Dérivés alkylés de l'antibiotique BM-123 et
leur procédé de préparation La présente invention concerne un nouveau groupe d'antibiotiques et plus particulièrement une nouvelle série d'agents antibactériens puissants dérivés par alkylation réductrice de l'antibiotique BM-123Y au moyen d'un aldéhyde de formule générale :
<EMI ID=1.1>
<EMI ID=2.1>
halogéno alkyle inférieur, alcényle inférieur, phényle, phényle monosubstitué, phénylalkyle inférieur, furyle-2, méthylfuryle-2, thiényle-2,
<EMI ID=3.1>
ou d'une cétone de formule générale :
<EMI ID=4.1>
dans laquelle R2 est un groupe alkyle inférieur, halogéno alkyle inférieur, ou phénylalkyle inférieur et R3 est un groupe alkyle inférieur, halogéno alkyle inférieur, alcényle inférieur, cycloalkyle inférieur, phényle, phényle monosubstitué, phénylalkyle inférieur, ou (phényl monosubstitué)alkyle inférieur ; ou bien R et R3 pris ensemble représentent un groupe
<EMI ID=5.1>
inférieur et halogéno alkyle inférieurs appropriés selon l'invention sont ceux ayant jusqu'à 6 atomes de carbone dans lesquels l'halogène est illustré par le chlore, le brome et l'iode, tels que méthyle, éthyle, isopropyle, sec-butyle, n-amyle, dichlorométhyle, bromo-2 éthyle, diiodo-2,3 propyle, y-chloropropyle, etc. Les groupes alcényle inférieurs appropriés sont ceux ayant jusqu'à 4 atomes de carbone tels que vinyle, allyle, propényle, isopropényle, butène-1 yle, butène-2 yle, butène-3 yle, . isobutényle, etc. Les groupes cycloalkyle inférieurs appropriés sont les groupes cyclopentyle, cyclohexyle et cycloheptyle.
Les groupes phényle monosubstituésappropriés selon l'invention sont par exemple Les groupes p-acétamidophényle, m-nitrophényle, m-mercaptophényle, o-anisyle, p-anisyle, o-tolyle, p-tolyle, etc., tandis que les groupes phénylalkyle inférieur sont illustrés par les groupes benzyle, a-phényléthyle et P-phényléthyle.
Les groupes (phényl monosubstitué)-alkyle inférieurs peuvent être les
<EMI ID=6.1>
thyl-1,3,4 pyrryle-2, etc.
Le procédé d'alkylation réductrice permettant de prépare? les nouveaux agents antibactériens selon l'invention est mis en oeuvre
<EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
cellosolve ou leurs mélanges, on ajoute ensuite un excès de l'aldéhyde ou
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
la réduction. On maintient le pH du mélange de réaction à 6,0-8,0 au moyen d'un acide inorganique dilué au cours de la réaction. Après 1 à
<EMI ID=11.1>
réaction à siccité sous vide, on triture le résidu avec du méthanol et on filtre. On dilue le filtrat par l'acétone et on sépare par filtra-
<EMI ID=12.1>
Les aldéhydes que l'on peut ainsi utiliser dans le procédé
de l'invention sont par exemples les composés suivants : acétaldéhyde, propionaldéhyde, butyraldéhyde, isobutyraldéhyde, crotonaldéhyde, valéraldéhyde, benzaldéhyde, p-cyanobenzaldéhyde, salicylaldéhyde, cinnamaldéhyde, trichloroacétaldéhyde, etc. Les cétones que l'on peut ainsi utiliser dans le procédé de l'invention sont par exemples les composés suivants: acétone, butanone-2, dibromo-1,3 acétone, chloroacétone, acétophénone, m-chloroacéto-
<EMI ID=13.1>
phênone, p-diméthylaminoacétophénone, etc.
On obtient les produits à partir des mélanges de réaction d'alkylation réductrice par des techniques classiques telles que précipitation, concentration, extraction par solvant ou des combinaisons de ces techniques. Après isolation, on peut purifier les produits par l'une quelconque des techniques généralement connues de purification. Celles-ci comprennent la recristallisation dans divers solvants et mélanges solvants, les techniques chromatographiques et la répartition à contre-courant, qui sont toutes ordinairement utilisées à cet effet.
Les nouveaux agents antibactériens selon l'invention sont des bases organiques et sont donc capables de former des sels d'addition d'acides avec divers réactifs salifiables organiques et inorganiques. Ainsi, on obtient des sels d'addition d'acides formés par mélange de l'antibactérien base libre avec jusqu'à trois équivalents d'un acide, avantageusement dans un solvant neutre, avec des acides tels que les acides sulfurique, phosphorique, chlorhydrique, bromhydrique, sulfamique, citrique, maléique, fumarique, tartrique, acétique, benzotque, gluconique, ascorbique et les analogues. Les sels d'addition d'acides des antibactériens selon l'invention sont en général des solides cristallisés relativement solubles dans l'eau,
<EMI ID=14.1>
organiques non polaires tels qu'éther diéthylique, benzène, toluène, et les analogues. Pour les buts de l'invention, les bases libres des antibacrériens sont équivalentes à leurs sels d'addition d'acides non toxiques.
