Dérivés alkylés de l'antibiotique BM-123 et
leur procédé de préparation La présente invention concerne un nouveau groupe d'antibiotiques et plus particulièrement une nouvelle série d'agents antibactériens puissants dérivés par alkylation réductrice de l'antibiotique BM-123Y au moyen d'un aldéhyde de formule générale :
<EMI ID=1.1>
<EMI ID=2.1>
halogéno alkyle inférieur, alcényle inférieur, phényle, phényle monosubstitué, phénylalkyle inférieur, furyle-2, méthylfuryle-2, thiényle-2,
<EMI ID=3.1>
ou d'une cétone de formule générale :
<EMI ID=4.1>
dans laquelle R2 est un groupe alkyle inférieur, halogéno alkyle inférieur, ou phénylalkyle inférieur et R3 est un groupe alkyle inférieur, halogéno alkyle inférieur, alcényle inférieur, cycloalkyle inférieur, phényle, phényle monosubstitué, phénylalkyle inférieur, ou (phényl monosubstitué)alkyle inférieur ; ou bien R et R3 pris ensemble représentent un groupe
<EMI ID=5.1>
inférieur et halogéno alkyle inférieurs appropriés selon l'invention sont ceux ayant jusqu'à 6 atomes de carbone dans lesquels l'halogène est illustré par le chlore, le brome et l'iode, tels que méthyle, éthyle, isopropyle, sec-butyle, n-amyle, dichlorométhyle, bromo-2 éthyle, diiodo-2,3 propyle, y-chloropropyle, etc. Les groupes alcényle inférieurs appropriés sont ceux ayant jusqu'à 4 atomes de carbone tels que vinyle, allyle, propényle, isopropényle, butène-1 yle, butène-2 yle, butène-3 yle, . isobutényle, etc. Les groupes cycloalkyle inférieurs appropriés sont les groupes cyclopentyle, cyclohexyle et cycloheptyle.
Les groupes phényle monosubstituésappropriés selon l'invention sont par exemple Les groupes p-acétamidophényle, m-nitrophényle, m-mercaptophényle, o-anisyle, p-anisyle, o-tolyle, p-tolyle, etc., tandis que les groupes phénylalkyle inférieur sont illustrés par les groupes benzyle, a-phényléthyle et P-phényléthyle.
Les groupes (phényl monosubstitué)-alkyle inférieurs peuvent être les
<EMI ID=6.1>
thyl-1,3,4 pyrryle-2, etc.
Le procédé d'alkylation réductrice permettant de prépare? les nouveaux agents antibactériens selon l'invention est mis en oeuvre
<EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
cellosolve ou leurs mélanges, on ajoute ensuite un excès de l'aldéhyde ou
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
la réduction. On maintient le pH du mélange de réaction à 6,0-8,0 au moyen d'un acide inorganique dilué au cours de la réaction. Après 1 à
<EMI ID=11.1>
réaction à siccité sous vide, on triture le résidu avec du méthanol et on filtre. On dilue le filtrat par l'acétone et on sépare par filtra-
<EMI ID=12.1>
Les aldéhydes que l'on peut ainsi utiliser dans le procédé
de l'invention sont par exemples les composés suivants : acétaldéhyde, propionaldéhyde, butyraldéhyde, isobutyraldéhyde, crotonaldéhyde, valéraldéhyde, benzaldéhyde, p-cyanobenzaldéhyde, salicylaldéhyde, cinnamaldéhyde, trichloroacétaldéhyde, etc. Les cétones que l'on peut ainsi utiliser dans le procédé de l'invention sont par exemples les composés suivants: acétone, butanone-2, dibromo-1,3 acétone, chloroacétone, acétophénone, m-chloroacéto-
<EMI ID=13.1>
phênone, p-diméthylaminoacétophénone, etc.
On obtient les produits à partir des mélanges de réaction d'alkylation réductrice par des techniques classiques telles que précipitation, concentration, extraction par solvant ou des combinaisons de ces techniques. Après isolation, on peut purifier les produits par l'une quelconque des techniques généralement connues de purification. Celles-ci comprennent la recristallisation dans divers solvants et mélanges solvants, les techniques chromatographiques et la répartition à contre-courant, qui sont toutes ordinairement utilisées à cet effet.
Les nouveaux agents antibactériens selon l'invention sont des bases organiques et sont donc capables de former des sels d'addition d'acides avec divers réactifs salifiables organiques et inorganiques. Ainsi, on obtient des sels d'addition d'acides formés par mélange de l'antibactérien base libre avec jusqu'à trois équivalents d'un acide, avantageusement dans un solvant neutre, avec des acides tels que les acides sulfurique, phosphorique, chlorhydrique, bromhydrique, sulfamique, citrique, maléique, fumarique, tartrique, acétique, benzotque, gluconique, ascorbique et les analogues. Les sels d'addition d'acides des antibactériens selon l'invention sont en général des solides cristallisés relativement solubles dans l'eau,
<EMI ID=14.1>
organiques non polaires tels qu'éther diéthylique, benzène, toluène, et les analogues. Pour les buts de l'invention, les bases libres des antibacrériens sont équivalentes à leurs sels d'addition d'acides non toxiques.
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
nouvelle souche d'une espèce non déterminée de Nocardia. Cette nouvelle souche productrice d'antibiotiques a été isolée d'un échantillon de terre de jardin recueillie à Oceola, dans l'Iowa,et elle est conservée dans la collection de la Lederle Laboratories Division de la.Société demanderesse à Pearl River, New York, sous la désignation Culture n[deg.] BM-123. Une culture viable du nouveau micro-organisme a été déposée au Culture Collection Laboratory, Northern Utilisation Researche and Development Division, United States Department of Agriculture, à Peoria dans l'Illinois et a été ajoutée à sa collection permanente. Elle est librement accessible au public sous le n[deg.] NRRL 5646. Dans la présente description, on
<EMI ID=17.1>
On donne ci-après une description générale du micro-organisme Nocardia sp., NRRL 5646, d'après les caractéristiques diagnostiques observées. On a observé les caractéristiques de culture, physiologiques et morphologiques de l'organisme selon les techniques décrites en détail par Shirling et Gottlieb dans Internat. Journ. of Syst. Bacteriol. 16, pages 213-240 (1966). La composition chimique de la culture a été déterminée par les techniques indiquées par Lechevalier et al., dans Advan. Appl. Microbiol. 14, pages 47-72
(1971). Les couleurs descriptives soulignées et les désignations de couleurs ont été empruntées à Jacobson et al., Color Harmony Manual, 3è Edition
(1948), Container Corp. of America, Chicago, Illinois. Les détails descriptifs
<EMI ID=18.1>
Croissance
Modérée sur géloses à l'extrait de levure, à l'asparaginedextrose, de Benedict, de Bennett, de pomme de terre-dextrose et de Weinstein ; légère sur gélose de Hickey et Transner, à la pite de tomate, à la farine d'avoine, et alimentaire ;
et traces de croissance sur géloses aux sels inorganiquesamidon, aux flocons d'avoine de Kuster, à la solution de Czapek et au riz.
Mycélium aérien
Mycelium aérien blanchâtre s'il y en a ; produit seulement sur géloses à l'extrait de levure, à l'asparagine dextrose, de Benedict, de Bennett et de pomme de terre-dextrose. Pigments solubles
Pas de production de pigments solubles. Couleur de l'envers
Nuances incolore à jaunâtre.
Réactions physiologiques diverses
Pas de liquéfaction de la gélatine ; réduction des nitrates en nitrites en 7 jours ; pas de formation de pigments mélanotdes sur géloses de peptone-fer ; pas de peptonisation ou de caillebotte dans le lait au pourpre de bromocrésol ; tolérance
<EMI ID=19.1>
sources de carb.ne, selon la méthode de Pridham et Gottlieb dans J. Bacteriol. 56, pages 107-114 (1948) : bonne utilisation du glycérol,de la salicine, du d-tréhalose et du dextrose ; assez bonne utilisation du 1-inositol ; et utilisation mauvaise ou nulle du d-fructose, du maltose, de l'adonitol, du 1-arabinose, du lactose, du d-mannitol, du d-mélibiose, du d-raffinose, du 1-rhamnose, du saccharose et du d-xylose.
Composition chimique
L'organisme appartient au type IV de parois cellulaires, c'est-à-dire qu'il contient de l'acide méso-diamino-2,6 pimélique et il a une constitution globale des sucres de la cellule du type A,c'est-à-dire il contient de l'arabinose et du galactose. Les extraits de cellule complète méthylés, soumis à la chromatographie gazeuse, présentent des schémas d'acides gras semblables à ceux produits par Nocardia asteroides ATCC 3308. Micromorphologie
Le mycélium aérien s'élève du mycélium de substrat en éléments flexibles moyennement longs, rarement ramifiés, se terminant couramment en spirales primitives allongées.
Les éléments flexibles sont irrégulièrement segmentés en sections elliptiques ou cylindriques courtes (spores ?) qui se désarticulent facilement. Les portions terminales en spirales sont moins nettement segmentées. Les segments
ont en général des dimensions de 0,8 à 1,7 p x 0,3 à 0,5
<EMI ID=20.1>
Diagnostic
Les caractéristiques morphologiques de la culture n[deg.] BM-123 sont difficiles à observer et à interpréter à cause du mauvais développement du mycélium aérien sur la plupart des milieux. En conséquence, on attache une importance considérable, par nécessité, à l'analyse chimique dans la détermination de la relation générique de l'organisme.
