Procédé d'extraction de phénols et
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La présente invention est relative à un procédé d'extraction de phénols et dl oi igosaccha rides à partir des tissus végétaux pour obtenir des concentrés et des produits isolés protéiques ayant une faible teneur en facteur antinutritionnel et en composés chromogènes.
Il est connu,"Loomis, W.D., et Battaile, J. Phy-
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J., 112, 609 (1969) que dans le règne végétal Les composés phénoliques et polyphénoliques sont largement répandus et sont trouvés dans leur forme libre ou liés aux constituants
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plantes, mais principalement dans les graines, les feuilles, les tiges et les racines. Ces substances naturelles ont la propriété de s'oxyder en quinones et celles-ci, à leur tour,
se polymérisent rapidement ans des conditions alcalines et réagissent avec les protéines pour former des liaisons covalentes et hydrogène.
L'oxydation des phénols en quinones a lieu en présence d'oxygène ou également sous l'action de quelques enzymes telles que phénoloxydases, peroxydases et autres.
L'utilisation des protéines extraites des végétaux pour l'alimentation humaine est fortement empêchée par la présence de constituants phénoliques pour les raisons de nature économique et nutritionnelle suivantes :
- la formation de liaisons covalentes entre les phénols et les quelques aminoacides essentiels qui sont présents dans les produits isolés diminue leur valeur nutritive dans la mesure où les nouveaux composés de condensation formés dans ce sens ne peuvent pas être métabolisés par l'organisme humain:
ainsi de telles substances phénoliques, si elles ne sont pas éliminées, sont des facteurs anti-nutritionnels.
- l'oxydation rapide de tels composés impartit, selon le pH, une décoloration brun-vert aux protéines, rendant ces dernières souvent inacceptables comme aliment.
- la présence de constituants phénoliques diminue la capacité des protéines à être extraites à cause de leur interaction avec les protéines elles-mêmes.
- certains phénols ont une nature toxique, tels que par exemple le gossypol, un phénol bialdéhyde qui est présent dans les graines de coton.
Les procédés qui ont été décrits jusqu'ici pour l'élimination de tels composés des farines végétales sont insatisfaisants puisqu'ils ne permettent pas une extraction qui soit suffisante pour assurer la préparation d'extraits
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(1972).
De la même manière les composés qui sont regardés comme indésirables dans les farines végétales sont les oligosaccharides de nature fermentescible (raffinose, stachyose, verbascose, etc.) qui provoquent la flatulence et ainsi peuvent limiter l'utilisation des farines et des concentrés pro-
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La présente invention décrit un procédé adapté pour extraire efficacement dans des conditions de non dénaturation pour les protéines, les pigments phénoliques et les oligosaccharides fermentescibles qui sont présents dans les végétaux. Le procédé chimique tel que suggéré ici exploite la diffusion dans un solvant polaire de substances ayant un poids moléculaire faible à travers les membranes des cellules et les organelles subcellulaires.
Le procédé d'extraction suggéré par l'invention fournit directement un concentré protéique ayant une valeur biologique élevée qui est efficacement privé de composés indésirables (acide chlorogénique, gossypol, raffinose, stachyose, etc.) et il est adapté à la préparation de produits isolés protéiques ayant un degré de pureté élevé, une couleur blanche à blanc crème dans le domaine des protéines entièrement solubles.
Le procédé en question prévoit l'utilisation d'un solvant organique polaire constitué par un alcool, une cétone ou un ester et par une solution aqueuse d'un électrolyte ayant une nature acide, choisi parmi les acides organiques et minéraux et les sels acides de ceux-ci.
L'électrolyte affaiblit l'interaction entre les protéines et les phénols tandis que le milieu faiblement acide tel que prévu pour l'électrolyte, augmente la solubilité des phénols. Le procédé d'extraction est effectué à une température s'échelonnant entre 4[deg.]C et la température à laquelle la dénaturation des protéines commence, avec un rapport final farine à solvant qui varie de 1 à 5 jusqu'à. 1 à 240 et un pH du solvant qui s'échelonne entre 2,0 et 6,0.
Parmi les farines végétales qui contiennent des phénols et des oligosaccharides fermentescibles, la farine de graines de tournesol, la farine de fèves de soja et la farine de graines de coton ont été soumises à un traitement avec une solution acide dans le n-butanol.
