<EMI ID=1.1>
La présente invention. est relative à un procédé de
production de dérivés de p-l,3-glucane qui consiste à faire
réagir un �-1,3-glucane insoluble dans l'eau avec un halogénure
de cyanogène.
La présente invention a pour objet un support insoluble dans l'eau ayant une réactivité élevée, utile pour la
production d'enzymes insolubles dans l'eau et de colonnes pour
la chromatographie par affinité.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente
invention apparaîtront à la lecture de la description qui va
suivre.
Un procédé général consistant à activer un polysaccharide avec un halogénure de cyanogène pour obtenir un
dérivé susceptible de fixer par covalence des substances contenant des groupes amino primaires ou secondaires est décrit par
<EMI ID=2.1>
tion d'enzymes insolubles dans l'eau et de matrices liées à
des ligands pour la chromatographie par affinité selon ce procédé général sont en réalité nombreuses.
Cependant, aucune de ces publications ne décrit l'u-
<EMI ID=3.1>
La réaction d'activation avec un halogénure de cyanogène est couramment exécutée à un pH alcalin et en particulier
au voisinage de pH 11. Cependant, les �-1,3-glucanes sont tellement susceptibles de se dissoudre dans de telles conditions
de pH que l'application directe du procédé général connu tel
<EMI ID=4.1>
activés recherchés.
La demanderesse a exécuté des recherches approfondies relativement aux conditions de la réaction d'activation des
<EMI ID=5.1>
fins de la présente invention peut âtre par exemple l'un des polysaccharides élaborés par des microorganismes appartenant
<EMI ID=6.1>
lièrement, on peut mentionner le polysaccharide produit par
<EMI ID=7.1> <EMI ID=8.1>
(brevet des E.U.A. n[deg.] 3 754 925, brevet des E.U.A. n[deg.] 3 822.250)
(désigné ci-après par PS-2) et le pachymane qui se trouve dans
<EMI ID=9.1>
réaction d'activation de la présente invention peut être sous forme de poudre ou d'articles façonnés, qui sont préparés en
<EMI ID=10.1>
téristiques physiques spécifiques, par exemple sous forme de fibres, de pellicules, de perles ou de petites billes etc., ou sous forme de microcapsules en enrobant une matière formant
le coeur avec ledit glucane.
En ce qui concerne le procédé de transformation de
<EMI ID=11.1>
on peut utiliser l'un quelconque des procédés couramment utilisés dans ce domaine particulier de la technique. Par exemple, pour obtenir un article fibreux, on peut suivre le mode opératoire
<EMI ID=12.1>
dans une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, puis à neutraliser la solution et à faire subir au glucane une gélification
(brevet des E.U.A. n[deg.] 3 899 480).
Une pellicule d'un tel �-1,3-glucane insoluble dans l'eau peut être préparée par exemple en dissolvant le P-1,3-
<EMI ID=13.1>
de potassium, en appliquant la solution sur une plaque de verre plat avec une épaisseur uniforme et finalement en immergeant la plaque de verre revêtue dans une solution aqueuse d'acide chlorhydrique de manière à neutraliser la pellicule et à provoquer la gélification du glucane (brevet des E.U.A. n[deg.] 3 899 480).
<EMI ID=14.1> en utilisant l'un des procédés suivants : le procédé qui consiste à extruder, à laisser tomber goutte à goutte ou à pulvériser un fluide contenant un j3-l,3-glucane insoluble dans l'eau dans un bain d'huile chauffé, ce qui provoque ainsi la
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
le p-l,3-glucane insoluble dans l'eau dans une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium et à introduire la solution résultante
par l'intermédiaire d'un ajutage goutte à goutte dans une solutbn aqueuse d'acide chlorhydrique pour neutraliser et provoquer la gélification du glucane (brevet des E.U.A. n[deg.] 3 899 480) ; le procédé qui consiste à disperser une solution aqueuse alcaline
<EMI ID=17.1>
qui n'est pas facilement miscible dans l'eau et à ajouter un acide organique à la dispersion résultante ; et le procédé qui consiste à ajouter une matière formant noyau à une solution
<EMI ID=18.1>
perser le mélange dans un solvant organique qui n'est pas facilement miscible à l'eau, puis à ajouter un acide organique à la dispersion résultante (ces deux derniers procédés sont décrits dans la demande de brevet japonais déposée le 21 Octobre 1975
au nom de la demanderesse, sous le titre "procédé de production de gels sous forme de perles").
On donne ci-après à titre d'exemples deux procédés spécifiques de production de gels sous forme de perles de �-1,3glucane insoluble dans l'eau indiqués dans la demande de brevet japonais susmentionnée déposée le 21 Octobre 1975.
(a) A 9 g de poudre de PS-1 on ajoute 270 ml d'eau distillée et on agite le mélange jusqu'à ce qu'il ait la consistance d'une pâte. On ajoute à cette pâte 30 ml d'une solution aqueuse <EMI ID=19.1>
Dans un bêcher ayant une capacité de 2 litres, on introduit
<EMI ID=20.1>
actif fourni par Japon Emulsion K.K., Japon ; dérivé polyoxyéthylénique d'huile de ricin hydrogénée) et, en agitant à
800 tr/mn à l'aide d'un agitateur du type à vis, on ajoute goutte à goutte à température ambiante la solution alcaline de PS-1 ci-dessus.
