MC2131A1

MC2131A1 - Nouveaux derives de peptides intestinaux vasoactifs

Info

Publication number: MC2131A1
Application number: MC902134A
Authority: MC
Inventors: Robert Bolin David
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-28
Publication date: 1992-01-03
Also published as: HUT55803A; CA2019970A1; IL94884A0; FI903296A0; IE902388A1; AU5808490A; PT94553A; FI903296A7; IE902388L; EP0405242A3; EP0405242A2; NO902916D0; US5141924A; NZ234268A; NO902916L; HU904033D0; ZA904897B; JPH0338600A; YU126690A; KR910000794A

Description

Nouveaux dérivés de peptides intestinaux vasoactifs

On a découvert en premier lieu, isolé et purifié le peptide intestinal vasoactif (VIP) à partir d'intestins de porcs (US. 3.879.371). Le peptide comporte 28 acides aminés 5 et .présente une homologie marquée avec la sécrétine et le glucagon (Carlquist et al., Horm. Metb. Res., 14, 28-29, 1982). La séquence des acides aminés dans VIP est comme suit :

I

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-10 Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn- ,

Ser-Ile-Leu-Asn-NH2

On sait que le VIP présente une grande variété d' activités biologiques sur la totalité des voies gastro-15 intestinales et le système circulatoire. En considérant sa similitude avec les hormones gastrointestinales, on a trouvé que VIP stimule la sécrétion pancréatique et biliaire, la glycogénolyse hépatique, la sécrétion du glucagon et de l'insuline et active le dégagement du bicarbonate pancréa-20 tique.

2

[Kerrins, C. et Said, S.I.. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 142. 1014-1017 (1972), Domschke, S. et al. Gastroenterology, 73., 478-480 (1977)].

5 On a localisé les neurones contenant VIP par immunotitrage des cellules des systèmes endocriniens et exocriniens, de l'intestin et du muscle lisse (Polak, J.M et al., Gut. 15_, 720-724, 1974 ). On a trouvé que VIP est un neuroeffecteur qui provoque le dégagement de plusieurs 10 hormones, notamment la prolactine (Frawley, L.S. et al,

Neuroendocrinology, 33, 79-83 (1981), la thyroxine (Ahren, B. et al, Nature, 287, 343-345 ( 1980) et l'insuline et le glucagon (Schebalin, M., et al., Am. J. Physiology E., 232 , 197-200, 1977 ). On a également trouvé que VIP stimule 15 la libération de rénine du rein in vivo et in vitro

(Porter J.P et al. Neuroendocrinology, 36, 404-408, 1983). On a trouvé que VIP est présent dans les nerfs et les terminaisons nerveuses dans les voies respiratoires de diverses espèces animales et chez l'homme (Dey. R.D., et Said, 20 S.I,., Fed. Proc., 39, 1062, ( 1980) ; Said, S.I., et al., Ann. N.Y. Acad. Sciences, 221 , 103-114 ( 1974 ). Les effets cardiovasculaires et broncopulmonaires de VIP sont intéres-

i sants étant donné qu'on a trouvé que VIP est un vaso-dilatateur puissant et un relaxant puissant des muscles 1i s -25 ses, agissant sur les couches vasculaires périphériques, pulmonaires et coronaires (Said, S.I. et al., Clin. Res., 20, 29 (1972). On a trouvé que VIP possède un effet vaso-dilatateur sur les vaisseaux sanguins du cerveau (Lee, T.J et Berszin, I., Science, 224, 898-900, 1984). Les études in 30 vitro ont démontré que le peptide intestinal vaso-actif quand il est appliqué par voie exogène aux artères cérébrales provoque la vasodilatation, ce qui laisse à penser que VIP est un éventuel transmetteur pour la vasodilatation

3

cérébrale (Lee, T. et Saito. A., Science, 224, 898-901, 1984). Dans l'oeil, VIP s'est également révélé un vaso-dilatateur puissant (Nilsson, S.F.E et Bill, A., Acta Physiol. Scand., 121, 385-392, 1984).

5

VIP peut avoir des effets régulateurs sur le système immunitaire. O'Dorisio et al. ont montré que VIP peut moduler la prolifération et la migration des lymphocytes (J. Immunol., 135, 792s-796s (1985).

10

Attendu que VIP détend le muscle lisse et est normalement présent dans les tissus des voies respiratoires, on a avancé l'hypothèse que VIP peut être un médiateur endogène de la relaxation du muscle bronchial lisse (Dey. R.D 15 et Said S.I., Fed. Proc., 39, 1062, 1980). Les tests in vitro et in vivo ont montré que VIP provoque la relaxation du muscle trachéal lisse et protège contre les agents bronchoconstricteurs tels que l'histamine et la prostaglan-dine F2a : fWasserman, M.A. et al.,

20 .Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, éd., Raven

Press, N.Y., 1982, pp 177-184. Said. S.I. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.. 221, 103-114 (1974)].I

I «

Quand on l'administre par voie intraveineuse, VIP protège 25 contre les agents bronchoconstricteurs tels que l'histamine, la prostagl andi ne ?2a' ^es ^ euc°tr1' ënes, le facteur d' activation des plaquettes ainsi que les bronchoconstrictions provoquées par un antigène (Said S.I et al, voir plus haut, 1982). On a également trouvé que VIP empêche la sécrétion 30 du mucus dans les tissus des voies respiratoires humaines in vitro (Col es.- S.J. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 124, 531-536, 1981).