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
nouvelle souche d'une espèce non déterminée de Nocardia. Cette nouvelle souche productrice d'antibiotiques a été isolée d'un échantillon de terre de jardin recueillie à Oceola, dans l'Iowa,et elle est conservée dans la collection de la Lederle Laboratories Division de la.Société demanderesse à Pearl River, New York, sous la désignation Culture n[deg.] BM-123. Une culture viable du nouveau micro-organisme a été déposée au Culture Collection Laboratory, Northern Utilisation Researche and Development Division, United States Department of Agriculture, à Peoria dans l'Illinois et a été ajoutée à sa collection permanente. Elle est librement accessible au public sous le n[deg.] NRRL 5646. Dans la présente description, on
<EMI ID=17.1>
On donne ci-après une description générale du micro-organisme Nocardia sp., NRRL 5646, d'après les caractéristiques diagnostiques observées. On a observé les caractéristiques de culture, physiologiques et morphologiques de l'organisme selon les techniques décrites en détail par Shirling et Gottlieb dans Internat. Journ. of Syst. Bacteriol. 16, pages 213-240 (1966). La composition chimique de la culture a été déterminée par les techniques indiquées par Lechevalier et al., dans Advan. Appl. Microbiol. 14, pages 47-72
(1971). Les couleurs descriptives soulignées et les désignations de couleurs ont été empruntées à Jacobson et al., Color Harmony Manual, 3è Edition
(1948), Container Corp. of America, Chicago, Illinois. Les détails descriptifs
<EMI ID=18.1>
Croissance
Modérée sur géloses à l'extrait de levure, à l'asparaginedextrose, de Benedict, de Bennett, de pomme de terre-dextrose et de Weinstein ; légère sur gélose de Hickey et Transner, à la pite de tomate, à la farine d'avoine, et alimentaire ;
et traces de croissance sur géloses aux sels inorganiquesamidon, aux flocons d'avoine de Kuster, à la solution de Czapek et au riz.
Mycélium aérien
Mycelium aérien blanchâtre s'il y en a ; produit seulement sur géloses à l'extrait de levure, à l'asparagine dextrose, de Benedict, de Bennett et de pomme de terre-dextrose. Pigments solubles
Pas de production de pigments solubles. Couleur de l'envers
Nuances incolore à jaunâtre.
Réactions physiologiques diverses
Pas de liquéfaction de la gélatine ; réduction des nitrates en nitrites en 7 jours ; pas de formation de pigments mélanotdes sur géloses de peptone-fer ; pas de peptonisation ou de caillebotte dans le lait au pourpre de bromocrésol ; tolérance
<EMI ID=19.1>
sources de carb.ne, selon la méthode de Pridham et Gottlieb dans J. Bacteriol. 56, pages 107-114 (1948) : bonne utilisation du glycérol,de la salicine, du d-tréhalose et du dextrose ; assez bonne utilisation du 1-inositol ; et utilisation mauvaise ou nulle du d-fructose, du maltose, de l'adonitol, du 1-arabinose, du lactose, du d-mannitol, du d-mélibiose, du d-raffinose, du 1-rhamnose, du saccharose et du d-xylose.
Composition chimique
L'organisme appartient au type IV de parois cellulaires, c'est-à-dire qu'il contient de l'acide méso-diamino-2,6 pimélique et il a une constitution globale des sucres de la cellule du type A,c'est-à-dire il contient de l'arabinose et du galactose. Les extraits de cellule complète méthylés, soumis à la chromatographie gazeuse, présentent des schémas d'acides gras semblables à ceux produits par Nocardia asteroides ATCC 3308. Micromorphologie
Le mycélium aérien s'élève du mycélium de substrat en éléments flexibles moyennement longs, rarement ramifiés, se terminant couramment en spirales primitives allongées.
Les éléments flexibles sont irrégulièrement segmentés en sections elliptiques ou cylindriques courtes (spores ?) qui se désarticulent facilement. Les portions terminales en spirales sont moins nettement segmentées. Les segments
ont en général des dimensions de 0,8 à 1,7 p x 0,3 à 0,5
<EMI ID=20.1>
Diagnostic
Les caractéristiques morphologiques de la culture n[deg.] BM-123 sont difficiles à observer et à interpréter à cause du mauvais développement du mycélium aérien sur la plupart des milieux. En conséquence, on attache une importance considérable, par nécessité, à l'analyse chimique dans la détermination de la relation générique de l'organisme.
Sur la base du système composé par Lechevalier et al., la culture n[deg.] BM-123 contient de l'acide méso-diamino-2,6
<EMI ID=21.1>
sucres montre la présence d'arabtnose et de galactose.
La culture appartient donc au type IV de paroi3 cellulaires.