On ajoute ensuite la dispersion résultante de PS-1, tout en agitant à 800 tr/mn, à un mélange de 2.000 ml de toluène et 100 ml d'acide acétique. On poursuit l'agitation pendant environ 1 heure et on laisse le système au repos à température ambiante pendante environ 3 heures, durée pendant laquelle le produit de gélification se dépose.
On sépare le solvant par décantation et on rince le produit déposé 5 fois avec des fractions de 2 litres d'eau distillée, ce traitement rendant le produit déposé neutre et exempt de solvant organique. On obtient 240 ml de gel PS-1 sous forme de perles.
(b) A 3 g de poudre de PS-1, on ajoute 144 ml d'eau distillée ainsi que 16 ml d'une solution aqueuse d'hydroxyde de <EMI ID=21.1>
<EMI ID=22.1>
dans 600 ml de toluène. On ajoute au mélange résultant 15 ml d'acide acétique et on récupère le gel résultant sous forme d'un gâteau par filtration sur un tissu filtrant en nylon. On rince le gâteau à l'eau. L'article solide ainsi obtenu, examiné
<EMI ID=23.1>
contenant SIRASU comme noyau enrobé dans du gel de PS-1.
En tant qu'halogénure de cyanogène qui est un agent d'activation, on peut normalement employer le bromure, le chlorure ou L'iodure ou un mélange de ces composés.
L'alcali à employer conformément à la présente invention peut être par exemple un alcali caustique tel que l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium, etc. et normalement, cet alcali est utilisé de préférence en solution aqueuse 1 à
5 N. Avantageusement, on ajoute l'alcali jusqu'à ce qu'une valeur de pH de 9 à 13 se soit établie, un pH d'environ 11 étant particulièrement préféré. On ajoute l'alcali peu à peu
<EMI ID=24.1>
dans l'eau, la vitesse d'addition étant généralement et de préférence comprise entre environ 0,2 et 0,5 unité de pH par minute.
On donne ci-après un exemple spécifique de la réaction d'activation d'un �-1,3-glucane insoluble dans l'eau avec un halogénure de cyanogène.
On met en suspension 1 partie d'un �-1,3-glucane <EMI ID=25.1>
insoluble dans l'eau en poudre dans 20 parties en volume d'eau, puis on ajoute 20 parties en volume d'eau contenant 0,1 à 3 parties d'un halogénure de cyanogène. Tout en agitant à une
<EMI ID=26.1>
à 11 en ajoutant goutte à goutte une solution d'hydroxyde de sodium 2N à une vitesse ne provoquant pas la dissolution du glucane (environ 0,5 unité de pH par minute). On maintient ensuite le mélange réactionnel à pE 11 pendant 15 minutes, à la suite de quoi la réaction d'activation est terminée. Après la réaction, on récupère la fraction solide par filtration et on la rince avec 100 parties en volume d'eau. Le procédé ci-dessus
<EMI ID=27.1>
est insoluble dans l'eau et les solutions alcalines, n'est pas thermiquement gélifiable et est hydrophile, est constitué de particules ayant des dimensions et une résistance telles qu'elles assurent un débit convenable lorsqu'elles sont utilisées comme garnissage dans des colonnes. Par conséquent, ce �-1,3-glucane peut être traité par des procédés tels que les procédés qui suivent pour obtenir des enzymes insolubles dans l'eau ayant des propriétés excellentes ou des produits support-ligand convenant à la chromatographie par affinité.
La production d'une telle enzyme insoluble dans l'eau ou d'un produit support-ligand pour la chromatographie par affi-
<EMI ID=28.1>
un peptide, un aminoacide, un substrat d'enzyme ou un inhibiteur, un antigène, un anticorps, une hormone, etc., de préférence en solution aqueuse légèrement alcaline et à une température comprise dans l'intervalle allant d'environ 0 à 50[deg.]C.
Une enzyme qui est liée à un P-l,3-glucane activé
peut constituer un garnissage de lit et être utilisée comme réacteur pour des réactions chimiques. A cet égard, on peut faire passer une solution d'un substrat à travers le lit d'enzyme pour transformer ce substrat en un produit intéressant.
La réaction est automatiquement arrêtée lorsque la
<EMI ID=29.1>
dant une période prolongée en fonctionnement continu.
Un autre ex&mple intéressant est celui d'anticorps
<EMI ID=30.1> produits peuvent être combinés spécifiquement avec l'antigène correspondant, par exemple pour la détermination analytique de ce dernier.
Par exemple, on peut préparer une enzyme insoluble dans l'eau d'une hydrolase d'ester d'a-amino acide en liant par covalence une hydrolase d'ester d'a-amino-acide telle qu'elle est élaborée par un microorganisme à un P-l,3-glucane insoluble dans l'eau activé par un halogénure de cyanogène.
