mais la souche diffère sous les aspects suivants : (1) la longueur des bâtonnets (2,5 à 6,0 microns) est plus grande que celle des batonnets du B. megaterium connu; (2) il n'y a pas de formation de spores sur un agar-agar nutritif;
(3) la chromogénèse est différente (aucun brunissement avec points pellucides au vieillissement); ne (4) les cultures/croissent pas bien sur un agar-agar glucose-ni- trate.
Phvsiologie
Pour les propriétés suivantes, la souchu est identique aux souches connues de B. megaterium: inaptitude à produire do
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l'acôtylméthylcarbinol; formation d'acicie partir de I1li\nrJitol;
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pas do (r()i3Si\nr.o .:1.n0:.obic dans un t;(1u.:lon #.i ..'.'c:m; 1;>,dri;- lysc de 1 "amidon, ,.t::'.J SOUC-:1C dlLft:C!? ,ut7ll.", l" ïW :JC...d il ';i;t - (1) olln ,^,7 ".i, g>; ; j;.;p;:=1;1,:.>r le 1,iit.; (2. cl'!...' .c;'-:1L !3 n.rra..e3 ::"I Ît.rl.tO.3; (3; 1:117-it'Ct ,1 1,,r-< >,,;t;#; Z=lï,:i.lT'.!:'3t'. :1:. :; ''1.>,.'.
"ci.l:":'1 .::..:.0..t!¯:-.:.:¯: '.' : î , ¯ , c' ; I 1 C u^/ C'; ; lv 0.,1' g¯: : '.!":': !.. 1.,l::t d: 1--'. ' < , . i .. 'lt:....I1 t. i,., ,...
.r ':1 : I -JI",-,1:'. ' (:r 1 ."..C ['1o.1T': L,':- !:itl'-" l,i , .
1:> 1. : ..1 , :- "1 "",' . f' j ¯ ...7 p . r <: '.... \ .. i )'... , ::<)-i3 '''..'''0 :.::1.. 1,.:: <"-"r -- .:'1'- !,'.. !".. ,1' , lt'1 (.'.CIInLi t.-I. ':f:'tl:." -' ,! . ,= 1 :.. ':' S . l\' (Il la ():1 q \ 1 è t" ( l '.1 :¯u'.' '1¯"¯ 1 , ( 1 "7, '1"¯i-t;3; C:3r ,l.1:,3 J { r ,1 r.r..: que pour : il,C;l'rI,lC'¯: I¯.^ -'\, n" ',1 ; (2) format lor) p'u al)"r1d.\nt.n ,!LIZc:ult cie sp')rc9 'Jur (y1r-c7tJr r,utritif;
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(3) la chromo9.n03c ert dl ff('r('nto (par de !Jt"unl:JDl1mcnt avec rom¯:3 p;<lluci;1,;s au V1Clll1Sg(r.h'nt)
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(4) les cultures ne croissent pas bien sur agar-agar glucose- nitrate.
Physiologie
Pour les propriétés suivantes, la souche est identique aux souches connues de B.megaterium; inaptitude à produire de l'ac6tylméthylcarbinol; formation d'acide partir de mannitol; pas de croissance anaérobie dans un bouillon de glucose; et nydro- lyse de l'amidon. Elle diffère sous les aspects suivants : (1) elle ne peut pas utiliser le citrate; (2) elle réduit faiblement les nitrates en nitrites; (3) elle est incapable de fermenter le xylose.
Les propriétés baccériologiques des deux nouvelle--. souches sont résumées dans les tableaux suivants.
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Bacillus Meqatcrlum var. P o n i c i 11 a 1 y t i cum 1. Ob9cvations morpt:oloca ic' uts : A. Observations microscopiques : (a) cellules végétatives - lors d'une croissance
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sur un agar-agar nutritif il 3()"C pendant 13 24 heures, dos bâtonnets de 1,0 à 1,3 micron sur 2,5 à 5,0 microns, avec extrémités arrondies,
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se pr'l:nl8nt 1.,abit.ielli;rrent '>0US forme d."' fi- L\'!\(.':1,J ou sous ferme 3t: ':J r" ,3 longues 3 Jt 13;';1- '7!LJ'.-!, nais .3c p:".3Cr:t:1t d...\f"3 quelques cù3 !:3(- 1.' '"t'i. ou en courte:! C:!:3;ic¯5" ioiiàs de t'ouvo- ,':W il >.,,<;c flagellas UrlLY iC!'1('";r pr0nant La Gr.i1 ou v,ari.ii>1<;.; (\'.1 Gror.1 pan de 't i'liC¯^ (>rls de ,4raisse acide).