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L'acide chlorogénique (acide 3:3'-cafeylquinic�e) est équivalent environ aux 70% des composés phénoliques du tournesol et il est présent dans diverses variétés de
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que et acide trans-cinnamique) et par quelques composés encore non identifiés, sinon qu'ils ont été découverts par "Sabir,
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L'utilisation dans l'alimentation humaine des produits isolés protéiques provenant des farines de graines de tournesol est considéra blement empêchée par la présence d'acide chlorogénique qui, dans le milieu légèrement alcalin utilisé
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à la fois aux extraies et aux produits isolés protéiques une couleur qui, selon le pH, varie du vert au brun.
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solubles dans l'eau. Ces composés apparaissent également dans les produits isolés, puisqu'ils sont éliminés durant le procédé d'extraction des protéines.
FARINE DE GRAINES DE COTON
La limitation principale à l'utilisation des protéines du coton comme aliment est due à l'association d'un
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8,8'-dicarboxyaldéhyde), avec la fraction protéinique. De tout le gossypol, une partie réagit avec les protéines desgraines de coton et une partie est trouvée libre. Les effets toxiques du gossypol ampêchent l'utilisation des protéines des graines de coton dans les produits alimentaires.
Diverses méthodes ont été suggérées pour éliminer ou désactiver le gossypol (Vaccarino, C.J. Amer. 011
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sont efficaces mais elles utilisent seulement des farines de graines de coton faibles en gossypol.
Afin d'expliquer plus en détail le procédé suggéré par la présente invention, référence sera faite, dans la description qui va suivre, à quelques exemples non limitatifs qui se réfèrent à l'extraction de l'acide chlorogénique et du raffinose à partir de l'huile de graines de tournesol, de gossypol à partir de la farine de graines de coton et de raffinose et de staohyose à partir de la farine de fèves de soja. Pour ces exemples, les matières suivantes ont été utilisées et les processus mis en évidence ci-après ont été adoptés.
MATIERES
Acides chlorogénique et caféique, à l'état pur, fournis par Fluka AG, Bueks SG. saccharose, raffinose et stachyose, à l'état pur, fournis par Sigma Chem. Co.,
acide chlorhydrique pur fourni par Merck, alcool n-butylique et n-hexane comme solvants fournis par Carlo Erba comme réactifs Erba purs, RPE (Reattivo Puro Erba),
gossypol-acide acétique préparé en laboratoire par extraction à partir de graines de coton décortiquées selon
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METHODES
La méthode de macro-Kjeldahl est utilisée pour déterminer l'azote et la valeur en azote protéiniqueest obtenue en multipliant l'azote total par 6,25.
L'humidité, les lipides et la fibre brute sont mesurées selon les méthodes normalisées selon A.O.A.C.
(Association Official Analytical Chemists, 12ème édition (1975).
Le dosage de l'acide chlorogénique en ce qui concerne l'exemple 1 seulement a été effectué selon la méthode A.O.A.C 14.025 llème édition, (1970).
L'acide chlorogénique, l'acide caféique, le saccharose et le raffinose ont été déterminés dans les exemples 2 et 3 selon des méthodes de chromatographie gazeuse sous forme
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J,A., J. Agr. Food Chem., 22 572 (1974), tandis que le saccharose, le raffinose et le stachyose ont été déterminés dans le même sens dans l'exemple 5. L'analyse du gossypol libre et total a été effectuée selon les méthodes normalisées par A.O.C.S. (Officiai and Tentative Methods de l'American 011 Chemists' Society, 3ème édition (1972) Ba 8-58 et Ba 8-55, respectivement).
TECHNIQUES DE CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE (glo)
Préparation des échantillons - les composés phénoliques et les oligosaccharides tels qu'ils sont présents dans la farine dégraissée et les concentrés protéiques sont extraits par du méthanol aqueux à 80% dans le rapport de 1 à
100 farine/solvant pendant 5 heures au reflux (Mikalojczak, K.L., Smith, Jr. C.R., et Wolff, I.A. (1970) J. Agr. Food Chem. 18, 27). L'extrait méthanolique est évaporé à siccité
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2,0 et la solution résultante est ajustée à un pH de 6,0 par addition de NaOH dilué, La solution est évaporée à siccité
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charides sont extraits à température ambiante par du méthanol anhydre en une quantité mesurée; la suspension est centrifugée et une fraction du liquide surnageant est évaporée à siccité dans un courant d'azote à température ambiante dans les fioles de réaction et le résidu est sylilé avec une quantité connue de TRI-SIL 'Z' par incubation à 60[deg.]C durant 2 heures, TRI-SIL étant le N-triméthylsilylimidazole fourni par Pierce Chemical Co.
Conditions chromatographiques.
