CH384588A - Procédé pour préparer de la L-lysine par fermentation - Google Patents
Procédé pour préparer de la L-lysine par fermentationInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
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Description
Procédé pour préparer de la L-lysine par fermentation La présente invention a pour objet un procédé pour préparer de la L-lysine par fermentation. Plus particulièrement, elle a pour objet un procédé pour préparer directement de la L-lysine en quantité appré ciable en cultivant un micro-organisme sélectionné dans un milieu de culture et pour la recueillir.
On sait que la L-lysine est l'amino-acide le plus indispensable spécifiquement pour la nutrition de l'homme et des animaux, et l'on s'attend à un large emploi de cette substance pour enrichir la nourriture.
On a déjà, par le passé, préparé de la L-lysine par fermentation, comme décrit dans Can. J. Micro- biol. 3, pp. 467 à 476, 1957, par E. L. Dulaney, mais la quantité de L-lysine trouvée dans le milieu fermenté était extrêmement faible, à savoir de l'ordre de 400 microgrammes par millilitre. La séparation et la récu pération d'une si faible quantité de L-lysine à partir d'un grand volume d'un milieu de composition com plexe implique généralement de nombreuses difficul tés.
C'est pourquoi, du point de vue industriel, la récupération d'une si faible quantité de L-lysine à partir du milieu fermenté offre peu de valeur pra tique.
D'autres procédés connus pour la préparation de L-lysine sont décrits dans les brevets américains Nos 2771396 et 2841532. Dans le premier cas, le procédé comprend deux opérations : premièrement, on fait fermenter un milieu nutritif comprenant du gly- cérol et de la liqueur de grain macéré avec une sou che mutante du E. coli afin de produire de l'acide di- aminopimélique ;
secondement, on traite l'acide di- aminopimélique ainsi obtenu avec les enzymes pro duits par un organisme choisi dans le groupe formé par A. aerogenes et E. coli. Par suite, pour effectuer la réaction ci-dessus, deux micro-organismes distincts sont nécessaires, et des matières spécifiques, telles que le glycérol et la liqueur de grain macéré, sont requises comme constituants du milieu de culture.
Dans le second cas, le procédé est mis en aeuvre en employant un seul micro-organisme, mais comprend encore deux opérations : premièrement, on fait fermenter un milieu nutritif contenant initialement 0,1 à 0,5 g environ de L-lysine par litre avec une souche mutante de E. coli ayant besoin de L-lysine dans des conditions aérobi- ques pour produire de l'acide diaminopimélique ;
se condement, on rompt la paroi cellulaire du micro organisme et l'on poursuit la réaction dans des condi tions anaérobiques pour transformer l'acide diamino- pimélique en L-lysine.
Au contraire, la présente invention concerne un procédé pour produire directement de la L-lysine à partir d'hydrates de carbone et de sources d'azote avec des rendements élevés, en cultivant un micro-orga nisme sélectionné dans des conditions aérobiques.
L'invention permet de produire de la L-lysine d'une manière plus économique qu'avec les procédés habituels.
Les inventeurs ont trouvé que lorsqu'une souche mutante de Micrococcus glutamicus, quia besoin pour sa croissance (a) d'homosérine, (b) de thréonine et méthionine, (c) de thréonine et cystathionine, ou (d) de thréonine et homocystéine, est cultivée dans un milieu approprié composé de matières saccharides, de sources d'azote et de minéraux, mais ne renfermant pas lesdits aminoacides,
la L-lysine est produite et accumulée en grande quantité dans ledit milieu par les mécanismes biochimiques subtils de la souche ; et la L-lysine produite est facilement récupérable à partir du milieu. Une telle souche mutante peut être produite par des procédés bien connus, par exemple en appliquant la méthode de Davis, décrite dans le Journal of American Chemical Society,<I>70,</I> 4267, 1948.
Les deux souches employées dans cette invention furent obtenues par l'irradiation ultraviolette de la souche mère de Micrococcus glutamicus No 534 (ATCC No 13032). Une culture vivante de chaque souche mutante, c'est-à-dire de M. glutamicus No 702 (aussi appelé M. glutamicus No 612-1) et de M. gluta- micus No 901 (aussi appelé M. glutamicus No 613-5), a été déposée dans la American Type Culture Col lection à Washington, D. C.
Lesdites cultures ont respectivement reçu les désignations ATCC No 13286 et ATCC No 13287.
Le Micrococcus glutamïcus est une espèce qu'on ne trouve pas dans le Bergey's Manual of Determina- tive Bacteriology (7e édition), car il s'agit d'une nou velle espèce découverte en 1955 par Shukuo Kino- shita, l'un des présents inventeurs, et ses collabora teurs.