Sur la base du système composé par Lechevalier et al., la culture n[deg.] BM-123 contient de l'acide méso-diamino-2,6
<EMI ID=21.1>
sucres montre la présence d'arabtnose et de galactose.
La culture appartient donc au type IV de paroi3 cellulaires.
Une comparaison du diagramme de chromatographie gazeuse
de la culture n[deg.] BM-123 avec celui de Nocardia asteroides , ATCC <3>308 montre que les deux sont remarquablement semblables*
<EMI ID=22.1>
le cadre des Nocardia sent sa croissance aérienne fragmentaire sur certains milieux et l'absence totale
de croissance aérienne sur la plupart des milieux. Au
vu de l'absence de critères adéquats pour la caractérisation de Nocardia au niveau de l'espèce, on n'a pas tenté d'effectuer cette détermination. On considère donc que
la culture n[deg.] BM-123 est une espèce indéterminée de Nocardia., jusqu'à ce qu'un diagnostic soit réalisable.
<EMI ID=23.1>
à cet organisme particulier ou à des organismes répondant complètement aux caractéristiques ci-dessus de croissance et d'examen microscopique,qui ne
sont données qu'à titre d'illustration. En réalité, on peut également utiliser
<EMI ID=24.1>
l'exposition aux rayons X, aux radiations ultraviolettes, à la moutarde azotée aux actinophages, etc. Une culture viable d'une telle souche mutante caractéristique a été déposée au Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Researche and Development Division, United States Department of Agriculture, à Peoria dans l'Illinois,et ajoutée à sa collection permanente sous le n[deg.] NRRL 8050. Bien que les caractéristiques <EMI ID=25.1>
les mêmes que celles de NRRL 5646, il produit pendant la fermentation aérobie des quantités accrues de BM-123 . De même, NRRL 8050 diffère de la souche mère NRRL 5646 par les points suivants : <EMI ID=26.1> b) production d'un pigment de mycélium brun-bois de rose <EMI ID=27.1>
Les nouveaux antibactériens selon l'invention sont en général des solides cristallisés ayant une solubilité relativement limitée
dans les solvants non polaires tels qu'éther éthylique et hexane, mais considérablement plus solubles dans les solvants tels que l'eau et les
<EMI ID=28.1>
isomères de structure et peuvent être représentés par les formules générales suivantes :
<EMI ID=29.1>
<EMI ID=30.1>
<EMI ID=31.1>
former des dérivés de formule générale :
<EMI ID=32.1>
dans laquelle R est un reste de formule :
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
chaîne latérale spermadine pour former des dérivés mono-, di- ou trisubstitués de formules générales suivantes :
<EMI ID=35.1>
dans lesquelles R et IL sont tels que définis ci-dessus.
L'utilité des dérivés alkylés du BM-123 est démontrée
par leur aptitude à combattre les infections générales mortelles chez
les souris. Ces nouvelles substances présentent une activité antibactérienne in vivo élevée chez les souris contre Escherichia coli US 311, lorsqu'on les administre en une seule dose sous-cutanée à des groupes
de souris Carworth Fanas CF-1 pesant environ 20 g, infectées par voie intrapéritonéale avec une dose létale de cette bactérie dans une dilution
<EMI ID=36.1>
5 heures. Le tableau VI ci-après indique l'activité in vivo des produits caractéristiques de l'invention préparés à partir des réactifs carbonylés indiqués, contre Escherichia coli US 311 chez la souris. L'activité est exprimée par la DE 50 c'est-à-dire la dose en mg par kg de poids du
<EMI ID=37.1>
Procédé par fermentation choisi pour produire principalement le BM-123P et le BM-123Y.
<EMI ID=38.1>
dans une grande variété de milieux de culture liquides. Les milieux qui sont utiles pour la production des antibiotiques comprennent une source assimilable de carbone telle qu'amidon, sucre, mélasse, glycérol, etc. et une source assimilable d'azote telle que protéines, hydrolysat de protéines, polypeptides, aminoacides, liqueur de trempage de mats, etc. ; et des anions inorganiques tels que pc -assium, magnésium, calcium, ammonium, sulfate, carbonate, phosphate, chlorure, etc. Des éléments à l'état de traces tels que bore, molybdène, cuivre, etc. sont fournis sous forme d'impuretés des autres constituants du milieu. On réalise l'aération
dans les cuves et bouteilles par circulation forcée d'air stérile à travers le milieu de fermentation ou au-dessus de sa surface. On réalise encore l'agitation dans les cuves au moyen d'un agitateur mécanique à hélice.
On peut ajouter si nécessaire un agent anti-mousse tel que le produit
vendu sous le nom de Hodag FD82.
<EMI ID=39.1>
en flacons agités en inoculant 100 ml de milieu liquide stérile dans des fioles de 500 ml avec des produits de raclage ou de lavage d'une culture sur gélose inclinée. On utilise ordinairement le milieu de composition suivante :
<EMI ID=40.1>
On fait incuber les fioles à une température de 25-29[deg.]C,
<EMI ID=41.1>
pendant 30 à 48 heures. On transfère ensuite les inoculums dans des tubes de culture stériles à bouchon vissant et on les conserve au-dessous de <EMI ID=42.1> de raclage de milieux inclinés pour l'inoculation d'autres fioles agitées dans la préparation de ce premier stade d'inoculum.
On utilise ces inoculums des fioles de premier stade pour ensemencer des échantillons de 12 litres du même milieu dans des fermenteurs en verre de 20 litres. On aère la bouillie d'inoculums avec de l'air stérile,tandis que l'on poursuit la culture pendant 30 à 48 heures.
On utilise les échantillons de 12 litres d'inoculums de deuxième stade pour ensemencer des fermenteurs contenant 300 litres du milieu liquide stérile suivant pour produire l'inoculum de troisième et dernier stade :
<EMI ID=43.1>
On stérilise le glucose séparément.
On aère l'inoculum de troisième stade à raison de 0,4 à
0,8 litre d'air stérile par litre de bouillon par minute et on agite le mélange en fermentation avec un agitateur à hélice tournant à 150-300 tr/mn. On maintient la température à 25-29'C ordinairement 28[deg.]C. On continue la culture pendant 48 à 72 heures, après quoi on utilise l'inoculum pour ensemencer une cuve de fermentation de 3000 litres.
<EMI ID=44.1>
Pour la production du BM-123P et du BM-123y dans des cuves de fermentation, on utilise de préférence le milieu de fermentation suivant :
<EMI ID=45.1>
On stérilise séparément le glucose.
<EMI ID=46.1>
troisième stade préparé comme décrit dans la préparatin de l'inoculum. On maintient la bouillie en fermentation à une température de 25-28[deg.]C, ordinairement 26[deg.]C. On aère la bouillie avec de l'air stérile à raison de 0,3-0,5 litre d'air stérile par litre et par minute et on agite avec un agitateur à hélice tournant à 70-100 tr/mn. On laisse se poursuivre la fermentation entre 65 et 90 heures et on récolte la bouillie.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.
EXEMPLE 1
Préparation de l'inoculum pour le BM-123P et le BM-123
On prépare un milieu caractéristique de composition suivante utilisé pour faire pousser les inoculums de premier et second stades.
<EMI ID=47.1>
<EMI ID=48.1>
milieu stérile ci-dessus avec 5 ml chacun d'un inoculum végétatif congelé de
<EMI ID=49.1>
et on agite vigoureusement pendant 48 heures à 28[deg.]C. On transfère l'inoculum du ballon résultant dans un fermenteur en verre de 18,9 litres contenant
12 litres du milieu stérile ci-dessus. On aère la bouillie avec de l'air stérile tandis que l'on poursuit la culture pendant environ 48 heures, après quoi on utilise le contenu pour ensemencer un fermenteur de
378 litres contenant 300 litres du milieu liquide stérile de composition suivante :
<EMI ID=50.1>
On stérilise séparément le glucose.
On aère la bouillie d'inoculum de troisième stade en faisant barboter de l'air stérile dans le fermenteur à raison de 0,4 litre d'air par litre de bouillie et par minute. L'agitation est obtenue au moyen d'un agitateur à hélice tournant à 240 tr/mn. On maintient la bouillie à 28[deg.]C et on utilise comme agent anti-monsse le produit vendu sous le nom de Hodag FD82. Après une période de croissance de 48 heures, on utilise la bouillie d'inoculum pour ensemencer une fermentation de 3000 litres.
EXEMPLE 2
Fermentation utilisant Nocardia sp. NRRL 8050 et un milieu favorisant la production de BM-123P et de BM-123y
On prépare une milieu de fermentation de composition suivante :
<EMI ID=51.1>
On stérilise séparément le glucose.
On stérilise le milieu de fermentation à 120[deg.]C par la vapeur sous 9 kg pendant 60 minutes. Le pH du milieu après stérilisation est de 6,9. On inocule 3000 litres de milieu stérile dans un fermenteur de 4000 litres avec 300 litres d'inoculum,comme décrit à l'exemple l,et
<EMI ID=52.1>
le produit vendu sous le nom de Hodag FD82. On aère la bouillie à raison de 0,35 litre d'air stérile par litre et par minute. On agite au moyen d'un agitateur à hélice tournant à 70-72 tr/mn. On récolte la bouillie après une durée de fermentation de 67 heures.
