JPH05123178A - Ｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Ｌ−フェニルアラニンとＬ−チロシンが共存
する発酵液もしくは単離工程液に、β−チロシナーゼ活
性を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生
物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を作用させてＬ−
チロシンを分解せしめた後、Ｌ−フェニルアラニンを単
離することを特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造
法。 【効果】 本発明の方法によれば、Ｌ−チロシンが副生
もしくは残存するＬ−フェニルアラニン発酵液もしくは
その単離工程液より容易にＬ−チロシンを除去すること
が可能で、高純度のＬ−フェニルアラニンを効率よく単
離することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＬ−フェニルアラニンの
製造法に関する。Ｌ−フェニルアラニンは医薬用アミノ
酸あるいは甘味料であるＬ−アスパラチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルの原料として有用である。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−フェニルアラニンの製造法と
しては、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、アルスロバクター属、バチルス属あるいはエシェリ
ヒア属に属し、フェニルアラニンアナログもしくはチロ
シンアナログに耐性な変異株、チロシン要求性の変異
株、遺伝子操作で育種した菌株等を用いた発酵法による
製造法が知られている（特公昭３７−６３４５号、特公
昭５１−２８７１２号、特公平２−４２７６号、特開昭
６０−６６９８４号公報参照）。これらの方法では、発
酵液中に主たる生産物であるＬ−フェニルアラニンの他
にＬ−チロシンが副生もしくは残存し、高純度のＬ−フ
ェニルアラニンを高い収率で単離することが困難である
という問題点があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｌ−
フェニルアラニンとＬ−チロシンが共存する発酵液もし
くは単離工程液から高純度のＬ−フェニルアラニンを容
易に単離する方法を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｌ−フェ
ニルアラニンとＬ−チロシンが共存する発酵液もしくは
単離工程液から高純度のＬ−フェニルアラニンを効率よ
く単離する方法を開発するために鋭意研究した結果、Ｌ
−フェニルアラニンとＬ−チロシンが共存する発酵液も
しくはその単離工程液に、β−チロシナーゼ活性を有す
る微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体も
しくは該微生物菌体の処理物を作用させてＬ−チロシン
を分解せしめた後、Ｌ−フェニルアラニンの単離を行う
ことにより、高純度のＬ−フェニルアラニンが得られ、
単離収率が向上することを見出し、この知見に基づいて
本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、Ｌ−フェニルアラニ
ンとＬ−チロシンが共存する発酵液もしくは単離工程液
に、β−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物、該
培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の
処理物を作用させてＬ−チロシンを分解せしめた後、Ｌ
−フェニルアラニンを単離することを特徴とするＬ−フ
ェニルアラニンの製造法を提供するものである。

【０００６】本発明において対象となる発酵液は、Ｌ−
フェニルアラニンとＬ−チロシンが共存する発酵液であ
ればいかなるものでもよいが、具体的に例示すると以下
のようなＬ−フェニルアラニン生産菌を用いた発酵液が
挙げられる。 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ
２１４２０ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
２１４２１ アルスロバクター・プロトフォルミエ ＡＴＣＣ２１４
２２ エシェリヒア・コリ ＡＪ１１３７９ （ＦＥＲＭ Ｐ
−５０４３）

【０００７】また、単離工程液の例としては、上記発酵
液を除菌した液、イオン交換樹脂で処理した液、濃縮し
た液、晶析後再溶解した液等が挙げられる。

【０００８】本発明で使用されるβ−チロシナーゼ活性
を有する微生物に特に制限はないが、具体例としては以
下のものが挙げられる。 エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３ シトロバクター・フロインディ （エシェリヒア・イン
ターメディア） ＡＴＣＣ６７５０ プロテウス・ミラビリス ＡＴＣＣ１５２９０ エンテロバクター・クロアカエ （アエロバクター・ア
エロゲネス） ＡＴＣＣ７２５６ フラボバクテリウム・フラベセンス （アルカリゲネス
・フェカリス） ＡＴＣＣ８３１５

【０００９】これらの微生物を液体培地に培養すること
によりβ−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物を
得ることができる。液体培地としては、炭素源、窒素
源、無機塩類及び有機栄養素を含有する通常の天然ある
いは合成培地が適宜用いられる。

【００１０】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、シュクロース、マンノース、マルトース、マンニト
ール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、グリセ
リン、ソルビトールなどの糖又は糖アルコール類、酢
酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸等の有機酸
類、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノー
ル等のアルコール類、その他脂肪酸類、炭化水素などが
主な炭素源あるいは補助的炭素源として使用可能であ
り、その濃度は特に制限はないが、通常培地に対して
０．１〜１０％が適当である。

【００１１】また、窒素源としては塩化アンニモウム、
硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種無
機もしくは有機アンモニウム塩、あるいは尿素、アンモ
ニア水、アンモニアガス等が用いられ、その他コーンス
ティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ−アミン、
蛋白質加水分解物、アミノ酸類等の有機蛋白性物質等の
使用も可能である。

【００１２】また、無機塩類としては、リン酸一カリウ
ム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、
炭酸カルシウム等が使用される。有機栄養素としては、
アミノ酸類、各種ビタミン類、有機酸類、脂肪酸類、そ
の他に蛋白性物質等がある。これらは純粋な形でなくて
もそれらを含有する天然物質としても用いることがで
き、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵
母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、クロレラエキ
ス、脱脂大豆塩酸加水分解物、味液（商品名）、動植
物、魚介類、微生物菌体のエキスや分解物等が用いられ
る。

