BE844837A - Polypeptides derives de la somatostatine - Google Patents

Description

  "Polypeptides dérivés de la somatostatine"  <EMI ID=1.1> 

  
une influence inhibitrice 1) sur la sécrétion de l'homone de croissance par la glande pituitaire, 2) sur la sécrétion de glucagoa et d'insuline par le pancréas et 3) sur la sécrétion de polypeptide intestinal vasoactif, de sécrétine, de gastrine et d'acide gastrique chez l'homme et les animaux. Plus particulièrement, l'invention a pour objet des peptides qui inhibent efficacement la libération de l'hormone de croissance par la glande pituitaire et la libération de glucagon et d'insuline par le pancré as .

  
 <EMI ID=2.1> 

  
hormone de croissance est décrit dans le brevet des E.U.A. n[deg.]

  
3 904 595. Ce peptide a été nommé "somatostatine". La somatostatine est un tétradécapeptide et répond à la structure suivante, dans laquelle les fragments aminoacide sont numérotés de gauche à droite selon la nomenclature usuelle :

  

 <EMI ID=3.1> 


  
La somatostatine, la forme linéaire de somatostatine (dihidro- <EMI ID=4.1>  te invention porte sur cette découverte que certains aminoacides peuvent remplacer les substituants aminoacides du squelette de la somatostatine et de la dihidrosomatostatine, donnant ainsi des peptides qui sont thérapeutiquement utiles lorsqu'on les introduit directement ou indirectement dans le courant sanguin des mammifères pour inhiber la sécrétion d'hormone de croissance&#65533;ar la glande pituitaire et celle d'insuline et de glucagon par le pancréas. On peut introduire indirectement les peptides dans le courant sanguin par voie nasale, par implantation sous-cutanée ou intramusculaire ou par toutes autres méthodes connues, avec ou sans la présence d'un diluant ou véhicule. On peut introduire directement les peptides dans le courant sanguin par injection.

   On a trouvé que divers peptides de l'invention ont un pouvoir plusieurs fois supérieur à celui de la somatostatine quand on les utilise pour inhiber l'hormone de croissance, l'insuline et le glucagon.

  
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ayant un effet d'inhibition : 1) sur la sécrétion d'hormone de

  
 <EMI ID=6.1> 

  
glucagon et d'insuline par le pancréas des mammifères, y compris  <EMI ID=7.1> 

  
Ces buts de l'invention, ainsi que d'autres, apparaîtront mieux dans la description détaillée ci-après.

  
Généralement, selon l'invention, on a trouvé que des peptides ayant une activité biologique d'inhibition de la sécrétion d'hormone de croissance sont celles qui répondent à la structure :

  

 <EMI ID=8.1> 


  
 <EMI ID=9.1> 

  
représente Ala, Asn ou dès-R2. On a déterminé que Tyr peut remplacer l'un des Phe en positions 7 et 11 ou tous les deux, sans que cela influence l'efficacité des peptides.On a découvert aussi que Ala peut remplacer tout substituant aminoacide des peptides ci-dessus.

  
Des groupes acyle préférentiels que l'on a trouvés propres à

  
 <EMI ID=10.1>  les peptides pontés, il est préférable que l'aminoacide ne contienne pas de groupe sulfhydryle; (c) un dipeptide tiré de deux aminoacides quelconques dont le deuxième, relié à Cys<3>, ne cause pas d'empêchement stérique ; le deuxième aminoacide est de préférence Gly, Ala ou 5 -Ala ; pour les peptides pontés, il est préférable que les aminoacides des dipeptides ne contiennent pas de groupe sulfhydryle ; (d) un tripeptide dont le troisième amino-

  
 <EMI ID=11.1> 

  
les deux autres aminoacides sont quelconques ; le troisième aminoacide du tripeptide est de préférence Gly, Ala ou D-Ala ; pour les peptides pontés, il est préférable qu'aucun des aminoacides du tripeptide ne contienne de groupe sulfhydryle ; (e) un pentapeptide dont les trois premiers constituants aminoacides sont Gly, le quatrième est Ala ou D-Ala et le cinquième, relié à Cys', ne cause pas d'empêchement stérique et peut être Ala, Gly ou D-Ala ; (f) des acides organiques aliphatiques, aromatiques ou cycliques autres que les aminoacides, contenant 1 à 10 atomes de carbone ; les acides organiques peuvent être saturés et/ou contenir d'autres groupes fonctionnels ; des groupes acyle particulièrement préfé-