EXEMPLE 3
<EMI ID=53.1>
On ajuste à pH 4,0 par l'hydroxyde de sodium une portion de 3000 litres de bouillie de fermentation à pH 4,3 préparée comme décrit
à l'exemple 2 et on filtre en utilisant 5% de terre d'infusoires comme auxiliaire de filtration. On lave le gâteau de filtration avec environ
100 litres d'eau et on le jette. On combine le filtrat et l'eau de lavage et on les envoie par pompage de bas en haut à travers trois colonnes d'acier inoxydable parallèles de 21 cm x 122 cm, contenant chacune 15 litres de gel de résine échangeuse de cations dextra-épichlorhydrine réticulée vendue sous le nom de CM Sephadex C-25 (Na ) par la Société Pharmacia Fine
<EMI ID=54.1>
390 litres d'eau et ensuite on développe avec 200 litres de solution aqueuse <EMI ID=55.1>
clarifié à travers une colonne de verre., 22,8 cm x 152,4 cm contenant
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
la colonne chargée avec 120 litres d'eau et ensuite on développe avec
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
vide entre l'éluat de méthanol aqueux à 15% jusqu'à environ 7 litres d'une phase aqueuse et on ajuste le pH 4,5 6,0 au moyen d'une résine échangeuse d'anions faiblement basique du type polystyrène-polyamine vendue sous
<EMI ID=60.1>
on concentre le filtrat sous vide jusqu'à environ 1 litre et ensuite on lyophilise pour obtenir 38 g d'une substance consistant principalement
<EMI ID=61.1>
On ajuste l'éluat de méthanol aqueux à 50% à pH 4,65-6,0 par la résine Amberlite IR-45 (OH-). On sépare la résine par filtration et on concentre le filtrat sous vide jusqu'à environ 6,3 litres et ensuite on lyophilise pour obtenir 213 g d'une substance consistant principalement en BM 123 y .
<EMI ID=62.1>
pour obtenir 56 g de BM 123y impur.
EXEMPLE 4
Purification ultérieure du BM-123y
<EMI ID=63.1>
<EMI ID=64.1>
diamètre jusqu'à une hauteur de résine d'environ 62 cm. On fait couler l'excès de chlorure d'ammonium aqueux à 2% et on dissout dans un échantillon de 5,0 g de BM-123y préparé comme décrit à l'exemple 3 dans environ 10 ml de chlorure d'ammonium aqueux à 2% et on l'applique sur la colonne. On
élue ensuite la colonne avec 6 litres de chlorure d'ammonium aqueux ayant
<EMI ID=65.1>
par examen de l'effluent de la colonne en lumière ultraviolette et par bioautographie de disques de papier plongés dans l'effluent sur de grandes plaques de gélose ensemencées avec Klebsiella pneumoniae souche AD.
La majeure partie du BM-123 est localisée entre les fractions 71 et 107 incluses.
On met en suspension dans l'eau 130 ml de Darco C-60
<EMI ID=66.1>
et on fait couler l'excès d'eau. On combine les fractions 84 à 96 incluses de la chromatographie sur CM Sephadex ci-dessus et on fait passer sur une colonne de carbone granulaire. On lave la colonne chargée avec 600 si d'eau et ensuite on développe avec 1 litre d'acétone aqueuse à 50%. Les deux éluats contiennent le BM-123 y ; on les concentre sous vide jusqu'à obtenir des phases aqueuses et on lyophilise pour obtenir un total de 886 mg
<EMI ID=67.1>
analytique en soumettant la matière ci-dessus à la répétition du procédé ci -dessus.
L'antibiotique BM-123 y ne possède pas un point de fusion défini, mais la décomposition progressive commence au voisinage de 200[deg.]C. La micro-analyse d'un échantillon équilibré pendant 24 heures dans une atmosphère à 22[deg.]C et 23% d'humidité relative donne les résultats suivants :
<EMI ID=68.1>
séchage : 8,19%. Le BM-l23y dans l'eau donne un maximum d'absorption
<EMI ID=69.1>
<EMI ID=70.1>
870 930, 980 1035, 1105, 1175, 1225, 1300, 1340 1370, 1460, 1510, 1555,
<EMI ID=71.1>
le spectre d'absorption infrarouge standard du BM-123y dans une pastille de KB r.
EXEMPLE 5
<EMI ID=72.1>
On verse une bouillie de CM Sephadex C 25 /Na_7 dans le chlorure de sodium aqueux à 2%, dans une colonne de verre de 2,6 cm de diamètre jusqu'à une hauteur de résine d'environ 70 cm. On fait couler l'excès de chlorure de sodium aqueux à 2% et on dissout un échantillon
<EMI ID=73.1>
et d'autres impuretés, préparé comme décrit à l'exemple 3, dans environ '10 ml de chlorure de sodium aqueux à 2% et on applique la solution sur cette colonne. On élue ensuite la colonne avec 4 litres de chlorure de <EMI ID=74.1>
<EMI ID=75.1>
BM-123y par examen de l'effluent de la colonne en lumière ultraviolette et par bioautographie de disques de papier plongés dans l'effluent sur de grandes plaques de gélose ensemencées avec Klebsiella pneumoniae souche AD. La majeure partie du BM-123y est localisée entre les fractions 64-90 incluses;
<EMI ID=76.1>
<EMI ID=77.1>
blement pur.
On met en suspension dans l'eau 100 ml de Darco G-60 granulaire (0,42-0,84 mm), on transfère dans une colonne de verre, on laisse déposer et on laisse couler l'excès d'eau. On combine les fractions
<EMI ID=78.1>
<EMI ID=79.1>
<EMI ID=80.1>
<EMI ID=81.1>
<EMI ID=82.1>
<EMI ID=83.1>
concentre le filtrat sous vide jusqu'à obtenir une phase aqueuse et on lyophilise pour obtenir 294 mg de BM-123T . 1 amorphe blanc sous forme du chlorhydrate.
L'antibiotique BM-123 y. ne possède pas un point de fusion défini,mais la décomposition progressive commence au voisinage de 200[deg.]C.
La mi.croanalyse d'un échantillon équilibré pendant 24 heures dans une
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
dans l'eau).
L'antibiotique BK-123Y 1 présente les absorptions carac- téristiques suivantes dans l'infrarouge : 770 830, 870, 930, 980, 1045, 1080,
1110, 1125, 1175, 1225, 1305, 1345 1380, 1465, 1615, 1560, 1605, 1660, 1730,
2950 et 3350 cm . La figure 2 du dessin annexé représente un spectre
<EMI ID=87.1>
La figure 4 du dessin annexé représente un spectre de résonance magnétique <EMI ID=88.1>
lourde au moyen d'un spectromètre fonctionnant à 100 mégacycles.
EXEMPLE 6
Isolement du BM-123 y
14
<EMI ID=89.1>
et du BM-123�, préparé comme décrit a l'exemple 3, et on l'applique sur
<EMI ID=90.1>
aqueuse de chlorure de sodium ayant un gradient de 2% à 4%.Les 12 premier:
litres d'éluat sont recueillis dans une grande bouteille et jetés. Ensuite, on recueille automatiquement des fractions d'environ 800 ml toutes les
40 minutes. On localise l'antibiotique BM-123y en examinant les fractions de la colonne en lumière ultraviolette. La majeure partie du BM-123y est comprise entre les fractions 7 et 18 incluses ; les fractions initiales
(7 à 15) contiennent du BM-123Y- sensiblement pur et les dernières frac-
<EMI ID=91.1>
On met en suspension dans l'eau 600 ml de Darco G-60 granulaire (0,42-0,84 mm), on transfère dans une colonne de verre, on laisse déposer et on laisse couler l'excès d'eau. On combine les fractions
<EMI ID=92.1>
les fait passer à travers la colonne de carbone granulaire. On lave
la colonne chargée avec 3 litres d'eau et ensuite on développe avec
3 litres de méthanol aqueux à 107.,puis 6 litres de méthanol aqueux à 50%. On ajuste l'éluat de méthanol aqueux à 107. à pH 5,8-6,0 par la résine Amberlite IR-45 (OR-). On sépare la résine par filtration et on concentre le filtrat sous vide jusqu'à une phase aqueuse et on lyophilise pour
<EMI ID=93.1>
ajuste l'éluat de méthanol aqueux à Sa% à pH 4,6-6,1 par la résine
<EMI ID=94.1>
le filtrat sous vide jusqu'à une phase aqueuse et on lyophilise pour obtenir 3,645 g de BM-123y2 sous forme de chlorhydrate amorphe blanc légèrement moins pur.
<EMI ID=95.1>
<EMI ID=96.1>
La microanalyse d'un échantillon équilibré pendant 24 heures dans une
<EMI ID=97.1> séchage 10,87%. Dans le méthanol, le BM-123y2 donne un maximum d'absorption <EMI ID=98.1>
dans l'eau).
<EMI ID=99.1>
téristiques suivantes dans l'infrarouge : 770, 830, 870, 950, 980, 1035,
1110, 1175, 1225, 1235, 1345, 1380, 1470, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755,
<EMI ID=100.1> au moyen d'un spectromètre fonctionnant à 100 mégacycles.
EXEMPLE 7
Distribution sur papier et chromatographie sur couche mince du BM-123P et du BM-123y
On peut distinguer les antibiotiques BM-123 par chromatographie sur papier. A cet effet, on asperge des bandes de papier Whatman
<EMI ID=101.1>
équilibre pendant 1 à 2 heures en présence des phases inférieure et supérieure. On développe les bandes pendant une nuit avec la phase infé-
<EMI ID=102.1>
eau (100:25:4:4:75 en volume). On sépare les bandes développées de la
<EMI ID=103.1>
les lave à l'éther pour séparer le phénol résiduel et on les soumet à la bioautographie sur de grandes plaques de gélose ensemencées avec Klebsiella pneumoniae souche AD. Les valeurs de Rf représentatives sont indiquées dans le tableau VII ci-après.