Une comparaison du diagramme de chromatographie gazeuse
de la culture n[deg.] BM-123 avec celui de Nocardia asteroides , ATCC <3>308 montre que les deux sont remarquablement semblables*
<EMI ID=22.1>
le cadre des Nocardia sent sa croissance aérienne fragmentaire sur certains milieux et l'absence totale
de croissance aérienne sur la plupart des milieux. Au
vu de l'absence de critères adéquats pour la caractérisation de Nocardia au niveau de l'espèce, on n'a pas tenté d'effectuer cette détermination. On considère donc que
la culture n[deg.] BM-123 est une espèce indéterminée de Nocardia., jusqu'à ce qu'un diagnostic soit réalisable.
<EMI ID=23.1>
à cet organisme particulier ou à des organismes répondant complètement aux caractéristiques ci-dessus de croissance et d'examen microscopique,qui ne
sont données qu'à titre d'illustration. En réalité, on peut également utiliser
<EMI ID=24.1>
l'exposition aux rayons X, aux radiations ultraviolettes, à la moutarde azotée aux actinophages, etc. Une culture viable d'une telle souche mutante caractéristique a été déposée au Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Researche and Development Division, United States Department of Agriculture, à Peoria dans l'Illinois,et ajoutée à sa collection permanente sous le n[deg.] NRRL 8050. Bien que les caractéristiques <EMI ID=25.1>
les mêmes que celles de NRRL 5646, il produit pendant la fermentation aérobie des quantités accrues de BM-123 . De même, NRRL 8050 diffère de la souche mère NRRL 5646 par les points suivants : <EMI ID=26.1> b) production d'un pigment de mycélium brun-bois de rose <EMI ID=27.1>
Les nouveaux antibactériens selon l'invention sont en général des solides cristallisés ayant une solubilité relativement limitée
dans les solvants non polaires tels qu'éther éthylique et hexane, mais considérablement plus solubles dans les solvants tels que l'eau et les
<EMI ID=28.1>
isomères de structure et peuvent être représentés par les formules générales suivantes :
<EMI ID=29.1>
<EMI ID=30.1>
<EMI ID=31.1>
former des dérivés de formule générale :
<EMI ID=32.1>
dans laquelle R est un reste de formule :
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
chaîne latérale spermadine pour former des dérivés mono-, di- ou trisubstitués de formules générales suivantes :
<EMI ID=35.1>
dans lesquelles R et IL sont tels que définis ci-dessus.
L'utilité des dérivés alkylés du BM-123 est démontrée
par leur aptitude à combattre les infections générales mortelles chez
les souris. Ces nouvelles substances présentent une activité antibactérienne in vivo élevée chez les souris contre Escherichia coli US 311, lorsqu'on les administre en une seule dose sous-cutanée à des groupes
de souris Carworth Fanas CF-1 pesant environ 20 g, infectées par voie intrapéritonéale avec une dose létale de cette bactérie dans une dilution
<EMI ID=36.1>
5 heures. Le tableau VI ci-après indique l'activité in vivo des produits caractéristiques de l'invention préparés à partir des réactifs carbonylés indiqués, contre Escherichia coli US 311 chez la souris. L'activité est exprimée par la DE 50 c'est-à-dire la dose en mg par kg de poids du
<EMI ID=37.1>
Procédé par fermentation choisi pour produire principalement le BM-123P et le BM-123Y.
<EMI ID=38.1>
dans une grande variété de milieux de culture liquides. Les milieux qui sont utiles pour la production des antibiotiques comprennent une source assimilable de carbone telle qu'amidon, sucre, mélasse, glycérol, etc. et une source assimilable d'azote telle que protéines, hydrolysat de protéines, polypeptides, aminoacides, liqueur de trempage de mats, etc. ; et des anions inorganiques tels que pc -assium, magnésium, calcium, ammonium, sulfate, carbonate, phosphate, chlorure, etc. Des éléments à l'état de traces tels que bore, molybdène, cuivre, etc. sont fournis sous forme d'impuretés des autres constituants du milieu. On réalise l'aération
dans les cuves et bouteilles par circulation forcée d'air stérile à travers le milieu de fermentation ou au-dessus de sa surface. On réalise encore l'agitation dans les cuves au moyen d'un agitateur mécanique à hélice.
On peut ajouter si nécessaire un agent anti-mousse tel que le produit
vendu sous le nom de Hodag FD82.
<EMI ID=39.1>
en flacons agités en inoculant 100 ml de milieu liquide stérile dans des fioles de 500 ml avec des produits de raclage ou de lavage d'une culture sur gélose inclinée. On utilise ordinairement le milieu de composition suivante :
<EMI ID=40.1>
On fait incuber les fioles à une température de 25-29[deg.]C,
<EMI ID=41.1>
pendant 30 à 48 heures. On transfère ensuite les inoculums dans des tubes de culture stériles à bouchon vissant et on les conserve au-dessous de <EMI ID=42.1> de raclage de milieux inclinés pour l'inoculation d'autres fioles agitées dans la préparation de ce premier stade d'inoculum.
On utilise ces inoculums des fioles de premier stade pour ensemencer des échantillons de 12 litres du même milieu dans des fermenteurs en verre de 20 litres. On aère la bouillie d'inoculums avec de l'air stérile,tandis que l'on poursuit la culture pendant 30 à 48 heures.