Cette nouvelle espèce est mentionnée dans l'ar ticle Taxonomical Study of Glutamic Acid Accu mulating Bacteria, Micrococcus glutamicus nov. sp. (voir Bulletin of the Agricultural Chemical Society of Japan, vol. 22, Ne 3, pp. 176 à 185, 1958).
Le Micrococcus glutamicus No 534 est comparé avec d'autres micrococci dans le tableau I. Les sym- boles du Bergey's Manual of Determinative Bacte- riology , 6e édition, sont employés dans ce tableau.
Comme montré dans le tableau I, les espèces Nos 18 à 22 sont fondamentalement différentes du M. glutamicus No 534 par leur caractère anaérobique. Les espèces Nos 13 à 17 se distinguent nettement du M. glutamicus No 534 par leur production de pigment rouge. Les espèces Nos 1 à 5 se distinguent clairement du M. glutamicus No 534 par leur incapacité de produire des nitrites à partir de nitrates.
Les espèces Nos 8 à 10 et 6 diffèrent du M. glutamicus No 534 par le fait qu'elles liquéfient la gélatine et produisent de l'acide dans le lait. Les espèces Nos 7, 11 et 12 diffèrent du M. glutamicus No 534 par leur production d'acide dans le lait. Les espèces Nos <I>8, 9a, 9b</I> et 11 diffèrent également par leur production de pigment.
En outre, les espèces Nos 6 à 8 se différencient par leur capacité d'utiliser un sel d'ammonium comme seule source d'azote dans le milieu de Hucker. <I>Tableau 1</I> Comparaison du M. glutamicus NI> 534 avec d'autres Micrococci
EMI0002.0064
<U>A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> G <SEP> H</U>
<tb> 1. <SEP> M. <SEP> luteus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> 2. <SEP> M. <SEP> urène <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> 3. <SEP> M.
<SEP> freudenreichii <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> 8. <SEP> M. <SEP> caseolyticus <SEP> ** <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> 4. <SEP> M. <SEP> flavus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> + <SEP> 5. <SEP> M. <SEP> candidus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> 6. <SEP> M. <SEP> conglomeratus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> *
<tb> 7. <SEP> M. <SEP> varians <SEP> <B>.......</B> <SEP> .
<SEP> <B>......</B> <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> + <SEP> * <SEP> - <SEP> + <SEP> *
<tb> 8. <SEP> M. <SEP> caseolyticus <SEP> * <SEP> * <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> * <SEP> * <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> *
<tb> 9a <SEP> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> <B>....</B> <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> orange* <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> *
<tb> 9b <SEP> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> albus <SEP> <B>....</B> <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> * <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> * <SEP> +
<tb> 10. <SEP> M. <SEP> citreus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> * <SEP> + <SEP> *
<tb> 11. <SEP> M. <SEP> aurantiacus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> orange* <SEP> <SEP> - <SEP>
<tb> 12. <SEP> M. <SEP> epidermidis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> * <SEP> + <SEP> * <SEP> - <SEP> +
<tb> 13. <SEP> M. <SEP> roseus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> + <SEP> *
<tb> 14. <SEP> M. <SEP> cinnabareus <SEP> <B>.......</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> + <SEP> *
<tb> 15. <SEP> M. <SEP> rubens <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> <B>.....</B> <SEP> + <SEP> +
<tb> 16. <SEP> M. <SEP> rhodochrous <SEP> <B>......</B> <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> + <SEP> + <SEP> *
<tb> 17. <SEP> M. <SEP> agilis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> + <SEP> +
<tb> 18. <SEP> M. <SEP> aerogenes <SEP> ....... <SEP> .....
<tb> 19. <SEP> M. <SEP> assaccharolyticus <SEP> ......
<tb> 20. <SEP> M. <SEP> piger <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> -*
<tb> 21. <SEP> M. <SEP> grigoroffi <SEP> ............
<tb> 22. <SEP> M. <SEP> anaerobius <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> <B>.......</B>
<tb> M.
<SEP> glutamicus <SEP> Na <SEP> 534 <SEP> <B>......</B> <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> -- <SEP> - A - Taux d'oxygène libre (+ : aérobique à facultativement anaérobique ; - : anaérobique). B - Production de pigment rougeâtre sur la gélose.
C - Réduction de nitrate en nitrite.
D - Utilisation d'un sel d'ammonium comme seule source d'azote. E - Production de pigment jaune sur la gélose.
F - Production d'acide dans le lait. G - Liquéfaction de la gélatine.
H - Production d'acide à partir de lactose. - Différent du M. glutamicus No 534.
** - Deux souches de M. caseolyticus se trouvent dans le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 6e édi tion. Chaque souche est comparée dans le tableau I.