Le constituant P est un mélange de deux antibiotiques .lorsqu'on utilise ce système. Le BM-123� est constitué d'un antibiotique <EMI ID=104.1>
quantité (Rf - 0,70) dénommé BM-123�2.
On peut également distinguer les antibiotiques BM-123 par chromatographie sur couche mince. A cet effet, on dépose des gouttes d'une solution aqueuse de la substance à chromatographier (environ 20 à 40 y par tache) sur des plaques de Cellulose en couche épaisse vendues par la Société EM Laboratories Inc. Elmsford, New York, sous le non de Cellulose pré-enduite F (0,10 mm d'épaisseur). On développe les plaques pendant une nuit avec le mélange solvant n-butanol-eau-pyridine-acide acétique 15:2:10:1 en volume. On
sépare les plaques développées de la chambre chromatographique et on les sèche à l'air pendant environ 1 heure. On décèle les antibiotiques en utilisant la ninhydrine ou le réactif de Sakaguchi en pulvérisation. Les valeurs caractéristique!) de Rf sont indiquées dans le tableau VIII ci-après.
Le BM-123� et le BM-123y sont tous deux des mélanges de deux constituants lorsqu'on utilise ce système. Le BM-123� est constitué d'un composant prépondérant Rf 0,08 qui est le BM-123�1 et un composant
A une solution agitée de 100 mg d'antibiotique BM-123y dans
20 ml de méthanol, on ajoute 5 ml (ou 5 g) de l'aldéhyde approprié ou de la cétone appropriée et 100 mg de cyanoborohydrure de sodium. On maintient le pH de la solution résultante à environ 7,0 par le chlorure d'hydrogène
<EMI ID=105.1>
EXEMPLE 8
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
On filtre ensuite le mélange de réaction et on évapore le filtrat à siccité. On triture le résidu avec 3 ml de méthanol et on filtre. On dilue le filtrat avec 50 ml d'acétone et on sépare par filtration le précipité formé et on le sèche. On peut remplacer le méthanol utilisé comme solvant par
20 ml d'eau chaque fois que l'aldéhyde ou la cétone de départ est soluble dans l'eau.
EXEMPLE 9
<EMI ID=108.1>
solution aqueuse à 37% de formaldéhyde dans 50 ml d'eau, on ajoute,par .portions, 400 mg de cyanoborohydrure de sodium. On maintient le mélange de <EMI ID=109.1>
On agite le mélange de réaction pendant encore 10 minutes, à la température ambiante, puis on l'évapore à siccité sous vide. On triture le résidu
avec 20 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 250 ml d'acétone. On sépare le filtration le produit précipité et on le sèche. Rendement : 667 mg.
EXEMPLE 10
Préparation de l'isopropyl-BM-123y
A une solution de 200 mg de BM-123y dans 30 ml de méthanol, on ajoute 5 ml d'acétone. On ajoute à cette solution 139 mg de <EMI ID=110.1> ambiante pendant 30 minutes. Pendant cette durée on maintient le mélange de réaction à pH 7,4-7,8 par addition de chlorure d'hydrogène méthanolique
<EMI ID=111.1>
formée et on évapore le filtrat à siccité sous vide. On triture le résidu avec 2 ml de méthanol et on filtre. On dilue le filtrat avec 100 ml d'acétone, on sépare par filtration le produit solide qui se sépare et on sèche ; rendement : 184 mg.
EXEMPLE 11
<EMI ID=112.1>
A une solution de 200 mg de BM-123y dans 15 ml d'eau
,et 25 ml d'acétonitrile, on ajoute une solution de 2 ml de phénylacétaldéhyde' dans 4 ml d'éthanol. On ajoute 103 mg de cyanoborohydrure de sodium. On agite le mélange de réaction à la température ambiante pendant 30 minutes,
en maintenant le pH du mélange à 7 par l'acide chlorhydrique 0,2N. On filtre ensuite le mélange de réaction et on évapore le filtrat à siccité sous vide. On triture le résidu avec 2 ml de méthanol et on filtre. On dilue le filtrat avec 100 ml d'acétone et on sépare par filtration le produit qui s'est séparé et on le sèche ; rendement : 180 mg.
EXEMPLE 12
Préparation du (triméthyl-1.3.3 butyl)-BM-l23y
A une solution de 200 mg de chlorhydrate de BM-123y dans
50 ml de méthanol, on ajoute 3 ml de diméthyl-4,4 pentanone-2 et 106 mg de
<EMI ID=113.1>
en ajoutant goutte à goutte du chlorure d'hydrogène méthanolique. On agite le mélange de réaction à la température ambiante pendant 18 heures et on filtre. On évapore le filtrat à siccité sous vide. On dissout le résidu dans 3 ml de méthanol, on dilue avec 50 ml d'acétone et on filtre; rendement : 125 mg.
EXEMPLE 13
Préparation du(méthyl-l phénéthyl)-BM-123y
A une solution de 200 mg de BM-123Y dans 50 ml de méthanol, on ajoute 5 ml de phénylacétone. A cette solution on ajoute 170 mg de cyanoborohydrure de sodium et on agite le mélange de réaction à la température ambiante pendant 3 heures 1/2. Pendant cette durée, on maintient le pH du mélange de réaction à 7,0 par le méthanol saturé de gaz chlorhydrique. On concentre le mélange de réaction jusqu'à environ 5 ml, on dilue par 2 ml <EMI ID=114.1> de méthanol et on filtre. On verse le filtrat dans 100 ml d'acétone et
on sépare par filtration le produit solide qui se sépare et on sèche; rendement : 233 mg.
EXEMPLE 14
Préparation du (méthyl-1 nonyl)-BM-123y
On ajoute 100 mg de cyanoborohydrure de sodium à une solution de 200 mg de BM-123y et 1 ml de décanone-2 dans 40 ml de méthanol.
<EMI ID=115.1>
19 heures 1/2, on filtre le mélange de réaction et on concentre le filtrat
<EMI ID=116.1>
On ajoute le filtrat à 50 ml d'acétone. On recueille par filtration le
<EMI ID=117.1>
vide. Rendement en (méthyl-1 nonyl)-BM-123y brut : 167 mg.
EXEMPLE 15
Préparation du (diméthyl-1.3 butyl)-BM-123y
A une solution de 210 mg de BM-123Y dans 50 ml de méthanol, on ajoute 5 ml de méthylisobutylcétone. A cette solution on ajoute 166 mg de cyanoborohydrure de sodium et on agite le mélange de réaction à la température ambiante pendant 5 heures. Pendant cette durée, on maintient le pH du mélange de réaction à 7,0 par le méthanol saturé de
<EMI ID=118.1>
On triture le résidu avec 2 ml de méthanol et on filtre. On dilue le filtrat avec 100 ml d'acétone et on sépare par filtration le produit solide qui s'est séparé et on sèche ; rendement : 210 mg.
EXEMPLE 16
<EMI ID=119.1>
On ajoute 100 mg de cyanoborohydrure de sodium a une solution de 200 mg de BM-123y et 400 mg de norbornanone-2 dans 40 ml de
<EMI ID=120.1>
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
dans 5 ml de méthanol et on filtre. On ajoute le filtrat à 50 ni d'acétone. On recueille par filtration le solide blanc sale qui précipite, on le lave
<EMI ID=123.1>
EXEMPLE 17
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
on dilue la solution résultant* avec 50 ml d'acétone ; rendement : 49 mg.
EXEMPLE 18
<EMI ID=126.1>
On agite a la température ambiante pendant 40 minutes,
<EMI ID=127.1>
gène. On filtre le mélange et on évapore.. siccité sous vide. On triture le résidu avec 5 ml de méthanol et on dilue la solution résultante avec 50 ml d'acétone ; rendement : 46 mg.
EXEMPLE 19
<EMI ID=128.1>
On agite à la température ambiante pendant 3 heures et
<EMI ID=129.1>
170 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol. Pendant cette
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1>
évapore le mélange a siccité sous vide. On triture le résidu avec 5 ml de méthanol et on dilue la solution méthanolique résultante avec environ
50 ml d'acétone; rendement : 233 mg.
EXEMPLE 20
<EMI ID=132.1>
On conserve à la température ambiante pendant 18 heures, une solution de 200 mg de BM-123y, 3 ml 'd'éthyl-2 cyclopentanone et 101 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol. Pendant cette durée,
<EMI ID=133.1>
de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On évapore le mélange de réaction
<EMI ID=134.1>
le filtrat avec 40 ml d'acétone; rendement : 157 mg.
EXEMPLE 21
<EMI ID=135.1>
saturée de chlorure d'hydrogène dans ie méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec
40 ml d'acétone ; rendement : 200 mg.
<EMI ID=136.1>
<EMI ID=137.1>
une solution de 206 mg de BM-123y, 3 ml de diméthyl-2,4 cyclopentanone et
104 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol, Pendant cette durée, on maintient le pH de la solution à 7 par addition d'une solution saturée de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec
40 ml d'acétone ; rendement : 101 mg.