On utilise les échantillons de 12 litres d'inoculums de deuxième stade pour ensemencer des fermenteurs contenant 300 litres du milieu liquide stérile suivant pour produire l'inoculum de troisième et dernier stade :
<EMI ID=43.1>
On stérilise le glucose séparément.
On aère l'inoculum de troisième stade à raison de 0,4 à
0,8 litre d'air stérile par litre de bouillon par minute et on agite le mélange en fermentation avec un agitateur à hélice tournant à 150-300 tr/mn. On maintient la température à 25-29'C ordinairement 28[deg.]C. On continue la culture pendant 48 à 72 heures, après quoi on utilise l'inoculum pour ensemencer une cuve de fermentation de 3000 litres.
<EMI ID=44.1>
Pour la production du BM-123P et du BM-123y dans des cuves de fermentation, on utilise de préférence le milieu de fermentation suivant :
<EMI ID=45.1>
On stérilise séparément le glucose.
<EMI ID=46.1>
troisième stade préparé comme décrit dans la préparatin de l'inoculum. On maintient la bouillie en fermentation à une température de 25-28[deg.]C, ordinairement 26[deg.]C. On aère la bouillie avec de l'air stérile à raison de 0,3-0,5 litre d'air stérile par litre et par minute et on agite avec un agitateur à hélice tournant à 70-100 tr/mn. On laisse se poursuivre la fermentation entre 65 et 90 heures et on récolte la bouillie.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.
EXEMPLE 1
Préparation de l'inoculum pour le BM-123P et le BM-123
On prépare un milieu caractéristique de composition suivante utilisé pour faire pousser les inoculums de premier et second stades.
<EMI ID=47.1>
<EMI ID=48.1>
milieu stérile ci-dessus avec 5 ml chacun d'un inoculum végétatif congelé de
<EMI ID=49.1>
et on agite vigoureusement pendant 48 heures à 28[deg.]C. On transfère l'inoculum du ballon résultant dans un fermenteur en verre de 18,9 litres contenant
12 litres du milieu stérile ci-dessus. On aère la bouillie avec de l'air stérile tandis que l'on poursuit la culture pendant environ 48 heures, après quoi on utilise le contenu pour ensemencer un fermenteur de
378 litres contenant 300 litres du milieu liquide stérile de composition suivante :
<EMI ID=50.1>
On stérilise séparément le glucose.
On aère la bouillie d'inoculum de troisième stade en faisant barboter de l'air stérile dans le fermenteur à raison de 0,4 litre d'air par litre de bouillie et par minute. L'agitation est obtenue au moyen d'un agitateur à hélice tournant à 240 tr/mn. On maintient la bouillie à 28[deg.]C et on utilise comme agent anti-monsse le produit vendu sous le nom de Hodag FD82. Après une période de croissance de 48 heures, on utilise la bouillie d'inoculum pour ensemencer une fermentation de 3000 litres.
EXEMPLE 2
Fermentation utilisant Nocardia sp. NRRL 8050 et un milieu favorisant la production de BM-123P et de BM-123y
On prépare une milieu de fermentation de composition suivante :
<EMI ID=51.1>
On stérilise séparément le glucose.
On stérilise le milieu de fermentation à 120[deg.]C par la vapeur sous 9 kg pendant 60 minutes. Le pH du milieu après stérilisation est de 6,9. On inocule 3000 litres de milieu stérile dans un fermenteur de 4000 litres avec 300 litres d'inoculum,comme décrit à l'exemple l,et
<EMI ID=52.1>
le produit vendu sous le nom de Hodag FD82. On aère la bouillie à raison de 0,35 litre d'air stérile par litre et par minute. On agite au moyen d'un agitateur à hélice tournant à 70-72 tr/mn. On récolte la bouillie après une durée de fermentation de 67 heures.
EXEMPLE 3
<EMI ID=53.1>
On ajuste à pH 4,0 par l'hydroxyde de sodium une portion de 3000 litres de bouillie de fermentation à pH 4,3 préparée comme décrit
à l'exemple 2 et on filtre en utilisant 5% de terre d'infusoires comme auxiliaire de filtration. On lave le gâteau de filtration avec environ
100 litres d'eau et on le jette. On combine le filtrat et l'eau de lavage et on les envoie par pompage de bas en haut à travers trois colonnes d'acier inoxydable parallèles de 21 cm x 122 cm, contenant chacune 15 litres de gel de résine échangeuse de cations dextra-épichlorhydrine réticulée vendue sous le nom de CM Sephadex C-25 (Na ) par la Société Pharmacia Fine
<EMI ID=54.1>
390 litres d'eau et ensuite on développe avec 200 litres de solution aqueuse <EMI ID=55.1>
clarifié à travers une colonne de verre., 22,8 cm x 152,4 cm contenant
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
la colonne chargée avec 120 litres d'eau et ensuite on développe avec
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
vide entre l'éluat de méthanol aqueux à 15% jusqu'à environ 7 litres d'une phase aqueuse et on ajuste le pH 4,5 6,0 au moyen d'une résine échangeuse d'anions faiblement basique du type polystyrène-polyamine vendue sous
<EMI ID=60.1>
on concentre le filtrat sous vide jusqu'à environ 1 litre et ensuite on lyophilise pour obtenir 38 g d'une substance consistant principalement
<EMI ID=61.1>
On ajuste l'éluat de méthanol aqueux à 50% à pH 4,65-6,0 par la résine Amberlite IR-45 (OH-). On sépare la résine par filtration et on concentre le filtrat sous vide jusqu'à environ 6,3 litres et ensuite on lyophilise pour obtenir 213 g d'une substance consistant principalement en BM 123 y .