Sur ar-a1ar nctr.it;5 de glu- cose, les cellules contiennent quelques globules de graisse. Protoplasma granulaire taché . Formes d'omLre occasionnelles.
(h) Spores - lors d'une inoculation sur agar- agar nutritif, il n'y a pas de format-ion de spo-
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res, mais lors d'un incubation sur de l'agar- agar de graines de soja (à 30 C pendant' 24 à 48 heures), il y a une formation de nombreuses spo- res. Dimensions do 0,8 à 1,2 micron sur 1,5
2,0 microns, ellipsoïdales ou ovales, centrales ou paracentrales.
(c) Sporanges - pas de gonfloment distinct B. Culutres couchées sur agar-agar nutritif (30 C pen- dant 24 heures) : croissance abondante, uniformo, lisse, douce à butyreuse, translucide à opaque, étincelante, blanc laiteux à blanc légèrement jau- natre, chromogénèse non modifiée au vieillissement et pas de brunissement avec points mellucides au vieillissement, couleur du milieu inchangée, odeur putride.
C. Colonies sur plaque d'agar-agar nutritif : circu-
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laires, surface rugueuse, bords léqrèIlH;H1': ')r:,.1'..11 "f.. lisses, étincelantes, blanc lalccux à blanc l0yre- ment jaur.at.re, 16grement adhérentes,pas d'étaLe- ment.
D. Bouillon nutritif ï:30 C pendant 24 he-ur-2.,;). t::rb:c'.'.t: moyenrie à légrc1T-c!': c::,i [rr,0 .vec dp8t peu aror- dant, pas de p1¯:cu10 .
E. Cultures couch<'e3 su'" :"clr-<1:1.:\r d' :Ütr<1':c-qhl0;)' i.3 de CYO i :":,t;.C= '?- : 2'O? > 5,:1!!.',' trcj peu ai:1;;11<;,ic 1', Cultures couch<3e? 5',':; Ch);L'-,1,,,( de tyrosine 00"'" pendant: 24 éi 7.' :Wl':"l:J): t'I':1'lcnt tires noir pt")(.!'.1it.
G, Cultures rw<;.r;;.Fus sur agar-.qr de graines do :10]':' : croissance atondante, aussi bien que sur agar-agar
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nutritif, meilleure sporulation, lisai-s, bllnchos, étincelantes ou occauionnellorrent nacrées iridcs- contas .
Il. Cultures couchées sur agar-agar nutritif -glucose
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(30 C) . croissance habituellement plus abondante (quelque peu visqueuse) et plus melle que sur agar- agar nutritif.
I. Bouchon de pommes de terres croissance abondante, lisse, étincelante, étalement, habituellement bian- che à blanc crémeux (mais occasionnellement pale rose au vieillissement), couleur du milieu dovenant brun jaunâtre au vieillissement.
J. Bouillon à 7% de NaCl (30 C): pas de croissance.
K. Bouillon a 5% de NaCl (30 C): pas de croissance ou croissante peu abondante.
II. Propriétés physiologiques (température d'incubation de 50 C):
A. Oxygène : aérobie (pas de croissance anaérobie dans un bouillon de glucose).
B. Lait de tournesol : production d'alcalinité : pas de peptonisation.
C. Plaque de gélatine : lente liquéfaction, cratérifor- me (hydrolyse de gélatine : D. Plaque rayée d'agar-agar de gélatine : zone étroite d'hydrolyse (plaque d'agar-agar de gélatine de
Frazier).
E. Plaque striée d'agar-agar de lait : zone étroite d'hydrolyse de caséine (hydrolyse de caséine: positi- ve).
F, Hydrolyse d'amidon : positive .
G. Production d'acétylméthylcarbinol : négative (tempé- rature d'inculation de 32 C).
H. Utilisation de citrate : positive (agar-agar de citra- te pour bacles ).
I. Réduction de nitrate en nitrite forte ,
J. Production anaérobie de gaz à partir de nitrate négative:
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K. Réduction de bleu de m4ti,viAm+ . --:>.>
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L. Production d'indole : négative.