EXEMPLE 23
<EMI ID=138.1>
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
de cyanoborohydrure de sodium chus 50 ml de méthanol. Pendant cette durée
on maintient le pH de la solution à 7 par addition de chlorure d'hydrogène saturé dans le méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 40 ml d'acétone; rendement :
200 mg. EXEMPLE 24
<EMI ID=141.1>
On conserve à la température ambiante pendant 2 heures,
<EMI ID=142.1>
200 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol. Pendant cette durée, on maintient le pH de la solution à 7 par addition d'une solution saturée de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 40 ml d'acétone ; rendement : 200 mg.
EXEMPLE 25
<EMI ID=143.1>
saturée de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 40 ml d'acétone ; rendement : 176 mg.
EXEMPLE 26
<EMI ID=144.1>
On conserve à la température ambiante pendant 4 heures, une solution de 200 mg de BM-123y, 3 ml de propyl-2 cyclohexanone et
157 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol. pendant cette
<EMI ID=145.1>
saturée de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On triture le mélange de réactionnel avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 40 ml d'acétone ; rendement : 75 mg.
EXEMPLE 27
<EMI ID=146.1>
On conserve à la température ambiante pendant 3 heures 1/2,
<EMI ID=147.1>
de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol. Pendant cette durée, on maintient le pH de la solution à 7 par addition d'une solution saturée de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 40 ml d'acétone : rendement : 157 mg.
<EMI ID=148.1>
<EMI ID=149.1>
<EMI ID=150.1>
<EMI ID=151.1>
TABLEAU II
Micromorphologie de Nocardia sp. NRRL 5646
<EMI ID=152.1>
<EMI ID=153.1>
<EMI ID=154.1>
TABLEAU IV
Diagramme d'utilisation des sources de carbone par Nocardia sp. NRRL 5646
Incubation : 10 jours Température :,32[deg.]C
<EMI ID=155.1>
<EMI ID=156.1>
2 - assez bonne
1 - mauvaise
0 -pas d'utilisation
TABLEAU V
<EMI ID=157.1>
<EMI ID=158.1>
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
<EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
<EMI ID=166.1>
<EMI ID=167.1>
<EMI ID=168.1>
<EMI ID=169.1>
<EMI ID=170.1>
<EMI ID=171.1>
<EMI ID=172.1>
<EMI ID=173.1>
<EMI ID=174.1>
<EMI ID=175.1>
<EMI ID=176.1>
TABLEAU VII
<EMI ID=177.1>
TABLEAU VIII
<EMI ID=178.1>
Alkyl derivatives of the antibiotic BM-123 and
Process for their preparation The present invention relates to a new group of antibiotics and more particularly to a new series of powerful antibacterial agents derived by reductive alkylation of the antibiotic BM-123Y by means of an aldehyde of general formula:
<EMI ID = 1.1>
<EMI ID = 2.1>
halo lower alkyl, lower alkenyl, phenyl, monosubstituted phenyl, lower phenylalkyl, furyl-2, methylfuryl-2, thienyl-2,
<EMI ID = 3.1>
or a ketone of the general formula:
<EMI ID = 4.1>
wherein R2 is lower alkyl, halo lower alkyl, or phenyl lower alkyl and R3 is lower alkyl, halo lower alkyl, lower alkenyl, lower cycloalkyl, phenyl, monosubstituted phenyl, lower phenylalkyl, or (monosubstituted phenyl) lower alkyl; or R and R3 taken together represent a group
<EMI ID = 5.1>
suitable lower and halo lower alkyls according to the invention are those having up to 6 carbon atoms in which the halogen is exemplified by chlorine, bromine and iodine, such as methyl, ethyl, isopropyl, sec-butyl, n-amyl, dichloromethyl, 2-bromoethyl, 2,3-diiodo propyl, y-chloropropyl, etc. Suitable lower alkenyl groups are those having up to 4 carbon atoms such as vinyl, allyl, propenyl, isopropenyl, buten-1 yl, butene-2 yl, butene-3 yl,. isobutenyl, etc. Suitable lower cycloalkyl groups are cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl.
Suitable monosubstituted phenyl groups according to the invention are for example p-acetamidophenyl, m-nitrophenyl, m-mercaptophenyl, o-anisyl, p-anisyl, o-tolyl, p-tolyl, etc., while lower phenylalkyl groups are illustrated by benzyl, α-phenylethyl and P-phenylethyl groups.
The lower (monosubstituted phenyl) -alkyl groups may be
<EMI ID = 6.1>
1,3,4-thyl-2-pyrryl, etc.
The reductive alkylation process for preparing? the new antibacterial agents according to the invention is used
<EMI ID = 7.1>
<EMI ID = 8.1>
cellosolve or mixtures thereof, then an excess of the aldehyde or
<EMI ID = 9.1>
<EMI ID = 10.1>
the reduction. The pH of the reaction mixture is maintained at 6.0-8.0 using dilute inorganic acid during the reaction. After 1 to
<EMI ID = 11.1>
Reaction to dryness in vacuo, the residue is triturated with methanol and filtered. The filtrate is diluted with acetone and separated by filtration.
<EMI ID = 12.1>
The aldehydes which can thus be used in the process
of the invention are for example the following compounds: acetaldehyde, propionaldehyde, butyraldehyde, isobutyraldehyde, crotonaldehyde, valeraldehyde, benzaldehyde, p-cyanobenzaldehyde, salicylaldehyde, cinnamaldehyde, trichloroacetaldehyde, etc. The ketones which can thus be used in the process of the invention are, for example, the following compounds: acetone, butanone-2, dibromo-1,3-acetone, chloroacetone, acetophenone, m-chloroaceto.
<EMI ID = 13.1>
phenone, p-dimethylaminoacetophenone, etc.
The products are obtained from the reductive alkylation reaction mixtures by conventional techniques such as precipitation, concentration, solvent extraction or combinations of these techniques. After isolation, the products can be purified by any of the generally known purification techniques. These include recrystallization from various solvents and solvent mixtures, chromatographic techniques and countercurrent partitioning, all of which are commonly used for this purpose.
The new antibacterial agents according to the invention are organic bases and are therefore capable of forming acid addition salts with various organic and inorganic salt-forming reagents. Thus, acid addition salts are obtained formed by mixing the free base antibacterial with up to three equivalents of an acid, advantageously in a neutral solvent, with acids such as sulfuric, phosphoric, hydrochloric acids. , hydrobromic, sulfamic, citric, maleic, fumaric, tartaric, acetic, benzotic, gluconic, ascorbic and the like. The acid addition salts of the antibacterials according to the invention are generally crystalline solids relatively soluble in water,
<EMI ID = 14.1>
nonpolar organic products such as diethyl ether, benzene, toluene, and the like. For the purposes of the invention, the free bases of antibacrériens are equivalent to their addition salts of non-toxic acids.
<EMI ID = 15.1>
<EMI ID = 16.1>
new strain of an undetermined species of Nocardia. This new antibiotic-producing strain was isolated from a sample of garden soil collected in Oceola, Iowa, and is held in the collection of the Lederle Laboratories Division of the Claimant Company in Pearl River, New York. , under the designation Culture n [deg.] BM-123. A viable culture of the new microorganism has been deposited in the Culture Collection Laboratory, Northern Usage Researche and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Ill. And has been added to its permanent collection. It is freely accessible to the public under the number [deg.] NRRL 5646. In the present description, we
<EMI ID = 17.1>
The following is a general description of the microorganism Nocardia sp., NRRL 5646, based on the diagnostic characteristics observed. The culture, physiological and morphological characteristics of the organism were observed according to the techniques described in detail by Shirling and Gottlieb in Internat. Journ. of Syst. Bacteriol. 16, pages 213-240 (1966). The chemical composition of the culture was determined by the techniques indicated by Lechevalier et al., In Advan. Appl. Microbiol. 14, pages 47-72
(1971). Underlined descriptive colors and color designations were borrowed from Jacobson et al., Color Harmony Manual, 3rd Edition
(1948), Container Corp. of America, Chicago, Illinois. Descriptive details
<EMI ID = 18.1>
Growth
Moderate on yeast extract, asparaginedextrose, Benedict, Bennett, potato-dextrose and Weinstein agars; light on Hickey and Transner agar, tomato paste, oatmeal, and food;
and traces of growth on agar with inorganic starch salts, Kuster's oatmeal, Czapek's solution and rice.
Aerial mycelium
Whitish aerial mycelium if there is any; produced only on yeast extract, asparagine dextrose, Benedict, Bennett and potato-dextrose agars. Soluble pigments
No production of soluble pigments. Reverse color
Colorless to yellowish shades.
Various physiological reactions
No gelatin liquefaction; reduction of nitrates to nitrites in 7 days; no formation of melanotic pigments on peptone-iron agars; no peptonization or curd in bromocresol purple milk; tolerance
<EMI ID = 19.1>
sources of carbon, according to the method of Pridham and Gottlieb in J. Bacteriol. 56, pages 107-114 (1948): good use of glycerol, salicin, d-trehalose and dextrose; fairly good use of 1-inositol; and poor or no use of d-fructose, maltose, adonitol, 1-arabinose, lactose, d-mannitol, d-melibiose, d-raffinose, 1-rhamnose, sucrose and d-xylose.
Chemical composition
The organism belongs to cell wall type IV, that is, it contains 2,6-meso-diamino-pimelic acid and it has an overall constitution of cell-type A sugars, c that is, it contains arabinose and galactose. Methylated whole cell extracts, subjected to gas chromatography, show fatty acid patterns similar to those produced by Nocardia asteroides ATCC 3308. Micromorphology
Aerial mycelium arises from the substrate mycelium in moderately long, rarely branched flexible elements, commonly terminating in elongated primitive spirals.