【００１３】なお、β−チロシナーゼは適応酵素と考え
られ、β−チロシナーゼ活性を有する微生物の培養物の
調製の際、培地中にチロシンが存在していることが必要
である。従って、培地に添加する栄養物質から充分チロ
シンが入ってくる場合は問題ないが不充分な場合には培
地中にチロシンを添加する必要がある。添加するチロシ
ンはＬ型、Ｄ型、ＤＬ型いずれでもよく、またチロシン
の塩類、誘導体等でもよい。添加するチロシンの量は使
用する微生物菌株によっても多少相違するが、通常０．
０１％以上であり、０．１％ないし０．５％程度が好ま
しい。また一般にβ−チロシナーゼ活性を高めるために
培地中にビタミンＢ6 類を添加することが有効で通常培
地中５ｍｇ／ｌ以上の濃度で添加する。

【００１４】本発明で使用するβ−チロシナーゼ活性を
有する微生物の培養物の調製に当っては上記の如き培地
を公知の方法で殺菌後、微生物を接種して培養を行えば
よい。培養条件としては、温度は使用する微生物により
差があるが、１５℃ないし４０℃が適当であり、ｐＨは
微酸性から微アルカリ性に保つとよく、その調整のため
に酸あるいはアルカリを培養の途中で添加することも可
能である。培養の方法は振盪、通気攪拌培養のいずれで
も実施可能であり、培養時間は特に制限はないが、１０
ないし７２時間培養するのが適当である。

【００１５】かくして得られる培養物をそのままＬ−フ
ェニルアラニンとＬ−チロシンが共存する発酵液もしく
は単離工程液に作用させてもよく、培養物より分離した
微生物菌体を作用させてもよく、また、アセトン処理菌
体や固定化菌体の他、磨砕、自己消化、音波処理などの
方法によって得た菌体破砕液もしくはこれらを遠心分
離、塩析、溶媒沈澱などの方法で処理して得た菌体処理
物として作用させることもできる。

【００１６】この様にして得たβ−チロシナーゼ活性を
有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌
体もしくは該微生物菌体の処理物をＬ−フェニルアラニ
ンとＬ−チロシンが共存する発酵液もしくは単離工程液
に添加して作用させることにより、Ｌ−チロシンを酵素
分解して除去することができる。

【００１７】酵素分解の条件としては、ｐＨ５ないし１
０、反応温度５ないし６０℃で保持すればよく、反応時
間は使用するβ−チロシナーゼの力価、発酵液もしくは
単離工程液中のＬ−チロシン濃度等に応じ適宜選択すれ
ばよい。

【００１８】かくしてＬ−チロシンを分解せしめた後の
Ｌ−フェニルアラニンの単離は、濃縮、溶剤抽出、イオ
ン交換樹脂処理等の通常の方法により行うことができ
る。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。

【００２０】

【実施例１】表１に示す組成の培地６０ｍｌを５００ｍ
ｌ容坂口コルベンに分注し加熱殺菌後、予め肉汁寒天斜
面培地上で２８℃、２０時間培養したエルビニア・ヘル
ビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体を一白金耳量接種
し、２７℃で２０時間振盪培養した。この培養物計１ｌ
を遠心分離して集菌し、得られた菌体をβ−チロシナー
ゼ活性含有菌体とした。

【００２１】

【表１】

【００２２】一方、Ｌ−フェニルアラニン生産菌である
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ
２１４２０を、酵母エキス１％、ペプトン１％、食塩
０．５％、グルコース０．５％から成る寒天平板培地
（ｐＨ ７．０）に接種し、３１℃で２４時間培養し
た。ついでＬ−フェニルアラニン生産用の主培養培地と
して、表２に示す組成の培地を５００ｍｌ容坂口フラス
コに２０ｍｌずつ分注し、１１０℃で１０分加熱殺菌
後、炭酸カルシウム５％（別殺菌）を添加したものに、
先の寒天平板培地で培養した菌体を植菌し、３１．５℃
で７２時間振盪培養した。培養終了後、発酵液計２ｌよ
り遠心分離により菌体を分離除去した。

【００２３】

【表２】

【００２４】この除菌液１ｌに、先に示したエルビニア
・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３のβ−チロシナー
ゼ活性含有菌体の全量を添加して、ｐＨ７．５とし３０
℃にて６時間反応させた。

【００２５】β−チロシナーゼ活性含有菌体を発酵除菌
液１ｌに作用させた場合と、対照として同じ発酵除菌液
１ｌにβ−チロシナーゼ活性含有菌体を作用させなかっ
た場合の各液におけるＬ−フェニルアラニン及びＬ−チ
ロシンの濃度を測定した。また、各液をそれぞれ濃縮晶
析し、ついで結晶を純水に溶解して濃縮晶析を３回繰り
かえすことにより得られた結晶中のＬ−フェニルアラニ
ン及びＬ−チロシンの含有量を測定した。その結果、表
３に示す結果が得られた。

【００２６】

【表３】

【００２７】これから明らかなように、β−チロシナー
ゼ活性含有菌体を作用させなかった場合は得られた結晶
中にＬ−チロシンが残存していたのに対し、β−チロシ
ナーゼ活性含有菌体を作用させた場合は発酵除菌液中の
Ｌ−チロシンが分解され、Ｌ−チロシンを含まない高純
度のＬ−フェニルアラニン結晶を得ることができた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:37） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:20） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:05）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−フェニルアラニンとＬ−チロシンが
   共存する発酵液もしくは単離工程液に、β−チロシナー
   ゼ活性を有する微生物の培養物、該培養物より分離した
   微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を作用させて
   Ｌ−チロシンを分解せしめた後、Ｌ−フェニルアラニン
   を単離することを特徴とするＬ−フェニルアラニンの製
   造法。