BE818480A - Preparation de l'acide l-aspartique - Google Patents

Description

  préparation de l'acide L-aspartique.

  
L'acide aspartique est l'un des acides aminés non essentiels. Il existe dans les plantes et les animaux et en le trouve en particulier dans les mélasses de jeunes cannes à sucre et betteraves à sucre.

  
L'acide L-aspartique s'obtient habituellement par 'hydrolyse

  
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Il existe un certain nombre de rapports dans la littérature relatifs à la production de l'acide aspartique pair . fermenta-

  
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pseudomonas A-12 à former de l'acide L-aspartique dans un milieu de culture contenant de l'acide maléique comme unique source

  
de carbone. Apparemment cet organisme isomérise tout d'abord l'acide maléique en acide fumarique qui est ensuite transformé en acide L-aspartique. 

  
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Le brevet japonais 6808713 expose la préparation enzymatique de l'acide L-aspartique qui consiste à placer un bouillon de

  
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un milieu contenant du fumarate de calcium (4% en acide fumarique) dans les conditions favorables, la transformation de l'acide fumarique en acide aspartique est totale en 24 heures et le rendement l'acide aspartique est supérieur à 90%.

  
L'intérêt de la production de l'acide aspartique a été stimulé par l'emploi de celui-ci comme intermédiaire dans la synthèse des nouveaux agents édulcorants tels que aspartyl aspartates/dialkyle (brevet allemand 621160042) et l'ester méthylique de l'aspartyl phénylalanine (brevet E.U.A. 3.492.131).

  
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échelle offre des possibilités pour ce composé comme agent acidulant doux dans les boissons non alcoolisées. Les esters alkyliques à longue chaîne de l'acide aspartique se sont révélés avoir de bonnes propriétés tensio-actives.

  
Il existe un potentiel d'utilisation considérable de l'acide

  
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nickel et chrome.

  
L'acide aspartique peut trouver une utilisation comme seul monomère (polyamides) et comme monomère spécial pour donner à des polymères spécifiques des propriétés uniques avec applica-

  
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antistatiques, les plastifiants, les épaississants et les produits et remplacements de la gélatine.

  
La présente invention concerne un procédé de production

  
de l'acide L-aspartique qui consiste à cultiver en aérobiose Bacterium cadaveris ATCC 9760 dans un milieu de culture jusqu'à production de quantités importantes d'aspartase, à mettre dans

  
le bouillon de culture/, ou les cellules séparées de celui-ci,  <EMI ID=10.1> 

  
pratiquement total*, on sépara l'acide L-aspartique et on le récupère dans le bouillon de culture acidifié clarifié.

  
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Des recherches consacrées au rôle de désamination de l'aspartase produit par Bacterium cadaveris ATCC 9760 (réalisant la

  
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217, 467 (1955).

  
La présente invention concerne les facteurs et les conditions qui ont pour résultat des rendements élevés en aspartase produite par Bacterium cadaveris ATCC 9760 qui transforme quantitativement en L-aspartate des concentrations élevées d'ions

  
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Ce procédé constitue une méthode industriellement avantageuse pour produire l'acide L-aspartique.

  
La fermentation est essentiellement un procédé en trois stades s (a) préparation de l'inoculum, (b) production de l'aspartase et (c) transformation de l'acide fumarique en présence d'ions ammonium en L-aspartate.

  
Le milieu d'ensemencement pour cultiver des cellules de Bacterium cadaveris ATCC 9760 peut être choisi dans divers milieux appropriés à la croissance de cet organisme, on peut cultiver les cellules par exemple dans un milieu aqueux contenant 1% en poids/volume d'extrait de levure, 1% en poids/volume

  
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semencement préféré contient un produit de digestion enzymatique de la caséine (N-A-amine B, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.), un autolysat de levure soluble dans l'eau (Amber BYF-300,

  
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liqueur de macération de mats et du sulfate de magnésium. Le milieu d' ensemencement, contenu dans un flacon de Fernbach ou un fermanteur agité, est ajusté à pH 6,8, stérilisé et ensemencé avec des cellules de Bacterium cadaveris ATCC 9760. Le milieu est secoué sur une secoueuse rotative ou remué lentement, salon le cas, pendant environ 24 heures à 28[deg.]C.

  
On ajoute environ une partie aliquote de 5% en volume/volume de cette culture d'ensemencement à un milieu de fermentation stérilisé contenu dans un fermenteur agité pour la production d'aspartase.