4

Chez l'homme, lors d'une administration par infusion intraveineuse à des patients asthmatiques, VIP s'est révélé provoquer une augmentation du débit d'expiration de pointe et protéger la bronchodilatation induite 5 par l'histamine (Morice A.H et Sever, P.S., Peptides, _7> 279-280 (1986) ; Morice, A. et al., The Lancet, II, 1225-1227, 1983). Les effets pulmonaires qu'on observe à la suite de cette infusion intraveineuse de VIP s'accompagnent, cependant, d'effets cardiovasculaires secondaires, surtout 10 l'hypotension et la tachycardie et aussi des rougeurs du visage. Quand on l'administre par voie intraveineuse en des dosages qui ne provoquent pas d'effets cardiovasculai-res, le VIP ne change pas la conductivité spécifique des voies respiratoires (Palmer et al., Thorax., 41, 663-666, 15 1986). On explique l'absence d'activité comme étant due au faible dosage administré et, aussi, éventuellement à la dégradation rapide du composé.

Quand on l'administre par aérosol à l'homme, le VIP 20 naturel ne possède qu'une efficacité marginale de protection contre la bronchoconstriction induite par l'histamine (Altieri et al., Pharmacol ogi st, 2_5 , 123, 1983 ). On a trouvé que VIP n'a pas d'effet notable sur les paramètres fondamentaux des voies respiratoires, mais a un effet 25 protecteur contre la bronchoconstriction induite par l'histamine, quand on l'administre par inhalation à l'homme (Barnes, P.J et Dixon, C.M.S., Am. Rev. Respir. Dis., 130, 162-166, 1984). Quand on l'administre par aérosol, VIP n' affiche pas d'effet de tachycardie ou hypotenseur conjointe-30 ment avec la bronchodilatation (Said, S.I et al., dans

Vasoactive Intestinal Peptide, S.I Said, ed. Raven Press, N.Y., 1982, pages 185-191).

C

En raison des activités biologiques intéressantes et éventuellement d'une utilité clinique de VIP, cette substance a été la cible de divers programmes synthétiques publiés ayant pour but de rehausser une ou plusieurs propriétés de cette molécule. Takeyama et al. ont décrit un analogue de VIP ayant une substitution de l'acide asparti-que par l'acide glutamique en position 8. On a trouvé que ce composé était moins puissant que le VIP naturel (Chem. Pharm. Bull., 28, 2265-2269 (1980).

Wendlberger et al., ont décrit la préparation d'un analogue du VIP ayant une norleucine de substitution en position 17 pour la méthi oni ne (Peptide Proc. 16ème Symp. Eur. sur les Peptides, 290-295, 1980). On a trouvé que ce peptide possède la même puissance que le VIP naturel en ce qui concerne son aptitude à déplacer le VIP radio-iodé depuis les préparations à base de membrane de foie.

Turner et al. ont indiqué que le fragment VIP (10-28) est un antagoniste au VIP (Peptides, ]_, 849-854, 1986). On a g

également stipulé que l'analogue substitué (4-Cl-D-Phe , Leu^)-VIP se lie au récepteur de VIP et est un antagoniste à l'activité de VIP (Pandol, S. et al., Gastrointest.

Liver Physiol., 13, G553-G557, 1986).

P. Robberecht et al. ont présenté plusieurs analogues du VIP avec des résidus D substitués en position terminale N du VIP naturel (Peptides, _9, 339-345, 1988).

Tous ces analogues se lient moins fortement au récepteur de VIP et font preuve d'une plus basse activité que le VIP naturel dans l'activation c-AMP.

S. Tachibana et 0. Ito ont décrit plusieurs analogues de VIP de la molécule du précurseur (dans Peptide Chem., T. Shiba et S. Sakakibara, eds., Prot. Res. Foundation, 1988, pages 481-486 ).

6

On a démontré que ces composés sont des bronchodilatateurs 1 à 3 fois plus puissants que VIP et ont une activité d'hypotension plus forte de 1 à 2 fois.

Musso et al. ont également présenté plusieurs analogues du 5 VIP avec des substitutions dans les positions 6-7, 9-13, 15-17 et 19-28. (Biochemistry, 27, 8174-8181 (1988) ;

Brevet européen 88271141). On a trouvé que ces composés sont d'une puissance égale ou inférieure à celle du VIP naturel en ce qui concerne la liaison au récepteur du VIP 10 et la réponse biologique. De plus, US 4.605.641 et 4.734.400 décrivent des analogues à VIP.

La présente invention comprend des composés de formule :

15

X_Rl"R2~R3"Ala~R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12'

R13~R14~R15~R16~R17"Ala R19 R20 R21 R22

20 R23_R24_R25~R26 R27_R28 Y

25

dans laquelle est His, Ala, N-CHj-Ala,D-A1 a,G1y,pyro-Glu,B-Ala ou est supprimé ; R2 est Ser ou Ala ; R^ est Asp ou Ala ; R^ est Val, Leu ou Ala ; Rg est Trp, Ala ou

X,

■N' H

•C<

il

O

30

35

dans laquelle Q -

=WX2

"CHï"X_) (CHj)"

ï]

7

10

n = 1,2 ; Xj et X2 représentent chacun indépendamment H, OH, 0CH3, F. Cl. I. CH3. CF3. N02.

NHCOCH , NHCOC£Hc. OU C(CH,)_;

j o 3 j <5

X3 -

NH2. N(CH3)2 H ou F;

R7 = Thr ou Ala; Ala; R,

8

= Asp. Glu ou Ala; Rg =

Asn ou

= Tyr. ou. R.

R

= Thr ou Ala; R.

*10 "6' "11 """ " '12

Arg. Lys, Orn ou Ala; R13 = Leu ou Ala; R14 = Arg, Lys ou Ala; R = Lys ou Ala; Rn, = Gin ou Ala; R.

lD XO

Met, Nie ou Ala; R.

E21

Ala; R

19

= Lys ou Ala; R

24

22

=? Asn ou Ala; R

= Val ou Ala; R = Tyr, ou R

20 R.

17 ~ Lys ou Ala;

25

6' "23 Ser, Thr ou Ala; R

Leu ou 26

Ile, Val, Leu ou Ala; R

27

= Leu, Lys ou Ala; R

28

Asn, Thr, Lys ou Ala; X = hydrogène.