Il est bien connu que de nombreuses bactéries app artenant à la famille Pseudomonadaceae sont susceptibles d'hydrolyser les esters d'a-amino acides y compris l'ester méthylique de 2-phénylglycine et, en présence d'un accepteur d'acyle appro-
<EMI ID=31.1>
pénicillines semi-synthétiques ou des céphalosporines semisynthétiques peuvent être produites en utilisant ces bactéries
<EMI ID=32.1>
T. Takahashi et al, Biochem. J. 137, 497(1974) ; brevet des
<EMI ID=33.1>
ainsi proposes
dant, parce que les procèdes /dépendent invariablement des cellules bactériennes pour une source d'enzyme, ils impliquent une autolyse ou une perte d'activité par vieillissement, qui empêche en fait une utilisation répétée des cellules et procure seulement un faible rendement d'utilisation de l'enzyme. En outre, ces procédés ont l'inconvénient que le système réactionnel est souillé ou altéré par une élution partielle ou une pénétration des constituants ce llulaire s dans le système ou par une infiltration des ingrédients du milieu qui souvent se sont fixés aux cellules bactériennes. Le résultat est que dans la production de pénicillines ou de céphalosporines utilisées sous des formes posologiques injectables, beaucoup de temps et de travail sont nécessaires pour la purification des composés obtenus.
Pour surmonter l'inconvénient ci-dessus, la demanderesse a entrepris des recherches approfondies pour développer un procédé de transformation d'une hydrclase d'ester d'a-amino acide en une forme insoluble dans l'eau.
En tant que bactéries capables d'élaborer des hydrolases d'esters d'a-amino acides, on peut utiliser par exemple
<EMI ID=34.1>
Acetobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Aeromonas. Protaminobacter, Mycoplana, etc. Cette enzyme est une enzyme hydrolitique <EMI ID=35.1>
possède l'activité de synthèse de la Séphalexine à partir de
<EMI ID=36.1>
désacétoxycéphalosporanique (désigné ci-après plus brièvement par 7-ADCA). En outre, cette enzyme possède l'activité de synthèse de l'aupicilline et de l'amoxicilline à partir de l'ester méthylique de D-phénylglycine et de l'ester méthylique de D-p-
<EMI ID=37.1>
pénicillanique (désigné ci-après plus brièvement par 6-APA), ainsi que l'activité d'hydrolyse des esters d'a-amino acides racémiques ayant une spécificité optique. Parce que l'enzyme particulière est élaborée intracellulairement, il est nécessaire tout d'abord de disloquer les cellules et de préparer un extrait exempt de cellules. Cette dislocation des cellules peut être accomplie en utilisant un ou une combinaison appropriée
de deux ou plusieurs procédés connus pour la dislocation des cellules tels que le procédé lysozyme-EDTA, la dislocation par ultrasons, le procédé French-press, etc. On centrifuge la suspension résultante de cellules disloquées pour obtenir un extrait
<EMI ID=38.1>
la réaction de couplage avec un polysaccharide insoluble dans l'eau à haut poids moléculaire ou on peut le soumettre à une simple purification partielle conformément à un procédé de purification d'enzymes connu avant de l'utiliser dans la réaction d'immobilisation.
Cependant, il faut noter que toutes les hydrolases d'esters d'a-amino acides ne sont pas toujours utilisées pour les réactions d'immobilisation de la présente invention sous forme de produits enzymatiques bruts de pureté peu élevée.
Par conséquent, pour choisir l'hydrolase d'ester d'a-amino acide utile pour cette réaction, on exécute l'essai suivant. On produit d'abord une enzyme insoluble dans l'eau par le procédé indiqué ci-après dans l'exemple de référence 12 et, si l'activité spécifique de cette enzyme n'est pas inférieure au double de l'activité spécifique de l'enzyme brute initiale, cette enzyme est jugée utile pour cette réaction.
La réaction de couplage entre la préparation brute d'enzyme ainsi choisie et le polysaccharide à haut poids moléculaire activé est exécutée en milieu aqueux qui peut être <EMI ID=39.1>
faiblement acide, neutre ou faiblement alcalin, la température
<EMI ID=40.1>
La durée de la réaction est habituellement comprise entre environ 1 et 20 heures, bien qu'elle dépende de la température de réaction choisie. Après la réaction, on récupère le produit enzymatique insoluble dans l'eau résultant par filtration e�: on le rince pour éliminer les impuretés adhérentes ou adsorbées.
Pour synthétiser une pénicilline ou une céphalosporine semi-synthétique à l'aide de l'hydrolase d'ester d'a-amino
acide insoluble dans l'eau ainsi produite, on peut employer le procédé en continu ou le procédé en discontinu. Dans le procédé en discontinu, on met en suspension le produit enzymatique insoluble dans l'eau dans une solution des substrats et on laisse la réaction se dérouler dans les conditions de pH et de température optimales pendant un temps donné. On filtre ou on centrifuge ensuite le mélange réactionnel pour récupérer le pro-
<EMI ID=41.1>
produit enzymatique insoluble dans l'eau peut être utilisé à maintes reprises.
Dans le procédé de réaction en continu, le produit enzymatique insoluble dans l'eau est introduit dans une colonne à travers laquelle on fait ensuite passer 'une solution aqueuse contenant les substrats, c'est-à-dire un ester d'a-amino acide et 6-APA ou un dérivé de 7-aminocéphem, selon les cas. Ce procédé procure une pénicilline ou une céphalosporine semi-synthétique en continu et avec un rendement élevé. Le mélange réactionnel résultant (réaction en discontinu) ou l'effluent de la colonne (réaction en continu) sont exclusivement constitués du composé produit, des substrats n'ayant pas réagi et de l'aamino acide et de l'alcool obtenus comme sous-produits. Par conséquent, on peut non seulement produire facilement le composé recherché de pureté élevée, mais également récupérer les substances de départ avec une grande facilité.