L'analyse glc est effectuée en utilisant un chromatographe à gaz du type HP 7620 A équipé d'un intégrateur automatique de type HP 3380A. Les conditions expérimentales sont les suivantes:
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Dans le cas des farines de fèves de soja,
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changements suivants:
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Les o-biphénols et les oligosaccharides des extraits ont été identifiés sur la base des temps de rétention des composés purs correspondants . L'analyse quantitative des divers pics a été effectuée avec un intégrateur automatique. Des quantités
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de raffinose et de stachyose ajoutées aux extraits ont été récupérées avec des rendements quantitatifs.
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N.Y. Acad. Sci., 121, 404).
PREPARATION DES FARINES VEGETALES
Les farines devant être soumises à l'extraction
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sence de n-hexane dans le rapport des graines au solvant de
1 à 2. Les farines ont été dégraissées avec le n-hexane dans le rapport poids à volume de 1 à 10 tout en agitant durant 16
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sous vide en utilisant une pompe filtrante sur un entonnoir Buchner de porcelaine en utilisant un papier filtre Whatman n[deg.] 4. Les farines ont été séchées dans un courant d'azote du-
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degré n[deg.] 2. La composition chimique du produit sec a été déterminée par les méthodes normalisées pour l'humidité, les protéines, les lipides et la fibre brute : les teneurs en phénols et oligosaccharides dans la farine de graines de tournesol et dans la farine de soja ont été déterminées selon les méthodes de chromatographie gazeuse,
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On a réalisé comme suit la préparation du solvant utilisé dans l'exemple 1 pour l'extraction de l'acide chlorogénique à partir de l'huile de graines de tournesol :
On mélange 1 litre d'alcool n-butylique avec
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à un pH de 2,48, on agite sporadiquement la liqueur et on la laisse au repos pendant une nuit dans un entonnoir de séparation. La phase supérieure que l'on recueille après avoir dé-
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le procédé d'extraction concerné.
On tamise la farine de graines de tournesol telle que préparée dans le sens décrit ci-dessus en utilisant une machine de tamisage du type Fritsch Analysette 3 ayant une dimension de grain de 0,050 mm et on la mélange avec le solvant dans un rapport poids/volume de 1 à 30 durant 30 minutes à 30[deg.]C tout en agitant.
On centrifuge la suspension à 5000 tours/minute
<EMI ID=28.1> température ambiante durant 10 minutes.
Après avoir décanté la liqueur surnageante, on répète l'extraction avec le solvant plusieurs fois consécutives
(de 5 à 10 extractions) de la manière décrite ci-dessus. On suit la tendance de l'essai d'extraction en mesurant chaque
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courant d'azote durant 3 heures et l'on détermine les teneurs résiduelles en acide chlorogénique sur cette matière selon
la méthode A.O. A.C. 14 025.
EXTRACTION DES PHENOLS ET DES OLIGOSACCHARIDES PARTIR DE LAFARINE DE GRAINES DE TOURNESOL. DE LA FARINE DE GRAINES DE
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On effectue comme suit la préparation du solvant pour l'extraction des phénols et des oligosaccharides à partir des farines de graines de tournesol, de graines de coton
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hyorique à un pH de 2,30. Dans ces rapports, le solvant organique est complètement miscible à la phase aqueuse. On ajoute le solvant résultant à la farine devant être extraite dans différents rapports de farine à solvant tout en agitant pen-
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bilité minimum des protéines contenues dans la farine qui doit être examinée. On obtient la constance du pH par addition d'acide chlorhydrique demi-normal à la suspension tout en agitant et également en ajoutant une solution de pH 0,5 formée par 92 parties d'alcool n-butylique et de 8 parties d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique. On filtre la suspension
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(de 2 à 8 fois) sur le résidu de la manière décrite ci-dessus.
A la fin des extractions, on sèche les concentrés protéiques ainsi obtenus dans un courant d'azote durant au moins 3 heures. Sur différentes portions de matières sèches on détermine la composition chimique en ce qui concerne l'humidité, les protéines,
les lipides et la fibre brute. Sur un tel concentré, on dé-termine les teneurs résiduelles en acide chlorogénique, acide
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PREPARATION DES PRODUITS ISOLES PROTEIQUES
On soumet les concentrés protéiques ainsi ob-
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férents d'extraction des protéines : une méthode d'extraction non sélective en un stade, dans un milieu alcalin et une seconde méthode en deux stades qui opère un fractionnement entre les protéine.% solubles dans l'eau de faible poids moléculaire ayant une mobilité élevée du point de vue électrophorèse et les protéines qui sont solubles dans un milieu alcalin et qui
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point de vue électrophorèse. La seconde méthode donne deux produits isolés avec des compositions et des propriétés différences.