15

20

O

k4 ,

••dans laquelle est alkyle ou haloalkyle Cj_2

25

CH3S02-, CH3NHCO-,

CH S(O) (CH )-CO-, 3 n 2 2

ch3oco-, OU

OU

n = 0-2; Y = -OX

5'

-NHX ou R7Q-R,n-R,-,-Z: X = H ou alkyle -C1_3:

29 30 31 R29 = Gly ou Ala; R3Q

= Gly. Lys ou Ala; R31 = Gly,

Ala, Met, Cys. Cys(Acm). Thr. Ser. Phe ou -NHX&; Z-

-OXc ou -NHXC;

5 b

8

de sorte qu'on exclut le VIP naturel et un composé de formule :

15

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-R9-Tyr-Thr-R12-Leu-r14"Lys"Gln_Nle"Ala"Val"LyS-LyS~Tyr~LeU~ASn~R25"R26~

Leu-R_ - Y. 28

10 dans laquelle:

X

H. -CO-alkyle C

R9

= Ala, Asn

R12

Arg, Lys, Orn

R14

Arg, Lys

R_

Ser. Thr

25

R_

Ile, Val

26

R28 Y

= Asn, Thr

-OXc, -NHX 5 3

X5

= H, alkyle

, -CO-phenyle

3

20

et leurs sels d'addition avec des atides et des bases phar-maceutiquement acceptables.

9

On préfère des composés dans lesauels X est :

O

formule dans laquelle :

5

X4 = alkyle , CH3S02-. ow

CH_S(O) (CH )_CO-. et n = 1; R. = His. Ala, 3 n 2 2 1

N-CH -Ala,Gly; R = Ser ou Ala; R = Asp ou Ala; R = Val, Leu ou Ala; R, = Phe, p-F-Phe, Ala, 1-Nal;

in

10 g = Thr ou Ala; Rg = Asp, Glu ou Ala; Rg = Asn, Ala; r1q = Tyr. p-NH2-Phe. 2-Nal, Ala. 0-CH3-Tyr; R = Thr, Ala; R = Arg. Lys. Orn ouAla; R

XX i. «3

Leu. Ala; R,. = Arg, Lys, Ala; R. = Lys, Ala; R. =

x4 xd xd

Gin, Ala; R = Met, Nie ou Ala; Rig = Val, Ala;

15

20

30

R20 =Lys. Ala; R21 = Lys. Ala; R22 = Tyr. Ala m-F-Tyr; R23 = Leu, Ala; R24 = Asn, Ala; R25 = Ser,

Thr ou Ala; R2g = Ile, Val, Leu ou Ala; R27 = Leu,

Ala. Lys; R2g = Asn, Thr, Ala, Lys et Y = 0H» NH2 ou

R-,«-R,„-R,,-z où Z = OXc ou NHX_ où- X = 29 30 31 5 5 5

• H, et R2g = Gly, Ala; R3Q = Gly. Lys. Ala; et R = Cys(Acm). Met, Ala;

»

Parmi ces composés, on préfère ceux dans lesquels X est

25 O

A

X4 = CH3; Rx = His. N-CH3-Ala; R2 = Ser; R3

= Asp; R = Val, Leu; R. = Phe, p-F-Phe; R_ = Thr; 5 6 7

R8 = Asp, Glu; Rg - Asn; R1Q = Tyr. p-NH2-Phe, 2-Nal; Ri;l =Thr; R12 = Arg. Lys, Orn; R13 = Leu; R14 = Arg, Lys; R15 = Lys; Rlfi = Gin; R1? - Met. Nie. Ala; Rlg =. Val, Ala; R2Q = Lys; R21 =: Lys;

35 R22 '= Ty,:: R23 " LeU: R24 = RSn: S25 * Ser" Thr 1

10

R^g = Ile, Val ; R^7 = Leu ; R2g = Asn, Thr et Y = OH, NH2

ou R29"R30"R3rZ' où R29 = Gly ' R30 = Gly' Lis ; R31 = Cys(Acm), Met, Ala ; et Z = -OH ou -NH2 .

Parmi ces composés, on préfère particulièrement

5 ceux dans lesquels R1Q = Tyr, p-NH2-Phe ; R12 = Lys, Orn ;

R24 = Arg ; RJ7 = Nie, Ala ; R^5 = Ser ; R2g = Val ; R2g =

Thr et Y = OH, NH2 de sorte qu'on préfère surtout ceux dans lesquels R^2 = Lys et/ou R^ = Nie ou encore ceux dans lesquels Y = R29~R30~R31~Z oû R29 0St G^y' R30 est Gly ou 10 Lys et = Cys(Acm), Met, Ala ; et Z = -OH ou NH2 ; de sorte qu'on préfère également ceux dans lesquels R^^ = Cys (Acm) et/ou R12 = Lys et/ou R17 = Nie et/ou R3Q = Gly ou encore ceux dans lesquels R^ = Leu et/ou R^2 = Orn ou ceux dans lesquels R31 = Met et/ou R3Q = Gly et/ou R^2 = Lys et 15 R^ = Nie.

On préfère également les composés du type décrit dans les pages 6 et 7 dans lesquels X = (CH3)C0- ; R^ =

His ou N-CH3-Ala; R2 = Ala ou Ser; R3 = Asp; Rg = 2Q Val ou Leu; Rfi = Phe ou p-F-Phe; Ry =. Thr. Rg = Asp où Glu; Rg = Asn; R1Q = Tyr. 2-Nal ou p-NH2-Phe;

R11 = ThC; R12 = LyS °U °rn; R13 = LeU; R14 =

Arg; R15 = Lys; Rlfi = Gin; R1? Nie ou Ala; Rig

= Ala ou Val; R2Q = Lys; R21 = Lys; R22 = Tyr;

25 R23 = Leu; R24 = Asn; R25 = Ala. Thr ou. Ser; R2g

= Leu ou Val; R2? = Lys ou Leu; R28 =. Lys ou Thr; et

Y = NH2 ou r29-R3O"R31"Z; R29 = A1* °W Gl7;

R = Ala. Gly ou Lys; R_, =- Ala. Met. Thr. Cys(Acm) 30 "' 31

30 ou absent ; et Z = NH2 de sorte qu'on préfère particulièrement un composé dans lequel R^ = His et/ou R^ = Val ; Rg = Phe ; R1q = 2-Nal ou Tyr ; R12 = Lys ; R17 = Nie ; R25 =

Ala ou Ser et Y = R29~R30~R31~Z ' R30 = Ala 0U G1y ' et R3^ = Ala, Met ou Thr.