<EMI ID=62.1>
pour obtenir 56 g de BM 123y impur.
EXEMPLE 4
Purification ultérieure du BM-123y
<EMI ID=63.1>
<EMI ID=64.1>
diamètre jusqu'à une hauteur de résine d'environ 62 cm. On fait couler l'excès de chlorure d'ammonium aqueux à 2% et on dissout dans un échantillon de 5,0 g de BM-123y préparé comme décrit à l'exemple 3 dans environ 10 ml de chlorure d'ammonium aqueux à 2% et on l'applique sur la colonne. On
élue ensuite la colonne avec 6 litres de chlorure d'ammonium aqueux ayant
<EMI ID=65.1>
par examen de l'effluent de la colonne en lumière ultraviolette et par bioautographie de disques de papier plongés dans l'effluent sur de grandes plaques de gélose ensemencées avec Klebsiella pneumoniae souche AD.
La majeure partie du BM-123 est localisée entre les fractions 71 et 107 incluses.
On met en suspension dans l'eau 130 ml de Darco C-60
<EMI ID=66.1>
et on fait couler l'excès d'eau. On combine les fractions 84 à 96 incluses de la chromatographie sur CM Sephadex ci-dessus et on fait passer sur une colonne de carbone granulaire. On lave la colonne chargée avec 600 si d'eau et ensuite on développe avec 1 litre d'acétone aqueuse à 50%. Les deux éluats contiennent le BM-123 y ; on les concentre sous vide jusqu'à obtenir des phases aqueuses et on lyophilise pour obtenir un total de 886 mg
<EMI ID=67.1>
analytique en soumettant la matière ci-dessus à la répétition du procédé ci -dessus.
L'antibiotique BM-123 y ne possède pas un point de fusion défini, mais la décomposition progressive commence au voisinage de 200[deg.]C. La micro-analyse d'un échantillon équilibré pendant 24 heures dans une atmosphère à 22[deg.]C et 23% d'humidité relative donne les résultats suivants :
<EMI ID=68.1>
séchage : 8,19%. Le BM-l23y dans l'eau donne un maximum d'absorption
<EMI ID=69.1>
<EMI ID=70.1>
870 930, 980 1035, 1105, 1175, 1225, 1300, 1340 1370, 1460, 1510, 1555,
<EMI ID=71.1>
le spectre d'absorption infrarouge standard du BM-123y dans une pastille de KB r.
EXEMPLE 5
<EMI ID=72.1>
On verse une bouillie de CM Sephadex C 25 /Na_7 dans le chlorure de sodium aqueux à 2%, dans une colonne de verre de 2,6 cm de diamètre jusqu'à une hauteur de résine d'environ 70 cm. On fait couler l'excès de chlorure de sodium aqueux à 2% et on dissout un échantillon
<EMI ID=73.1>
et d'autres impuretés, préparé comme décrit à l'exemple 3, dans environ '10 ml de chlorure de sodium aqueux à 2% et on applique la solution sur cette colonne. On élue ensuite la colonne avec 4 litres de chlorure de <EMI ID=74.1>
<EMI ID=75.1>
BM-123y par examen de l'effluent de la colonne en lumière ultraviolette et par bioautographie de disques de papier plongés dans l'effluent sur de grandes plaques de gélose ensemencées avec Klebsiella pneumoniae souche AD. La majeure partie du BM-123y est localisée entre les fractions 64-90 incluses;
<EMI ID=76.1>
<EMI ID=77.1>
blement pur.
On met en suspension dans l'eau 100 ml de Darco G-60 granulaire (0,42-0,84 mm), on transfère dans une colonne de verre, on laisse déposer et on laisse couler l'excès d'eau. On combine les fractions
<EMI ID=78.1>
<EMI ID=79.1>
<EMI ID=80.1>
<EMI ID=81.1>
<EMI ID=82.1>
<EMI ID=83.1>
concentre le filtrat sous vide jusqu'à obtenir une phase aqueuse et on lyophilise pour obtenir 294 mg de BM-123T . 1 amorphe blanc sous forme du chlorhydrate.
L'antibiotique BM-123 y. ne possède pas un point de fusion défini,mais la décomposition progressive commence au voisinage de 200[deg.]C.
La mi.croanalyse d'un échantillon équilibré pendant 24 heures dans une
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
dans l'eau).
L'antibiotique BK-123Y 1 présente les absorptions carac- téristiques suivantes dans l'infrarouge : 770 830, 870, 930, 980, 1045, 1080,
1110, 1125, 1175, 1225, 1305, 1345 1380, 1465, 1615, 1560, 1605, 1660, 1730,
2950 et 3350 cm . La figure 2 du dessin annexé représente un spectre
<EMI ID=87.1>
La figure 4 du dessin annexé représente un spectre de résonance magnétique <EMI ID=88.1>
lourde au moyen d'un spectromètre fonctionnant à 100 mégacycles.