En outre, l'enzyme insoluble dans l'eau utilisée comme garnissage dans la colonne ne subit aucune réduction sensible dans son activité d'hydrolase d'ester d'a-amino acide même lorsqu'elle est utilisée en continu pour une réaction de synthèse de céphalosporine
<EMI ID=42.1>
Dans cet exemple, la quantité de céphalosporine synthétisée par l'enzyme insoluble dans l'eau durant cette période de 6 mois est comparable à la quantité de céphalosporine obtenue à l'aide des cellules microbiennes employées dans la préparation de la même enzyme insoluble dans l'eau répétée environ 100 fois. L'exemple montre clairement la supériorité du procédé de synthèse de céphalosporine en continu à l'aide du produit enzymatique insoluble dans l'eau même du point de vue de l'utilisation efficace de l'enzyme.
Les exemples de référence et de réalisation suivants sont destinés simplement à mieux illustrer la présente invention sans toutefois limiter sa portée.
Exemple de référence 1
PS-1 en poudre, PS-1 sous forme de perles, PS-2 sous forme de fibres et PS-1 sous forme de pellicule, qui ont été activés avec du bromure de cyanogène dans les exemples 1 et 4
à 6 respectivement, possèdent les propriétés suivantes.
(1) Forme
PS-1 en poudre non traité, par gonflement dans de l'eau distillée, prend la forme d'une balle en caoutchouc dégonflée, de diamètre compris entre 20 et 500�, le diamètre moyen
<EMI ID=43.1>
activé est sensiblement identique à PS-1 en poudre non traité en ce qui concerne la forme et la taille des particules.
Dans les cas de PS-1 sous forme de perles, PS-2 sous forme de fibres et PS-1 sous forme de pellicule, on n'observe pratiquement aucune variation de forme entre le glucane non activé et le glucane activé.
<EMI ID=44.1>
mogélification, aucune gélification n'ayant lieu même après chauffage de 15 minutes dans de l'eau bouillante.
<EMI ID=45.1>
A la différence des glucanes non activés, les glucanes activés ne se dissolvent pas du tout dans les solutions aqueuses
<EMI ID=46.1>
<EMI ID=47.1>
La détermination de l'azote par analyse élémentaire montre que les nombres moyens d'atomes d'azote introduits par le traitement d'activation sont do 0,43 par reste de glucose dans le cas d.e poudre de PS-1, 0,45 pour les perles de PS-1,
<EMI ID=48.1>
(5) Spectres d'absorption infrarouge (KBr)
Le spectre d'absorption infra-rouge de PS-1 en poudre non traité est reproduit sur la figure 1 du dessin annexé et le spectre correspondant de PS-1 activé est reproduit sur la figure
2.. Sur cette figure, le nombre d'ondes (en cm ) ou la longueur
<EMI ID=49.1>
en ordonnée. La comparaison des deux spectres montre de nouvelles
<EMI ID=50.1>
cas de PS-1 en poudre activé. Apparemment, l'absorption à
<EMI ID=51.1>
nate.
PS-1 sous forme de perles, PS-2 sous forme de. fibres et PS-1 sous forme de pellicules montrent aussi invariablement des maxima d'absorption caractéristiques des carboxyamides.
<EMI ID=52.1>
(6) Aptitude à la coloration
L'aptitude à la coloration de ces glucanes activés est étu.diée à l'aide de colorants hydrosolubles selon le procédé de Nakanishi et al [Carbohydrate Research �2, 47-52 (1974)]. Les résultats sont mentionnés dans le tableau 1 ci-dessous.
<EMI ID=53.1>
<EMI ID=54.1>
Exemple de référence 2
On. met en suspension 1 g (poids sec) de PS-1 activé obtenu dans l'exemple 1 dans de l'eau distillée pour obtenir
20 ml d'une suspension. On ajoute à cette suspension 10 ml de
<EMI ID=55.1>
20 mg/ml de pronase (fabriquée par Eaken gagaku K.K., Japon)
<EMI ID=56.1>
pH 8,5 en agitant pendant 20 heures. Lorsque la réaction est terminée, on récupère le gel de PS-1 à l'aide d'un filtre en
<EMI ID=57.1>
80 ml d'une solution de chlorure de sodium 0,5 M et 40 ml d'eau distillée dans l'ordre indiqué. On obtient un produit enzymatique de pronase insoluble dans l'eau. On détermine Inactivité de pronase du produit ci-dessus à 25[deg.]C et pH 8,0 à l'aide de l'ester méthylique de p-toluène sulfonyl-L-arginine qui est un substrat synthétique. Le résultat montre que 63 % de l'activité de pronase utilisée dans la réaction de couplage ont été transformés en enzyme insoluble dans l'eau.
La quantité totale de protéine dans les liquides de lavage récupérés dans le procédé ci-dessus est déterminée par
<EMI ID=58.1>
265 (1951)] et soustraite de la teneur en protéine de la pronase initialement utilisée. Le pourcentage de protéine insolubilisée
<EMI ID=59.1>
Exemple de référence 3
On met en suspension 1 g de PS-1 activé obtenu dans l'exemple 1 dans de l'eau distillée pour préparer 20 ml d'une suspension de polysaccharide. On ajoute à cette suspension
<EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
Japon). On laisse réagir le mélange à 5[deg.]C et pH 8,0 pendant
4- heures, après quoi on rince le gel de la même manière que dans l'exemple de référence 2 pour obtenir une a-amylase insoluble dans l' eau.
