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d'activité de glucose-isomérase" <EMI ID=2.1>
peut être utilisé pour catalyser la transformation de glucose
(dextrose) en fructose (lévulose) de plus grand pouvoir sucrant que la matière première. On sait également que la glucose-isomérase peut être produite par culture de diverses bactéries telles
que Streptomyces flavovirens, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Streptomyces albus, Streptomyces olivaceus, etc., dans des milieux nutritifs convenables. La glucose-isomérase
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qui croissent pendant sa production. Certaines souches produisent une quantité importante d'enzyme extracellulaire. Il est généralement préférable que l'activité enzymatique extracellulaire
soit négligeable. Les cellules peuvent ensuite être séparées par filtration du bouillon de fermentation et utilisées directement comme source de glucose-isomérase.
Il est désirable que les cellules bactériennes douées d'activité de glucose-isomérase puissent être utilisées dans
un procédé continu d'isomérisation de glucose en fructose. Diverses techniques ont été décrites dans l'art antérieur pour l'immobilisation de l'enzyme, de manière qu'il puisse être réutilisé dans
un procédé continu. Une technique avantageuse consiste à traiter les cellules bactériennes avec du glutaraldéhyde. Ce traitement immobilise la glucose-isomérase dans les cellules et permet d'utiliser ces dernières dans un réacteur équipé d'un agitateur
ou dans une colonne d'isomérisation. Toutefois, on a constaté
que les cellules bactériennes dont l'activité de glucose-isomérase est immobilisée ont une stabilité physique insuffisante altérant les caractéristiques hydrauliques de la colonne à moins qu'elles n'aient été convenablement traitées avant leur utilisation comme catalyseurs d'isomérisation; le sirop isomérisé résultant peut alors avoir une couleur indésirable et la durée d'activité de l'enzyme peut être indésirablement réduite.
Le procédé de l'invention, pour le prétraitement
de cellules bactériennes douées d'activité de glucose-isomérase
en vue de leur utilisation pour l'élaboration d'un produit contenant du fructose, consiste (a) à mélanger les cellules bacté- <EMI ID=4.1>
de dextrose à un pH d'environ 8, mesuré à 25[deg.]C, jusqu'à ce que les cellules soient hydratées et que le pH soit équilibré ; et
(b) à faire passer une solution aqueuse de dextrose en courant ascendant dans un lit de ces cellules bactériennes à une tempéra- <EMI ID=5.1>
qu'à ce que l'effluent soit clair et que son pH soit stabilisé
à 7,5-8,0, mesuré à 60[deg.]C ; ou à faire passer de l'eau à une tem-
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en courant ascendant dans un lit de ces cellules bactériennes jusqu'à ce que l'effluent soit clair et que son pH soit stabilisé à 8,0, mesuré à 25[deg.]C, puis à faire passer une solution aqueuse de dextrose en courant ascendant à travers le lit à une tempéra-
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en dextrose que la solution de dextrose qui entre.
Les cellules bactériennes douées d'activité de glucose-isomérase que l'on peut utiliser dans le procédé de l'invention peuvent être produites par des procédés bien connus. Les cellules contenant l'enzyme sont avantageusement produites par développement, dans des conditions aérobies en immersion,
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dans un milieu contenant des substances nutritives convenables. Les cellules bactériennes résultantes sont séparées du bouillon de fermentation par filtration ou par centrifugation.
Diverses techniques bien connues peuvent être utilisées pour immobiliser la glucose-isomérase. Dans une technique avantageuse, les cellules bactériennes isolées sont mises en suspension dans un milieu aqueux et sont agitées avec du glutaraldéhyde en quantité d'environ 0,1 à environ 50 % en poids sur la base du poids sec des cellules.
