<EMI ID=1.1>
d'activité de glucose-isomérase" <EMI ID=2.1>
peut être utilisé pour catalyser la transformation de glucose
(dextrose) en fructose (lévulose) de plus grand pouvoir sucrant que la matière première. On sait également que la glucose-isomérase peut être produite par culture de diverses bactéries telles
que Streptomyces flavovirens, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Streptomyces albus, Streptomyces olivaceus, etc., dans des milieux nutritifs convenables. La glucose-isomérase
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qui croissent pendant sa production. Certaines souches produisent une quantité importante d'enzyme extracellulaire. Il est généralement préférable que l'activité enzymatique extracellulaire
soit négligeable. Les cellules peuvent ensuite être séparées par filtration du bouillon de fermentation et utilisées directement comme source de glucose-isomérase.
Il est désirable que les cellules bactériennes douées d'activité de glucose-isomérase puissent être utilisées dans
un procédé continu d'isomérisation de glucose en fructose. Diverses techniques ont été décrites dans l'art antérieur pour l'immobilisation de l'enzyme, de manière qu'il puisse être réutilisé dans
un procédé continu. Une technique avantageuse consiste à traiter les cellules bactériennes avec du glutaraldéhyde. Ce traitement immobilise la glucose-isomérase dans les cellules et permet d'utiliser ces dernières dans un réacteur équipé d'un agitateur
ou dans une colonne d'isomérisation. Toutefois, on a constaté
que les cellules bactériennes dont l'activité de glucose-isomérase est immobilisée ont une stabilité physique insuffisante altérant les caractéristiques hydrauliques de la colonne à moins qu'elles n'aient été convenablement traitées avant leur utilisation comme catalyseurs d'isomérisation; le sirop isomérisé résultant peut alors avoir une couleur indésirable et la durée d'activité de l'enzyme peut être indésirablement réduite.
Le procédé de l'invention, pour le prétraitement
de cellules bactériennes douées d'activité de glucose-isomérase
en vue de leur utilisation pour l'élaboration d'un produit contenant du fructose, consiste (a) à mélanger les cellules bacté- <EMI ID=4.1>
de dextrose à un pH d'environ 8, mesuré à 25[deg.]C, jusqu'à ce que les cellules soient hydratées et que le pH soit équilibré ; et
(b) à faire passer une solution aqueuse de dextrose en courant ascendant dans un lit de ces cellules bactériennes à une tempéra- <EMI ID=5.1>
qu'à ce que l'effluent soit clair et que son pH soit stabilisé
à 7,5-8,0, mesuré à 60[deg.]C ; ou à faire passer de l'eau à une tem-
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en courant ascendant dans un lit de ces cellules bactériennes jusqu'à ce que l'effluent soit clair et que son pH soit stabilisé à 8,0, mesuré à 25[deg.]C, puis à faire passer une solution aqueuse de dextrose en courant ascendant à travers le lit à une tempéra-
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en dextrose que la solution de dextrose qui entre.
Les cellules bactériennes douées d'activité de glucose-isomérase que l'on peut utiliser dans le procédé de l'invention peuvent être produites par des procédés bien connus. Les cellules contenant l'enzyme sont avantageusement produites par développement, dans des conditions aérobies en immersion,
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dans un milieu contenant des substances nutritives convenables. Les cellules bactériennes résultantes sont séparées du bouillon de fermentation par filtration ou par centrifugation.
Diverses techniques bien connues peuvent être utilisées pour immobiliser la glucose-isomérase. Dans une technique avantageuse, les cellules bactériennes isolées sont mises en suspension dans un milieu aqueux et sont agitées avec du glutaraldéhyde en quantité d'environ 0,1 à environ 50 % en poids sur la base du poids sec des cellules.