EXEMPLE 6
Isolement du BM-123 y
14
<EMI ID=89.1>
et du BM-123�, préparé comme décrit a l'exemple 3, et on l'applique sur
<EMI ID=90.1>
aqueuse de chlorure de sodium ayant un gradient de 2% à 4%.Les 12 premier:
litres d'éluat sont recueillis dans une grande bouteille et jetés. Ensuite, on recueille automatiquement des fractions d'environ 800 ml toutes les
40 minutes. On localise l'antibiotique BM-123y en examinant les fractions de la colonne en lumière ultraviolette. La majeure partie du BM-123y est comprise entre les fractions 7 et 18 incluses ; les fractions initiales
(7 à 15) contiennent du BM-123Y- sensiblement pur et les dernières frac-
<EMI ID=91.1>
On met en suspension dans l'eau 600 ml de Darco G-60 granulaire (0,42-0,84 mm), on transfère dans une colonne de verre, on laisse déposer et on laisse couler l'excès d'eau. On combine les fractions
<EMI ID=92.1>
les fait passer à travers la colonne de carbone granulaire. On lave
la colonne chargée avec 3 litres d'eau et ensuite on développe avec
3 litres de méthanol aqueux à 107.,puis 6 litres de méthanol aqueux à 50%. On ajuste l'éluat de méthanol aqueux à 107. à pH 5,8-6,0 par la résine Amberlite IR-45 (OR-). On sépare la résine par filtration et on concentre le filtrat sous vide jusqu'à une phase aqueuse et on lyophilise pour
<EMI ID=93.1>
ajuste l'éluat de méthanol aqueux à Sa% à pH 4,6-6,1 par la résine
<EMI ID=94.1>
le filtrat sous vide jusqu'à une phase aqueuse et on lyophilise pour obtenir 3,645 g de BM-123y2 sous forme de chlorhydrate amorphe blanc légèrement moins pur.
<EMI ID=95.1>
<EMI ID=96.1>
La microanalyse d'un échantillon équilibré pendant 24 heures dans une
<EMI ID=97.1> séchage 10,87%. Dans le méthanol, le BM-123y2 donne un maximum d'absorption <EMI ID=98.1>
dans l'eau).
<EMI ID=99.1>
téristiques suivantes dans l'infrarouge : 770, 830, 870, 950, 980, 1035,
1110, 1175, 1225, 1235, 1345, 1380, 1470, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755,
<EMI ID=100.1> au moyen d'un spectromètre fonctionnant à 100 mégacycles.
EXEMPLE 7
Distribution sur papier et chromatographie sur couche mince du BM-123P et du BM-123y
On peut distinguer les antibiotiques BM-123 par chromatographie sur papier. A cet effet, on asperge des bandes de papier Whatman
<EMI ID=101.1>
équilibre pendant 1 à 2 heures en présence des phases inférieure et supérieure. On développe les bandes pendant une nuit avec la phase infé-
<EMI ID=102.1>
eau (100:25:4:4:75 en volume). On sépare les bandes développées de la
<EMI ID=103.1>
les lave à l'éther pour séparer le phénol résiduel et on les soumet à la bioautographie sur de grandes plaques de gélose ensemencées avec Klebsiella pneumoniae souche AD. Les valeurs de Rf représentatives sont indiquées dans le tableau VII ci-après.
Le constituant P est un mélange de deux antibiotiques .lorsqu'on utilise ce système. Le BM-123� est constitué d'un antibiotique <EMI ID=104.1>
quantité (Rf - 0,70) dénommé BM-123�2.
On peut également distinguer les antibiotiques BM-123 par chromatographie sur couche mince. A cet effet, on dépose des gouttes d'une solution aqueuse de la substance à chromatographier (environ 20 à 40 y par tache) sur des plaques de Cellulose en couche épaisse vendues par la Société EM Laboratories Inc. Elmsford, New York, sous le non de Cellulose pré-enduite F (0,10 mm d'épaisseur). On développe les plaques pendant une nuit avec le mélange solvant n-butanol-eau-pyridine-acide acétique 15:2:10:1 en volume. On
sépare les plaques développées de la chambre chromatographique et on les sèche à l'air pendant environ 1 heure. On décèle les antibiotiques en utilisant la ninhydrine ou le réactif de Sakaguchi en pulvérisation. Les valeurs caractéristique!) de Rf sont indiquées dans le tableau VIII ci-après.
Le BM-123� et le BM-123y sont tous deux des mélanges de deux constituants lorsqu'on utilise ce système. Le BM-123� est constitué d'un composant prépondérant Rf 0,08 qui est le BM-123�1 et un composant
A une solution agitée de 100 mg d'antibiotique BM-123y dans
20 ml de méthanol, on ajoute 5 ml (ou 5 g) de l'aldéhyde approprié ou de la cétone appropriée et 100 mg de cyanoborohydrure de sodium. On maintient le pH de la solution résultante à environ 7,0 par le chlorure d'hydrogène
<EMI ID=105.1>
EXEMPLE 8
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
On filtre ensuite le mélange de réaction et on évapore le filtrat à siccité. On triture le résidu avec 3 ml de méthanol et on filtre. On dilue le filtrat avec 50 ml d'acétone et on sépare par filtration le précipité formé et on le sèche. On peut remplacer le méthanol utilisé comme solvant par
20 ml d'eau chaque fois que l'aldéhyde ou la cétone de départ est soluble dans l'eau.