The flexible elements are irregularly segmented into elliptical or short cylindrical sections (spores?) Which are easily disarticulated. The spiral end portions are less sharply segmented. Segments
generally have dimensions of 0.8 to 1.7 '' x 0.3 to 0.5
<EMI ID = 20.1>
Diagnostic
The morphological characteristics of culture n [deg.] BM-123 are difficult to observe and interpret because of the poor development of the aerial mycelium on most media. Consequently, considerable importance is attached, by necessity, to chemical analysis in determining the generic relationship of the organism.
Based on the system composed by Lechevalier et al., Culture n [deg.] BM-123 contains 2,6-meso-diamino acid
<EMI ID = 21.1>
sugars shows the presence of arabtnose and galactose.
The culture therefore belongs to type IV cell wall3.
A comparison of gas chromatography diagram
of culture n [deg.] BM-123 with that of Nocardia asteroides, ATCC <3> 308 shows that the two are remarkably similar *
<EMI ID = 22.1>
the frame of Nocardia feels its fragmentary aerial growth on certain environments and the total absence
aerial growth in most environments. At
Due to the lack of adequate criteria for characterizing Nocardia at the species level, no attempt was made to make this determination. We therefore consider that
culture n [deg.] BM-123 is an undetermined species of Nocardia., until a diagnosis can be made.
<EMI ID = 23.1>
to that particular organism or to organisms completely meeting the above characteristics of growth and microscopic examination, which do not
are given for illustration only. In fact, we can also use
<EMI ID = 24.1>
exposure to x-rays, ultraviolet radiation, nitrogen mustard, actinophages, etc. A viable culture of such a characteristic mutant strain has been deposited in the Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Researche and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Ill., And added to its permanent collection under no. ] NRRL 8050. Although the characteristics <EMI ID = 25.1>
the same as those of NRRL 5646, during aerobic fermentation it produces increased amounts of BM-123. Likewise, NRRL 8050 differs from parent strain NRRL 5646 in the following points: <EMI ID = 26.1> b) production of a brown-rosewood mycelium pigment <EMI ID = 27.1>
The new antibacterials according to the invention are generally crystalline solids having relatively limited solubility.
in nonpolar solvents such as ethyl ether and hexane, but considerably more soluble in solvents such as water and
<EMI ID = 28.1>
structural isomers and can be represented by the following general formulas:
<EMI ID = 29.1>
<EMI ID = 30.1>
<EMI ID = 31.1>
form derivatives of general formula:
<EMI ID = 32.1>
in which R is a residue of formula:
<EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
spermadine side chain to form mono-, di- or trisubstituted derivatives of the following general formulas:
<EMI ID = 35.1>
in which R and IL are as defined above.
The utility of BM-123 alkyl derivatives is demonstrated
by their ability to fight fatal systemic infections in
mice. These new substances exhibit high in vivo antibacterial activity in mice against Escherichia coli US 311 when administered as a single dose subcutaneously to groups
of Carworth Fanas CF-1 mice weighing about 20 g, infected intraperitoneally with a lethal dose of this bacterium in a dilution
<EMI ID = 36.1>
5 hours. Table VI below indicates the in vivo activity of the characteristic products of the invention prepared from the carbonyl reagents indicated, against Escherichia coli US 311 in mice. The activity is expressed by the ED 50, i.e. the dose in mg per kg of body weight.
<EMI ID = 37.1>
Fermentation process chosen to primarily produce BM-123P and BM-123Y.
<EMI ID = 38.1>
in a wide variety of liquid culture media. Media which are useful for the production of antibiotics include an assimilable source of carbon such as starch, sugar, molasses, glycerol, etc. and an assimilable source of nitrogen such as protein, protein hydrolyzate, polypeptides, amino acids, mate steep liquor, etc. ; and inorganic anions such as pc -assium, magnesium, calcium, ammonium, sulfate, carbonate, phosphate, chloride, etc. Elements in trace amounts such as boron, molybdenum, copper, etc. are supplied as impurities of the other constituents of the medium. Aeration is carried out
in vats and bottles by forced circulation of sterile air through the fermentation medium or above its surface. Stirring is still carried out in the tanks by means of a mechanical propeller stirrer.
If necessary, an anti-foaming agent such as the product can be added.
sold under the name Hodag FD82.
<EMI ID = 39.1>
in shake vials by inoculating 100 ml of sterile liquid medium into 500 ml vials with scrapings or washings from a slant agar culture. Usually the medium of the following composition is used:
<EMI ID = 40.1>
The flasks are incubated at a temperature of 25-29 [deg.] C,
<EMI ID = 41.1>
for 30 to 48 hours. The inocula are then transferred to sterile, screw-top culture tubes and stored below <EMI ID = 42.1> scraping slant media for inoculation of other shake flasks in preparation for this first stage of 'inoculum.
These first stage vial inocula are used to inoculate 12 liter samples of the same medium in 20 liter glass fermenters. The inocula slurry is aerated with sterile air, while the cultivation is continued for 30 to 48 hours.
The 12 liter samples of second stage inocula are used to inoculate fermenters containing 300 liters of the following sterile liquid medium to produce the third and final stage inoculum:
<EMI ID = 43.1>
Glucose is sterilized separately.
The third stage inoculum is aerated at a rate of 0.4 to
0.8 liters of sterile air per liter of broth per minute and the fermenting mixture is stirred with a propeller stirrer rotating at 150-300 rpm. The temperature is maintained at 25-29 ° C, usually 28 [deg.] C. Cultivation is continued for 48 to 72 hours, after which the inoculum is used to inoculate a 3000 liter fermentation tank.
<EMI ID = 44.1>
For the production of BM-123P and BM-123y in fermentation tanks, the following fermentation medium is preferably used:
<EMI ID = 45.1>
The glucose is separately sterilized.
<EMI ID = 46.1>
third stage prepared as described in the preparation of the inoculum. The fermenting slurry is maintained at a temperature of 25-28 [deg.] C, usually 26 [deg.] C. The slurry is aerated with sterile air at the rate of 0.3-0.5 liters of sterile air per liter per minute and stirred with a propeller stirrer rotating at 70-100 rpm. The fermentation is allowed to continue between 65 and 90 hours and the porridge is harvested.
The following examples illustrate the invention without, however, limiting its scope.
EXAMPLE 1
Preparation of the inoculum for BM-123P and BM-123
A characteristic medium of the following composition is prepared which is used to grow the first and second stage inocula.
<EMI ID = 47.1>
<EMI ID = 48.1>
sterile medium above with 5 ml each of a frozen vegetative inoculum of
<EMI ID = 49.1>
and stirred vigorously for 48 hours at 28 [deg.] C. The inoculum from the resulting flask was transferred to an 18.9 liter glass fermenter containing
12 liters of the above sterile medium. The slurry is aerated with sterile air while cultivation is continued for about 48 hours, after which the contents are used to inoculate a fermenter.
378 liters containing 300 liters of sterile liquid medium of the following composition:
<EMI ID = 50.1>
The glucose is separately sterilized.
The third stage inoculum slurry is aerated by bubbling sterile air through the fermenter at the rate of 0.4 liters of air per liter of slurry per minute. Stirring is obtained by means of a propeller stirrer rotating at 240 rpm. The slurry is maintained at 28 [deg.] C and the product sold under the name Hodag FD82 is used as an anti-monsse agent. After a 48 hour growth period, the inoculum slurry is used to seed a 3000 liter fermentation.
EXAMPLE 2
Fermentation using Nocardia sp. NRRL 8050 and a medium favoring the production of BM-123P and BM-123y
A fermentation medium of the following composition is prepared:
<EMI ID = 51.1>
The glucose is separately sterilized.
The fermentation medium is sterilized at 120 [deg.] C by steam under 9 kg for 60 minutes. The pH of the medium after sterilization is 6.9. 3000 liters of sterile medium are inoculated into a 4000 liter fermenter with 300 liters of inoculum, as described in Example 1, and
<EMI ID = 52.1>
the product sold as Hodag FD82. The slurry is aerated at a rate of 0.35 liters of sterile air per liter per minute. Stirred by means of a propeller stirrer rotating at 70-72 rev / min. The slurry is harvested after a fermentation period of 67 hours.
EXAMPLE 3
<EMI ID = 53.1>
A 3000 liter portion of fermentation slurry at pH 4.3 prepared as described is adjusted to pH 4.0 with sodium hydroxide.
in Example 2 and filtered using 5% diatomaceous earth as the filter aid. The filter cake is washed with approximately
100 liters of water and we throw it away. The filtrate and wash water are combined and pumped from bottom to top through three parallel 21 cm x 122 cm stainless steel columns, each containing 15 liters of extra-epichlorohydrin cation exchange resin gel. crosslinked sold under the name CM Sephadex C-25 (Na) by the company Pharmacia Fine
<EMI ID = 54.1>
390 liters of water and then it is developed with 200 liters of aqueous solution <EMI ID = 55.1>
clarified through a glass column., 22.8 cm x 152.4 cm containing
<EMI ID = 56.1>
<EMI ID = 57.1>
column loaded with 120 liters of water and then developed with
<EMI ID = 58.1>
<EMI ID = 59.1>
vacuum enters the eluate of 15% aqueous methanol to about 7 liters of an aqueous phase and the pH 4.5 6.0 is adjusted by means of a weakly basic anion exchange resin of the polystyrene-polyamine type sold under
<EMI ID = 60.1>
the filtrate is concentrated in vacuo to about 1 liter and then freeze-dried to obtain 38 g of a substance consisting mainly
<EMI ID = 61.1>
The eluate of 50% aqueous methanol is adjusted to pH 4.65-6.0 with Amberlite IR-45 (OH-) resin. The resin was filtered off and the filtrate was concentrated in vacuo to about 6.3 liters and then freeze-dried to obtain 213 g of a substance consisting mainly of BM 123 y.