On détermine l'activité d'a-amylase de ce produit en le faisant réagir avec de l'amidon soluble comme substrat
<EMI ID=62.1>
est de 59 %. Le pourcentage de protéine insolubilisée est de
65 %.
Exemple de référence 4
<EMI ID=63.1>
l'exemple 1 dans de l'eau distillée pour préparer 20 ml d'une suspension. On ajoute à cette suspension 10 ml d'un tampon au phosphate 0,2M (pH 8,0) et 10 ml d'une solution à 2,5 mg/ml d'achymotrypsine cristalline (fabriquée par Sigma, E.U.A.). On exécute la réaction de couplage à 5[deg.]C et pH 8. La réaction est terminée en 2 heures. Par le procédé ci-dessus, 78 % de la pro-
<EMI ID=64.1>
On détermine l'activité d'estérase en utilisant comme
<EMI ID=65.1>
d' éthanol à 27[deg.]C et pH 7,8. Le pourcentage d'activité insolubi-
<EMI ID=66.1>
Exemple de référence 5
<EMI ID=67.1>
l'exemple 1 dans 20 ml d'eau distillée, puis on ajoute 10 ml de tampon tris-HCl 0,2M (pH 8,0) et 10 ml d'une solution à 2,5 mg/ml de phosphatase acide de germes de blé (fabriquée par Seikagaku Eogyo K.K., Japon).
<EMI ID=68.1>
pendant 18 heures, après quoi on rince le produit réactionnel résultant comme dans l'exemple de référence 2 pour obtenir une phosphatase acide insoluble dans l'eau. On détermine l'activité
<EMI ID=69.1>
<EMI ID=70.1>
l'activité initiale de l'enzyme ont été insolubilisée. Le pourcentage de protéine insolubilisée est de 63 %.
Exemple de référence 6
On met en suspension 1 g de PS-1 activé obtenu dans l'exemple 1 dans de l'eau distillée pour obtenir 20 ml d'une suspension. On ajoute à cette suspension 5 mg d'une hydrolase d'ester d'a-aminoacide extraite des cellules de Acetobacter turbidans ATCC 9325 et partiellement purifiée [en ce qui concerne le procédé de production de l'enzyme et ses diverses propriétés
<EMI ID=71.1>
de tampon tris-HCl 0,1 M (pH 8,0).
On laisse réagir le mélange à 5[deg.]C et pH 8,0 en agitant pendant 4 heures. Après cette réaction, on récupère le gel de PS-1 par filtration et on le rince de la même manière que dans l'exemple de référence 2. On met l'enzyme insoluble dans l'eau <EMI ID=72.1> ainsi obtenue en suspensior ians de l'eau distillée pour obtenir
40 ml d une suspension.*
On détermine l'activité de cette suspension d'enzyme insoluble en utilisant comme substrat l'ester méthylique de Dphénylglycine. On constate que l'activité est de 9,83 unités/ml. Le résultat montre que 84 % de l'activité initiale de l'enzyme ont été insolubilisés. Le pourcentage de protéine insolubilisée est de 69 %.
A l'aide de 25 ml de la suspension d'enzyme insoluble dans l'eau ci-dessus, on prépare une colonne de petites dimensions ayant un volume de lit de 5 ml et on fait passer à travers la colonne avec un débit constant de 12 ml/h une solution de substrat (pH 7,2) contenant 15 mg/ml de chlorhydrate d'ester
<EMI ID=73.1>
<EMI ID=74.1>
constate que le mélange réactionnel s'écoulant de la colonne contient 7,50 mg/ml de céphalexine. On poursuit cette réaction pendant 6 mois consécutifs. On constate que l'activité de synthèse de céphalexine de la colonne ne diminue pas du tout à la fin de cette période.
Exemple de référence 7
On met en suspension dans de l'eau distillée 1 g de PS-1 activé obtenu de la même manière que dans l'exemple 1 pour préparer 20 ml d'une suspension, On ajoute à cette suspension
<EMI ID=75.1>
<EMI ID=76.1>
Research Laboratories, E.U.A.). On laisse réagir le mélange à
<EMI ID=77.1>
ensuite le gel de PS-1 par filtration et on le rince comme dans l'exemple de référence 2.
La quantité de L-leucylglycylglycine couplée à PS-1,
<EMI ID=78.1>
quides de lavage, est de 12,6 mg.
Le procédé de réaction ci-dessus est répété de façon
<EMI ID=79.1>
(fabriquée par Sigma, E.U.A.), au lieu de 1-leucylglycyglycine.
<EMI ID=80.1>
PS-1 sont de 15,1 mg et 11,0 mg respectivement.