Etant donné que les cellules bactériennes traitées contenant l'enzyme sont habituellement produites en un lieu différent et en avance sur le moment où on devra les utiliser pour produire le sirop isomérisé, ces cellules sont avantageusement séchées avant leur entreposage et leur expédition. Ce séchage jusqu'à une teneur en humidité d'environ 3 à 10 % en poids peut être effectué dans tout appareil convenable de séchage à une température d'environ 60 à 70[deg.]C. Les cellules sèches agglomérées résultantes sont ensuite convenablement calibrées en vue de leur utilisation subséquente pour garnir une colonne. La masse cellulaire séchée agglomérée est avantageusement subdivisée en petits morceaux en exerçant le minimum d'effort sur les cellules individuelles, et les morceaux sont recueillis sur des tamis
en vue de l'obtention d'une fraction qui est retenue sur un tamis de 0,250 mm d'ouverture de maille et qui traverse un tamis de
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Lorsque les masses agglomérées de cellules bactériennes ainsi préparées doivent être utilisées dans la production . d'un sirop contenant du fructose à partir de dextrose, la pratique classique consiste à placer tout d'abord les cellules dans une colonne et à déclencher le passage de'la solution de dextrose en courant descendant dans la colonne- dans les conditions désirées de température et de pH. Généralement, la réaction d'isomérisation est longue à se stabiliser dans un état relativement constant. Pendant cette période de stabilisation, le sirop isomérisé résultant a une couleur indésirable. On a également constaté que la durée d'activité des cellules est indésirablement courte.
Conformément à la présente invention, les cellules sont tout d'abord mélangées avec de l'eau ou avec une solution aqueuse de dextrose. Cette dernière solution peut consister en dextrose dissout dans l'eau. De préférence, elle consiste en une solution saccharifiée à .forte teneur en dextrose, produite par hydrolyse enzymatique de l'amidon. Cette solution de dextrose doit contenir environ 30 à 50 % en poids de matières solides dissoutes et ces matières solides doivent contenir environ 93 à
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un équivalent de dextrose d'environ 97 à 98: Cette eau ou cette solution de dextrose est utilisée en quantité d'environ 10 parties en poids par partie en poids de cellules séchées. L'eau ou la solution de dextrose est également à une température d'environ
10 à 27[deg.]C. Elle doit aussi contenir du cobalt à une concentration molaire d'environ 0,0005, par exemple du chlorure de cobalt, du magnésium à uner concentration molaire d'environ 0,005 à 0,007, par exemple- de l'hydroxyde de magnésium, et un agent
de ch�lation à une concentration à peu près centinormale, ainsi qu'un agent tampon tel que l'acide citrique. On préfère l'acide citrique parce qu'il forme un complexe soluble de chélation avec les ions cobalt et magnésium et parce qu'il contribue à tamponner l'eau ou la solution de dextrose au pH désiré. Cette eau ou cette solution de dextrose doit avoir un pH égal à 8, mesuré à 25[deg.]C, et ce pH est avantageusement ajusté par l'addition de la quantité convenable d'hydroxyde de sodium. Les cellules et l'eau ou la solution de dextrose sont maintenues en contact sous agitation minimale pendant environ 1 heure pour permettre l'hydratation correcte des cellules et l'équilibrage du pH.