Etant donné que les cellules bactériennes traitées contenant l'enzyme sont habituellement produites en un lieu différent et en avance sur le moment où on devra les utiliser pour produire le sirop isomérisé, ces cellules sont avantageusement séchées avant leur entreposage et leur expédition. Ce séchage jusqu'à une teneur en humidité d'environ 3 à 10 % en poids peut être effectué dans tout appareil convenable de séchage à une température d'environ 60 à 70[deg.]C. Les cellules sèches agglomérées résultantes sont ensuite convenablement calibrées en vue de leur utilisation subséquente pour garnir une colonne. La masse cellulaire séchée agglomérée est avantageusement subdivisée en petits morceaux en exerçant le minimum d'effort sur les cellules individuelles, et les morceaux sont recueillis sur des tamis
en vue de l'obtention d'une fraction qui est retenue sur un tamis de 0,250 mm d'ouverture de maille et qui traverse un tamis de
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Lorsque les masses agglomérées de cellules bactériennes ainsi préparées doivent être utilisées dans la production . d'un sirop contenant du fructose à partir de dextrose, la pratique classique consiste à placer tout d'abord les cellules dans une colonne et à déclencher le passage de'la solution de dextrose en courant descendant dans la colonne- dans les conditions désirées de température et de pH. Généralement, la réaction d'isomérisation est longue à se stabiliser dans un état relativement constant. Pendant cette période de stabilisation, le sirop isomérisé résultant a une couleur indésirable. On a également constaté que la durée d'activité des cellules est indésirablement courte.
Conformément à la présente invention, les cellules sont tout d'abord mélangées avec de l'eau ou avec une solution aqueuse de dextrose. Cette dernière solution peut consister en dextrose dissout dans l'eau. De préférence, elle consiste en une solution saccharifiée à .forte teneur en dextrose, produite par hydrolyse enzymatique de l'amidon. Cette solution de dextrose doit contenir environ 30 à 50 % en poids de matières solides dissoutes et ces matières solides doivent contenir environ 93 à
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un équivalent de dextrose d'environ 97 à 98: Cette eau ou cette solution de dextrose est utilisée en quantité d'environ 10 parties en poids par partie en poids de cellules séchées. L'eau ou la solution de dextrose est également à une température d'environ
10 à 27[deg.]C. Elle doit aussi contenir du cobalt à une concentration molaire d'environ 0,0005, par exemple du chlorure de cobalt, du magnésium à uner concentration molaire d'environ 0,005 à 0,007, par exemple- de l'hydroxyde de magnésium, et un agent
de ch�lation à une concentration à peu près centinormale, ainsi qu'un agent tampon tel que l'acide citrique. On préfère l'acide citrique parce qu'il forme un complexe soluble de chélation avec les ions cobalt et magnésium et parce qu'il contribue à tamponner l'eau ou la solution de dextrose au pH désiré. Cette eau ou cette solution de dextrose doit avoir un pH égal à 8, mesuré à 25[deg.]C, et ce pH est avantageusement ajusté par l'addition de la quantité convenable d'hydroxyde de sodium. Les cellules et l'eau ou la solution de dextrose sont maintenues en contact sous agitation minimale pendant environ 1 heure pour permettre l'hydratation correcte des cellules et l'équilibrage du pH.
La suspension de cellules dans l'eau ou la solution de dextrose, résultant de l'étape décrite ci-dessus, est ensuite
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chemise, pour former une couche dont la profondeur de sédimentation est d'environ 89 à 100 cm. La suspension doit être agitée au minimum pour réduire toute altération mécanique des masses cellulaires agglomérées. Dans une forme de mise en oeuvre de l'invention, une solution de dextrose ayant la même composition que la solution de'dextrose décrite ci-dessus, de pH égal à 7,5-8,0 mesuré à 60[deg.]C, est amenée à passer à 60[deg.]C en courant ascendant à travers le lit cellulaire à un débit d'environ 53
à 61 1 par m<2> de section droite du lit par minute. Ce débit produit une expansion d'environ 50 à 60 % du volume sédimenté de la masse cellulaire agglomérée. Elle produit également la classification et la transposition désirées des masses cellulaires agglomérées. Dès que la solution de dextrose aborde le lit, on
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la chemise de la colonne. La solution qui sort à la partie supérieure de la colonne renferme une quantité importante de corps colorés, parce qu'elle contient divers résidus venant des cellules bactériennes. On doit faire passer la solution chaude de dextrose en courant ascendant dans la colonne jusqu'à ce que l'effluent soit clair et que son pH, mesuré à 60[deg.]C, soit stabilisé
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à 7,5-8,0. Cela requiert un débit horaire de solution d'environ 2 à 3 volumes de lit, pendant une période d'environ 1 à 3 heures. On arrête ensuite l'écoulement de la solution de dextrose et
on laisse le lit cellulaire se sédimenter. Pour réduire la quantité de solution de dextrose nécessaire pour ce prétraitement, on peut recycler dans la colonne la majeure partie de l'effluent de solution de dextrose, hormis la matière initiale très colorée. Le pH de la matière recylée, mesuré à 60[deg.]C, doit être ajusté entre 7,5 et 8,0 par l'addition d'une base alcaline avant la réutilisation. Dans une variante de l'invention, les cellules contenues dans la colonne du réacteur sont initialement traitées par passage d'une solution aqueuse de même composition que la solution aqueuse décrite ci-dessus, à une température d'environ 10
à 27[deg.]C et à un pH de 8,0, mesuré à 25[deg.]C, en courant ascendant dans le lit cellulaire jusqu'à ce que la solution qui sort soit claire et que son pH mesuré à 25[deg.]C soit stabilisé à 8,0, cette opération étant suivie du passage d'une solution aqueuse de dextrose de même composition que la solution de dextrose décrite ci-dessus, en courant ascendant dans le lit à environ 60[deg.]C et
à un pH, mesuré à 60[deg.]C, de 7,5 à 8,0 jusqu'à ce que la solution qui sort ait la même teneur en dextrose que la solution.de dextrose qui entre.