EXTRACTION EN UN STADE
On délaye une partie du concentré protéique provenant du procédé d'extraction dans 15 parties d'eau,
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1/15 poids en volume) et on agite durant 30 minutes à 25[deg.]C.
On centrifuge la bouillie à 17.000 tours/minu-
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RB-2 avec un rotor du type SS-34. On répète une seconde extraction dans les mêmes conditions sur le résidu. On combine les deux liqueurs surnageantes et on fait précipiter les protéines avec HC1 0,5 N au point isoélectrique. On laisse sédi-
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durant 10 minutes et on le lave ensuite avec une solution aqueuse acide. On reprend le précipité protéique par un milieu
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de la glace.
On réalise le dosage de l'azote total par la méthode de Kjeldahl sur le précipité, le liquide surnageant et le résidu insoluble.
EXTRACTION EN DEUX STADES
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que avec 15 parties d'eau à un pH de 6,5 (rapport farine à solvant en poids par volume égal 1/15) durant 30 minutes tout en agitant à 25[deg.]C. On centrifuge la suspension à 17.000 tours/ minute durant 20 minutes et on effectue une seconde extraction dans les mêmes conditions sur le résidu. On effectue sur les deux liqueurs surnageantes combinées la précipitation des protéines au point isoélectrique. On lave le précipité avec une solution acide, on le délaye à nouveau dans l'eau, on le neutralise à pH 7, 0 et on le sèche par évaporation de la glace.
II) Sur le résidu insoluble provenant du premier stade d'extraction, on effectue une solubilisation
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conditions que rapportées pour le procédé d'extraction en un stade.
D'autres détails ressortiront des exemples rapportés pour une meilleure compréhension de la présente invention qui toutefois ne présentent pas un caractère limitatif de la présente invention.
EXEMPLE 1 EXTRACTION DE L'ACIDE A PARTIR DES
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Composition chimique des graines :
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La farine de graines de tournesol telle que préparée dans le sens décrit ci-Cossus a la composition suivante :
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On mélange 10 g de farine ayant une dimension de grain de 0,050 mm dans un flacon avec 300 ml de solvant durant 30 minutes à 30[deg.]C tout en agitant. On centrifuge le mélange à 5000 tours/minute durant 10 minutes à température ambiante, on le décante et on répète l'extraction avec 300 ml supplémentaires de solvant frais. On effectue ce traitement consécutivement pour un total de huit fois (rapport final farine à solvant 1/240).
on détermine la teneur en acide chlorogénique de
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par rapport à un blanc à base de solvant; les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 ci-après.
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Or. détermine sur le résidu des huit extractions, séché
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d'acide chlorhydrique. L'extraction s'opère durant 15 minutes à 25[deg.]0 sous agitation. Le pH initial de la suspension a une valeur de 6,2 : durant l'extraction on le règle à 5,0 et on le maintient à cette valeur par de faibles additions d'acide chlorhydrique 0,5 N. On filtre la suspension sur un entonnoir
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et on effectue les extractions répétées sur le résidu solide, jusqu'à un total de huit extractions (rapport final farine à solvant 1/160).
Le produit résultant séché dans un courant d'azote durant trois heures a la composition suivante :
Humidité 12,2%
Sur la matière sèche :
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Ce produit, à cause de sa teneur en protéine (72,9%)
est défini comme un concentré protéique : il est essentiellement exempt d'oligosaccharides et de constituants phénoliques
qui sont responsables de la couleur verte qui est formée durant l'extraction des protéines dans un milieu alcalin. L'analyse par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide des protéines extraites du concentré montre qu'elles sont du même type du point de
vue électrophorèse que celles qui sont isolées de la farine de graines de tournesol, b) Préparation de produits isolés protéiques par extraction en un seul stade,
On délaye 10 g de concentré protéique dans 150 ml d'une solution alcaline aqueuse à un pH de 9,5 (rapport farine à
solvant 1/15, poids en volume) durant 30 minutes tout en agitant
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tante de 9,5 durant la totalité du temps d'extraction par addition de faibles quantités de solution de NaOH dilué. On centrifuge la suspension à 17 000 tours/minute durant 20 minutes et on soumet le résidu à nouveau à une extraction dans les mêmes conditions d'indiquées ci-dessus, On combine les deux solutions protéiques et on fait précipiter par HC1 0,5N à un pH de 5,2.
On sépare le précipité par centrifugation à 17 000 tours/minute durant 10 minutes, on le lave avec de l'eau acide ayant un
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glace. Les teneurs relatives en protéines du produit isolé, du liquide surnageant et du résidu insoluble provenant de la méthode d'extraction en un seul stade sont indiquées dans le tableau II.