Exemple de référence 8
On prélève 1 g (sur une base sèche) des perles de PS-1 activé, des fibres de PS-2 activé et de la pellicule de PS-1 activé qui ont été préparés dans les exemples 4 à 6 res-
<EMI ID=81.1>
solution aqueuse à 1 % (poids/volume) d'alcool p-aminophénéthylique et 10 ml de tampon au phosphate 0,04M (pH 6). Tout en agitant, on exécute la réaction à 500 et pH 6 pendant 24 heures. On filtre le mélange réactionnel et on rince la matière solide avec 200 ml d'une solution aqueuse de NaCl 0,5 M. La quantité d'alcool p-aminophénéthylique couplée dans la réaction cidessus est calculée à partir de la quantité d'alcool p-aminophénéthylique récupérée dans le filtrat ci-dessus. Les quantités d'alcool p-aminophénétylique ainsi couplées sont de 47 mg
<EMI ID=82.1>
et 24 mg pour la pellicule de PS-1 (tous les chiffres sont
<EMI ID=83.1>
déré comme correspondant aux quantités de groupe actif (groupe
<EMI ID=84.1>
tivation.
Exemple de référence 9
On met en suspension dans 40 ml d'eau distillée 1 g
(sur la base du poids sec) de perles de PS-1 activé obtenues
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
pronase (fabriquée par Kaken Kagaku Kabushiki Kaisha, Japon)
<EMI ID=87.1>
pendant 6 heures, en agitant constamment. Après cette réaction, on récupère le gel de PS-1 sous forme de perles à l'aide d'un filtre de verre et on le rince avec 120 ml d'une solution de glycine 0,2M, 120 ml d'une solution de chlorure de sodium 0,5 M et 80 ml d'eau distillée dans l'ordre indiqué. Le procédé donne un produit de pronase insoluble dans l'eau. On détermine ensuite l'activité de pronase du produit ci-dessus en utilisant un substrat synthétique, l'ester méthylique de p-toluène sul-
<EMI ID=88.1>
l'activité initiale de pronase ont été transformés par la réaction de couplage en produit enzymatique insoluble dans l' e au.
On détermine également la quantité totale de protéine <EMI ID=89.1>
et on soustrait la valeur trouvée de la teneur totale en protéine de la pronase initiale. le pourcentage de protéine inso-
<EMI ID=90.1>
Exemple de référence 10
On met en suspension 1 g de fibres de PS-2 activé obtenues dans l'exemple 5 dans 20 ml d'eau distillée. On ajoute à cette suspension 10 ml d'un tampon au phosphate 0,2M (pH 8,0)
<EMI ID=91.1>
cristalline (fabriquée par Sigma, E.U.A.). Cette réaction de
<EMI ID=92.1>
en 4 heures, temps au bout duquel 65 % de la protéine enzymatique initialement ajoutée ont été couplés avec le support.
On détermine l'activité d'estérase du produit à 27[deg.]C
<EMI ID=93.1>
tyrosine en présence de 10 % d'éthanol. Le pourcentage d'acti-
<EMI ID=94.1>
Exemple de référence 11
A 1 g de la pellicule de PS-1 activé obtenue dans l'exemple 6 on ajoute 20 ml d'eau distillée ainsi que 5 ml d'une solution à 1 % d'uréase (dérivée du Jaquier, fabriquée par Wako Junyaku Kabushiki kaisha, Japon) et 5 ml de tampon au phosphate
<EMI ID=95.1>
18 heures, à la suite de quoi 35 % de l'activité enzymatique initiale sont insolubilisés. Le pourcentage de protéine insolubilisée est 44 %.
Exemple de référence 12
On utilise des souches de microorganismes ayant une activité d'hydrolase d'ester d'a-amino acide pour inoculer dans une fiole à secousses de 2 litres contenant 5 ml d'un milieu de composition indiquée au bas du tableau 2, et on exécute la culture avec secousses à 28[deg.]C pendant 24 heures.
On centrifuge le bouillon de culture et on ajoute aux
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pour préparer 50 ml d'une suspension. On soumet la suspension à une rupture par ultrasons à 150W pendant 50 minutes. On centrifuge l'extrait d'hydrolase d'ester a-amino acide exempt de cellules résultant et on ajoute au fluide surnageant 1/10 de partie en volume de phosphate de potassium secondaire 1M et <EMI ID=97.1>
d'acétate de calcium 1M. On laisse reposer le mélange à 5[deg.]C pendant 30 minutes et on sépare par centrifugation le gel de phosphate de calcium résultant pour obtenir un liquide surnageant. On introduit 1 ml de ce liquide surnageant traité au phosphate de calcium dans un petit tube à essais bouché de façon courante, puis on ajoute 0,1 g de PS-1 activé obtenu par le procédé de l'exemple 3 et 1 ml de tampon au phosphate 2M
(pH 8,0), ainsi qu'une quantité suffisante d'eau distillée pour obtenir un volume total de 4 ml. On exécute le. réaction avec
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à l'aide d'un filtre en verre et on le rince avec 18 ml d'une solution de glycine 0,2M et 18 ml d'une solution de chlorure
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des de lavage. On met en suspension l'enzyme insolubilisée obtenue dans 4 ml d'eau distillée. On détermine l'activité enzy-
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et pH 6,0 en utilisant 20 mM d'une solution d'ester méthylique
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(11). En ce qui concerne les liquides de lavage ci-dessus, la quantité de protéine dans les liquides de lavage est déterminée et la quantité de protéine liée est calculée à partir du pourcentage de récupération. En outre, on divise le pourcentage de récupération d'activité liée à PS-1 par le pourcentage de récu-
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sente le rapport de l'activité spécifique d'enzyme.immobilisée
à l'activité spécifique du fluide surnageant obtenu après traitement au phosphate de calcium et, comme on peut le voir dans le tableau 2, on choisit, comme enzymes ayant un rapport tel que défini ci-dessus supérieur à 2, les enzymes de 5 souches de microorganismes, à savoir Acetobacter pasteurianus (IFO 3223, ATCC 6033), Acetobacter turbidans (IPO 3225, ATCC 9325), Mycoplana sp. (IFO 13213, ATCC 21759), Gluconobacter suboxidans
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On met en suspension dans 40 ml d'eau distillée une portion de 1 g (sur une base de poids sec) de PS-1 activé par le procédé mentionné dans l'exemple 3. On ajoute ensuite à la
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20 ml du fluide surnageant qui a été obtenu par traitement des cellules disloquées de Kanthomonas sp. (IFO 13215, ATCC 21764) avec du phosphate de calcium comme dans l'exemple de référence
12. On exécute la réaction à 5[deg.]C et pH 8,0 en agitant pendant
20 heures, après quoi on filtre le mélange réactionnel à travers un filtre de verre pour récupérer la fraction solide. On rince cette fraction solide avec 100 ml de solution de glycine 0,2M, 100 ml d'une solution de chlorure de sodium 0,5M et
200 ml d'eau distillée dans l'ordre indiqué. On met à nouveau en suspension dans de l'eau distillée les produits enzymatiques insolubles dans l'eau ainsi obtenus pour préparer 40 ml d'une suspension. On détermine l'activité et la quantité de protéine liée du produit enzymatique insoluble dans l'eau résultant. Les résultats sont mentionnés dans le tableau 3 ci-dessous.