La suspension de cellules dans l'eau ou la solution de dextrose, résultant de l'étape décrite ci-dessus, est ensuite
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chemise, pour former une couche dont la profondeur de sédimentation est d'environ 89 à 100 cm. La suspension doit être agitée au minimum pour réduire toute altération mécanique des masses cellulaires agglomérées. Dans une forme de mise en oeuvre de l'invention, une solution de dextrose ayant la même composition que la solution de'dextrose décrite ci-dessus, de pH égal à 7,5-8,0 mesuré à 60[deg.]C, est amenée à passer à 60[deg.]C en courant ascendant à travers le lit cellulaire à un débit d'environ 53
à 61 1 par m<2> de section droite du lit par minute. Ce débit produit une expansion d'environ 50 à 60 % du volume sédimenté de la masse cellulaire agglomérée. Elle produit également la classification et la transposition désirées des masses cellulaires agglomérées. Dès que la solution de dextrose aborde le lit, on
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la chemise de la colonne. La solution qui sort à la partie supérieure de la colonne renferme une quantité importante de corps colorés, parce qu'elle contient divers résidus venant des cellules bactériennes. On doit faire passer la solution chaude de dextrose en courant ascendant dans la colonne jusqu'à ce que l'effluent soit clair et que son pH, mesuré à 60[deg.]C, soit stabilisé
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à 7,5-8,0. Cela requiert un débit horaire de solution d'environ 2 à 3 volumes de lit, pendant une période d'environ 1 à 3 heures. On arrête ensuite l'écoulement de la solution de dextrose et
on laisse le lit cellulaire se sédimenter. Pour réduire la quantité de solution de dextrose nécessaire pour ce prétraitement, on peut recycler dans la colonne la majeure partie de l'effluent de solution de dextrose, hormis la matière initiale très colorée. Le pH de la matière recylée, mesuré à 60[deg.]C, doit être ajusté entre 7,5 et 8,0 par l'addition d'une base alcaline avant la réutilisation. Dans une variante de l'invention, les cellules contenues dans la colonne du réacteur sont initialement traitées par passage d'une solution aqueuse de même composition que la solution aqueuse décrite ci-dessus, à une température d'environ 10
à 27[deg.]C et à un pH de 8,0, mesuré à 25[deg.]C, en courant ascendant dans le lit cellulaire jusqu'à ce que la solution qui sort soit claire et que son pH mesuré à 25[deg.]C soit stabilisé à 8,0, cette opération étant suivie du passage d'une solution aqueuse de dextrose de même composition que la solution de dextrose décrite ci-dessus, en courant ascendant dans le lit à environ 60[deg.]C et
à un pH, mesuré à 60[deg.]C, de 7,5 à 8,0 jusqu'à ce que la solution qui sort ait la même teneur en dextrose que la solution.de dextrose qui entre.
Pendant le traitement indiqué ci-dessus, la solution dans l'eau et la solution aqueuse de dextrose sont recyclées dans le lit. Le pH de la matière recyclée est ajusté à la valeur désirée par l'addition de base alcaline, avant la réutilisation.
Toutes les solutions de dextrose qui entrent en contact avec les cellules bactériennes douées d'activité de glucose-isomérase contiennent un peu de fructose formé par une réaction d'isomérisation. Par conséquent, les solutions de dextrose utilisées dans les étapes de prétraitement décrites cidessus peuvent être décolorées par traitement au carbone, déminéralisées avec des substances d'échange ionique puis utilisées comme composants de produits renfermant du fructose.
Les cellules prétraitées par le procédé décrit cidessus peuvent ensuite être utilisées d'une manière bien connue pour produire un sirop isomérisé. Une solution de dextrose de composition définie ci-dessus peut s'écouler en courant descendant à travers le lit à un pH d'environ 8 et à une température d'environ 60[deg.]C pour donner un produit contenant environ 42 à 48 %
en poids de fructose, suivant le débit. Les masses cellulaires agglomérées prétraitées conformément à l'invention ont une très grande stabilité physique et de bonnes caractéristiques hydrauliques qui conviennent très bien pour des lits relativement profonds
(76-102 cm). Au contraire, l'utilisation des cellules traitées conformément aux techniques antérieures doit être limitée à
des lits peu profonds (environ 1,3 à 10,2 cm), à surface spécifique extrêmement grande.