Pendant le traitement indiqué ci-dessus, la solution dans l'eau et la solution aqueuse de dextrose sont recyclées dans le lit. Le pH de la matière recyclée est ajusté à la valeur désirée par l'addition de base alcaline, avant la réutilisation.
Toutes les solutions de dextrose qui entrent en contact avec les cellules bactériennes douées d'activité de glucose-isomérase contiennent un peu de fructose formé par une réaction d'isomérisation. Par conséquent, les solutions de dextrose utilisées dans les étapes de prétraitement décrites cidessus peuvent être décolorées par traitement au carbone, déminéralisées avec des substances d'échange ionique puis utilisées comme composants de produits renfermant du fructose.
Les cellules prétraitées par le procédé décrit cidessus peuvent ensuite être utilisées d'une manière bien connue pour produire un sirop isomérisé. Une solution de dextrose de composition définie ci-dessus peut s'écouler en courant descendant à travers le lit à un pH d'environ 8 et à une température d'environ 60[deg.]C pour donner un produit contenant environ 42 à 48 %
en poids de fructose, suivant le débit. Les masses cellulaires agglomérées prétraitées conformément à l'invention ont une très grande stabilité physique et de bonnes caractéristiques hydrauliques qui conviennent très bien pour des lits relativement profonds
(76-102 cm). Au contraire, l'utilisation des cellules traitées conformément aux techniques antérieures doit être limitée à
des lits peu profonds (environ 1,3 à 10,2 cm), à surface spécifique extrêmement grande.
L'invention est illustrée en détail par les exemples suivants :
Exemple 1
On prépare un bouillon de fermentation contenant
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en cultivant ces cellules de manière connue dans un milieu renfermant du xylose. Le pH du bouillon de fermentation est ensuite ajusté à 8,2 par l'addition d'hydroxyde de sodium. Une solution aqueuse à 1 % en poids/volume de glutaraldéhyde est ajoutée
au bouillon de fermentation en quantité de 7 % en poids de glutaraldéhyde sur la base du poids sec des cellules contenues dans le bouillon. Le mélange résultant est agité pendant 1,5 heure, période pendant laquelle de l'hydroxyde de sodium est ajouté
pour maintenir le pH à 8,2. Les cellules sont ensuite filtrées, lavées à un pH égal à 8, puis séchées à 60-70[deg.]C jusqu'à une
teneur en humidité de 3 à 10 % en poids. Ce résidu de filtrage séché, formé des cellules agglomérées, est ensuite subdivisé
et les morceaux sont recueillis sur des tamis pour former une fraction qui est retenue sur un tamis de 0,250 mm d'ouverture de maille et qui traverse un tamis de 0,84 mm d'ouverture. Les masses de cellules bactériennes séchées et convenablement tamisées, contenant la glucose-isomérase immobilisée, sont ensuite conservées à la température ambiante en vue de leur utilisation ultérieure.