La couleur du produit isolé est blanc crème léger.
<EMI ID=57.1> tion à deux stades.
I) On ajoute 10 g de concentré protéique à 150 ml d'une solution aqueuse de pH 6,5 (rapport farine à solvant, poids en
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tient le pH de la suspension constant à 6,5 par addition de faibles quantités de solution de soude 0,02N. On centrifuge la suspension à 17 000 tours/minute durant 20 minutes et l'on soumet le résidu à nouveau à une extraction dans les mêmes conditions.
On fait précipiter les deux solutions protélques combinées
par HC1 0,5N à. un pH de 4,0. On sépare le précipité par centrifugation à 17 000 tours/minute durant 10 minutes, on le
lave avec de l'eau acidifiée à un pH 4,0, on le délaye à nouveau dans l'eau, on le neutralise à pH 7,0 et éventuellement
on le sèche par évaporation de la glace.
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II) Sur le résidu insoluble provenant du procédé précédent on effectue une extraction des protéines dans un milieu alcalin à un pH de 9,5 dans les mêmes conditions que décrites dans la méthode d'extraction des protéines en un seul stade.
Les teneurs en protéines relatives au produit isolé,
au liquide surnageant et au résidu insoluble provenant du procédé d'extraction en deux stades sont insérés dans le tableau II.
Le produit isolé II a une couleur blanc crème légère.
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EXEMPLE Optimisation du procédé d'extraction des o-biphé-
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La farine de graines de tournesol utilisée a la même composition que rapportée dans l'exemple II.
On ajoute 20 g de farine deshuilée dans un flacon à
100 ml d'un solvant formé de 92 parties d'alcool n-butylique et de 8 parties d'une solution aqueuse de HC1, l'extraction
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pH initial de la suspension 6,2 et durant l'extraction on le maintient constant à une valeur de 5, 0 avec de faibles additions
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S extractions sur le résidu solide (rapport final farine à solvant 1/40). On sèche dans un courant d'azote durant 3 heures le produit résultant qui a la composition :
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Ces résultats montrent que par passage d'un taux d'extraction farine à solvant de 1/160 (Exemple 1) à 1/40, les teneurs résiduelles en acide chlorogénique et acide caféique restent inaltérées (inférieures à 0,05%) tandis que les capacités d'extraction du saccharose et du raffinose sont diminuées.
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de coton décortiquées
La farine de graines de coton utilisée a la composition suivante :
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On ajoute 20 g de farine de graines de coton dégrais-
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agitation. Le pH initial de la suspension a une valeur de 6,1. Durant l'extraction on le maintient constant à une valeur
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suspension sous vide sur un entonnoir BUchner avec un papier filtre Whatman n[deg.] 3 et on effectue sur le résidu solide huit extractions (rapport final farine à solvant 1/160) dans les mêmes conditions que rapportées ci-dessus. On sèche le concentré protëlque résultant dans un courant d'azote durant 3 heures celui-ci a la composition suivante :
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Le traitement avec l'alcool n-butylique et la solution
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téines) dans des conditions de non dénaturation avec des teneurs résiduelles faibles en gossypol libre et total. La méthode suggérée selon la présente invention a l'avantage de pouvoir utiliser également la farine de graines de coton ayant une teneur élevée en gossypol, laquelle est à présent inappropriée pour la préparation de concentrés et de produits isolés protéiques.
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variété Ada
Composition chimique de la farine :
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On ajoute 20 g de farine de soja deshuilée dans un flacon à 400 ml d'un solvant formé de 92 parties d'alcool n-butylique et de 8 parties d'une solution aqueuse de HC1, l'extrac-
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par addition de faibles quantités de HC1 0,5N.
On filtre la suspension sous vide sur un entonnoir
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effectue sur le résidu solide des extractions répétées jusqu'à un nombre de 8 (rapport final farine à solvant 1/160). On sèche le produit résultant dans un courant d'azote durant 3 heures, il a la composition suivante :
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Ce produit, du fait de sa teneur en protéines (65,9%) est défini comme un concentré protéique et il a une teneur faible en
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1. Procédé d'extraction de phénols et d'oligosaccharides à partir des tissus végétaux, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter lesdits tissus végétaux ou les produits obtenus à partir de ceux-ci avec un solvant organique polaire constitué par un alcool, une cétone ou un ester conjointement avec une solution aqueuse d'un électrolyte ayant une nature acide choisi parmi les acides organiques et minéraux et les sels acides de ceux-ci.
2. Procédé d'extraction de phénols et d'oligosacchari-