L'invention est illustrée en détail par les exemples suivants :
Exemple 1
On prépare un bouillon de fermentation contenant
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en cultivant ces cellules de manière connue dans un milieu renfermant du xylose. Le pH du bouillon de fermentation est ensuite ajusté à 8,2 par l'addition d'hydroxyde de sodium. Une solution aqueuse à 1 % en poids/volume de glutaraldéhyde est ajoutée
au bouillon de fermentation en quantité de 7 % en poids de glutaraldéhyde sur la base du poids sec des cellules contenues dans le bouillon. Le mélange résultant est agité pendant 1,5 heure, période pendant laquelle de l'hydroxyde de sodium est ajouté
pour maintenir le pH à 8,2. Les cellules sont ensuite filtrées, lavées à un pH égal à 8, puis séchées à 60-70[deg.]C jusqu'à une
teneur en humidité de 3 à 10 % en poids. Ce résidu de filtrage séché, formé des cellules agglomérées, est ensuite subdivisé
et les morceaux sont recueillis sur des tamis pour former une fraction qui est retenue sur un tamis de 0,250 mm d'ouverture de maille et qui traverse un tamis de 0,84 mm d'ouverture. Les masses de cellules bactériennes séchées et convenablement tamisées, contenant la glucose-isomérase immobilisée, sont ensuite conservées à la température ambiante en vue de leur utilisation ultérieure.
Une portion de 300 g des cellules conservées indiquées ci-dessus est mélangée avec un sirop aqueux de dextrose produit par traitement enzymatique de l'amidon. Ce sirop a un équivalent
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dissoutes, lesdites matières contenant 94 % en poids de dextrose. Ce sirop est à une température de 10 à 27[deg.]C et il est utilisé
en quantité de 10 parties en poids par partie en poids de cellules séchées. Il contient également du chlorure de cobalt (environ 0,0005 M), de l'hydroxyde de magnésium (environ 0,005-0,007 M)
et de l'acide citrique (environ 0,01 N). Une quantité suffisante d'hydroxyde de sodium est également ajoutée pour maintenir le
pH du sirop de dextrose à 8_, mesuré à 25[deg.]C. Les cellules sont maintenues au contact de la solution de dextrose pendant environ
1 heure de manière qu'elles puissent s'hydrater correctement et que le pH s'équilibre.
La suspension résultante de cellules et de solution de dextrose est ensuite transvasée dans la colonne d'un réacteur convenable de 3,8 cm de diamètre, équipé d'une chemise, pour former une couche de cellules ayant une profondeur de sédimentation d'environ 89-100 cm. On agite la suspension au minimum pour réduire toute altération mécanique des cellules hydratées. On fait passer une solution de dextrose ayant la même composition que ci-dessus, de pH égal à 7,5-8,0 mesuré à 60[deg.]C, à cette température en courant ascendant à travers le lit de cellules à un débit
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de dextrose aborde le lit, on fait passer un fluide chauffant convenable à 60[deg.]C à travers la chemise de la colonne. On fait monter la solution chaude de dextrose dans la colonne pendant environ 1 heure jusqu'à ce que l'effluent soit clair et que son
pH soit stabilisé à 7,5-8,0, mesuré à 60[deg.]C. On arrête ensuite l'écoulement de la solution de dextrose et on laisse la couche de cellules se sédimenter pendant environ 15-20 mn. Pendant le prétraitement décrit ci-dessus, la solution de dextrose est recyclée dans le lit de cellules. Le pH de la solution de dextrose recyclée est maintenu à 7,5-8,0, mesuré à 60[deg.]C, par l'addition d'hydroxyde de sodium. Si on laissait le pH s'abaisser au-dessous d'environ 7 (mesuré à 60[deg.]C) pendant le prétraitement, il résulterait <EMI ID=17.1>
La couche de cellules est alors prête à être utilisée pour isomériser du dextrose en fructose. Une solution de dextrose de même composition que ci-dessus est amenée à s'écouler par gravité sous pression d'environ 10,2 à 15,2 cm de solution à
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de la solution de dextrose est maintenu à 8 (mesuré à 60[deg.]C)
par l'addition d'hydroxyde de sodium. On produit un sirop isomérisé contenant environ 42-43 % en poids de fructose (sur la
base du poids des matières solides dissoutes), incolore et ne contenant pas de psicose. Lorsque le débit horaire da sirop
de dextrose est ajusté à 1,1 volume de lit (16,3 1/m<2>/h), on obtient un produit contenant environ 45-46 % en poids de fructose
(sur la base du poids des matières solides dissoutes), incolore et ne contenant pas de psicose.