Une portion de 300 g des cellules conservées indiquées ci-dessus est mélangée avec un sirop aqueux de dextrose produit par traitement enzymatique de l'amidon. Ce sirop a un équivalent
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dissoutes, lesdites matières contenant 94 % en poids de dextrose. Ce sirop est à une température de 10 à 27[deg.]C et il est utilisé
en quantité de 10 parties en poids par partie en poids de cellules séchées. Il contient également du chlorure de cobalt (environ 0,0005 M), de l'hydroxyde de magnésium (environ 0,005-0,007 M)
et de l'acide citrique (environ 0,01 N). Une quantité suffisante d'hydroxyde de sodium est également ajoutée pour maintenir le
pH du sirop de dextrose à 8_, mesuré à 25[deg.]C. Les cellules sont maintenues au contact de la solution de dextrose pendant environ
1 heure de manière qu'elles puissent s'hydrater correctement et que le pH s'équilibre.
La suspension résultante de cellules et de solution de dextrose est ensuite transvasée dans la colonne d'un réacteur convenable de 3,8 cm de diamètre, équipé d'une chemise, pour former une couche de cellules ayant une profondeur de sédimentation d'environ 89-100 cm. On agite la suspension au minimum pour réduire toute altération mécanique des cellules hydratées. On fait passer une solution de dextrose ayant la même composition que ci-dessus, de pH égal à 7,5-8,0 mesuré à 60[deg.]C, à cette température en courant ascendant à travers le lit de cellules à un débit
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de dextrose aborde le lit, on fait passer un fluide chauffant convenable à 60[deg.]C à travers la chemise de la colonne. On fait monter la solution chaude de dextrose dans la colonne pendant environ 1 heure jusqu'à ce que l'effluent soit clair et que son
pH soit stabilisé à 7,5-8,0, mesuré à 60[deg.]C. On arrête ensuite l'écoulement de la solution de dextrose et on laisse la couche de cellules se sédimenter pendant environ 15-20 mn. Pendant le prétraitement décrit ci-dessus, la solution de dextrose est recyclée dans le lit de cellules. Le pH de la solution de dextrose recyclée est maintenu à 7,5-8,0, mesuré à 60[deg.]C, par l'addition d'hydroxyde de sodium. Si on laissait le pH s'abaisser au-dessous d'environ 7 (mesuré à 60[deg.]C) pendant le prétraitement, il résulterait <EMI ID=17.1>
La couche de cellules est alors prête à être utilisée pour isomériser du dextrose en fructose. Une solution de dextrose de même composition que ci-dessus est amenée à s'écouler par gravité sous pression d'environ 10,2 à 15,2 cm de solution à
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de la solution de dextrose est maintenu à 8 (mesuré à 60[deg.]C)
par l'addition d'hydroxyde de sodium. On produit un sirop isomérisé contenant environ 42-43 % en poids de fructose (sur la
base du poids des matières solides dissoutes), incolore et ne contenant pas de psicose. Lorsque le débit horaire da sirop
de dextrose est ajusté à 1,1 volume de lit (16,3 1/m<2>/h), on obtient un produit contenant environ 45-46 % en poids de fructose
(sur la base du poids des matières solides dissoutes), incolore et ne contenant pas de psicose.
Le lit cellulaire défini ci-dessus a été utilisé
en continu pendant plus de 1000 heures pour l'isomérisation et l'activité des masses cellulaires agglomérées n'a été que légèrement réduite. Des cellules qui n'auraient pas été préalablement traitées par le procédé de la présente invention auraient perdu au moins la moitié de leur activité enzymatique au bout d'environ 500-600 heures de service continu.
Exemple 2
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les bactériennes convenablement séchées et calibrées, contenant de la glucose-isomérase immobilisée, est produite conformément au premier paragraphe de l'exemple 1. On prépare une solution dans l'eau contenant du chlorure de cobalt (environ 0,0005 M),
de l'hydroxyde de magnésium (environ 0,005-0,007 M), de l'acide citrique (environ 0,01 N) et un volume suffisant d'hydroxyde de sodium pour maintenir le pH à 8, mesuré à 25[deg.]C. Les cellules séchées sont ensuite mélangées avec cette solution dans l'eau à
10-27[deg.]C en quantité de 10 parties en poids de solution dans l'eau par partie en poids de cellules séchées. Les cellules sont main-tenues au contact de la solution dans l'eau pendant environ
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que leur pH soit équilibré.