  
 <EMI ID=12.1> 

  
Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, acétyle, acroyle, pivaloyle, et  <EMI ID=13.1> 

  
Sauf lorsqu'on utilise D-Trp, chacun des aminoacides contenus dans la partie des peptides de l'invention qui est située entre les deux groupes Cys et comprend ceux-ci, donc aux positions 3 à
14, est l'isomère L lorsque l'aminoacide comporte des formes iso-

  
 <EMI ID=14.1> 

  
tides de l'invention peut être l'isomère L ou l'isomère D lorsque l'aminoacide comporte des formes isomères. Un peptide préférentiel

  
 <EMI ID=15.1> 

  
 <EMI ID=16.1> 

  
on obtient des peptides ayant un pouvoir plusieurs fois supérieur à celuidelasomatostatine quant à l'inhibition de l'hormone de croissance et aussi quant à la libération de glucagon et s'insuline. En remplaçant par Ala divers aminoacides du squelette de la somatôstatine, on obtient aussi des peptides ayant une activité pharmaceutique notable.

  
On prépare synthétiquement les peptides de l'invention par des techniques en phase solide, généralement par le procédé décrit dans le brevet des E.U.A. n[deg.] 3 904 595 déjà cité. On conduit la synthèse de façon discontinue sur une résine chlorométhylée. La résine est composés de perles fines (20 à 70 microns de diamètre) d'une résine synthétique que l'on prépare en copolymérisant le styrène avec 1 à 2 % de divinylbenzène. Les noyaux benzène de la résine sont chloromcthylés dans une réaction Friedel-Crafts sur l'éther chlorométhyl-méthylique et le chlorure stannique. Le chlore ainsi introduit est en liaison réactive du type chlorure de benzyle. On poursuit la réaction Friedel-Crafts jusqu'il ce que la résine contienne 0,5 à 2 millimoles de chlore par gramme de résine.

   Dans la suite de la'description de la synthèse des peptides, les réactifs utilisés sont d'abord définis par leur nom chimique, leur abréviation usuelle étant entre parenthèses ; par la suite, on désigne le réactif par l'abréviation usuelle.

  
On prépare un peptide répondant à la structure : 

  

 <EMI ID=17.1> 


  
par la technique on phase solide ci-après. On prépare par une technique similaire d'autres peptides définis ci-après.

  
 <EMI ID=18.1>   <EMI ID=19.1> 

  
le sel de potassium de l'aminoacide protégé par Boc. On n'utilise qu'un milliéquivalent de Cys protégé par milliéquivalent de Cl de la résine. Le procédé 3 est décrit plus en détail ci-après : à une bouillie de la résine et du Cys protégé dissous dans DMSO, on ajoute 0,9 milliéquivalent (méq) de tertbutylate de potassium
(KOtBut) par méq d'aminoacide. On expose le mélange le moins possible à l'air de façon qu'on n'observe pas de coloration ambrée.

  
La réaction à 80[deg.]C pendant 2 heures donne une résine substituée

  
 <EMI ID=20.1> 

  
d'aminoacide par gramme de résine). Après élimination du groupe protecteur et neutralisation, on forme la chaîne peptide sur la

  
résine. L'élimination du groupe protecteur, la neutralisation et l'addition de chaque aminoacide s'effectuent selon le programme I.

  
 <EMI ID=21.1> 

  
aminoacide, si ce n'est que l'on peut utiliser n'importe quel &#65533; groupe protecteur de groupe " -amine pour le résidu alanine
(benzyloxycarbonyle ; Z; Boc etc.). Après élimination du groupe protecteur du premier résidu (c'est-à-dire SpOMe Bzl Cys) selon

  
 <EMI ID=22.1> 

  
de Ser en même temps qu'un agent d'enchaînement qui est le dicyclo- <EMI ID=23.1>  thréonine. On utilise l'ester p-nitrophénylique (ONp) pour activer l'extrémité carboxyle de Asn. On peut aussi utiliser à cet effet l'ester o-nitrophénylique. On peut utiliser des groupes formyle

  
 <EMI ID=24.1> 

  
peptide est un acide organique, on rattache celui-ci au peptide avant de le détacher de la résine. Pour rattacher l'acide organique au peptide fixé sur la résine) on introduit l'acide organique en présence de DCC ou de l'anhydride organique ou de l'ester actif organique. On peut aussi ajouter l'acide organique en l'utili- <EMI ID=25.1> 

  
ajouté. 