(En (absence d'une autre définition, les signes + et - indiquent respectivement la présence et l'absence du caractère mentionné.) Les caractéristiques du Micrococcus glutamicus, représenté par le Micrococcus glutamicus No 534 (ATCC No 13032) vont maintenant être décrites en détail.
Les tests expérimentaux furent effectués selon les méthodes décrites dans le Descriptive Chart du Manual of Methods for Pure Culture Study of Bac- teria (publié par la Society of American Bacteriolo- gists, 1950).
Ses caractères morphologiques et physiologiques sont les suivants Sphères légèrement ellipsoïdales, habituellement groupées par paires, mais aussi en masses isolées et irrégulières. Grandeur de la majorité: 0,6 à 1,2 mi cron. Des formes allongées se rencontrent dans cer taines conditions. Non doué de mouvement, pas de formation de spores. Gram-positif.
Gélose inclinée: croissance modérée, filiforme, terne, jaune pâle.
Colonies sur gélose : circulaires, lisses, parfaites, légèrement élevées, jaune pâle.
Bouillon: légèrement trouble, des anneaux appa raissent parfois le long du tube. Sédiment floconneux, pas d'odeur.
Lait au tournesol: pas de changement ou légère ment alcalin.
Inoculation de la gélatine par piqûre: pas de liquéfaction ou liquéfaction très faible.
Hydrogène sulfuré non formé. Indol non produit.
Amidon non hydrolysé.
Nitrites produits à partir de nitrates. Catalase-positif.
Uréase produite. Phosphates-négatif. Réaction de Voges-Proskauer : négative à très faible.
Le NH4H2p04 n'est pas utilisé comme seule source d'azote dans le milieu de Hucker.
L'utilisation de citrate dans le milieu de Koser est négative.
Désassimilation de la caséine : négative ou très faible.
Réduction de colorants<B>:</B> le bleu de méthylène, le 2,6-dichloro-phénolindophénol, le vert de Janus et le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium sont réduits.
Test du rouge de méthyle : faiblement acide. Croissance en fonction de la température<B>:</B> pas de croissance à 47 C, très faible croissance à 42() C, bonne croissance entre 28 et 37o C. Température opti mum, environ 300 C.
pH optimum, entre 7 et 8. La croissance se pro duit entre 6 et 9.
Acide provenant du glucose, du fructose, du mannose, du sucrose et du maltose. Pas d'acide à par tir du lactose. (Voir tableau II).
L'acide L-glutamique s'accumule en grande quan tité aérobiquement en présence d'hydrates de carbone, d'ion ammonium et de sels inorganiques. Production d'acide organique : l'acide a-kétoglu- tarique et l'acide lactique sont produits dans les milieux de glucose.
Aérobique. Habitat : air, sol, eaux d'égouts. <I>Tableau II</I> Production d'acide à partir d'hydrates de carbone par le M. glutamicus No 534
EMI0003.0044
Milieu <SEP> Milieu
<tb> Hydrates <SEP> de <SEP> carbone <SEP> de <SEP> gélose <SEP> liquide
<tb> Inositol <SEP> .......... <SEP> - <SEP>
<tb> Arabinose <SEP> ........ <SEP> - <SEP>
<tb> Thamnose <SEP> ........ <SEP> - <SEP> Xylose <SEP> .......... <SEP> - <SEP>
<tb> Glucose <SEP> .......... <SEP> -f- <SEP> -I Fructose <SEP> .......... <SEP> -f- <SEP> -I Galactose <SEP> ........ <SEP> - <SEP> Mannose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> . <SEP> -i- <SEP> -I Lactose <SEP> .. <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> - <SEP> Sucrose <SEP> ..........
<SEP> -I- <SEP> -I Maltose <SEP> .......... <SEP> -I- <SEP> -I Tréhalose <SEP> ........ <SEP> * <SEP> Mélibiose <SEP> ........ <SEP> - <SEP> Cellobiose <SEP> ........ <SEP> - <SEP> Raffinose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> - <SEP> Mélézitose <SEP> ........ <SEP> - <SEP> Amidon <SEP> .......... <SEP> - <SEP> Inuline <SEP> .......... <SEP> - <SEP> Dextrine <SEP> .......... <SEP> - <SEP> Glycogène <SEP> ........ <SEP> - <SEP> Glycérol <SEP> .......... <SEP> - <SEP> Erythritol <SEP> ........ <SEP> - <SEP> Adonitol <SEP> .......... <SEP> - <SEP> Mannitol..........