M. Production d'hydrogène sulfuré positive.
N. Activité de catalase positive.
0. Activité d'uréase : négative.
P. Hydrolyse de cellulose (milieu de McBcth ): négative.
Q. Températures de croissance: bonne croissance à 28 C à 35 C, températures maxima habituellement entre 40 et 44 C, pas de croissance à 45 C ou plus, légère croissance à 8 C après culture de 5 jours.
R. pH pour la croissance : optimum compris entre
7,0 à 8,5, et pas décroissance au pH de 5,0 ou moins.
S. Tests de fermentation : acide mais pas de gaz (avec sels d'ammonium comme source d'azote) à partir de glucose, fructose, galactose, mannose, sucrose, mal- tose, tréhalose, cellobiose, amidon, dextrine, glyco-
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gne, .glycérol, mannitol et salie in. ;'tU d'aride à partir d'arabinose, rli.tri-tos4--, xyloso, j.ci.o m61i1J10SC, r.tffinoso, mé16si.t.u'i>c, int11in,;'. ,i.i0i"rGl,
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dulcit01, inosirol 0l t-mtiy'171GCOSide, III. Sourc" : ol;t-i,nt.ion par i3olm''nh à 1>,irt iv ,1'un çl A 'i >#t;;r.; Prcfccturc, J.tpon.
[i:7C1 :¯¯^. ;i(.erj..:1!l: '1,1:".. j trn.'.:1¯!1] I. Cbserv.tir.,ns m('n):1f)ioLt.'l,-,-?- A. Ob;f'r'/\1t ion:] mi -:r,)C't) ,U(:5 : 1> C (' 11 u "; ';t'1 \ '-j.7 - 1;):- d'un''' cr 0 i 9 S ' ' 1 C e s'ir ,llj.li'"",S! 1!" :l',l'.l ' t. l .1 ..'C :.r:,;.151' kil A 24 hf'ur.,,'1, 'J't(';::1'.; IL T.) 7 ; 1, 1 :".)#'.'' sur J,') à 7,0 L'tl ¯l'C.1..i .t., ;1' O.IJ:1,;' :,i:.-1',t"11r)f"1'n s<,<i 1;1 <;u en <:<..<.ir t<,=i <;i.,i;>;j [)'.)i.'3 '! "'1 l'! ..i c,,µ 1>il,,;, o!n.crv(.(.!:1 sous {'orme 'J'-' i Ll;)1...l1ll> ou <1. !,.:t:ea iunquca ,.!t emmlée9 .
Do ., de mouvemenL: .lv<:c f1.1<Jollcs , prenant
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le gram , pas de capsules. Sur agar-agar nutritif- glucose, nombreux grands globules le graisse conte- nus dans les cellules. Protoplasma granulaire taché.
Formes d'ombre occasionnelles.
(b) spores - formation de nombreuses spores sur agar-agar de graines de soja à 30 C pendant 24 à
48 heures, 1,0 à 1,2 micron sur 1,5 à 2,2 microns, oviformcsou ellipsoïdales, centrales ou paracentrales (c) Sporanges : pas de gonflement particulier.
B. Cultures couchées sur agar-agar nutritif : croissan- ce abondante, filiforme, lisse, douce à butyreuse, légèrement adhérente, translucide à opaque, éti@ce- lante, blanche à blanc légèrement jaunâtre, chromo- génèse inchangée au vieillissement , pas de brunis- sement avec points pellucides au vieillissement; couleur du milieu inchangée, odeur putride.
C. Colonies sur plaque d'agar-agar nutritif : circulai- res , lisses, douces, étincelantes, convexes, entiè- res, translucides à opaques, pas d'étalement, blanches à blanc légèrement jaunâtre, légèrement adhérentes.
D. Bouillon nutritif : turbidité moyenneà forte, uni- forme, avec dépôt , pas de pellicule, (30 C pendant
24 heures de croissance).
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E. Cultures couchées sur agar-agar nutritif-,ql.ica?e : croissance habituellement plus ahondatc (quelque peu visc;ucu:;c'; .t plu:3 mollo que sur <1'],lr-1 ;,Ir nutritif.
1-'. Cultures C.")U'.:1\f!('8 3Ut." ù'; r-ù'dr dr.' nitrate-glucose (30"C, 24 1 72 h:ure3) : '..tj do croiosnncc.
G. Cultures couchées sur agar-agar de tyrosine (30 C,
24 heures ): pigment fortement noir produit .
Il. Cultures couchées sur agar-agar de graines de soja
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(3o C, 24 heures) : croissance ,1bondantc. meilleure Hporultition (lu(! sur ''Flr-,1Q..r nutritif.