  
1 - Programme pour l'enchaînement d'aminoacides autres que Asn

  
dans une synthèse en phase solide (5 à 10 g de résine)

  

 <EMI ID=26.1> 


  
 <EMI ID=27.1> 

  
ninhydrine ; si l'essai est négatif, revenir à l'étape 1 pour l' enchaînement de l'aminoacide suivant ; si l'essai est positif ou légèrement positif, revenir aux étapes 9 à 13. On utilise le pro-

  
 <EMI ID=28.1> 

  
avec Cys, à l'exception de Asn lorsqu'il est présent. Pour Asn, les étapes 1 à 8 sont les mêmes et on utilise le programme II pour le reste de la réaction d'enchaînement :

  
Programme II page suivante. 

  
 <EMI ID=29.1> 

  
actif dans une synthèse en phase solide (5 à 10 g de résine)

  

 <EMI ID=30.1> 


  
Après l'étape 14, on prélève une portion pour un essai à la

  
 <EMI ID=31.1> 

  
enchaînement de l'aminoacide suivant ; si l'essai est positif ou légèrement positif, revenir aux étapes 9 à 14.

  
La coupure entre les peptides et la résine (5 g) et.l'élimination des groupes protecteurs en chaîne latérale du peptide s' effectuent dans l'acide fluorhydrique (75 ml) en présence d'anisole (8 ml). Après élimination de l'acide fluorhydrique sous vide poussé, on lave ensemble résine-peptide à l'éther.

  
On extrait immédiatement la résine séchée par l'acide acéti-

  
 <EMI ID=32.1> 

  
(N2). On ajuste le pH de la solution entre 6,6 et 7,0 avec NH40H. On titre la solution goutte à goutte en agitant avec une solution de ferricyanure de potassium (1 g/500 ml de Il 20) jusqu'à ce qu'on observe une couleur jaune permanente. On laisse reposer la solution pendant 10 minutes et on ajuste le pH à 5,0 au moyen d'acide

  
 <EMI ID=33.1> 

  
 <EMI ID=34.1> 

  
on agite pendant 15 minutes. On filtre la solution sur de la celite et on l'applique successivement sur deux colonnes : a) ré-

  
 <EMI ID=35.1> 

  
Rex-70" (100 ml), forme cationique. On lave soigneusement le touxteau de célite et de résine avec 500 ml d'eau que l'on applique

  
 <EMI ID=36.1> 

  
moyen d'un mélange pyridine-acide acétique-eau (30 : 4 : 66) ou  <EMI ID=37.1> 

  
dilue à l'eau seulement celles qui contiennent du peptide (positives à la ninhydrine) et on les lyophilise immédiatement. On obtient 1,2 g de matière brute de couleur crème. On l'applique sur

  
 <EMI ID=38.1> 

  
et on élue par l'acide acétique 2n.

  
La courbe d'élution observée à 280 nm présente un pic symé-

  
 <EMI ID=39.1> 

  
une colonne de partage 1,8 x 100 cm (butanol normal-acide acétique
-eau 4 : 1 : 5). La courbe d'élution (280 nm) présente un pic principal de V 2,5 à 4,0. On sépare deux fractions qui apparaissent ensuite identiques à la chromatographie en couche mince (165 mg) <EMI ID=40.1> 

  
vées à la chromatographie en couche mince pour les peptides synthétiques. Le produit désiré s'élue sous la forme d'une bande très étroite qui, après 2 lyophilisations, donne une poudre duveteuse blanche (Il; mg). On observe une impureté peu importante

  
 <EMI ID=41.1> 

  
acétique-eau (4:1:5) (BAW). On applique cette matière (100 mg) sur une colonne de partage 1,8 x 100 cm. La courbe d'élution (280

  
 <EMI ID=42.1> 

  
 <EMI ID=43.1> 

  
utilise pour inhiber la libération d'hormone de croissance par les cellules pituitaires mises en culture ou pour inhiber la libération d'insuline et de glucagon par le pancréas sous l'action de l'arginiue.