La suspension résultante de cellules et de solution dans l'eau est ensuite transvasée dans la colonne d'un réacteur convenable de 3,8 cm de diamètre, équipé d'une chemise, pour former une couche cellulaire dont la profondeur de sédimentation est d'environ 100 cm. On agite la suspension au minimum pour réduire toute altération méçanique des cellules hydratées. On fait.passer en courant ascendant à travers la couche de cellules, à 10-27[deg.]C, à un débit de 53 à 61 1 par m<2> de section droite du lit par minute, une solution aqueuse de même composition que celle qui a été décrite ci-dessus et de pH égal à 8,0, mesuré
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dant à travers la colonne pendant environ heure jusqu'à ce
que l'effluent soit clair et jusqu'à ce que son pH soit stabilisé
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solution dans l'eau. On fait ensuite passer en courant ascendant à travers la couche de cellules, à un débit de 53 à 61 1 par
m<2> de section droite du lit, par minute, une solution de dextrose du type défini dans l'exemple 1 à 60[deg.]C, da pH mesuré à 60[deg.]C égal à 7,5-8,0, jusqu'à ce que la solution sortant du lit ait
la même teneur en dextrose que la solution qui y entre. Dès que la solution de dextrose aborde le lit, on fait passer un liquide chauffant convenable à 60[deg.]C dans la chemise de la colonne. On interrompt ensuite l'écoulement de la solution de dextrose et on laisse la couche de cellules se sédimenter pendant environ 15-
20 minutes. Pendant le prétraitement décrit ci-dessus, la solution aqueuse et la solution subséquente de dextrose son+ recyclées dans le lit cellulaire. Le pH de la solution aqueuse et
le pH de la solution subséquente de dextrose que l'on recycle sont maintenus respectivement à 8 (mesuré à 25[deg.]C) et à 7,5-8,0
(mesuré à 60[deg.]C) par addition d'hydroxyde de sodium.
Le lit cellulaire prétraité ainsi obtenu est ensuite utilisé pour isomériser du dextrose en fructose de la manière décrite dans l'exemple 1, en vue de produire un sirop isomérisé contenant environ 42-43 % en poids de fructose, incolore et ne renfermant pas de psicose. Le lit cellulaire prétraité comme indiqué ci-dessus a avantageusement une longue durée d'activité.
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glucose-isomerase activity "<EMI ID = 2.1>
can be used to catalyze the transformation of glucose
(dextrose) into fructose (levulose) with greater sweetening power than the raw material. It is also known that glucose isomerase can be produced by culturing various bacteria such as
as Streptomyces flavovirens, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Streptomyces albus, Streptomyces olivaceus, etc., in suitable nutrient media. Glucose-isomerase
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that grow during its production. Some strains produce a significant amount of extracellular enzyme. It is generally preferable that the extracellular enzymatic activity
is negligible. The cells can then be separated by filtration from the fermentation broth and used directly as a source of glucose isomerase.
It is desirable that bacterial cells endowed with glucose-isomerase activity can be used in
a continuous process of isomerizing glucose to fructose. Various techniques have been described in the prior art for the immobilization of the enzyme, so that it can be reused in
a continuous process. One advantageous technique is to treat bacterial cells with glutaraldehyde. This treatment immobilizes the glucose-isomerase in the cells and allows the latter to be used in a reactor equipped with a stirrer.
or in an isomerization column. However, we found
that bacterial cells whose glucose-isomerase activity is immobilized have insufficient physical stability affecting the hydraulic characteristics of the column unless they have been suitably treated before their use as isomerization catalysts; the resulting isomerized syrup can then have an undesirable color and the duration of activity of the enzyme can be undesirably reduced.
The process of the invention, for the pretreatment
bacterial cells endowed with glucose-isomerase activity
with a view to their use for the preparation of a product containing fructose, consists of (a) mixing the bacterial cells - <EMI ID = 4.1>
dextrose at a pH of about 8, measured at 25 [deg.] C, until the cells are hydrated and the pH is balanced; and
(b) passing an aqueous solution of dextrose in an updraft through a bed of these bacterial cells at a temperature- <EMI ID = 5.1>
until the effluent is clear and its pH is stabilized
at 7.5-8.0, measured at 60 [deg.] C; or pass water at a time
<EMI ID = 6.1>
rising in a bed of these bacterial cells until the effluent is clear and its pH stabilized at 8.0, measured at 25 [deg.] C, then passing an aqueous solution of dextrose through updraft through the bed at a tempera-
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in dextrose than the dextrose solution that enters.