EXEMPLE 9
<EMI ID=108.1>
solution aqueuse à 37% de formaldéhyde dans 50 ml d'eau, on ajoute,par .portions, 400 mg de cyanoborohydrure de sodium. On maintient le mélange de <EMI ID=109.1>
On agite le mélange de réaction pendant encore 10 minutes, à la température ambiante, puis on l'évapore à siccité sous vide. On triture le résidu
avec 20 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 250 ml d'acétone. On sépare le filtration le produit précipité et on le sèche. Rendement : 667 mg.
EXEMPLE 10
Préparation de l'isopropyl-BM-123y
A une solution de 200 mg de BM-123y dans 30 ml de méthanol, on ajoute 5 ml d'acétone. On ajoute à cette solution 139 mg de <EMI ID=110.1> ambiante pendant 30 minutes. Pendant cette durée on maintient le mélange de réaction à pH 7,4-7,8 par addition de chlorure d'hydrogène méthanolique
<EMI ID=111.1>
formée et on évapore le filtrat à siccité sous vide. On triture le résidu avec 2 ml de méthanol et on filtre. On dilue le filtrat avec 100 ml d'acétone, on sépare par filtration le produit solide qui se sépare et on sèche ; rendement : 184 mg.
EXEMPLE 11
<EMI ID=112.1>
A une solution de 200 mg de BM-123y dans 15 ml d'eau
,et 25 ml d'acétonitrile, on ajoute une solution de 2 ml de phénylacétaldéhyde' dans 4 ml d'éthanol. On ajoute 103 mg de cyanoborohydrure de sodium. On agite le mélange de réaction à la température ambiante pendant 30 minutes,
en maintenant le pH du mélange à 7 par l'acide chlorhydrique 0,2N. On filtre ensuite le mélange de réaction et on évapore le filtrat à siccité sous vide. On triture le résidu avec 2 ml de méthanol et on filtre. On dilue le filtrat avec 100 ml d'acétone et on sépare par filtration le produit qui s'est séparé et on le sèche ; rendement : 180 mg.
EXEMPLE 12
Préparation du (triméthyl-1.3.3 butyl)-BM-l23y
A une solution de 200 mg de chlorhydrate de BM-123y dans
50 ml de méthanol, on ajoute 3 ml de diméthyl-4,4 pentanone-2 et 106 mg de
<EMI ID=113.1>
en ajoutant goutte à goutte du chlorure d'hydrogène méthanolique. On agite le mélange de réaction à la température ambiante pendant 18 heures et on filtre. On évapore le filtrat à siccité sous vide. On dissout le résidu dans 3 ml de méthanol, on dilue avec 50 ml d'acétone et on filtre; rendement : 125 mg.
EXEMPLE 13
Préparation du(méthyl-l phénéthyl)-BM-123y
A une solution de 200 mg de BM-123Y dans 50 ml de méthanol, on ajoute 5 ml de phénylacétone. A cette solution on ajoute 170 mg de cyanoborohydrure de sodium et on agite le mélange de réaction à la température ambiante pendant 3 heures 1/2. Pendant cette durée, on maintient le pH du mélange de réaction à 7,0 par le méthanol saturé de gaz chlorhydrique. On concentre le mélange de réaction jusqu'à environ 5 ml, on dilue par 2 ml <EMI ID=114.1> de méthanol et on filtre. On verse le filtrat dans 100 ml d'acétone et
on sépare par filtration le produit solide qui se sépare et on sèche; rendement : 233 mg.
EXEMPLE 14
Préparation du (méthyl-1 nonyl)-BM-123y
On ajoute 100 mg de cyanoborohydrure de sodium à une solution de 200 mg de BM-123y et 1 ml de décanone-2 dans 40 ml de méthanol.
<EMI ID=115.1>
19 heures 1/2, on filtre le mélange de réaction et on concentre le filtrat
<EMI ID=116.1>
On ajoute le filtrat à 50 ml d'acétone. On recueille par filtration le
<EMI ID=117.1>
vide. Rendement en (méthyl-1 nonyl)-BM-123y brut : 167 mg.
EXEMPLE 15
Préparation du (diméthyl-1.3 butyl)-BM-123y
A une solution de 210 mg de BM-123Y dans 50 ml de méthanol, on ajoute 5 ml de méthylisobutylcétone. A cette solution on ajoute 166 mg de cyanoborohydrure de sodium et on agite le mélange de réaction à la température ambiante pendant 5 heures. Pendant cette durée, on maintient le pH du mélange de réaction à 7,0 par le méthanol saturé de
<EMI ID=118.1>
On triture le résidu avec 2 ml de méthanol et on filtre. On dilue le filtrat avec 100 ml d'acétone et on sépare par filtration le produit solide qui s'est séparé et on sèche ; rendement : 210 mg.