  
On peut utiliser des esters actifs dans une synthèse en phase solide et on peut aussi utiliser le procédé classique de synthèse pour préparer les peptides de l'invention.

  
On a mis au point un titrage in vitro de l'efficacité des

  
 <EMI ID=44.1>  

  
 <EMI ID=45.1> 

  
glandes pituitaires prélevées sur des rats pour en séparer des cellules. On place les adules dans des boîtes de culture sur un milieu Eagle modifié (Dulbecco et al., Virology, volume 8, page
396, 1949). On amène de l'anhydride carbonique et de l'oxygène

  
 <EMI ID=46.1> 

  
de milieu., on ajoute des cultures de cellules qui ont incubé pendant 4 heures et des peptides somatostatines particuliers. On uti-

  
 <EMI ID=47.1> 

  
sécrétion d'hormone de croissance, exprimé en nanogrammes par heure.

  
Les peptides de l'invention inhibent la stimulation basale et stimulée d'insuline et de glucagon chez les mammifères, y com-

  
 <EMI ID=48.1> 

  
la libération d'insuline et de glucagon par le pancréas de rat perfusé, les cellules insulaires isolées et les cultures primaires in vitro de cellules pancréatiques dispersées par voie enzymatique. Il semole que les :peptides ont un effet direct sur les cel-

  
 <EMI ID=49.1> 

  
de glucagon.

  
On étudie comme suit l'effet de la somatostatine, de la di-
-hydrosomatostatine (comme témoin) et des peptides de l'invention, quant à l'inhibition de la libération de glucagon et d'insuline :

  
On utilise dans toutes les expériences des rats mâles SpragusDawley pesant 180 à 220 g, séjournant dans des logements à température et à humidité réglée, avec 14 heures de lumière et 10 heures d'obscurité (lumière de 7 à 21 h). On donne aux animaux de la

  
 <EMI ID=50.1> 

  
moins 5 jours après l'arrivée des rats venant du fournisseur, entre 14 et 16 heures. Après anesthésie par l'éther, on administre des peptides ou du sérum physiologique en un volume de 0,2 ml par la veine jugulaire externe et immédiatement après, un bol de 1 ml d'arginine. Cinq minutes plus tard, on recueille, du sang tronculaire par décapitation rapide.. On effectue la détermination de l'insuline et du glucagon dans le plasma par,des titrages radioimmunologiques spécifiques. On détermine des valeurs d'efficacité rela-

  
 <EMI ID=51.1> 

  
&#65533; quatre et six points. 

  
L'arginine,lorsqu'elle est administrée à une dose de 100 mg/  <EMI ID=52.1> 

  
insuline aussi bien que de glucagon. La somatostatine et la dihydrosomatostatine inhibent la libération d'insuline et de glucagon sous l'action de l'arginine, de façon également puissante en fonction de la dose (indiquée dans les deux cas à 100 ug/100 g de poids du sujet).

  
On prépare divers peptides selon l'invention, conformément

  
à la technique en phase solide décrite ,plus haut. La composition

  
 <EMI ID=53.1> 

  
 <EMI ID=54.1> 

Peptide

  
Témoin (somatostatine)

  
 <EMI ID=55.1> 

  
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Il 12 13 14

  
Peptides de l'invention

  
Les peptides suivants sont pontés et répondent à la structure;

  
 <EMI ID=56.1> 

  

 <EMI ID=57.1> 


  
On détermine, par l'essai in vitro décrit plus haut l'efficacité de la somatostatine (témoin) et des peptides de l'invention quant à l'inhibition de la sécrétion d'hormone de croissance. Cha-

  
 <EMI ID=58.1>   <EMI ID=59.1> 

  
la sécrétion d'hormone de croissance. On détermine aussi l'éfficacité relative des peptides de l'invention., mentionnés au tableau I, pour l'inhibition de la sécrétion de glucagon et d'insuline sous l'action de l'arginine. Chacun des peptides de l'invention est 8 à 10 fois plus efficace que la somatostatine quant à l'inhibition de la sécrétion de glucagon et d'insuline sous l'action de l'arginine. 