  
Le milieu de fermentation destiné à la production d'aspartase contient de l'azote assimilable fourni par des sources organiques telles que urée, peptones et produit de digestion de la caséine ou autres hydrolysats de protéines. En outre, le milieu de fermentation contient de l'azote assimilable fourni par les

  
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d'ammonium des acides minéraux.

  
Les acides aminés tels que &#65533;lanine, asparagine, glycine et acide glutamique, ou leurs sels de métaux alcalins, sont importants pour que la production d'anpartase soit élevée.

  
La présence d'ions phosphate est une condition nécessaire

  
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ou types de phosphate ne sont pas essentielles et on peut faire varier dans une assez large mesure les proportions de phosphates basiques et acides.

  
lais cations bivalents tels que les ions magnésium et manganèse ont un effet stimulant sur la production d'aspartase, les ions magnésium étant préférés.

  
Les sucres ont un effet nocif sur les rendements en aspartase et de préférence on les évite dans les milieux de fermenta-

  
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glutamate de sodium, de la glycine, de la N-Z-amine 3 et, si

  
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Chemical Co., Wyandotte, Michigan). La quantité ou la concentration de chaque ingrédient n'est pas essentielle et on peut la faire varier dans une assez large mesure. L'influence de certains de ces ingrédients sur la production d'aspartaae est donnée dans le Tableau I. 

  
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TABLEAU!

  

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tion d'environ 28[deg.]C pendant environ 12 à 14 heures sans ajustage du pH pendant la fermentation.

  
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pH 6,8-7,0 avant autoclavage

  
Le Tableau II montre que peu ou pas d'aspartase est produite au-dessous de pH 7,0. Dans la présente pratique, on laisse la fermentation pour la production d'aspartase évoluer sans ajuster

  
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approche de 9 à la fin du cycle. 

TABLEAU II

  

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Il est bien entendu que toutes les sources de Bacterium

  
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de la présente invention. cependant, on ne peut pas se procurer ces souches facilement à l'exception de Bacterium cadaveris ATCC 9760 que l'on s'est procurée auprès de The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Cet organisme est un anaérobie facultatif. On peut obtenir une croissance et la

  
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supplémentaire ne soit pas nécessaire pour que la croissance et la production d'aspartase sciant bonnes, il est préférable d'aérer à environ un volume par volume de milieu et par minute avec en outre une agitation produite en remuant par un moyen mécanique lent .

  
On suit la production d'aspartase par titrage enzymatique, et on conduit la fermentation jusqu'à obtention de concentration d'aspartase importantes (approximativement 1,0 à 2,5

  
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vement de 12 à 17 heures.

  
Dans le stade de fermentation finale ou de transformation, on ajoute de l'acide fumarique et des ions ammonium au bouillon de culture contenant l'aspartase. Les ions ammonium peuvent

  
être apportés par le sel d'ammonium d'un acide organique ou la sel d'ammonium d'un acide minéral. La source d'ammonium préférée est l'hydroxyde d'ammonium.

  
Le rapport molaire des ions ammonium aux ions fumarate

  
est essentiel pour le procédé de la présente invention. Dans

  
les recherches concernant l'aspartase produite par Bacterium cadaveris ATCC 9760 et la réaction d'équilibre fumarate/aspartate  <EMI ID=31.1> 

  
(1968), il est montré que la réaction d'équilibre se déplace

  
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molaire des ions ammonium aux ions fumarate est égal à 1:1 ou

  
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un mélange 50/50 de L-aspartate et de fumarate.

  
Dans la présente invention, on utilise un rapport molaire

  
aux ions

  
des ions ammonium / fumarate d'au moins 1,5:1. Ce rapport peut être porté à 4:1, de préférence 2:1. Pour ces rapports, la réaction d'équilibre est totalement déplacée vers la droite avec transformation quantitative du fumarate en L-aspartate.

  
La concentration d'acide fumarique utilisée dépend de la concentration de l'aspartase obtenue et peut aller d'environ

  
7% à 40% en poids/volume. La concentration de 40% en poids/volume représente une suspension de fumarate de diammonium. La concentration préférée d'acide fumarique est d'environ 20% en poids/ volume. 

  
La transformation du fumarate en L-aspartate a lieu à un

  
pH compris entre 7,0 et 8,6 et à une température comprise entre

  
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avoir ajouté l'acide fumarique et l'hydroxyde d'ammonium, on ajuste le pH à 8,5-8,6 et on le maintient à cette valeur avec de l'hydroxyde de sodium ou de potassium pendant l'ensemble

  
du stade de transformation. On effectue la réaction enzymatique à une température de 35-37[deg.]C en agitant lentement par un moyen mécanique et sans aération jusqu'à ce que la réaction soit pratiquement achevée (il reste moins de 1% de l'acide fumarique initialement ajouté).