11

Dans le présent mémoire, l'expression "alkyle 3" désigne le méthyle, l'éthyle, le propyle et 1 ' isopropy1e .

La nomenclature utilisée pour définir les peptides 5 est celle qu'on emploie normalement dans la technique, le groupe amino à la terminaison N apparaissant à la gauche et le groupe carboxy à la terminaison C apparaissant à droite. On entend par acides aminés naturels l'un des amino-acides naturels qu'on trouve dans les protéines, c'est à dire 10 Gly, Ala, Val , Leu , Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp et His.

On entend par Nie la norleucine ; par Orn, on entend l'orni-thine ; par Ac, on entend acéty 1 e ( CH^CO.). Quand l'amino-acide présente des formes isomères, c'est la forme L de 1 ' 15 amino-acide qui est représentée sauf stipulation contraire.

On indique les analogues de VIP en présentant 1'

amino-acide substitué entre crochets devant "VIP". La dérivâtisation du groupe amino terminal N, c'est à dire

20 par X ci-dessus, est indiquée à la gauche des substitutions entre crochets . Les numéros de séquences indiqués entre parenthèses à la droite de VIP indiquent les suppressions de 1'

amino-acide et les additions aux numéros de la séquence na-

12 17 2 9

turelle. C'est ainsi par exemple que Ac-/"Lys ,Nle ,Gly J-25 VIP(2-29) indique un polypeptide ayant une séquence d'amino-acides qui correspond au VIP humain naturel dans lequel l'hydrogène à la terminaison N est substitué par un groupe acétyle, l'arginine en position 12 a été remplacée par une lysine et la méthionine en position 17 est remplacée par la 30 norleucine. En outre, l'histidine en position 1 a été supprimée et une glycine a été couplée sur le côté carboxyle de l'asparagine 28, qu'on appelle position 29.

12

Les suffixes -OH et -NH2 qui suivent VIP concernent les formes acides libres et amide du polypeptide respectivement. Si aucun suffixe n'est employé, la formule doit couvrir les deux formes.

5 Les abréviations suivantes sont également définies

N-CH^-Ala = N-méthyl-alanine p-F-Phe = p-f1uoro-phénylalanine

1-Nal = 3-(l'-naphtyl)-alanine

2-Nal = 3-(2'-naphtyl )-alanine

10 p-NH2-Phe = p-amino-phény1 a 1anine

0-CH3-Tyr = 0-méthyl-tyrosine Cys(Acm) = S-acétoamidométhyl-cystéine m-F-Tyr = m-f1uoro-tyrosine 15 B-Ala = bêta-alanine .

Les composés représentât!" fs selon l'invention sont notamment les peptides comportant les séquences d'amino-acides ci-après.

20

Ac-[Lys12.Nie17.Val26.Ala28]-VIP Ac-[Lys12,Nie17.Val26,Ala27.Thr28]-VIP Ac-[Lys12.Nie17.Ala26.Thr28]-VIP Ac-[Lys12.Nie17.Ala25.Val26.Thr28]-VIP ; 25 Ac-[Lys12.Nle17.Ala24.Val26.Thr28]-VIP I

Ac-[Lys12.Nie17.Ala23.Val26.Thr28]-VIP ! Ac-[Lys12.Nie17.Ala22.Val26.Thr28]-VIP Ac-[Lys12.Nie17.Ala21.Val26.Thr28]-VIP Ac-[Lys12.Nie17,Ala20.Val26.Thr28]-VIP , 30 Ac-[Lys12,Nie17,Ala19,Val26,Thr28]-VIP

Ac-[Lys12,Ala17,Val26,Thr 2 8]-VIP Ac-[Lys12,Ala16.Nie17.Val26.Thr28]-VIP Ac-[Lys12,Ala15.Nie17.Val26,Thr28]-VIP Ac-[Lys12.Ala14,Nle17.Val26.Thr28]-VIP