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I. Bouchon de pommes de terre (30 C,24 heures) crois- sance abondante, lisse, douce à visqueuse, étince- lante, blanche à blanc jaunâtre (mais occasionnel- lement jaune au vieillissement). Couleur du milieu devenant brun jaunâtre au vieillissement.
J. Bouillon à 7% de NaCl : pas de croissance.
K. Bouillon à 5% de NaCl pas de croissance ou croiasan @ peu ce/abondante.
II. Propriétés physiologiques(température d'incubation habituelle- ment de 30 C): A. Oxygène: aérobie (croissance anaérobie dans bouil- lon de glucose : négative ).
B. Lait de tournesol production d'alcalinité com- mence à peptoniser à 15 jours.
C. Plaque do gélatine : lente liquéfaction, cratérifor- me (hydrolyse de gélatine : position).
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D. Plaque rayée d'aç>4r-aqar de gélatine i zona laga ù'hydrol;'9c (plaque d' aci.:t-ac,ar de g'Hilti:1c 4z Frazier),
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E. Plaque rayé'? d'agar-agar de loi'- : zone large de caséine hydrolyse'.'' (hydrolyse de. c-iséinc ; C5t1,'!" b', Hydrolyse d'amidon : pc..-i':ivc .
G. Production '. c C -i:l.i.'1G'f' 71 t:.E= 3 :,. :.. : !1j;:iti'v' :. C:'i'.Ë:,'', " d'incu1:,.c)r (C' J2 '<z), il. 1,'t llis"tion de ci:rt" r.'2,;.,L i 'JI (<1gi.lr-ctL1r ',,,- c-- trite pour bac3.iEczi.
1. Réduction de n L:.1"¯-,¯ en ni:rita i pcsiti../.i (f,iibi.e- ment).
J. Production anaérobie de gaz à partir de nitrate : négative.
K. Réduction de bleu de méthylène : positive .
L. Production d'hydrogène sulfuré : positive.
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M. Production d'indole : négative.
N. Activité de catalase : positive.
0. Activité d'uréasc : négative.
P. Hydrolyse de cellulose : négative (milieu de McBeth.
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Q. Températures pouvcroissance : bonne croissance à 28'C-
35 C, températures maxima habituellement entre 4C et
44 C, pas de croissance à 45 C ou plus, légère crois- sance à 8 C après culture de 5 jours.
R. pH pour croissance : pH optimum compris entre 7,0 et
8,5 : pas de croissance au pH de 5,0 ou moins.
S. Tests de fermentation : acide mais pas de gaz (avec sels d'ammonium comme source d'azote) à partir @ara- binose, glucose, fructose, surcrose, maltose, tréha-
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lose,cellobiose,amidon,dcctrine,glycogène,glycérol, mannitol et salacine.L6gùrement acide à partir de ga- lactose.Pas d'acide à partir de rhamnose,xylose,man- nose,lactose,mélibiose,raffinose,m6làsitose,inuline, sorbitol,dulcitol,inositol ot a-m0thylglucostd2.
III. Source : Obtention par isolement à partir d'un sol à
Tottori District au Japon.
Pour préparer l'acide 6-aminopénicillanique suivant le procédé de l'invention, on laisse agir sur une pénicilline des enzimes provenant de l'une des souches de Bacillus megaterium que l'on a décrites ci-dessus.
On peut employer n'importe quelle pénicilline comme
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précurseur dans la préparation de l'acide C,-ami;oi>13ni<rill*aniqiJe suivant le procédé de l'invention. De telles pénicillines sont notamment la pénicilline G, la pénicilline F, la pénicilline X, la pénicilline K, la pénicilline O, la pénicilline V, la 2-(phé- nylthio)-éthyl-pénicilline et la a-phénoxyéthyl pénicilline. On peut employer la pénicilline telle quelle ou, de préférence, sous la forme d'un sel, par exemple un sel soluble dans l'eau,
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tel que les sels de métaux alcalins (par exemple les sels de potassium et de sodium).
La pénicilline est mise en contact avec les enzymes de l'une des souches de Bacillus meqaterium mentionnées ci-dessus.
Les enzymes sont ceux se trouvant dans les cellules du micro- organisme désiré et/ou les enzymes libérés dans le milieu à par- tir des cellules. L'activité enzymatique est obtenue par crois- sance du micro-organisme désiré dans un milieu nutritif pendant une période de temps suffisante. Par séparation des cellules à partir du milieu, comme.! par filtration ou centrifugation, l'acti- vité enzymatique est trouvée principalement dans les milieux, plutot que dans les cellules.