Le lit cellulaire défini ci-dessus a été utilisé
en continu pendant plus de 1000 heures pour l'isomérisation et l'activité des masses cellulaires agglomérées n'a été que légèrement réduite. Des cellules qui n'auraient pas été préalablement traitées par le procédé de la présente invention auraient perdu au moins la moitié de leur activité enzymatique au bout d'environ 500-600 heures de service continu.
Exemple 2
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les bactériennes convenablement séchées et calibrées, contenant de la glucose-isomérase immobilisée, est produite conformément au premier paragraphe de l'exemple 1. On prépare une solution dans l'eau contenant du chlorure de cobalt (environ 0,0005 M),
de l'hydroxyde de magnésium (environ 0,005-0,007 M), de l'acide citrique (environ 0,01 N) et un volume suffisant d'hydroxyde de sodium pour maintenir le pH à 8, mesuré à 25[deg.]C. Les cellules séchées sont ensuite mélangées avec cette solution dans l'eau à
10-27[deg.]C en quantité de 10 parties en poids de solution dans l'eau par partie en poids de cellules séchées. Les cellules sont main-tenues au contact de la solution dans l'eau pendant environ
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que leur pH soit équilibré.
La suspension résultante de cellules et de solution dans l'eau est ensuite transvasée dans la colonne d'un réacteur convenable de 3,8 cm de diamètre, équipé d'une chemise, pour former une couche cellulaire dont la profondeur de sédimentation est d'environ 100 cm. On agite la suspension au minimum pour réduire toute altération méçanique des cellules hydratées. On fait.passer en courant ascendant à travers la couche de cellules, à 10-27[deg.]C, à un débit de 53 à 61 1 par m<2> de section droite du lit par minute, une solution aqueuse de même composition que celle qui a été décrite ci-dessus et de pH égal à 8,0, mesuré
<EMI ID=21.1>
dant à travers la colonne pendant environ heure jusqu'à ce
que l'effluent soit clair et jusqu'à ce que son pH soit stabilisé
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solution dans l'eau. On fait ensuite passer en courant ascendant à travers la couche de cellules, à un débit de 53 à 61 1 par
m<2> de section droite du lit, par minute, une solution de dextrose du type défini dans l'exemple 1 à 60[deg.]C, da pH mesuré à 60[deg.]C égal à 7,5-8,0, jusqu'à ce que la solution sortant du lit ait
la même teneur en dextrose que la solution qui y entre. Dès que la solution de dextrose aborde le lit, on fait passer un liquide chauffant convenable à 60[deg.]C dans la chemise de la colonne. On interrompt ensuite l'écoulement de la solution de dextrose et on laisse la couche de cellules se sédimenter pendant environ 15-
20 minutes. Pendant le prétraitement décrit ci-dessus, la solution aqueuse et la solution subséquente de dextrose son+ recyclées dans le lit cellulaire. Le pH de la solution aqueuse et
le pH de la solution subséquente de dextrose que l'on recycle sont maintenus respectivement à 8 (mesuré à 25[deg.]C) et à 7,5-8,0
(mesuré à 60[deg.]C) par addition d'hydroxyde de sodium.
Le lit cellulaire prétraité ainsi obtenu est ensuite utilisé pour isomériser du dextrose en fructose de la manière décrite dans l'exemple 1, en vue de produire un sirop isomérisé contenant environ 42-43 % en poids de fructose, incolore et ne renfermant pas de psicose. Le lit cellulaire prétraité comme indiqué ci-dessus a avantageusement une longue durée d'activité.