35

13

_ r_ 12 ,, 13 17 .26 28, Ac-[Lys .Ala .Nie .Val .Thr ]-VIP

_ r _ , 12 ,, 17 _T ,26 , 28,

Ac-[Ala .Nie .Val .Thr ]-VIP

n r * i r ^-2 , 17 ,26 , 28, Ac-[Ala .Lys .Nie .Val ,Thr ]-VIP

r^, 10 T 12 „, 17 „ ,26 28, Ac-[Ala .Lys .Nie .Val ,Thr ]-VIP

_ r_, 9 _ 12 17 ,_ ,26 28, ,T__ Ac-[Ala .Lys .Nie .Val .Thr ]-VIP

8 12 17 26 28 Ac-[Ala .Lys .Nie .Val .Thr j-VIP

_ r_, 7 _ 12 „, 17 ,26 28, Ac-[Ala .Lys .Nie .Val .Thr j-VIP

Ac-[Ala6.Lys12.Nie17.Val26.Thr28]-VIP

10

35

r > i 5 12 17 ,26 28, _ _ _

Ac-[Ala .Lys .Nie .Val .Thr ]-VIP

Ac-[Ala3.Lys12.Nie17.Val26.Thr28]-VIP

Ac-[Ala2.Lys12.Nie17.Val26.Thr28]-VIP

Ac-[Ala1.Lys12.Nie17.Val26.Thr28]-VIP

Ac-[Gly1.Lys12.Nie17.Val26.Thr28]-VIP

Ac-[Leu5.Lys12.Nie17.Val26.Thr28]-VIP

Ac-[1-Nal6.Lys12.Nie17.Val26.Thr28]-VIP

Ac-[p-F-Phe6.Lys12.Nie17.Val26.Thr28j-VIP

Ac-[Glu8.Lys12.Nie17,Val26.Thr28]-VIP

Ac-[2-Nal10,Lys12.Nie17.Val26,Thr28]-VIP

1 a no i 7 oé o o

Ac-[P-NH2-Phe .Lys .Nie .Val .Thr ]-VIP Ac-[0-CH -Tyr10.Lys12,Nie17,Val26,Thr28]-VIP Ac-[Lys.Nie17.m-F-Tyr22.Val26,Thr,28J-VIP Ac-[Lys12.Nie17.Val26.Thr28.Gly29'3°.Met31]-VIP Ac-[Lys12.Nie17.Val26.Thr28,Gly29'3°,Cys(Acm)31]-VIP Ac-[Lys12.Nie17.Val26.Thr28.Gly29'3°.Thr31]-VIP

Ac-[Lys12.Nie17.Val26.Thr28.Ala29'3°.Met31]-VIP

_ rT 12 „, 17 „ ,26 m. 28 ,, 29-31,

Ac-[Lys .Nie .Val .Thr .Ala ]-VIP

12 17 26 28 29 30 Ac-[Lys .Nie .Val .Thr .Gly .Lys ]-VIP

Ac-[Lys12*14.Nie17.Ala19.Val26.Thr28]-VIP

Ac-[2-Nal10.Lys12.Ala17.Val26.Thr28]-VIP

_ r_. 8 T 12 17 „ ,26 28 ,, 29.30 „ 31, „T„ Ac-[Glu .Lys .Nie .Val .Thr .Ala .Met ]-VIP

_ ___ 8 T 12 17 „ ,26 28 „, 29.30 31,

Ac-[Glu .Lys .Nie .Val .Thr .Gly .Phe ]-VIP

- r - n. 6 8 T 12 17 ,, 19 „ .26 mu 28 29,30 Ac-[p-F-Phe .Glu .Lys .Nie .Ala .Val .Thr .Gly

Cys(Acm)31]-VIP

14

Ac-[p-F-Phe6.p-NH2-Phe10.Lys12.Nle17,Val26.Thr28]-Vlp Ac-[Lys12,Ala17,Val26,Thr28.Gly29'30,Cys(Acm)31]-VIP Ac-[Glu8,Lys12'14,Nie17,Val26,Thr28,Gly29'30,Met31]-viP Ac-[p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17.Ala19.Val26.Thr28]-VIP 5 Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nie17,Val26,Thr28,Gly29'30,

Cys(Acm)31]-VIP !

Ac-[Glu8,Lys12,Ala17'19, Val26,Thr28,Gly29'3°,Met31]-VIP Ac-[Glu8,Lys12.Nle17.Val26,Thr28.Gly29'30,Ala31]-viP Ac-[Glu8,Lys12,Nle17.Ala19,Val26.Thr28.Gly29'30,Met31]-VIP 10 Ac-[p-F-Phe6,Lys12,Nle17,Ala19.Val26,Thr28.Gly29'30. Cys(Acm)31]-VIP Ac-[Glu8,Lys12,Nie17,Val26,Thr28,Gly29'3°,Ser31]-VIP

1R Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nie17,Ala19,Val26,Thr28]-VIP

_ r _i 8 12 „, 17 „ 26 mu 28 Ac-[Glu .Orn ,Nle ,Val ,Thr ]-VlP

_ rT 12 17 25 _ 26 _ 27,28 29,30 31,

Ac-[Lys ,Nle .Ala ,Leu ,Lys .Gly ,Thr ]-VlP

_ r _, 8 12 ... 17 ,26 28 29-31, ,rT_

Ac-[Glu .Lys .Nie .Val .Thr .Ala ]-VIP

12 17.19 26 28 Ac-[Lys .Ala .Val .Thr ]-VIP

20 Ac-[Glu8,Lys12,Nie17,Val26.Thr28.Gly29.Lys30]-VIP

Ac-[p-NH2-Phe10,Lys1'2,Nle17.Val26,Thr28.Gly29 '30,

Cys(Acm)31]-VIP

r„, 8 „ 12 17 „ ,26 28 29,30 „ ,, v31, „TT, Ac-[Glu ,Lys ,Nle ,Val .Thr .Gly .Cys(Acm) ]-VIP

r„, 8 T 12 „, 17 „ ,26 m. 28 29. 30 „ Jl, ,TT_

Ac-[Glu .Lys ,Nle ,Val ,Thr .Gly .Met ]-VIP

25 CH3S(CH2)2CO- [Lys12,Nie17.Val26,Thr28]-VIP(2—28)

CH3SO(CH2)2CO-[Lys12,Nle1/,Val26,Thr28]-VIP(2-28)

Ac-[N-CH_-Ala1,Lys12,Nle17,Val26,Thr28]-VIP

Ac-[Leu5,Orn12.Ala17'19.Thr25,Val26.Thr28.Gly29'30,

Cys(Acm)31]-VIP

30 Ac-[p-F-Phe6.2-Nal10,Lys12,Nie17,Val26,Thr28,Gly29'30,

Met31]-VIP

r „ 6 8 T 12.14 „, 17 _, 19 ,, ,26 28 29.30 Ac-[p-F-Phe .Glu .Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Gly

Cys(Acm)31]-VIP

35

15

Les composés particulièrement préférés selon l'invention sont choisis parmi les suivants :

Ac-[p-F-Phe6.Lys12.Nie17.Ala19. Val26.Thr28Gly29'30

Cys(Acm)31]-VIP Ac-[Leu5.Orn12.Ala17'19Thr25.Val26.Thr28Gly29"30.