  
On ajuste le bouillon de fermentation, clarifié par centrifugation ou filtration, à pH 2,8, soit le point iso-électrique de l'acide L-aspartique, en ajoutant un acide minéral tel que l'acide sulfurique ou l'acide chlorhydrique. on sépare l'acide L-aspartique précipité par centrifugation ou filtration et on le sèche. La méthode préférée consiste à abaisser le pH du bouillon de fermentation à une valeur d'environ 1,0, à séparer les cellules et à précipiter la substance protéinée par centra

  
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clarifiée & une valeur de 2,8 pour précipiter l'acide L-aspartique que l'on récupère par centrifugation ou filtration. On peut également utiliser des résines échangeuses d'ions ou d'autres absorbants pour récupérer l'acide L-aspartique.

  
Dans un autre procédé, on sépare les cellules de Bacterium cadaverjs ATCC 9760 du bouillon de culture de l'aspartase par centrifugation. L'activité enzymatique dans cette pâte de cellules humide reste stable pendant au moins un mois lorsqu'on la conserve à 4[deg.]C. On ajoute environ trois grammes de pâte

  
de cellules humide à 200 ml d' une solution à 20% en poids/volume d'acide fumarique et assez d'hydroxyde d'ammonium à 28% pour transformer l'acide fumarique en fumarate de diammonium et obtenir un rapport molaire des ions ammonium aux ions fumarate d'au moins 1,5:1. On ajuste le pH du mélange à 8,5-8,6 avec

  
de l'hydroxyde de sodium et on agite à 35-37[deg.]C jusqu'à ce

  
que tout le fumarate ait été pratiquement transformé en L-aspartate (approximativement 3 heures). on centrifuge le mélange

  
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surnageant à 2,8 avec un acide minéral pour précipiter l'acide

  
L-aspartique à son point iso-électrique.

  
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de la teneur en aspartase intracellulaire des cellules bactériennes. on peut utiliser des concentrations de 7% en poids/ volume à environ 40% en poids/volume (auquel cas on a une bouillie), une concentration de 20% en poids/volume ayant la préférence.

  
On réalise un titrage électrolytique par sélectivité d'ions de l'activité enzymatique de l'aspartase, de la manière suivante:

  
On centrifuge 200 ml d'un bouillon de culture de Bacterium

  
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les cellules en suspension dans l'eau distillée bouillie et

  
on centrifuge à 12.000 TPM pendant 20 minutes. ceci donne approximativement 2-4 grammes de pâte de cellules humide, on met la pâte de cellules entière dans un bécher de 100 ml et on ajoute assez d'eau distillée bouillie pour amener le volume

  
à 46 ml. On ajoute une quantité aliquote de 2,0 ml d'une solu-

  
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et de référence d'un appareil de mesure de pH et mv étant immergées dans le mélange. Après que la température s'est équilibrée à 30[deg.]C (approximativement 5 minutes), on ajuste l'appareil  <EMI ID=40.1> 

  
une quantité aliquote de 2,0 ml d'un mélange de fumarate 1,0 M et de tris 2,1 M à pH 8. Le pH final est égal à 7,75. La variation de f.e.m. (qui reflète une diminution de la concentration en ions ammonium) est enregistrée pendant environ 10 minutes, l'échelle totale d'enregistrement Citant ajustée de manière à

  
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à la partie la plus abrupte de la courbe (si celle-ci n'est pas linéaire) et on détermine la variation de mv en 10 minutes* 

  

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Une unité d'aspartase se définit comme le nombre de micro-

  
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a été ajouté spécifiquement ci-dessus au milieu de titrage.

  
préparation de la solution

  

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 <EMI ID=45.1> 

  
tillée bouillie. on ajuste le volume de la solution finale à

  
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final à 7,0 avec une petite quantité d'hydroxyde de sodium.

  
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On amène 116,1 grammes d'acide fumarique (1 mole) et 242 g

  
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avec une solution de tris 2 M. On ajuste le volume de la solution totale à 1000 ml avec de l'eau distillée bouillie.

  
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On ajuste le pH du milieu à environ 6,8, on le répartit dans

  
des flacons de Fernbach, on stérilise à l'autoclave, on refroidit  <EMI ID=51.1> 

  

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On stérilise le milieu contenu dans un fermenteur agité, en refroidit et on ensemence avec un inoculum de 5% en volume/ volume comme il est décrit précédemment. on conduit la fermentation à une température d'incubation d'environ 28[deg.]C pendant environ 1.2 à 14 heures sans ajuster le pH. pendant ce temps,

  
on introduit de l'air à raison d'un volume/volume de milieu par minute en agitant simultanément et lentement de manière mécanique. Le pH du milieu passe d'environ 6 à 9 à la fin du cycle.