<tb> Sorbitol <SEP> .......... <SEP> - <SEP> Dulcitol <SEP> .......... <SEP> - <SEP> Salicine <SEP> .......... <SEP> - <SEP> Aesculine <SEP> ........ <SEP> - <SEP> a-Méthylglucoside -f- :
l'acide est produit;<B>-:</B> l'acide n'est pas produit; -I- : la production d'acide est douteuse.
l'acide est produit par d'autres souches du M. glu- tamicus.
la composition du milieu liquide est la suivante peptone 2 0/0, hydrate de carbone à examiner 1 0/0, eau distillée, reste. A 1000 ml de cette solu tion, 1 ml d'une solution alcoolique (95 0/0) de pourpre de brome-crésol à 1,2 0/0 fut ajouté avant la stérilisation. Le pH du milieu fut amené au point neutre en employant une solution de NaOH. En identifiant le M.
glutamicus d'après le Ber- gey's Manual of Determinative Bacteriology (6e édi tion), on voit facilement qu'un tel micro-organisme n'y est pas décrit. Cette édition du Bergey's Manual montre que le M. glutamicus est fortement apparenté au M. aurantiacus et au M. epidermis, mais diffère desdites espèces connues comme cela ressort du tableau III.
<I>Tableau 111</I> Comparaison du M. glutamicus N 534 avec le M. aurantiacus et le M. epidermidis..
EMI0004.0018
Milieux <SEP> M. <SEP> aurantiacus <SEP> M. <SEP> epidermidis <SEP> M.
<SEP> glutamicus <SEP> No <SEP> 534
<tb> Lait <SEP> Faiblement <SEP> acide <SEP> Produit <SEP> de <SEP> l'acide <SEP> Pas <SEP> de <SEP> changement <SEP> à <SEP> faible ment <SEP> alcalin
<tb> Lactose <SEP> Produit <SEP> de <SEP> l'acide <SEP> Produit <SEP> de <SEP> l'acide <SEP> Ne <SEP> produit <SEP> pas <SEP> d'acide
<tb> Bouillon <SEP> nutritif <SEP> Trouble <SEP> avec <SEP> pellicule <SEP> Trouble <SEP> avec <SEP> anneau <SEP> blanc <SEP> Légèrement <SEP> trouble, <SEP> des <SEP> an et <SEP> sédiment <SEP> neaux <SEP> apparaissent <SEP> parfois <SEP> le
<tb> long <SEP> du <SEP> tube.
<SEP> Sédiment <SEP> flo conneux
<tb> Gélose <SEP> nutritive <SEP> Croissance <SEP> moniliforme, <SEP> Blanc <SEP> Croissance <SEP> modérée, <SEP> blanc
<tb> chamois <SEP> à <SEP> jaune <SEP> orange <SEP> laiteux <SEP> à <SEP> jaune <SEP> pâle
<tb> pâle, <SEP> en <SEP> relief, <SEP> étincelante
<tb> Habitat <SEP> Habituellement <SEP> isolé <SEP> des <SEP> Peau <SEP> et <SEP> membranes <SEP> Air, <SEP> sol, <SEP> eaux <SEP> d'égouts
<tb> infections, <SEP> mais <SEP> se <SEP> trouve <SEP> muqueuses
<tb> aussi <SEP> dans <SEP> le <SEP> lait,
<SEP> le <SEP> fro mage <SEP> et <SEP> la <SEP> poussière Il a été clairement établi que le Micrococcus glu- tamicus No 534 est une souche d'une nouvelle espèce appartenant au genre Micrococcus. Ceci est montré ci-dessous en se référant au Key to the species of genus Micrococcus contenu dans le Bergey's Ma nual of Determinative Bacteriology .
1. Key to the species of genus Micrococcus , tiré du Bergey's Manual , 6e édition.
1. Espèces aérobiques à facultativement anaérobi- ques.
Le M. glutamicus No 534 est aérobique. B. Nitrites produits à partir de nitrates.
Le M. glutamicus No 534 produit des nitrites à partir de nitrates.
2. N'utilise pas le NH4H2Pd4 comme seule source d'azote.
Le M. glutamicus No 534 est conforme à cette description.
aa) La gélatine n'est pas liquéfiée ou est liquéfiée très lentement.
Le M. glutamicus No 534 est conforme à cette description.
Dans cette section, deux espèces, à savoir le M. aurantiacus et le M. epidermidis sont inclus.
Le M. glutamicus est comparé avec le M. auran- tiacus et le M. epidermidis dans le tableau III. Comme montré dans ce tableau, le M. glutamicus NI, 534 diffère de ces deux espèces par le pigment sur la gélose, la production d'acide dans le lait et la pro duction d'acide à partir de lactose.
En outre, dans le M. epidermidis, la réaction de Voges-Proskauer est positive, bien que dans le M. glu- tamicus No 534 elle soit négative. Cette réaction est un caractère important selon C. Shaw, J. M. Stit et S. T. Cowan (J. Gen. Microbiol. 5, 1010, 1951). II.