Suivant le procédé préféré de l'invention, le micro- organisme désiré est mis à crottre au contact avec un milieu nu - tritif convenable en présence d'air. Un milieu nutritif conveno-
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ble comprend essentiellement, uno sour;:c de [,1':' (',!'- ;1z,)té!.l ot une source ,1,J3imil,1?>le d<-' carbone et d'ù>icrq:< . Cc3tt^ </vci;1..r; source peut Mrc f'nrIP0e par un hydrate de carbone (pilr CX('1lpJ.U
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du 'TLllC'S-', du fructose, r;u sucrer-, dr "',11 ':r)-5, , J;y l.'71121GG:1, de la glycérine ou <1,1 la c3c::trirr1 .
Lü ucurc. e t,wteur5 <iz<>? <EIT peut Dtr<; r")r<1,1:dru,,; (l;,lr exemple ,jr111c.Jp ;j<; 1.i, licrr.tr de ma- C?iiltlon cte m,113, ''¯atï';11 de ':7OtC:'. m,:-;. r.., ; 1 :;t)1"':n¯:3 eL, dt.3- 1.:,'rl', !:I..!(lt.:n'.,, C'i.!OU v:.:t-;,1ll <.i.i 1- TJl't"Il vu .;i'n 11/)\ i :il(C ([.Jd:''' '::<:uaIh 2'" 1; i I...'¯/'C" --If' frt;,r; ..¯ ')r f '1 J qUI. '' Jt. s:;>: r,lnicy.t..,s !jy",.I,(... t;s,;1;1..>.: ;=;.j,1<.i, .,.. , (;!:.' ,1<ax sl.'l; d'd('-,10'}1l:m . dfs il : I';.." Jl,11jr:) ou :3 .i;i:;ii>-<ici<1<.x) , Li ^It.¯C'¯rJZ'Cj.ajL:"t' est !n'S ., C:ïWt :...l d U:1' 1'i!It :Y it¯".lr 'L';''.'.'.?n.!.3l" , T:,lr '¯'1:":('!1p le d t env i '('("';1 2) ,1 environ 37 C, ;,.,miant un¯ , . ¯c>ùc d<; t'Jrn.J3 d):propri6<.!. de pr6f6- re:7cc environ 1 1 ourj, 'm pr!sence d'une source d 'oxYf);ne, par l>xcmJlc p,1r sccvumc';t ;,,rrc3is qu'on I!XPOSü l'air.
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)}ion que la mlturc 1U19SC ntrc utiliaëc directement peut l 'tiy<irnly;J<, r30es 1)1'tiicillin,s, d,in3 le proc6cié référé (le la 1>réy<,iiLv 1;ii,,:iità.on les cellules sont s6p.)rf*a, df t'rt't'r.nr-.-'
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par centrifugation du milieu de culture, avantageusement pendant 5 à 20 minutes dans une centrifugeuse à 5.000-12 COO tours par minute, et le liquide surnageant, contenant la majeure pro- portion de la pénicilline amidase,estutilisé comme source d'en- zyme .
Ce liquide surnageant peut être employé directement après dilution ,avec un tampon aqueux, tel qu'une solution de tampon d'acide borique, auquel cas la pénicilline est ajoutée , de ?ré- férence sous la forme d'un sel soluble dans l'eau, au liquide surnageant ainsi traité; ou bien le liquide surnageant peut enco- re être purifié , par exemple par dialyse , avant l'addition du tampon et de la pénicilline. L'hydrolyse peut être réalisée à n'importe quelle température normale et à n'importe quel p@ normal.
Cependant, pour assurer que l'enzyme et la pénicilline pr ne soient pas détruits , la réaction est de/éférence menée à une température inférieure à environ 55 C, avantageusement d'en- viron 37 à 38 C, et à un pH de l'ordre d'environ 6 1 environ 10 (de préférence d'environ 7.8 à 8,4).
L'acide 6-aminopénicillanique formé peut alors être récupéré de la manière habituelle, par exemple par adsorption
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sur du charbon actif ou sur une résine échangeuac d' ions /- D,r exemple une résine échangouse d'ions fortement acide , telle que la IR-120(11+)/7 , àlution avec une base (par exemple hydroxyde d'ammonium au pH de 7), concentration de l'éluat sous vide et
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réglage du pil à 4,4 pour obtenir le produit cristiliin; ou bien il p ?ut @trc mis en réaction in situ avec un agent acylant désiré f.our donner une pénJ.c 111] n0 idc..tique ou diff6rc',1tc ric celle partir de laquelle l'acide r,-..mlnopénlcillani'1\.:c été prerùr6 au départ.