  
C. Transformation du fumarate en aspartate

  
On ajoute de l'acide fumarique à une concentration d'environ 90 grammes pour 250 ml de bouillon de culture total. Au

  
fur et à mesure que le pH diminue, on utilise une solution d'hy-

  
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8,5. On ajoute alors du chlorure d'ammonium (82 grammes) et MgS04.7H20 (167 mg). A ce moment là le volume final est approximativement égal à deux fois celui du bouillon de culture initial. On porte la température d'incubation à environ 35-37[deg.]C et on main-

  
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tation évoluer pendant environ 18 heures en agitant lentement par un moyen mécanique et sans faire d'aération.

  
On clarifie le bouillon de fermentation par centrifugation et on ajuste le pH à 2,8 avec de l'acide sulfurique aqueux.

  
1'acide

  
On sêpare/L-aspartique précipité par filtration et on le sèche. Le rendement est approximativement égal à 90% par rapport à  <EMI ID=55.1> 

  
à 28% et de l'acide fumarique dans un rapport molaire de 2 à 1. de l'hydroxydo de sodium jusqu'à pH 8,5 et de l'eau jusqu'à un

  
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on maintient le pH à 8,5-8,6 avec une solution d'hydroxyde de sodium ou de potassium, jusqu'à ce que la teneur en acide fumarique atteigne 1% ou mina de la quantité initialement ajoutée.

  
Normalement environ 17 heures suffisent bien que la durée

  
de réaction soit directement en relation avec l'activité totale

  
de la lyase ammoniaque L-aspartate (aspartase)présente .

  
On ajuste le mélange de réaction enzymatique à pH 5,6-6,5

  
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tion et on traite la solution limpide avec une quantité supplémentaire de H2S04 à 30% jusqu'à pH 2,8, ce qui entraîne la précipitation de l'acide L-aspartique au point iso-électrique, on

  
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EXEMPLE III

  
On sépare par centrifugation les cellules de Bacterium cadaveris ATCC 9760 du bouillon de culture B de l'Exemple i. L'activité d'aspartase dans cette pâte de cellules humide demeure

  
 <EMI ID=59.1> 

  
ajuste à pH 8,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium une solution de fumarate de diammonium, préparée avec 40,64 grammes d'acide fumarique, une proportion 1,5 molaire d'hydroxyde d'ammonium avec 28% et d'eau jusqu'à 200 ml. On ajoute 3 grammes de pâte de cellules humide et on agite le mélange à 35[deg.]C pendant environ trois heures, on sépare les cellules bactériennes par centrifugation et on ajuste le surnageant avec de l'acide chlorhydrique dilué à pH 2,8. Par filtration, lavage et séchage des solides précipités on obtient 40,66 grammes d'acide L-

  
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d'acide fumarique et d'hydroxyde d'ammonium à 28% que précédemment pour obtenir de nouveau 40,66 grammes d'acide L-aspartique. 

EXEMPLE IV

  
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des résultats comparables en utilisant 7% en poids/volume d'acide fumarique et une quantité d'hydroxyde d'ammonium à

  
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EXEMPLE V

  
On peut répéter le procédé de l'Exemple II, en obtenant des résultats comparables, avec 40% en poids/volume d'acide

  
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 <EMI ID=65.1>  

REVENDICATIONS

  
1. Procédé de préparation de l'acide L-aspartique qui consiste :
(a) à cultiver en aérobiose Bacterium cadaveris ATOC 9760 dans un milieu de culture jusqu'à obtention de quantités importantes d'aspartase;
(b) à mettre les cellules de Bacterium cadaveris ATÇC 9760 <EMI ID=66.1> 

  
d'au moins 1,5:1, la concentration initiale du substrat exprimée en acide fumarique étant comprise entre 7% et
40% en poids/volume relatif au mélange de réaction, et

  
 <EMI ID=67.1> 

  
35-37[deg.]C et un pH de 8,5-8,6 jusqu'à ce que la transformation en L-aspartate soit pratiquement complète; et
(c) à séparer et récupérer ledit L-aspartate sous forme d'acide L-aspartique.

Claims (1)

1. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel lesdites <EMI ID=68.1>

   le bouillon de culture total.

   3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel lesdites

   <EMI ID=69.1>

   bouillon de culture total.