<EMI ID = 62.1>
to obtain 56 g of impure BM 123y.
EXAMPLE 4
Further purification of BM-123y
<EMI ID = 63.1>
<EMI ID = 64.1>
diameter up to a resin height of about 62 cm. The excess 2% aqueous ammonium chloride is run off and dissolved in a 5.0 g sample of BM-123y prepared as described in Example 3 in about 10 ml of 2% aqueous ammonium chloride. % and apply it to the column. We
then elutes the column with 6 liters of aqueous ammonium chloride having
<EMI ID = 65.1>
by examination of the column effluent in ultraviolet light and by bioautography of paper discs immersed in the effluent on large agar plates seeded with Klebsiella pneumoniae strain AD.
Most of the BM-123 is located between fractions 71 and 107 inclusive.
130 ml of Darco C-60 are suspended in water
<EMI ID = 66.1>
and run off the excess water. Combine fractions 84 to 96 inclusive from the above CM Sephadex chromatography and pass through a granular carbon column. The loaded column was washed with 600 µl of water and then developed with 1 liter of 50% aqueous acetone. Both eluates contain BM-123 y; concentrated in vacuo to obtain aqueous phases and lyophilized to obtain a total of 886 mg
<EMI ID = 67.1>
analytical by subjecting the above material to repeating the above process.
Antibiotic BM-123 γ does not have a definite melting point, but progressive decomposition begins around 200 [deg.] C. Microanalysis of a sample equilibrated for 24 hours in an atmosphere at 22 [deg.] C and 23% relative humidity gives the following results:
<EMI ID = 68.1>
drying: 8.19%. BM-l23y in water gives maximum absorption
<EMI ID = 69.1>
<EMI ID = 70.1>
870 930, 980 1035, 1105, 1175, 1225, 1300, 1340 1370, 1460, 1510, 1555,
<EMI ID = 71.1>
the standard infrared absorption spectrum of BM-123y in a KB r pellet.
EXAMPLE 5
<EMI ID = 72.1>
A slurry of CM Sephadex C 25 / Na_7 in 2% aqueous sodium chloride is poured into a glass column 2.6 cm in diameter to a resin height of about 70 cm. Pour off excess 2% aqueous sodium chloride and dissolve a sample
<EMI ID = 73.1>
and other impurities, prepared as described in Example 3, in about 10 ml of 2% aqueous sodium chloride and the solution is applied to this column. The column is then eluted with 4 liters of chloride of <EMI ID = 74.1>
<EMI ID = 75.1>
BM-123y by examination of the column effluent in ultraviolet light and by bioautography of paper discs immersed in the effluent on large agar plates seeded with Klebsiella pneumoniae strain AD. Most of the BM-123y is localized between fractions 64-90 inclusive;
<EMI ID = 76.1>
<EMI ID = 77.1>
bluntly pure.
100 ml of granular Darco G-60 (0.42-0.84 mm) are suspended in water, transferred to a glass column, allowed to settle and the excess water is allowed to flow. We combine the fractions
<EMI ID = 78.1>
<EMI ID = 79.1>
<EMI ID = 80.1>
<EMI ID = 81.1>
<EMI ID = 82.1>
<EMI ID = 83.1>
Concentrate the filtrate in vacuo to obtain an aqueous phase and lyophilize to obtain 294 mg of BM-123T. 1 white amorphous in the form of the hydrochloride.
Antibiotic BM-123 y. does not have a definite melting point, but gradual decomposition begins around 200 [deg.] C.
The mi.croanalysis of a sample equilibrated for 24 hours in a
<EMI ID = 84.1>
<EMI ID = 85.1>
<EMI ID = 86.1>
in water).
Antibiotic BK-123Y 1 has the following characteristic absorptions in the infrared: 770 830, 870, 930, 980, 1045, 1080,
1110, 1125, 1175, 1225, 1305, 1345 1380, 1465, 1615, 1560, 1605, 1660, 1730,
2950 and 3350 cm. Figure 2 of the accompanying drawing shows a spectrum
<EMI ID = 87.1>
Figure 4 of the attached drawing represents a magnetic resonance spectrum <EMI ID = 88.1>
heavy using a spectrometer operating at 100 megacycles.
EXAMPLE 6
Isolation of BM-123 y
14
<EMI ID = 89.1>
and BM-123 �, prepared as described in Example 3, and applied to
<EMI ID = 90.1>
aqueous sodium chloride having a gradient of 2% to 4%. The first 12:
liters of eluate are collected in a large bottle and discarded. Subsequently, fractions of about 800 ml are automatically collected every
40 minutes. Antibiotic BM-123y is localized by examining the column fractions in ultraviolet light. Most of the BM-123y is between fractions 7 and 18 inclusive; initial fractions
(7 to 15) contain substantially pure BM-123Y- and the last frac-
<EMI ID = 91.1>
600 ml of granular Darco G-60 (0.42-0.84 mm) are suspended in water, transferred to a glass column, allowed to settle and the excess water is allowed to flow. We combine the fractions
<EMI ID = 92.1>
passes them through the granular carbon column. We wash
column loaded with 3 liters of water and then developed with
3 liters of 107. aqueous methanol, then 6 liters of 50% aqueous methanol. The aqueous methanol eluate is adjusted to 107. at pH 5.8-6.0 with Amberlite IR-45 (OR-) resin. The resin is filtered off and the filtrate is concentrated in vacuo to an aqueous phase and lyophilized to
<EMI ID = 93.1>
adjusts the aqueous methanol eluate to Sa% at pH 4.6-6.1 with the resin
<EMI ID = 94.1>
the filtrate in vacuo to an aqueous phase and lyophilized to obtain 3.645 g of BM-123y2 as slightly less pure white amorphous hydrochloride.
<EMI ID = 95.1>
<EMI ID = 96.1>
Microanalysis of a sample equilibrated for 24 hours in a
<EMI ID = 97.1> drying 10.87%. In methanol, BM-123y2 gives maximum absorption <EMI ID = 98.1>
in water).
<EMI ID = 99.1>
following infrared characteristics: 770, 830, 870, 950, 980, 1035,
1110, 1175, 1225, 1235, 1345, 1380, 1470, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755,
<EMI ID = 100.1> using a spectrometer operating at 100 megacycles.
EXAMPLE 7
Distribution on paper and thin layer chromatography of BM-123P and BM-123y
BM-123 antibiotics can be distinguished by paper chromatography. For this purpose, we sprinkle strips of Whatman paper
<EMI ID = 101.1>
equilibrium for 1 to 2 hours in the presence of the lower and upper phases. The bands are developed overnight with the inferior phase.
<EMI ID = 102.1>
water (100: 25: 4: 4: 75 by volume). The developed bands are separated from the
<EMI ID = 103.1>
washed with ether to separate residual phenol and subjected to bioautography on large agar plates seeded with Klebsiella pneumoniae strain AD. Representative Rf values are shown in Table VII below.
Component P is a mixture of two antibiotics when this system is used. The BM-123 � consists of an antibiotic <EMI ID = 104.1>
quantity (Rf - 0.70) referred to as BM-123 2.
BM-123 antibiotics can also be distinguished by thin layer chromatography. To this end, drops of an aqueous solution of the substance to be chromatographed (approximately 20 to 40 μm per spot) are placed on thick-layer cellulose plates sold by the company EM Laboratories Inc. Elmsford, New York, under the name not of pre-coated F cellulose (0.10 mm thick). The plates were developed overnight with the solvent mixture n-butanol-water-pyridine-acetic acid 15: 2: 10: 1 by volume. We
the developed plates are separated from the chromatographic chamber and air dried for about 1 hour. Antibiotics are detected using ninhydrin or Sakaguchi's reagent spray. The characteristic values!) Of Rf are shown in Table VIII below.
The BM-123 � and BM-123y are both mixtures of two components when using this system. The BM-123 � consists of a preponderant Rf 0.08 component which is BM-123 1 and a component
To a stirred solution of 100 mg of antibiotic BM-123y in
20 ml of methanol, 5 ml (or 5 g) of the appropriate aldehyde or the appropriate ketone and 100 mg of sodium cyanoborohydride are added. The pH of the resulting solution is maintained at about 7.0 by hydrogen chloride.
<EMI ID = 105.1>
EXAMPLE 8
<EMI ID = 106.1>
<EMI ID = 107.1>
The reaction mixture is then filtered and the filtrate evaporated to dryness. The residue is triturated with 3 ml of methanol and filtered. The filtrate is diluted with 50 ml of acetone and the precipitate formed is filtered off and dried. The methanol used as solvent can be replaced by
20 ml of water each time the starting aldehyde or ketone is soluble in water.
EXAMPLE 9
<EMI ID = 108.1>
37% aqueous solution of formaldehyde in 50 ml of water, 400 mg of sodium cyanoborohydride are added in portions. Maintain the mixture of <EMI ID = 109.1>
The reaction mixture is stirred for a further 10 minutes at room temperature, then evaporated to dryness in vacuo. We triturate the residue
with 20 ml of methanol, it is filtered and the filtrate is diluted with 250 ml of acetone. The precipitated product is filtered off and dried. Yield: 667 mg.