Bacterial cells endowed with glucose isomerase activity which can be used in the method of the invention can be produced by well known methods. The cells containing the enzyme are advantageously produced by development, under aerobic conditions in immersion,
<EMI ID = 8.1>
in a medium containing suitable nutrients. The resulting bacterial cells are separated from the fermentation broth by filtration or by centrifugation.
Various well known techniques can be used to immobilize glucose isomerase. In a preferred technique, the isolated bacterial cells are suspended in an aqueous medium and are stirred with glutaraldehyde in an amount of from about 0.1 to about 50% by weight based on the dry weight of the cells.
Since the treated bacterial cells containing the enzyme are usually produced in a different location and in advance of when they should be used to produce the isomerized syrup, these cells are advantageously dried prior to storage and shipment. This drying to a moisture content of about 3 to 10% by weight can be carried out in any suitable drying apparatus at a temperature of about 60 to 70 [deg.] C. The resulting agglomerated dry cells are then suitably sized for their subsequent use to pack a column. The agglomerated dried cell mass is advantageously subdivided into small pieces with minimal effort exerted on the individual cells, and the pieces are collected on sieves.
with a view to obtaining a fraction which is retained on a sieve of 0.250 mm mesh opening and which passes through a sieve of
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When the agglomerated masses of bacterial cells thus prepared are to be used in production. of a syrup containing fructose from dextrose, the conventional practice is to first place the cells in a column and initiate the passage of the dextrose solution downward through the column - under the desired conditions of. temperature and pH. Generally, the isomerization reaction takes a long time to stabilize in a relatively constant state. During this stabilization period, the resulting isomerized syrup has an undesirable color. It has also been found that the duration of activity of cells is undesirably short.
According to the present invention, the cells are first mixed with water or with an aqueous solution of dextrose. The latter solution may consist of dextrose dissolved in water. Preferably, it consists of a saccharified solution with a high dextrose content, produced by enzymatic hydrolysis of starch. This dextrose solution should contain about 30 to 50% by weight of dissolved solids and these solids should contain about 93 to
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a dextrose equivalent of about 97 to 98: This water or this dextrose solution is used in an amount of about 10 parts by weight per part by weight of dried cells. The water or dextrose solution is also at a temperature of about
10 to 27 [deg.] C. It should also contain cobalt at a molar concentration of about 0.0005, for example cobalt chloride, magnesium at a molar concentration of about 0.005 to 0.007, for example - magnesium hydroxide, and an agent.
of chlorination to about 100 normal concentration, as well as a buffering agent such as citric acid. Citric acid is preferred because it forms a soluble chelating complex with cobalt and magnesium ions and because it helps buffer water or dextrose solution to the desired pH. This water or this dextrose solution must have a pH equal to 8, measured at 25 [deg.] C, and this pH is advantageously adjusted by the addition of the suitable quantity of sodium hydroxide. Cells and water or dextrose solution are kept in contact with minimal agitation for about 1 hour to allow proper hydration of cells and pH balance.
The suspension of cells in water or dextrose solution, resulting from the step described above, is then
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jacket, to form a layer with a sedimentation depth of about 89 to 100 cm. The suspension should be agitated to a minimum to reduce any mechanical damage to the agglomerated cell masses. In one embodiment of the invention, a dextrose solution having the same composition as the dextrose solution described above, with a pH equal to 7.5-8.0 measured at 60 [deg.] C , is caused to pass to 60 [deg.] C as an updraft through the cell bed at a rate of about 53
at 61 1 per m <2> cross section of the bed per minute. This flow produces an expansion of about 50-60% of the sedimented volume of the agglomerated cell mass. It also produces the desired classification and transposition of agglomerated cell masses. As soon as the dextrose solution reaches the bed, we
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the column shirt. The solution which comes out at the top of the column contains a significant amount of color bodies, because it contains various residues from the bacterial cells. The hot dextrose solution should be passed in an ascending current through the column until the effluent is clear and its pH, measured at 60 [deg.] C, has stabilized.