Cys(Acm)31]-VIP j

Ac-[p-F-Phe6.Glu8.Lys12.Nie17.Ala19.Val26.Thr28.Gly29,30.

Cys(Acm)31]-VIP

X 1 P 17 y P 8

Ac-[N-CH3-Ala .Lys .Nie .Val .Thr J-VIP

Ac-[p-F-Phe6.p-NH -Phe10.Lys12.Nie17.Val26,Thr28]-VIP

Ac-[Glu8.Lys12.Nie17.Val26.Thr28.Gly29'30. Met31]-VIP

, r ____ 10 12 _T, 17 26 28

Ac-[p-NH_-Phe .Lys .Nie .Val .Thr ]-VIP

Ac-[Glu8.Lys12.Nie17.Val26.Thr28.Gly29'30.Met31]-VIP

En outre, les composés spécialement préférés selon l'invention sont choisis parmi les suivants :

Ac-[Lys12.Nie17.Ala19.Val26. Thr28. Ala29-31]-VIP Ac-[Lys12.Nie17.Ala19.Val26.Thr28.Gly29.Lys30]-VIP Ac-[Lys12.Nie17.Ala19.Ala25.Leu26.Lys27'28]-VIP

Ac-[Leu5.p-F-Phe6.Glu8.Orn12.Ala17'19.Thr25.Val26.Thr28.

„, 29, 30 „ .31, ,____

Gly .Cys(Acm) ]-VIP

Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nie17,Val26.Thr28.Gly29' 3°.Thr31]-VIP

Ac-[Glu8.Lys12.Nle17.Ala19.Val26.Thr28.Gly29'30.Thr31]-VlP

Ac-[Glu8,Lys12,Nie17,Ala25,Leu26.Lys27'28.Gly29'30.Thr31]-VIP

Ac-[p-F-Phe6.Glu8.Lys12.Nie17.Ala25,Leu26,Lys27'28.Gly29'30.

Thr31]-VIP

Ac-[2-Nal10,Lys12.Nie17.Ala19. Val26.Thr28.Gly29'30.Met31]-VIP Ac-[Ala2.Glu8.Lys12.Nie17.Ala19.Val26.Thr28,Ala29"31]-VIP Ac-[Ala2.Lys12.Nie17.Ala25.Leu26.Lys27'28.Gly29'30.Thr31]-VIP Ac-[Glu8.Lys12.Nie17.Ala19. Ala25.Leu26.Lys27'28.Ala29"31J-VIP Ac-[Lys12.Nie17.Ala19.Ala25.Leu26.Lys27'28.Ala29"31]-VIP

16

On peut facilement synthétiser les composés représentatifs ci-dessus par un procédé classique quelconque servant à former une liaison peptide entre des amino-acides. Ces procédés classiques sont par exemple tout procédé en phase solution permettant une condensation entre le groupe alpha-amino libre d'un amino-acide ou d'un reste de celui-ci dont un groupe carboxyle ou d'autres groupes réactifs sont protégés et le groupe carboxyle primaire libre d'un autre amino-acide ou d'un reste de celui-ci ayant le groupe amino ou d'autres groupes réactifs protégés.

Le procédé de synthèse des composés représentatifs peut se faire par une technique dans laquelle on ajoute un par un chaque amino-acide suivant la séquence désirée à la suite d'un autre amino-acide ou d'un reste de celui-ci ou par une technique dans laquelle on commence par synthétiser de façon classique les fragments peptides avec 1'amino-acide désiré et ensuite on condense pour obtenir le peptide désiré .

Les procédés classiques de synthèse des nouveaux composés selon l'invention sont, par^exemple, un procédé de synthèse de peptide en phase solide. Dans un tel procédé, on peut effectuer la synthèse des composés nouveaux en incorporant successivement les restes désirés dés amino-acides, un par un, dans la chaîne de peptide en cours de croissance selon les principes généraux des procédés en phases solides. [Merrifield,

R. B., J. Amer. Chem. Soc. 85., 2149-2154 (1963); Barany et al. The Peptides. Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. et Meienhofer. J.. Eds. Academic Press 1-284 (1980)].

17

Une caractéristique commune de toutes les synthèses chimiques des peptides est la protection des chaînes latérales réactives des divers fragments d'amino-acides à l'aide groupes protecteurs convenables qui empêchent toute ré-5 action chimique à cet endroit jusqu'à l'enlèvement final du groupe protecteur. Habituellement, il est tout aussi courant de protéger le groupe alpha-amino sur un acide aminé ou un fragment lorsque cet ensemble réagit sur le groupe carboxyle, après quoi on élimine sélectivement le groupe 10 alpha-aminoprotecteur en vue de permettre une réaction ultérieure à cet endroit.- Alors que des groupes protecteurs spécifiques ont été décrits à propos du procédé de synthèse en phase solide, on remarquera que chaque amino-acide peut être protégé par un groupe protecteur qu'on emploie de 15 façon classique pour la synthèse respective de 1'amino-acide en phase solution.

Les groupes alpha-amino peuvent être protégés par un groupe protecteur convenable choisi parmi les groupes 20 protecteurs aromatiques du type uréthane, tels que benzyl-oxycarbonyle (Z) et benzy1oxycarbony1e substitué, tel que p-chlorobenzyloxycarbonyle, p-nitrobenzyloxycarbonyle, p-bromobenzyl-oxycarbonyle, p-biphényl-isopropyl-oxycarbonyle, 9-fluorénylméthyl-oxycarbonyle (Fmoc) et p-méthoxybenzy1oxy-25 carbonyle (Moz) ; les groupes aliphatiques protecteurs du type uréthane tels que t-butyloxycarbony1e (Boc), diiso-propylméthyloxycarbony1e, isopropyloxycarbony1e et allyloxy-carbonyle. Boc est particulièrement préféré pour la protection d'alpha-amino.