Key to the genera of Family Micrococcaceae tiré du Bergey's Manual , 7e édition, par Breed, Robert S. ; Murray, E.G.D. ; et Smith, Nathan R. ; publié par The Williams & Wilkins Company à Balti more, Maryland, octobre 1957.
1.. Espèces aérobiques à facultativement anaéro- biques. Comprend aussi quelques anaérobies obliga toires qui se présentent par paquets (Sarcina).
Le M. glutamicus N, 534 est aérobique.
A. Les cellules se présentent généralement en masses irrégulières ; occasionnellement, elles sont sim ples ou en paires.
Le M. glutamicus No 534 est conforme à cette description.
1. L'action sur le glucose, s'il y en a une, est oxy dante. Aérobique. Le M. glutamicus No 534 est aéro- bique. Par suite, le M. glutamicus No 534 appartient au Genus I. Micrococcus.
Selon le Key to the species of genus Micrococ- cus , dans le Bergey's Manual , 7e édition.
1. Peut ou ne peut pas réduire les nitrates en nitri- tes. Pas d'azote libre ou de gaz d'oxyde nitreux pro duit à partir de nitrates.
Le M. glutamicus Ne 534 est conforme à ce cri tère.
A. Pas de pigment rose ou rouge produit sur des milieux de gélose dans de jeunes cultures.
Le M. glutamicus Ne 534 est conforme à ce cri tère.
2. Nitrites produits à partir de nitrates.
Le M. glutamicus No 534 produit des nitrites à partir de nitrates. Dans cette section, il n'est décrit aucune espèce qui n'utilise pas le NH4H2P04 comme seule source d'azote.
. Le M. glutamicus Ne 534 n'utilise pas le NH4H2P04 comme seule source d'azote. Il est donc clair que le M. glutamicus No 534 est différent de toute autre espèce figurant dans le Bergey's Ma- nual , 7e édition. Cela signifie que le M. glutamicus est une nouvelle espèce.
Dans le tableau suivant, la souche mère (M. glu- tamicus NI, 534) est comparée avec les souches mutan tes produisant de la L-lysine (M. glutamicus No 702 et No 901).
<I>Tableau IV</I>
EMI0005.0017
M. <SEP> glutamicus <SEP> No <SEP> 534 <SEP> M. <SEP> glutamicus <SEP> Ne <SEP> 702 <SEP> M. <SEP> glutamicus <SEP> No <SEP> 901
<tb> (ATCC <SEP> N <SEP> 13032) <SEP> (ATCC <SEP> Ne <SEP> 13286) <SEP> (ATCC <SEP> Ne <SEP> 13287)
<tb> homosérine <SEP> homosérine
<tb> ou <SEP> ou
<tb> <I>besoin</I> <SEP> thréonine <SEP> et <SEP> méthionine <SEP> thréonine <SEP> et <SEP> méthionine
<tb> <I>d'amino-acides</I> <SEP> néant <SEP> ou <SEP> ou
<tb> thréonine <SEP> et <SEP> cystathionine <SEP> thréonine <SEP> et <SEP> cystathionine
<tb> ou <SEP> ou
<tb> thréonine <SEP> et <SEP> homocystéine <SEP> thréonine <SEP> et <SEP> homocystéine
<tb> <I>uréase</I> <SEP> positif <SEP> négatif <SEP> positif
<tb> <I>couleur</I> <SEP> normale <SEP> normale <SEP> albino Le phénomène de l'accumulation de <RTI
ID="0005.0018"> L-lysine par ces micro-organismes insuffisamment nourris est tout à fait nouveau et frappant, et l'explication théorique du phénomène n'est pas connue avec certitude, mais elle peut être comprise grâce aux connaissances actuel les dans le domaine de la biosynthèse des amino acides, comme montré sur la fig. 1.
<I>Figure 1</I>
EMI0005.0021
D'après ce schéma de la synthèse des amino acides, il est compréhensible que la L-lysine puisse s'accumuler sous forme d'un produit excédentaire lorsqu'un micro-organisme est biochimiquement défi cient dans sa capacité de synthétiser des aminoacides, par exemple (a) l'homosérine, (b) la thréonine et la méthionine, (c) la thréonine et la cystathionine, et (d) la thréonine et l'homocystéine.
Le procédé pour obtenir ces souches mutantes a été bien établi, et n'importe quel homme du métier peut facilement obtenir le micro-organisme mutant nécessaire à partir d'une souche mère donnée, en appliquant les techniques de mutation habituelles.