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at 7.5-8.0. This requires an hourly flow rate of solution of about 2 to 3 bed volumes, over a period of about 1 to 3 hours. The flow of the dextrose solution is then stopped and
the cell bed is allowed to settle. To reduce the amount of dextrose solution required for this pretreatment, most of the dextrose solution effluent can be recycled to the column, apart from the highly colored starting material. The pH of the recycled material, measured at 60 [deg.] C, should be adjusted to between 7.5 and 8.0 by the addition of an alkaline base before reuse. In a variant of the invention, the cells contained in the column of the reactor are initially treated by passing an aqueous solution of the same composition as the aqueous solution described above, at a temperature of approximately 10
at 27 [deg.] C and pH 8.0, measured at 25 [deg.] C, ascending through the cell bed until the solution that comes out is clear and its pH measured at 25 [deg.] C is stabilized at 8.0, this operation being followed by passing an aqueous solution of dextrose of the same composition as the dextrose solution described above, in an updraft in the bed at about 60 [deg. ] C and
at a pH, measured at 60 [deg.] C, 7.5-8.0 until the exiting solution has the same dextrose content as the entering dextrose solution.
During the treatment indicated above, the solution in water and the aqueous solution of dextrose are recycled to the bed. The pH of the recycled material is adjusted to the desired value by the addition of alkaline base, before reuse.
All dextrose solutions which come into contact with bacterial cells endowed with glucose-isomerase activity contain some fructose formed by an isomerization reaction. Therefore, dextrose solutions used in the pretreatment steps described above can be decolorized by carbon treatment, demineralized with ion exchange substances and then used as components of fructose-containing products.
Cells pretreated by the process described above can then be used in a well known manner to produce an isomerized syrup. A dextrose solution of the composition defined above can flow downward through the bed at a pH of about 8 and a temperature of about 60 [deg.] C to give a product containing about 42 to 48. %
by weight of fructose, depending on the flow rate. The agglomerated cell masses pretreated according to the invention have very high physical stability and good hydraulic characteristics which are very suitable for relatively deep beds.
(76-102 cm). On the contrary, the use of cells treated in accordance with the prior art should be limited to
shallow beds (approximately 1.3 to 10.2 cm), with an extremely large specific surface.
The invention is illustrated in detail by the following examples:
Example 1
A fermentation broth is prepared containing
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by culturing these cells in a known manner in a medium containing xylose. The pH of the fermentation broth is then adjusted to 8.2 by the addition of sodium hydroxide. A 1% w / v aqueous solution of glutaraldehyde is added
to fermentation broth in an amount of 7% by weight glutaraldehyde based on the dry weight of the cells contained in the broth. The resulting mixture is stirred for 1.5 hours, during which time sodium hydroxide is added.
to maintain the pH at 8.2. The cells are then filtered, washed at a pH equal to 8, then dried at 60-70 [deg.] C to a
moisture content of 3 to 10% by weight. This dried filter residue, formed from agglomerated cells, is then subdivided
and the pieces are collected on sieves to form a fraction which is retained on a sieve of 0.250 mm mesh opening and which passes through a sieve of 0.84 mm opening. The dried and suitably sieved bacterial cell masses containing the immobilized glucose isomerase are then stored at room temperature for later use.
A 300 g portion of the preserved cells indicated above is mixed with an aqueous syrup of dextrose produced by the enzymatic treatment of starch. This syrup has an equivalent
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dissolved, said materials containing 94% by weight dextrose. This syrup is at a temperature of 10 to 27 [deg.] C and it is used
in an amount of 10 parts by weight per part by weight of dried cells. It also contains cobalt chloride (approximately 0.0005 M), magnesium hydroxide (approximately 0.005-0.007 M)
and citric acid (about 0.01 N). Sufficient sodium hydroxide is also added to maintain the
pH of the dextrose syrup at 8, measured at 25 [deg.] C. The cells are kept in contact with the dextrose solution for about
1 hour so that they can hydrate properly and the pH is balanced.