30

On peut protéger les groupes carboxyle par un groupe protecteur convenable choisi parmi les esters aromatiques tels que le benzyle (OBzl) ou le benzyle substitué par un alkyle inférieur, halo, nitro, thio et thio substitué,

C

18

c'est à dire alkyle inf(C^ 7)thio ; les esters aliphatiques tels que alkyle inférieur, t-butyle (Ot-Bu), cyc1openty1e, cyclohexyle (OCHx), cycloheptyle et 9-fluorénylméthyle (OFm). On préfère particuliërement OBzl pour l'acide gluta-mique (Glu). On préfère particulièrement OcHx et OBzl pour l'acide aspartique (Asp).

On peut protéger les groupes hydroxyle par un groupe protecteur convenable choisi parmi les éthers tels que benzyle (Bzl) ou benzyle substitué par un alkyle inférieur, halo, tel que 2,6-dichlorobenzyle (DCB), nitro ou méthoxy ; t-butyle (t-Bu), tetrahydropyranyle et triphénylméthyle (trityl). Bzl est particulièrement préféré pour la sérine (Ser) et la thréonine (Thr). Bzl et DCB sont particulièrement préférés pour la tyrosine (Tyr).

On peut protéger les groupes amino des chaînes latérales par un groupe protecteur convenable choisi parmi les protecteurs aromatiques du type uréthane tels que benzyloxycarbonyle (Z) et benzyloxycarbony1e substitué tel que p-chlorobenzyloxycarbonyle, 2-chlorobenzyloxycarbony1e (2-C1-Z), p-nitro-benzyloxycarbonyle, p-bromobenzy1oxy-carbonyle, p-biphénylisopropyloxycarbony1e, 9-fluorényl-méthyloxycarbony1e (Fmoc) et p-méthoxybenzyloxycarbony1e (Moz) ; les groupes protecteurs aliphatiques du type uréthane tels que t-butyloxycarbonyle (Boc), diisopropylméthyl-oxycarbony1e, isopropyloxycarbonyle et al 1 y 1oxycarbonyle . Z est particulièrement préféré pour l'ornithine (Orn), 2-C1-Z est particulièrement préféré pour la lysine (Lys).

Les groupes guanidino peuvent être protégés par un groupe protecteur convenable choisi parmi nitro, p-toluène-sulfonyle (Tos), Z, adamantyloxycarbony1e et Boc. On préfère particulièrement Tos pour l'arginine (Arg).

19

On peut protéger les groupes amide des chaînes latérales par le xanthyle (Xan). On ne préfère aucune protection pour l'asparagine (Asn) et la glutamine (Gin).

5 On peut protéger les groupes imidazole par un grou pe protecteur convenable choisi parmi le p-toluènesulfonyle (Tos), le 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc), le tri-phénylméthyle (trityl), le 2,4-dinitrophényle (Dnp), Boc et benzyloxyméthyle (Bom). Tos est particulièrement préféré 10 pour l'histidine (His).

On achète tous les solvants c'est à dire l'isopro-panol (iPrOH), le chlorure de méthylène (CH2C12) et le di-méthylformamide (DMF) chez Fisher ou Burdick & Jackson et 15 on les utilise sans distillation supplémentaire. On achète l'acide trif1uoracétique chez Halocarbon et on l'utilise sans autre purification. On achète la diisopropyléthylami ne (DIPEA) chez Pfaltz et Bauer et on distille à partir de CaO et la ninhydrine avant utilisation. On achète le dicyclo-20 hexylcarbodiimide (DCC) et le diisopropylcarbodiîmide (DIC) chez Fluka et on l'utilise sans autre purification. On achète 1 ' hydroxybenzotriazole (HOBT) et le 1,2-éthane-di-thiol (EDT) chez Sigma Chemical Co et on l'utilise sans autre purification. Les amino-acides protégés sont en général de 25 configuration L et on les obtient chez Chemica.l Dynamics Corp. ou Bachem. On vérifie la pureté de ces réactifs par chromatographie en couche mince (CCM), RMN et le point de fusion avant utilisation. La résine benzhydrylaminé (BHA) est un copolymère styrène/1% divinylbenzène (100-200 ou 30 200-400 mesh) qu'on obtient chez Biomega, Bachem, Omni ou Advanced Chemtech. La teneur totale en azote dans ces résines est en général comprise entre 0,3 et 0,7 meq/g.

"1

20

On effectue la CCM sur des plaques de gel de silice préenduites de verre 60 F254 (Merck) en utilisant des systèmes solvants convenables. On effectue la détection des composés par refroidissement en fluorescence UV (254 nm d" absorption), tachage à l'iode ou pulvérisation de ninhydrine (pour les aminés primaires et secondaires).

Pour les analyses de la composition des amino-acides, on hydrolyse les peptides dans HC1 hexanormal contenant 1 à 4 mg de phénol, à 115°C pendant 22 à 24 heures dans des tubes hermétiques évacués par hydrolyse. On effectue les analyses sur un analyseur Beckman 121M d'amino-acides ou un système d'analyse d'amino-acides à base de CLHP de Waters en utilisant une résine Cat Ex de Waters ou une colonne AA511 de Pierce et une détection de ninhydrine.

On effectue la chromatographie liquide haute performance (CLHP) sur un appareil LDC comprenant des pompes Constametric I et III, un programmeur de solvant Gradient Master et un mélangeur, ainsi qu'un Spectromonitor III assurant la détection UV d'une longueur d'onde variable. On effectue la CLHP analytique sur un mode de phase inversée en utilisant des colonnes [jBondapack C^g de Waters (0,4 x 30 cm). On effectue les séparations préparatives CLHP sur des colonnes Whatman Magnum 20 parti si 1 10 0DS-3 (2 x 25 cm ou 2 x 50 cm) équipées d'une colonne préalable Guard-Pak C^g de Waters.