Pour mettre en aeuvre la fermentation de la L- lysine, on peut employer n'importe quel hydrate de carbone fermentable, tel que le glucose, le sucrose, le fructose, le mannose, le maltose, le xylose, le galac tose, la mélasse de bonne qualité, la mélasse rési duelle et l'amidon hydrolysé acide. Plusieurs acides organiques tels que l'acide fumarique, l'acide lactique, l'acide succinique et l'acide pyruvique peuvent aussi être employés comme sources de carbone.
Ces hydra tes de carbone fermentables peuvent être employés le plus généralement suivant une concentration com- prise entre 2 et 15 % en poids, basée sur un équiva- lent de glucose.
Comme sources d'azote, on peut employer des matières organiques protéinées telles que la peptone, la NZ-amine, les hydrolysats de caséine, les hydroly- sats de soja, les hydrolysats de pupe de ver à soie, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la liqueur de grain macéré, la farine de poisson ou des substances similaires, des sels d'ammonium inorganiques ou organiques tels que NH4C1, (NH4)2SO4, (NH4)2C03, (NH4)3PO4,
CH3C02NH4 ou substances similaires, l'urée et d'autres matières contenant de l'azote. Il est préférable d'employer au moins une des- sources d'azote protéinées susmentionnées en même temps qu'une source d'azote synthétique telle que l'urée ou des sels d'ammonium. Comme minéraux, on peut ajouter KH2P04, MgSO4, NaCl, K2HP04, FeS04, MnSO-1 et CaCO3.
La fermentation est conduite dans des conditions aérobiques, par exemple par culture en boîte avec agitation ou suivant un procédé de culture submer gée en employant un récipient profond équipé de dis positifs d'aération et d'agitation. La température de fermentation est généralement comprise entre 24 et 370 C. Le contrôle du pH pendant la fermentation est très important dans cette fermentation. Lorsque la fermentation a commencé, le pH du milieu tend à tomber au-dessous de 7,0, et lorsque le pH descend au-dessous de 5,0, la fermentation cesse pratiquement.
Par conséquent,, le pH du milieu doit être ajusté entre les limites 5,1 et 8,5 avec un agent neutralisant appro prié tel que de l'hydroxyde d'ammonium, de l'alcali caustique (hydroxyde de sodium ou hydroxyde de potassium), du carbonate de calcium ou de l'hydro- oxyde de calcium. La fermentation est généralement poursuivie pendant deux à cinq jours, jusqu'à ce qu'une quantité appréciable de L-lysine se soit accu mulée dans le milieu.
Une fois la fermentation terminée, le milieu fer menté est filtré pour enlever les cellules. On fait passer de nouveau le filtrat à travers une colonne d'une faible résine échangeuse de cations telle que la résine carboxylique Amberlite IRC-50 (marque déposée de Rohm & Haas Co., Philadelphie, Pa.), qui est préalablement ajustée à un pH de 7,0 avec un phosphate tampon.
Après avoir lavé la colonne de résine avec de l'eau, on l'élue avec de l'ammoniaque aqueuse 0,15 N pour recueillir la fraction qui pré sente une réaction de ninhydrine positive, et cette fraction est évaporée pour en éliminer l'ammoniaque. Ensuite, on ajoute à la fraction une quantité calculée d'acide chlorhydrique, et l'on concentre ladite frac tion jusqu'à siccité sous pression réduite. Le résidu sec est ensuite dissous dans une faible quantité d'eau à laquelle on ajoute de l'alcool, et on le laisse reposer jusqu'à ce que le monochlorhydrate de L-lysine se sépare par cristallisation.
Lorsqu'on ajoute ensuite de l'éther à la liqueur mère, obtient en plus du dichlor- hydrate cristallin de L-lysine. Une nouvelle purifica tion est ensuite effectuée par une méthode habituelle de cristallisation.
D'autres procédés usuels, par exemple un traite ment avec échange d'ions, sont aussi utilisés pour recueillir la L-lysine. Par exemple, la L-lysine conte nue dans le filtrat est recueillie par absorption de la L-lysine sur une forte résine échangeuse de cations telle que l' Amberlite IR-120 , élution de la L- lysine à partir de la résine échangeuse de cations par un alcali dilué,
passage de cet éluat à travers une fai ble résine échangeuse de cations telle que l' Amber- lite IRC-50 , qui n'absorbe pas la L-lysine, et séchage de l'effluent.
Les exemples suivants sont donnés uniquement à titre illustratif et ne doivent pas être interprétés dans un sens limitatif, bien des variations étant possibles sans sortir du cadre de l'invention. <I>Exemple 1</I> 2 ml de la suspension cellulaire du Micrococcus glutamicus No 534 (ATCC No<B>13032)</B> furent placés dans la boîte de Petri ordinaire de laboratoire et irra diés par une lampe ultraviolette de 15 watts située à une distance de 50 cm pendant 4 minutes.