TABLEAU 3
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Exemple de référence 14
A 500 ml du fluide surnageant obtenu par le traitement au phosphate de calcium de Acetobacter turbidans (IFO 3225, ATCC 9325) comme dans l'exemple de référence 12, on ajoute 25 g de PS-2 préactivé avec du bromure de cyanogène comme dans
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reste étant de l'eau distillée pour compléter à 1 litre. On exécute la réaction à une température constante de 5[deg.]C et une valeur de pH constante de 8,0 pendant 18 heures, après quoi on filtre le mélange réactionnel à travers un filtre de verre. On <EMI ID=112.1>
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dans l'ordre indiqué. On met en suspension l'enzyme insolubilisée
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le rendement de protéine insolubilisée est de 33 %. L'activité spécifique est dons multipliée par 2,5.
Exemple de référence 15
On prépare une colonne ayant un volume de lit de 50 ml en utilisant 200 ml d'une suspension du produit enzymatique insoluble dans l'eau préparé par le procédé mentionné dans l'exemple de référence 14. On fait ensuite passer à travers la colonne
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cédé donne de la céphalexine avec un pourcentage de conversion d'environ 95 %. On détermine le titre de la céphalexine par photométrie en utilisant la céphalosporinase élaborée par
Aelobacter cloacae (IFO 12937) [ T. Takahasi et al, J. Amer,
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On concentre à 1000 ml le mélange réactionnel conte-
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sur colonne en continu ci-dessus en une quantité de 1650 ml dans un évaporateur rotatif et on fait passer le concentré à travers une colonne de charbon activé ayant un volume de lit de 250 ml, à la suite de quoi la céphalexine est adsorbée. On lave la colonne avec 2500 ml d'eau distillée, puis on élue la céphalexine avec une solution aqueuse de butanol à 4 % pour récupérer 1600 ml d'éluat. On concentre l'éluat pratiquement jusqu'à siccité et on récupère les cristaux résultants par filtration, on les rince avec 50 ml de méthanol et 50 ml d'éther éthylique, puis on les sèche. On déshydrate ensuite les cristaux dans un dessicateur contenant du pentoxyde de phosphore. Le procédé donne 10,3 g de cristaux de céphalexine. De cette
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de synthèse de 95 %, un rendement de purification de 81 % et
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Exemple de référence 16
A partir de 40 ml de la suspension d'enzyme insoluble dans l'eau supportée par PS-1 préparée dans l'exemple de référence 13, on récupère la fraction solide par f iltration. On ajoute cette fraction solide à 100 ml d'une solution de substrat
(pH 7,0) contenant 0,5 % (poids/volume) de 6-APA, 1,0 % (poids/ volume) d'ester méthylique de D-phénylglycine, 12 % (volume/ volume) de méthanol et 50 mM de tampon au phosphate. On exécute la réaction à 25[deg.]C en agitant pendant 3 heures, après quoi on sépare l'enzyme insoluble dans l'eau par filtration. On constate
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On utilise à nouveau la même enzyme insoluble dans l'eau dans la réaction de synthèse de l'ampicilline dans les mêmes conditions que ci-dessus cinq fois. Les teneurs en ampicilline des
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Ainsi, l'inactivation de l'enzyme est pratiquement nulle.
Dans un évaporateur rotatif, on concentre jusqu'à environ 200 ml 600 ml (teneur en ampicilline : 6750 �g/ml) du mélange réactionnel obtenu ci-dessus et on fait passer le concentré à travers une colonne (2,3 x 35 cm) de Amberlite XAD-2 (fabriqué par Rohm and Haas Co. E.U.A.), à la suite de quoi l'ampicilline est adsorbée. On lave d'abord la colonne avec 150 ml d'une solution aqueuse de méthanol à 20 % (volume/ volume), puis on élue l'ampicilline avec 100 ml d'une solution aqueuse de méthanol à 50 % (volume/volume),. On concentre l'éluat résultant jusqu'à environ un cinquième de son volume initial
et on le laisse reposer à 5[deg.]C. On récupère les cristaux d'ampicilline résultants par filtration et on les sèche. Le procédé donne 3,40 g de cristaux d'ampicilline (rendement global
71 %).