EXAMPLE 10
Preparation of isopropyl-BM-123y
To a solution of 200 mg of BM-123y in 30 ml of methanol, 5 ml of acetone is added. 139 mg of ambient <EMI ID = 110.1> are added to this solution over 30 minutes. During this time, the reaction mixture is maintained at pH 7.4-7.8 by adding methanolic hydrogen chloride.
<EMI ID = 111.1>
formed and the filtrate evaporated to dryness in vacuo. The residue is triturated with 2 ml of methanol and filtered. The filtrate is diluted with 100 ml of acetone, the solid product which separates is filtered off and dried; yield: 184 mg.
EXAMPLE 11
<EMI ID = 112.1>
Has a solution of 200 mg of BM-123y in 15 ml of water
, and 25 ml of acetonitrile, a solution of 2 ml of phenylacetaldehyde in 4 ml of ethanol is added. 103 mg of sodium cyanoborohydride are added. The reaction mixture is stirred at room temperature for 30 minutes,
while maintaining the pH of the mixture at 7 with 0.2N hydrochloric acid. The reaction mixture is then filtered and the filtrate evaporated to dryness in vacuo. The residue is triturated with 2 ml of methanol and filtered. The filtrate is diluted with 100 ml of acetone and the product which separated is filtered off and dried; yield: 180 mg.
EXAMPLE 12
Preparation of (trimethyl-1.3.3 butyl) -BM-l23y
Has a solution of 200 mg of BM-123y hydrochloride in
50 ml of methanol, 3 ml of 4,4-dimethyl pentanone-2 and 106 mg of
<EMI ID = 113.1>
by adding methanolic hydrogen chloride dropwise. The reaction mixture is stirred at room temperature for 18 hours and filtered. The filtrate is evaporated to dryness in vacuo. The residue is dissolved in 3 ml of methanol, diluted with 50 ml of acetone and filtered; yield: 125 mg.
EXAMPLE 13
Preparation of (methyl-1 phenethyl) -BM-123y
To a solution of 200 mg of BM-123Y in 50 ml of methanol, 5 ml of phenylacetone is added. To this solution is added 170 mg of sodium cyanoborohydride and the reaction mixture is stirred at room temperature for 3 1/2 hours. During this time, the pH of the reaction mixture is maintained at 7.0 with methanol saturated with hydrochloric gas. Concentrate the reaction mixture to about 5 ml, dilute with 2 ml <EMI ID = 114.1> methanol and filter. The filtrate is poured into 100 ml of acetone and
the solid product which separates is filtered off and dried; yield: 233 mg.
EXAMPLE 14
Preparation of (1-methyl nonyl) -BM-123y
100 mg of sodium cyanoborohydride are added to a solution of 200 mg of BM-123y and 1 ml of decanone-2 in 40 ml of methanol.
<EMI ID = 115.1>
19 1/2 hours, the reaction mixture is filtered and the filtrate is concentrated
<EMI ID = 116.1>
The filtrate is added to 50 ml of acetone. The
<EMI ID = 117.1>
empty. Yield of crude (1-methyl nonyl) -BM-123y: 167 mg.
EXAMPLE 15
Preparation of (1.3-dimethyl butyl) -BM-123y
To a solution of 210 mg of BM-123Y in 50 ml of methanol, 5 ml of methyl isobutyl ketone is added. To this solution was added 166 mg of sodium cyanoborohydride and the reaction mixture was stirred at room temperature for 5 hours. During this time, the pH of the reaction mixture is maintained at 7.0 with methanol saturated with
<EMI ID = 118.1>
The residue is triturated with 2 ml of methanol and filtered. The filtrate is diluted with 100 ml of acetone and the solid product which separated is filtered off and dried; yield: 210 mg.
EXAMPLE 16
<EMI ID = 119.1>
100 mg of sodium cyanoborohydride are added to a solution of 200 mg of BM-123y and 400 mg of norbornanone-2 in 40 ml of
<EMI ID = 120.1>
<EMI ID = 121.1>
<EMI ID = 122.1>
in 5 ml of methanol and filtered. The filtrate is added to 50 µl of acetone. The dirty white solid which precipitates is collected by filtration, washed.
<EMI ID = 123.1>
EXAMPLE 17
<EMI ID = 124.1>
<EMI ID = 125.1>
the resulting solution * is diluted with 50 ml of acetone; yield: 49 mg.
EXAMPLE 18
<EMI ID = 126.1>
Stirred at room temperature for 40 minutes,
<EMI ID = 127.1>
uncomfortable. The mixture is filtered and evaporated to dryness in vacuo. The residue is triturated with 5 ml of methanol and the resulting solution is diluted with 50 ml of acetone; yield: 46 mg.
EXAMPLE 19
<EMI ID = 128.1>
Stir at room temperature for 3 hours and
<EMI ID = 129.1>
170 mg of sodium cyanoborohydride in 50 ml of methanol. During this
<EMI ID = 130.1>
<EMI ID = 131.1>
the mixture evaporates to dryness in vacuo. The residue is triturated with 5 ml of methanol and the resulting methanolic solution is diluted with approximately
50 ml of acetone; yield: 233 mg.
EXAMPLE 20
<EMI ID = 132.1>
A solution of 200 mg of BM-123y, 3 ml of 2-ethyl cyclopentanone and 101 mg of sodium cyanoborohydride in 50 ml of methanol is stored at room temperature for 18 hours. During this period,
<EMI ID = 133.1>
of hydrogen chloride in methanol. Evaporate the reaction mixture
<EMI ID = 134.1>
the filtrate with 40 ml of acetone; yield: 157 mg.
EXAMPLE 21
<EMI ID = 135.1>
saturated with hydrogen chloride in methanol. The reaction mixture is triturated with 3 ml of methanol, filtered and the filtrate is diluted with
40 ml of acetone; yield: 200 mg.
<EMI ID = 136.1>
<EMI ID = 137.1>
a solution of 206 mg of BM-123y, 3 ml of 2,4-dimethyl cyclopentanone and
104 mg of sodium cyanoborohydride in 50 ml of methanol. During this time, the pH of the solution is maintained at 7 by adding a saturated solution of hydrogen chloride in methanol. The reaction mixture is triturated with 3 ml of methanol, filtered and the filtrate is diluted with
40 ml of acetone; yield: 101 mg.
EXAMPLE 23
<EMI ID = 138.1>
<EMI ID = 139.1>
<EMI ID = 140.1>
of sodium cyanoborohydride chus 50 ml of methanol. During this time
the pH of the solution is maintained at 7 by adding saturated hydrogen chloride in methanol. The reaction mixture is triturated with 3 ml of methanol, filtered and the filtrate is diluted with 40 ml of acetone; yield:
200 mg. EXAMPLE 24
<EMI ID = 141.1>
Store at room temperature for 2 hours,
<EMI ID = 142.1>
200 mg of sodium cyanoborohydride in 50 ml of methanol. During this time, the pH of the solution is maintained at 7 by adding a saturated solution of hydrogen chloride in methanol. The reaction mixture is triturated with 3 ml of methanol, filtered and the filtrate is diluted with 40 ml of acetone; yield: 200 mg.
EXAMPLE 25
<EMI ID = 143.1>
saturated with hydrogen chloride in methanol. The reaction mixture is triturated with 3 ml of methanol, filtered and the filtrate is diluted with 40 ml of acetone; yield: 176 mg.
EXAMPLE 26
<EMI ID = 144.1>
Is stored at room temperature for 4 hours, a solution of 200 mg of BM-123y, 3 ml of 2-propyl cyclohexanone and
157 mg of sodium cyanoborohydride in 50 ml of methanol. during this
<EMI ID = 145.1>
saturated with hydrogen chloride in methanol. The reaction mixture is triturated with 3 ml of methanol, filtered and the filtrate is diluted with 40 ml of acetone; yield: 75 mg.
EXAMPLE 27
<EMI ID = 146.1>
Keep at room temperature for 3 1/2 hours,
<EMI ID = 147.1>
of sodium cyanoborohydride in 50 ml of methanol. During this time, the pH of the solution is maintained at 7 by adding a saturated solution of hydrogen chloride in methanol. The reaction mixture is triturated with 3 ml of methanol, filtered and the filtrate is diluted with 40 ml of acetone: yield: 157 mg.
<EMI ID = 148.1>
<EMI ID = 149.1>
<EMI ID = 150.1>
<EMI ID = 151.1>
TABLE II
Micromorphology of Nocardia sp. NRRL 5646
<EMI ID = 152.1>
<EMI ID = 153.1>
<EMI ID = 154.1>
TABLE IV
Diagram of the use of carbon sources by Nocardia sp. NRRL 5646
Incubation: 10 days Temperature:, 32 [deg.] C
<EMI ID = 155.1>
<EMI ID = 156.1>
2 - quite good
1 - bad
0 - no use
TABLE V
<EMI ID = 157.1>
<EMI ID = 158.1>
<EMI ID = 159.1>
<EMI ID = 160.1>
<EMI ID = 161.1>
<EMI ID = 162.1>
<EMI ID = 163.1>
<EMI ID = 164.1>
<EMI ID = 165.1>
<EMI ID = 166.1>
<EMI ID = 167.1>
<EMI ID = 168.1>
<EMI ID = 169.1>
<EMI ID = 170.1>
<EMI ID = 171.1>
<EMI ID = 172.1>
<EMI ID = 173.1>
<EMI ID = 174.1>
<EMI ID = 175.1>
<EMI ID = 176.1>
TABLE VII
<EMI ID = 177.1>
TABLE VIII
<EMI ID = 178.1>