Par suite de ce traitement, une souche mutante blanche (albino) et une souche mutante uréase-négative de la souche mère furent séparément obtenues. Ensuite, en traitant séparément la souche mutante blanche (albino) et la souche mutante uréase-négative à nouveau avec des rayons ultraviolets dans les mêmes conditions que ci- dessus, on obtint une série de diverses souches mutan tes.
Les caractéristiques biochimiques de ces souches mutantes furent examinées et l'on trouva des souches mutantes insuffisamment nourries qui ont besoin pour leur croissance d'un aminoacide choisi dans le groupe formé de (a) l'homosérine, (b) la thréonine et la méthionine, (c) la thréonine et la cystathionine, et (d) la thréonine et l'homocystéine. Le M. glutamicus No 702 et le M. glutamicus No 901 furent ainsi obtenus.
Un milieu de fermentation fut préparé comme suit: 25 g de glucose, 5 g de NH4Cl, 0,5 g de KH.P04, 0,5 g de MgS04, 7H20 et 2 g de NZ-amine furent dissous dans de l'eau de robinet et complétés jusqu'à 1 litre. Le pH du milieu était d'environ 7,0. Des portions de 40 ml de ce milieu furent réparties dans des fioles coniques de 250 ml chacune et stérili sées sous pression à<B>1100C</B> pendant 10 minutes. Après la stérilisation du milieu, 0,2 g de CaCO3 ayant été stérilisé séparément par chauffage à sec fut ajouté à chaque portion de 40 ml du milieu.
Ce milieu fut inoculé avec du M. glutamicus No 702 (ATCC No 13286) qui avait été cultivé dans un bouillon de glucose, dans un dispositif de culture avec agitation, à 28c, C pendant 24 heures. Pendant la fermentation, le pH du milieu fut maintenu entre les limites 5,1 et 8,5, en ajoutant 10 % en poids d'ammoniaque aqueuse toutes les quatre à six heures.
Les résultats analytiques pendant la fermentation sont donnés dans le tableau V. <I>Tableau V</I>
EMI0006.0089
Durée <SEP> L-lysine <SEP> Rendement
<tb> de <SEP> la <SEP> pH <SEP> produite <SEP> basé <SEP> sur <SEP> le
<tb> culture <SEP> (mg/ml) <SEP> glucose
<tb> (heures) <SEP> ajouté <SEP> (0/0)
<tb> 62 <SEP> 5,81 <SEP> 3,6 <SEP> 14,4
<tb> 86 <SEP> 5,99 <SEP> 6,7 <SEP> 26,8 Le milieu fermenté qui avait été cultivé pendant 86 heures fut filtré pour éliminer les cellules bacté riennes. On fit passer 2,1 litres de ce filtrat à travers une colonne de faible résine échangeuse de cations, marque Amberlite IRC-50 , qui avait été au préala ble réglée à un pH de 7,0 avec un phosphate-tampon 0,5 M.
Après avoir lavé la colonne de résine avec de l'eau, on l'élua avec de l'ammoniaque aqueuse 0,15 N pour recueillir la fraction qui montrait une réaction de ninhydrine positive, et cette fraction fut évaporée pour en éliminer l'ammoniaque. Ensuite, la fraction fut ajustée à un pH de 2,0 avec de l'acide chlorhydrique 6 N et concentré sous vide jusqu'à siccité.
Le pro duit fut dissous dans 15 ml d'eau auxquels on avait ajouté 100 ml d'alcool éthylique absolu, et on le laissa reposer jusqu'à ce qu'un cristal brut de monochlor- hydrate de L-lysine se sépare. On obtint ainsi environ 7,6 g de cette matière. Lorsqu'on ajouta de l'éther à la liqueur-mère, on obtint 1,2 g de cristal brut supplé mentaire de dichlorhydrate de L-lysine.
<I>Exemple 2</I> Le procédé décrit dans l'exemple 1 fut répété en utilisant le même micro-organisme, et 25 g de maltose et 5,0 g d'extrait de viande au lieu de glucose et de NZ-amine. Des résultats comparables furent obtenus ; en effet, de la L-lysine fut produite suivant une con centration d'approximativement 6,2 mg par millilitre du milieu.
<I>Exemple 3</I> Le procédé décrit dans l'exemple 1 fut répété en utilisant le même micro-organisme, et 25 g de fruc tose et 20 g d'hydrolysat de caséine (équivalant à 2 g de caséine) au lieu de glucose et de NZ-amine. Pendant la fermentation, le pH du milieu fut main- tenu entre les limites 5,1 et 8,
5 par addition de 10 % en poids de solution aqueuse de (NH4)CO3 toutes les quatre à six heures.
Après trois jours de culture, on trouva que le milieu de culture contenait de la L-lysine suivant une concentration d'approximativement 5,4 mg par milli litre.