Exemple de référence 17
On prépare une colonne ayant un volume de lit de
50 ml en utilisant 200 ml d'une suspension du produit enzymatique insoluble dans l'eau obtenue par le procédé mentionné dans l'exemple de référence 14 et à 5[deg.]C, on fait passer à travers la colonne avec un débit de 200 ml/jour une solution de substrat (pH 6,5) contenant 0,5 % (poids/volume) de 6-APA,
1,0 % (poids/volume) d'ester méthylique de D-p-hydroxyphénylglycine, 10 % (volume/volume) d'éthanol et 75 mM de tampon au phosphate (pH 6,5). Le procédé ci-dessus donne un mélange <EMI ID=126.1>
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rateur rotatif, on concentre 2 1 du mélange' réactionnel. cidessus jusqu' à environ la moitié de son volume initial et on refroidit.. On récupère les cristaux blancs résultants par filtration et on concentre ensuite la liqueur-mère pour obtenir d'autres cristaux similaires. On combine les cristaux et on les rince avec de faibles quantités d'eau, d'acétone et d'éther éthylique dans l'ordre indiqué, puis on les sèche sur du pentoxyde de phosphore.. Le procédé donne 10,5 g de cristaux (rendement global 66 %).
Les cristaux ainsi obtenus donnent une seule tache sur un chromatogramme sur couche mince (gel de silice) et ont
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Exemple de référence 18
On prépare une petite colonne ayant un volume de lit de 5 ml en utilisant 20 ml de l'enzyme insoluble dans l'eau obtenue dans l'exemple de référence 14- et on exécute la réaction de synthèse de céphalexine à 5[deg.]C en faisant.passer en continu une solution de substrat de composition indiquée dans l'exemple de référence 15 avec un débit de 10 ml/h sur la colonne. Après
6 mois, on constate que le rendement en céphalexine est resté stable à 93-97 %. Ainsi, aucune inactivation n'a eu lieu.
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On introduit 10 g de poudre blanche de PS-1 dans un bêcher ayant une capacité de 500 ml. Après addition de 200 ml d'eau distillée, on.agite la suspension avec un agitateur magnétique jusqu'à ce que PS-1 ait suffisamment gonflé. On ajoute ensuite 200 ml d'une solution aqueuse à 5 % (poids/volume) de
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goutte à goutte une solution 2N d'hydroxyde de sodium à l'aide
de dosage
d'un appareil/automatique pour augmenter le pH de la suspension à la vitesse d'environ 0,5 unité de pH/mn jusqu'à ce qu'une valeur de pH de 11 se soit établie. On maintient ensuite la suspension à cette valeur de. pH pendant environ 15 minutes, à la suite de quoi la réaction est terminée. Après la réaction, on récupère les particules de PS-1 dans le mélange réactionnel par filtration et on les rince avec 1 1 d'eau distillée pour obtenir 10,05 g (poids sec) de PS-1 activé.
EXEMPLE 2
De la même manière que dans l'exemple 1, on active
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EXEMPLE 3
A 1 g de PS-1 on ajoute 20 ml d'eau et, lorsque le
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tion aqueuse à 5 % (poids/Volume) de bromure de cyanogène. Tout
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réactionnel à 11 à la vitesse de 0,2 à 0,5 unité de par minute
en utilisant un appareil de dosage automatique (pH-stat). On poursuit la réaction à un pH constant de 11 pédant 15 minutes, après quoi on récupère la fraction solide par filtration et on la rince bien à l'eau distillée. Le procédé ci-dessus donne PS-1 activé.
EXEMPLE 4
A 125 ml de PS-1 sous forme de perles (diamètre de particules 50-200 microns) (qui équivalent à environ 5 g de PS-1 en poids sec) on ajoute 100 ml d'eau et 100 ml de bromure de cyanogène à 5 % (poids/volume).
A 25[deg.]C et en agitant, on ajoute goutte à goutte une solution d'hydroxyde de sodium 2N à l'aide d'un appareil de dosage automatique en des quantités telles que le pH augmente peu à peu à la vitesse d'environ 0,5 unité de pH/mn jusqu'à une valeur
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15 minutes, à la suite de quoi la réaction est terminée. Après cette réaction, on récupère la matière solide par filtration
et on la rince avec 500 ml d'eau distillée. Le procédé ci-dessus
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EXEMPLE 5
On pèse 5 gode PS-2 sous forme de fibres (diamètre environ 0,2 à 0,3 mm ; longueur environ 10 cm), qu'on traite de la même 'manière que dans l'exemple 4.. Le procédé donne PS-2 activé sous forme de fibres (poids sec 5,15 g).
EXEMPLE 6
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viron 0,2 mm d'épaisseur) qu'on traite de la même manière que dans l'exemple 4. Le procédé donne PS-1 activé sous forme de
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REVENDICATIONS
1 - Procédé de production d'un dérivé de bêta-1,3--
glucane, caractérisé par le fait qu'il consiste à faire réagir
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cyanogène.
2 - Procédé de production d'un dérivé de bêta-1,3-