The resulting suspension of cells and dextrose solution is then transferred to the column of a suitable 3.8 cm diameter reactor, equipped with a jacket, to form a layer of cells having a sedimentation depth of about 89. -100 cm. The suspension is stirred at a minimum to reduce any mechanical damage to the hydrated cells. A dextrose solution having the same composition as above, having a pH equal to 7.5-8.0 measured at 60 [deg.] C, is passed at this temperature in an upward flow through the bed of cells at a temperature. debit
<EMI ID = 16.1>
of dextrose reaches the bed, a suitable heating fluid at 60 [deg.] C is passed through the column jacket. The hot dextrose solution is raised up the column for about 1 hour until the effluent is clear and its
pH is stabilized at 7.5-8.0, measured at 60 [deg.] C. The flow of the dextrose solution is then stopped and the cell layer is allowed to settle for about 15-20 minutes. During the pretreatment described above, the dextrose solution is recycled to the cell bed. The pH of the recycled dextrose solution is maintained at 7.5-8.0, measured at 60 [deg.] C, by the addition of sodium hydroxide. If the pH was allowed to drop below about 7 (measured at 60 [deg.] C) during the pretreatment, it would result in <EMI ID = 17.1>
The cell layer is then ready to be used to isomerize dextrose to fructose. A dextrose solution of the same composition as above is caused to flow by gravity under pressure of about 10.2 to 15.2 cm of solution to
<EMI ID = 18.1>
of the dextrose solution is maintained at 8 (measured at 60 [deg.] C)
by the addition of sodium hydroxide. An isomerized syrup is produced containing about 42-43% by weight of fructose (on the
basis of weight of dissolved solids), colorless and not containing psicosis. When the hourly syrup flow
dextrose is adjusted to 1.1 bed volume (16.3 1 / m <2> / h), a product is obtained containing approximately 45-46% by weight of fructose
(based on the weight of dissolved solids), colorless and not containing psicosis.
The cell bed defined above was used
continuously for over 1000 hours for isomerization and the activity of agglomerated cell masses was only slightly reduced. Cells which would not have been previously treated by the method of the present invention would have lost at least half of their enzymatic activity after approximately 500-600 hours of continuous service.
Example 2
<EMI ID = 19.1>
the suitably dried and calibrated bacteria, containing immobilized glucose-isomerase, is produced according to the first paragraph of Example 1. A solution in water containing cobalt chloride (approximately 0.0005 M) is prepared,
magnesium hydroxide (about 0.005-0.007 M), citric acid (about 0.01 N) and a sufficient volume of sodium hydroxide to maintain the pH at 8, measured at 25 [deg.] C . The dried cells are then mixed with this solution in water to
10-27 [deg.] C in an amount of 10 parts by weight of solution in water per part by weight of dried cells. The cells are kept in contact with the solution in water for about
<EMI ID = 20.1>
that their pH is balanced.
The resulting suspension of cells and solution in water is then transferred to the column of a suitable reactor 3.8 cm in diameter, equipped with a jacket, to form a cell layer whose depth of sedimentation is about 100 cm. The suspension is stirred at a minimum to reduce any mechanical damage to the hydrated cells. An aqueous solution of the same is passed in an updraft through the layer of cells at 10-27 [deg.] C, at a rate of 53 to 61 L per m <2> of cross section of the bed per minute. composition as that which has been described above and of pH equal to 8.0, measured
<EMI ID = 21.1>
dant through the column for about an hour until
that the effluent is clear and until its pH is stabilized
<EMI ID = 22.1>
solution in water. The cell layer is then ascended at a rate of 53 to 61 L per
m <2> cross section of the bed, per minute, a dextrose solution of the type defined in Example 1 at 60 [deg.] C, da pH measured at 60 [deg.] C equal to 7.5-8 , 0, until the solution exiting the bed has
the same dextrose content as the solution entering it. As soon as the dextrose solution reaches the bed, a suitable heating liquid at 60 [deg.] C is passed through the column jacket. The flow of the dextrose solution is then stopped and the cell layer is allowed to settle for about 15-
20 minutes. During the pretreatment described above, the aqueous solution and the subsequent dextrose solution are recycled to the cell bed. The pH of the aqueous solution and
the pH of the subsequent dextrose solution which is recycled are maintained respectively at 8 (measured at 25 [deg.] C) and at 7.5-8.0
(measured at 60 [deg.] C) by adding sodium hydroxide.
The pretreated cell bed thus obtained is then used to isomerize dextrose into fructose as described in Example 1, in order to produce an isomerized syrup containing about 42-43% by weight of fructose, colorless and not containing psicose. . The cell bed pretreated as indicated above advantageously has a long duration of activity.