Le fait les pénicillines peuvent fifre hydrolysées
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en acide 6-ominopénicillam que en des rendements presque quantl- tatifs par des enzymes obtenus partir de deux souches de Ilus m'?atcri<im de L'invention est surpn'ntlnt du fit que <'Ci 'iouch'ps connues do )...."'...j..'...w. m'""tÇri!m nc donnent
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d'acide 6-aminopénicillanique quelconque. C'ost ainsi que lorsque des expériences étaient menées avec los trois souchus connues de Bacillus megaterium identifiées dans la "American Type Culture Collection" par lesnuméros 89,8245 et 10778, on a trouvé que l'onnobtenait pas d'acide 6-aminopénicillanique.
Les exemples suivants illustrent encore l'invention (toutes les températures sont données en degrés contigrades).
EXEMPLE 1 (a) Fermentation - 10 flacons à secouement de 500 cm3 contenant chacun 100 cm3 du milieu aqueux suivant 1% de poly- potone; 1% d'extrait de viande; et 0,5% de NaCl, sont réglée au
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pH de 7 et mis à l'autoclave. Apréefrvidissement, chaque flacon est ensemmencé avec une bouble en fil de platine d'une culture couchée de Bacillus megaterium ATCC 14945 sur agar-agar d'extrait
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de viande. Les flacons sont a1rs cultivés pcncl1t 48 heures à
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30 C avec secouement (course de 6 cm, 120 tOl.;3 ::,:r minuit.-) .
(b) Récupération des er:zym#s - Los façons >30#t, , -.3'éra- blés et centrifuges dans un0 centrifugeuse 4000 tours par. mi;;ut p'-)ur donner C':lVlrC1'WiWi cm3 d'un liqujde 'Jur!1.:l'Jcdn. /1. co 1;<=#ii .l:#, on ajoute 1000 em3 d'une solution tampon d'':h'i;) hc%riqi:a \1'111 J;; 8,2) et 150 cm3 de toluol.
(c) Au liquide obtenu <an.= 1 pb;!s'.:' (r:', or, ,1JO\t., scluticr aqueuse d'un biL2.1on à'unii-, : pn'icill!::'; C sc s la fcr:i'-; ii'Z sof sel de ptJtSE1'ùill. Le ''''1.-."' VFi'ù Li.1' ccàt 'J, Ccnné pencnt 5 jours <à 37 z..', 1 1>'1<iis c,,: ¯ 1." J=i .;oeccu<> oc.i,>., :=,i :ce':- lement. Arr;!s Id réaction . 1c il.J=..]e '-:'3': :"\.)'11,;.\ ,1 àn H ,:1, 2, >, 2,3 jvec du 11c1 1:--.1 CL ensuite 'La p6nlt::i111.n r4sid'J<airc es>;
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aeparcc par uno c:<trùC\:l')[1 à l'dthcr. Cc yll t.'!)t il()rs W r.'cJlÉ1 à 6,6-7,0 p.ir addition de >1,.iJli lN* Une partie du liquide est dévelop- pée par chromatographie sur papier en utilisant un système n- butanol /éthanol/ eau (5/4/1).
Après séchage dans l'air, le pro- duit est acyle avec du chloruro de phénylacétyle et la portion
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qui inhibe la croissance de sqanli aurrua t-9t7 r11('<!IIt""'O tirilir nrn-
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duire un Rf de 0,20-'0,22,ce qui est exactement égal à la valeur de Rf de l'acide 6-aminopénicillanique pur. Du plus, par mesure de la résistance aux bactéries oréés par acylation, on a trouvé que le liquide contient encorcenviron 3,2gr d'acide 6-amino- pénicillanique, qui peut être transformé en un produit séché par adsorption ou dialyse, ou être transformé en pénicilline synthé- tique après avoir été soumis à une acylation désirée dans le formo adsorbée.
EXEMPLE 2 (a) Fermentation - Un litre du milieu aqueux suivant : 0,5% de glucose? 0,3% de glycérine; 1,0% d'extrait de viande ; 1,0% de rolypeptone et 0,5% de NaC1, réglé au pH de 7, est a@outé dans un petit appareil de fermentation et mis à l'autoclave.