EXEMPLE 16
<EMI ID=119.1>
On ajoute 100 mg de cyanoborohydrure de sodium a une solution de 200 mg de BM-123y et 400 mg de norbornanone-2 dans 40 ml de
<EMI ID=120.1>
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
dans 5 ml de méthanol et on filtre. On ajoute le filtrat à 50 ni d'acétone. On recueille par filtration le solide blanc sale qui précipite, on le lave
<EMI ID=123.1>
EXEMPLE 17
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
on dilue la solution résultant* avec 50 ml d'acétone ; rendement : 49 mg.
EXEMPLE 18
<EMI ID=126.1>
On agite a la température ambiante pendant 40 minutes,
<EMI ID=127.1>
gène. On filtre le mélange et on évapore.. siccité sous vide. On triture le résidu avec 5 ml de méthanol et on dilue la solution résultante avec 50 ml d'acétone ; rendement : 46 mg.
EXEMPLE 19
<EMI ID=128.1>
On agite à la température ambiante pendant 3 heures et
<EMI ID=129.1>
170 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol. Pendant cette
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1>
évapore le mélange a siccité sous vide. On triture le résidu avec 5 ml de méthanol et on dilue la solution méthanolique résultante avec environ
50 ml d'acétone; rendement : 233 mg.
EXEMPLE 20
<EMI ID=132.1>
On conserve à la température ambiante pendant 18 heures, une solution de 200 mg de BM-123y, 3 ml 'd'éthyl-2 cyclopentanone et 101 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol. Pendant cette durée,
<EMI ID=133.1>
de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On évapore le mélange de réaction
<EMI ID=134.1>
le filtrat avec 40 ml d'acétone; rendement : 157 mg.
EXEMPLE 21
<EMI ID=135.1>
saturée de chlorure d'hydrogène dans ie méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec
40 ml d'acétone ; rendement : 200 mg.
<EMI ID=136.1>
<EMI ID=137.1>
une solution de 206 mg de BM-123y, 3 ml de diméthyl-2,4 cyclopentanone et
104 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol, Pendant cette durée, on maintient le pH de la solution à 7 par addition d'une solution saturée de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec
40 ml d'acétone ; rendement : 101 mg.
EXEMPLE 23
<EMI ID=138.1>
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
de cyanoborohydrure de sodium chus 50 ml de méthanol. Pendant cette durée
on maintient le pH de la solution à 7 par addition de chlorure d'hydrogène saturé dans le méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 40 ml d'acétone; rendement :
200 mg. EXEMPLE 24
<EMI ID=141.1>
On conserve à la température ambiante pendant 2 heures,
<EMI ID=142.1>
200 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol. Pendant cette durée, on maintient le pH de la solution à 7 par addition d'une solution saturée de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 40 ml d'acétone ; rendement : 200 mg.
EXEMPLE 25
<EMI ID=143.1>
saturée de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 40 ml d'acétone ; rendement : 176 mg.
EXEMPLE 26
<EMI ID=144.1>
On conserve à la température ambiante pendant 4 heures, une solution de 200 mg de BM-123y, 3 ml de propyl-2 cyclohexanone et
157 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol. pendant cette
<EMI ID=145.1>
saturée de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On triture le mélange de réactionnel avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 40 ml d'acétone ; rendement : 75 mg.
EXEMPLE 27
<EMI ID=146.1>
On conserve à la température ambiante pendant 3 heures 1/2,
<EMI ID=147.1>
de cyanoborohydrure de sodium dans 50 ml de méthanol. Pendant cette durée, on maintient le pH de la solution à 7 par addition d'une solution saturée de chlorure d'hydrogène dans le méthanol. On triture le mélange de réaction avec 3 ml de méthanol, on filtre et on dilue le filtrat avec 40 ml d'acétone : rendement : 157 mg.
<EMI ID=148.1>
<EMI ID=149.1>
<EMI ID=150.1>
<EMI ID=151.1>
TABLEAU II
Micromorphologie de Nocardia sp. NRRL 5646
<EMI ID=152.1>
<EMI ID=153.1>
<EMI ID=154.1>
TABLEAU IV
Diagramme d'utilisation des sources de carbone par Nocardia sp. NRRL 5646
Incubation : 10 jours Température :,32[deg.]C
<EMI ID=155.1>
<EMI ID=156.1>
2 - assez bonne
1 - mauvaise
0 -pas d'utilisation
TABLEAU V
<EMI ID=157.1>
<EMI ID=158.1>
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
<EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
<EMI ID=166.1>
<EMI ID=167.1>
<EMI ID=168.1>
<EMI ID=169.1>
<EMI ID=170.1>
<EMI ID=171.1>
<EMI ID=172.1>
<EMI ID=173.1>
<EMI ID=174.1>
<EMI ID=175.1>
<EMI ID=176.1>
TABLEAU VII
<EMI ID=177.1>
TABLEAU VIII
<EMI ID=178.1>