  
On prépare divers autres peptides selon l'invention, ayant des structures identiques à celles qui sont indiquées au tableau I, si ce n'est que Tyr remplace Phe à l'une des positions 7 et 11 ou à toutes les deux. Ces peptides .substitués par Tyr ont aussi un

  
 <EMI ID=60.1> 

  
quant à l'inhibition de l'hormone de croissance, du glucagon et de l' insuline .

  
On prépare aussi par synthèse des contre-parties linéaires des peptides selon l'invention, indiqués au tableau I. Ces peptides linéaires ont aussi un pouvoir au moins 8 fois supérieur à

  
 <EMI ID=61.1> 

  
croissance, du glucagon et de l'insuline.

  
Le tableau II indique les pouvoirs relatifs (somatostatine =
100 %) d'une série de peptides de l'invention, quant à l'inhibition de la sécrétion d'hormone de croissance et à l'inhibition de

  
 <EMI ID=62.1>  

  
 <EMI ID=63.1> 

  
Pouvoirs relatifs de la somatostatine (SRIF) et de la somatostatine substituée, quant à l'inhibition de la libération d' hormone de croissance (GH) par les cellules pituitaires antérieures in vitro et à l'inhibition de la libération d'insuii-line et de glucagon sous l'action de l'arginine in vivo. Pour les déterminations in vivo, on administre les peptides par injection dans la veine jugulaire immédiatement avant l'injection d'arginine (100 mg/100 g de poids du sujet)

  

 <EMI ID=64.1> 
 

  
 <EMI ID=65.1> 

  
1. Composé à action inhibitrice de la sécrétion d'hormone de croissance par la glande pituitaire ou de la libération par le pancréas de glucagon et d'insuline chez l.es mammifères, caractéri-

  
 <EMI ID=66.1> 

  

 <EMI ID=67.1> 


  
 <EMI ID=68.1> 

  
 <EMI ID=69.1> 

  
tique aromatique ou cyclique avec jusqu'à 10 atomes de carbone, un hydrogène ou un dérivé dès des groupes précités, et où R2 est Ala, dès-Ala, Asn ou dès-Asn.

Claims (1)

1. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que <EMI ID=70.1>

   dèsamino-Cys, Tyr-Gly, Sarc-Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, GlyGly-Gly-Ala-Gly, Gly-Gly-Gly-Ala-Ala, Gly-Gly-Gly-Ala-D-Ala, Acétyle, Acroyle, Pivaloyle ou Benzoyle.

   3. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R2 est Ala.

   4. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que

   <EMI ID=71.1>

   5. Composé selon une quelconque des revendications 2 à 4,

   <EMI ID=72.1>

   6. Composé selon une quelconque des revendications 2 à 5, ca-

   <EMI ID=73.1>

   <EMI ID=74.1>

   7. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 est Ala.

   8. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 est D-Ala.

   <EMI ID=75.1>

   <EMI ID=76.1>

   Thr , Ser13 et Cys14.

   10. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que

   <EMI ID=77.1>

   un groupe Ala est substitué à D-Trp . <EMI ID=78.1>

   de composé actif au point de vue pharmaceutique, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation d'un ester d'aminoacide Cys

   <EMI ID=79.1>

   la protection de cet aminoacide Cys, et l'enchaînement graduel

   <EMI ID=80.1>

   aminoacide Cys pour former un peptide enchaîné à la résine, ayant

   <EMI ID=81.1>

   <EMI ID=82.1>

   données dans les revendications 1 à 11.

   13. Un intermédiaire convenant pour la préparation de peptides, caractérisé par un peptide enchaîné à un support de

   <EMI ID=83.1>

   <EMI ID=84.1>

   R2 pnt les diverses significations données dans les revendications 1 à 11.

   14. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent un véhicule ou support approprié et au

   <EMI ID=85.1>

   15. Composés nouveaux et leur préparation, comme décrit ci-dessus, notamment dans les Exemples donnés.