<I>Exemple 4</I> Le procédé décrit dans l'exemple 1 fut répété en utilisant le même micro-organisme et le milieu sui vant: 50 g de glucose, 10 g de NH4C1, 6 g de NZ- amine, 0,5 g de KH2P04, 0,5 g de K2HP04, 0,25 g de MgSO4, 7H20, 0,01 g de FeS04, 7H20, 0,01 g de MnS04, 4H20, 1,0 g d'extrait de levure et 5,0 g de CaCO3 furent dissous dans de l'eau de robinet et complétés jusqu'à 1 litre.
Après trois jours de culture, on trouva que le milieu de culture contenait de la L-lysine suivant une concentration d'approximativement 14 mg par milli- litre.
<I>Exemple 5</I> Le procédé décrit dans l'exemple 1 fut répété en utilisant le même micro-organisme et le milieu sui vant: 450g de mélasse résiduelle (équivalant à 225 g de glucose), 600 g d'hydrolysat de soja (équi- valant à 60 g de farine de soja sèche) et 45 g de NH4Cl furent dissous dans de l'eau de robinet et com plétés jusqu'à 1 litre.
Le pH du milieu était d'environ 7,0. 3 litres de ce milieu furent versés dans une cuve de fermentation de 5 litres et furent stérilisés,- puis la fermentation fut effectuée à 280 C tout en remuant à la vitesse de 500 tours par minute et en aérant à la vitesse d'un volume d'air par volume du milieu par minute.
Après 60 heures de culture, on trouva que le milieu de culture contenait de la L-lysine suivant une concentration d'approximativement 20 mg par milli- litre.
<I>Exemple 6</I> Le procédé décrit dans l'exemple 1 fut répété en utilisant le milieu et l'inoculum suivants Milieu: 25 g de glucose, 2 g de NH4C1, 0,5 g de KH2PO4, 0,5 g de K2HP04, 0,5 g de MgS04, 7H20 et 2 g de peptone furent dissous dans de l'eau de robi net et complétés jusqu'à 1 litre. Le pH du milieu était d'environ 7,0.
Inoculum : M. glutamicus No 901 (ATCC No 13287), qui avait été cultivé dans un bouillon de glucose dans un dispositif de culture avec agitation à 37o C pendant 24 heures.
Les résultats analytiques pendant la fermentation sont montrés dans le tableau VI. <I>Tableau VI</I>
EMI0007.0092
Durée <SEP> L-lysine <SEP> Rendement
<tb> de <SEP> la <SEP> basé <SEP> sur <SEP> le
<tb> culture <SEP> pH <SEP> produite <SEP> glucose
<tb> (heures) <SEP> (mg/ml) <SEP> ajouté <SEP> (%)
<tb> 62 <SEP> 8,07 <SEP> 1,2 <SEP> 4,8
<tb> 86 <SEP> 7,39 <SEP> 1,8 <SEP> 7,2 Le milieu fermenté qui avait été cultivé à 280 C pendant 86 heures fut filtré.
A partir d'un litre de ce filtrat, on obtint 0,2 g de cristal brut de monochlor- hydrate de L-lysine et 0,55 g de cristal brut de di- chlorhydrate de L-lysine.
Claims (1)
- REVENDICATION Procédé pour produire de la L-lysine par fermen tation, caractérisé en ce qu'on cultive en aérobie une souche mutante du Micrococcus glutamicus, ayant besoin pour sa croissance d'un groupe d'amino-acides suivants :(a) homosérine, (b) thréonine et méthio- nine, (c) thréonine et cystathionine, ou (d) thréonine et homocystéine, dans un milieu de culture ne renfer mant pas lesdits aminoacides, en ce qu'on maintient le pH du milieu de culture dans les limites 5,1 à 8,5 jusqu'à ce qu'une quantité appréciable de L lysine s'ac cumule dans ledit milieu,et en ce qu'on recueille la L-lysine dans le milieu. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le milieu de culture contient au moins une source d'azote protéinée telle que la peptone, la NZ- amine, l'hydrolysat de caséine, l'hydrolysat de soja, l'extrait de viande et l'extrait de levure.2. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le milieu de culture contient de la mélasse. 3. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que la souche mutante est le Micrococcus glutami- cus ATCC No 13286. 4. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que la souche mutante est le Micrococcus glutami- cus ATCC No 13287.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP535258 | 1958-03-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=11608786
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH6644958A CH384588A (fr) | 1958-03-01 | 1958-11-21 | Procédé pour préparer de la L-lysine par fermentation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CH (1) | CH384588A (fr) |
-
1958
- 1958-11-21 CH CH6644958A patent/CH384588A/fr unknown
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