Après refroidissement, on ajoute 50 cm3 d'un fluide précultivé, obtenu par croissance de Bacillus mogaterium ATCC 14946 pendant 20 heures sur le même milieu. Le mélange résultant est aéré dans le rapport de 1/1 et cultivé pendant 48 heures.
(b) Récupération des enzymes - La culture obtenue dans la phase (a) est centrifugée dans une centrifugeuse à 4000 tours par minute pour donner 1000 cm3 de liquide surnageant, Ce liquide est saturé à 80% avec du sulfate d'ammonium et le précipité ré- sultant est dissous dans de l'eau distillée , tandis que le pH est réglé à 8,0-8,4 par addition d'eau ammoniacale.La solution résultante est placée dans un sac de céllophane et dialyse pen- dant 20 heures dans de l'eau de ville en circulation, puis pen- dant 30 heures supplémentaires dans de l'eau distillée en circu- lation, pour donner 300 cm3 d'un liquide dialytique.
(c) Hydrolyse du pénicilline G on acide c-aminopénicil- lanique- -¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
Aux 300 cm3 de liquide obtenus dans la phase (b), on ajoute 375 cm3 d'une solution tampon d'acide borique, 30 cm3 de toluol et 2,12 gr du sel de potassium de pénicilline B. On
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laisse réagir le mélange pendant 5 heures à 37 avec un secoue- ment occasionnel. La concentration initiale de pénicilline est de 5000 unités par cm3. Après 5 heures, la pénicilline résiduaire s'élève à 150 unités par cm3, ce qui conrrospond à une conversion de 97% en acide 6-aminopénicillanique. Ceci est confirmé par la
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récupération de 1,1 gr d'acide G-aminop6nicillaniqua.
EXEMPLE (a) Fermentation - 550 litres du milieu stérile aqueux suivant : 3,0% de caséine hydrolysée par enzyme ambre, 0,03% de lubrifiant Ucon LB 025 et 0,5% de glucose (stérilisation séparée ) le pH étant réglé à 7,0 . avant et après stérilisation pondant 30 minutes à 121 C, ont été inoculés avec 17 litres d'une culture
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de Bi1cillus mcqaterium ATCC14945, que l'on a mis à crottre à 30 pendant 24 heures dans le milieu suivant ! 4,0% de caséine hydro -
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lysée par enzyme ambre, 0,,05y% de lubrifiant Ccon LB 625 et 0, 5\' de glucose, le pli étant réglé à 7,0, ù'/al1t et ,.Jpr;}s stérilisation pendant 30 minutes à 121 , Le mÓlnge rÓuulLJnt oust a>jit4 (0,'? li.P./100 galions) et n6ré pendant 4fil3 ,:1 72 hCl.n:n':
1. l\pr..... "n'-'iron 8 heures, on ajoute , 15. C" lCldt¯ ph':!nyLlc6+:lq,:I.
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(b) IIvdrDJ..¯[J.QD..-!.±!.ll! nJ.L...:':>r.-.:.: '.r1:?...0¯-:,¯I.!!'¯i. norÓn 1<.'11-' l<ini<,;ic- 'L0 iicuii inn ribt ri<ins lu '.hriar' (.1) .2qc rég16 au pli de 7. avec d 1';;.;;,,1e L i oe tt - i''':r.t.ion , on prévoit ,.i:;v c-'jc;.'- d'r1i:Ot,1, ')11 ,iiop;;a îJ, 2.,i, flct '.:olU0n(! '''t- on 6:.\1,,'(' 1d tf'rnp':'I'C1" :'''. !3 t nI' 3ou<.'.' n qr;1,iLr , iii ji<;,,,ixsi;;in ''c'n,' .ii;t.:,,:.ili ::;.,, i,>, j il <;iL " 't)6 7, 3 <:;e <;ol it;?;; ,iL;;r, ]<, d, .'.."d'; ;,ii, . , i<j..o, e1>r,,:i 1 1.¯, 1eUr:'¯:-i, on ;i:,,.<,,ri; c:r/):'0!'. ''5 7 '; J i j>,F ;i<;1 lliit;. t-'.i ,àci<t. <)-.)nm<"cnt.c).lLr:i!;'
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E ;{F;>13'i.i: .. z) l'!:¯-mc:ti;m. - i,c procède' <1(' l'exemple 3, phase (,1), est suivi, sauf qu'on utilise une culture de Bicillus mc<7tr'rium ATCC 149.m .
( b ) JLo1y: d' p('nicil.1inü r, ('n¯.,,¯iL<.6-.1\11jOP<Fil}.t-
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Le procédé de l'exemple 3, phase (b) est suivi sauf
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qu'on ajoute 30 gr/litre de potassium benzylpèni.:14.1line, et que la pH est réglé et contrôlé à 8,5 Après 3 à 6 heures, on convertit environ 65 à 70% de la pénicilline G en acide 6-aminopénicilla- nique.
EXEMPLE (a) Fermentation - Un litre du milieu stérile aqueux suivant : 4,0% de,caséine hydrolysée par enzyme ambre , 0,0 5% de lubrifiant Ucon LB 625 , 0,5% de glucose, 0,15% d'acide phé- nylacétique, le pH étant réglé à 7,0, avant et après stérili- sation pendant 30 minutes à 121 C, a été inoculé avec une culture de Bacillus Megaterium ATCC 14945, que l'on a fait crottre 30 pendant 24 heures dans le milieu suivant : 4,0% de caséine hydro- lysée par enzyme ambre, 0,05% de lubrifiant Ucon LB 625 et 0,5% de glucose, le pH étant réglé à 7,0,avant et après stérilisation pendant 30 minutes à 121 . Le mélange résultant est agité et aéré pendant 70 heures.
Le bouillon est ensuite centrifugé et le fluide surnageant le bouillon est récupéré.
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(b) Hydrolyse de pénicilline V en acide r)-aminopénicll- 1.-! nique - On ajoute 0,5 ml du fluide surnageant à 0,5 'ni d'un tampon de borate 0, 2M d'un pis de 8,6, contenant 2 mgr de pénicilline V. Le mélange est incubé à 37 pendant: 2 heures, on ajoute une quantité de 0,06 ml sur du papier-filtre Whatman
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r1 1, et on développe le papier pondant la :1'-!1t. par un 31'!3t0mc bt>1,.,ant de but f4; 1/). L'acic3e 6-amirioiaénicilla- ni,!',:" prodiiit est dfCCW' (:.lr une: hio-titration cr, mttnc temps que l'acide standard eH drSaeloii>f de la mt?me manière' et après acyle- tion avec du chlorur de phénylacétyle.
EXEMPLE 6
En suivant le même procédé que celui de l'exemple 5, mais en substituant 2 mgr de pénicilline 0 à la pénicilline V, on
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obtient de l'acide 6-.itninopànicill,inique.
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EXEMPLE 7
En suivant le même procédé que celui de l'exemple 5, mais en substituant 2 mgr de pénicilline F à la pénicilline V,on
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obtient de l'acide 6-aminopériicillanique.
EXEMPLE 8
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En suivant le mémefprocédé que celui do l'exemple 5, mais en substituant 2 mgr de potassium phénéthicilline à la pé- nicilline V, on obtient de l'acide 6-aminopénicillanique.
EXEMPLE 9
En suivant le même procédé que celui de l'exemple 5,
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mais en substituant 2 mgr de 2-(phénylthio)éthylpEnicilline à la pénicilline V, on obtient de l'acide 6-aminopénicillanique.
REVENDICATIONS
1. Un procédé de préparation d'acide 6-aminopénicilla-
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nique, qui consiste à soumettre ure pénicilline à l'action des enzymes d'un micro- organisme choisi dans lu groupe ceimp=.eniJr le Bad 1,1,u.! m±'qatcr ium vlr. pn i.ci 1J:lù.vticum ATCC 1'4 -3t ,1<? Bacillus ill.,0'1<1terium var.oonci..B:9..Yo ATCC 14946, ,1%cc \1,,ui obtention d'acide 6-arr:nopénicilïaniruc.
2. Le procédé de la revendication 1., J,l;::; L({:lCl oie micro-organismp at le Bcillus '2S¯i vr . p'-'i''.i f i. 1 ] a '!.Yt njn ATCC 14945.
3. Le procède d.; n'v"r.:Jl :d::jr)!1 : , :1,in.5 1eci'.1ül 1. micro-Qrc:;,1isr,e 0:3 le 3.- ci Il,-, :<1t-=,-\:: ' t;7.
ATCC 1494G.
4. 1>r prcc<'d''' la :'/0j-.ji/.:¯tion 1, darus lcqc::-l 1.) :t;- nicilline est la pénic'¯.zn= C.