On prépare avantageusement les peptides en utilisant une synthèse en phase solide selon le procédé décrit d'une façon générale par Merrifield (J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963), bien qu'on puisse utiliser d'autres synthèses chimiques équivalentes connues des spécialistes, comme il a été déjà été dit.

21

On débute la synthèse en phase solide à partir de l'extrémité terminale C du peptide à synthétiser par couplage d'un alpha-aminoacide protégé à une résine appropriée. On peut préparer une telle matière de départ en fixant un amino-5 acide al pha-ami no-proté,gé par une liaison ester à une résine chlorométhylée ou une résine hydroxyméthy1e ou par une liaison amide à une benzhydrylamine (BHA) ou p-méthylbenzhydryl-aminé (MBHA). La préparation de la résine hydroxyméthyle est bien connue dans la technique. Les résines chlorométhy-10 lées sont disponibles dans le commerce et leur préparation est également bien connue. Les supports de résine BHA et MBHA sont disponibles dans le commerce et on les utilise en général quand le peptide désiré en cours de synthèse porte un amide non substitué sur le terminus C. En ce qui concerne 15 les résines, l'expression "ASTM-mesh" indique les grosseurs de mailles. Les grosseurs des mailles sont un moyen courant pour mesurer la grosseur des particules solides. Mesh désigne la dimension du plus grand tamis qui retient les particules. Le terme ASTM désigne le groupe qui normalise les 20 grosseurs des mailles servant à mesurer la granulométrie de la résine réticulée.

t

En général, le premier amino-acide à coupler avec la résine BHA est ajouté à l'anhydride symétrique d'amino-25 acide Boc, en utilisant 2 à 10 eq d ' ami no-aci'de activé par eq d'azote dans la résine. Après couplage, on lave la résine et on on sèche sous vide. La charge de 1'amino-acide sur la résine peut être déterminée par l'analyse des amino-acides dans une aliquote de résine de Boc-amino-acide. Les charges 30 vont en général de 0,2 à 0,4 mmole/g de résine. On peut coiffer tous les groupes amino n'ayant pas réagi en faisant réagir la résine avec l'anhydride acétique et la diisopropyl-éthylamine dans le chlorure de méthylène.

22

Après l'addition de Boc-amino-acide, on fait passer les résines par plusieurs cycles répétitifs pour ajouter les aminoacides successivement. La protection alpha-amino-Boc est éliminée dans des conditions acides. On peut utiliser l'acide trif1uoracétique (TFA) dans le chlorure de méthylène, HC1 dans le dioxanne ou des mélanges d'acides formique et acétique dans ce but. De préférence, on utilise 50% de TFA dans le chlorure de méthylène en volume. Celui-ci peut aussi contenir 1 à 5% en volume de EDT ou de sulfure de diméthyle en qualité d'épurateur des ions t-butylcar bonium. On peut aussi utiliser d'autres réactifs normalisés de clivage bien connus dans la technique.

Après l'enlèvement du groupe protecteur d'alpha-amino, on couple les amino-acides protégés par paliers dans l'ordre désiré pour obtenir une résine peptide intermédiaire protégée. Les réactifs d'activation servant à coupler les amino-acides lors de la synthèse en phase solide des peptides sont bien connus dans la technique. Par exemple, les réactifs appropriés pour ces synthèses sont 1'hexaf1uoro-phosphate de benzotriazol-l-yloxy-tri-(diméthylamino)-phosphonium (BOP), le dicyclohexylcarbodiimi de (DCC) et le diisopropylcarbodiimi de (DIC). On préfère DCC et DIC.

On peut aussi utiliser d'autres agents activants décrits par Barany et Merrifield (dans The Peptides, Vol 2., J. Meienhofer, éd., Academic Press, 1979, pages 1-284). On peut ajouter aux mélanges de couplage pour optimiser les cycles synthétiques divers réactifs tels que 1-hydroxybenzotriazole (HOBT), N-hydroxysuccinimide (HOSu) et 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazine (HOOBT). On préfère HOBT.

23

Le protocole pour un cycle synthétique normal est comme suit :

Tableau 1

Stade

Réacti f

Durée

1

CH2C12

2

x

30

S

2

50% TFA/CH2C12

1

min

3

50% TFA/CH2C12

15 min

4

CH Cl 2 2

2

x

30

s

5

iPrOH

2

x

30

s

6

CH2CI2

6% DIPEA/CH2C12

4

X

30

s

7

3

X

2 min

8

CH Cl 2 2

3

X

30

s

9

couplage

1

-

18

h

10

CH2C12

2

X

30

s

11

iPrOH

1

X

10

s

12

CH2C12

1

X

30

s

13

DMF

2

X

30

s

14

CH Cl 2 2

3

X

30

s

On dose les solvants pour tous les lavages et couplages pour obtenir des volumes de 10 à 40 ml/g de résine. On effectue les couplages en utilisant les anhydrides symétriques préformés des Boc-amino-acides ou les dérivés d'O-acy1-isourée. En général, on ajoute 2 à 10 eq de Boc-amino-acide activé par eq de résine aminée en utilisant comme solvant du chlorure de méthylène. On couple Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn et Boc-His(Tos) dans 20 à 25% DMF/CsC^-

24

On couple Boc-Asn et Boc-Gln sous forme de leurs esters actifs HOBT en vue de réduire au minimum les réactions secondaires connues.

On contrôle les réactions de couplage par le test à la ninhydrine de Kaiser afin de déterminer le degré d' achèvement (Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595-598, 1970). On observe les facteurs cinétiques à réaction lente pour Boc-Arg(Tos), Boc-Asn et Boc-Gln. Toutes les réactions de couplage qui sont incomplètes subissent un nouveau couplage avec un amino-acide activé nouvellement préparé ou sont coiffées par traitement de la résine peptide avec 1' anhydride acétique comme décrit plus haut. Les résines peptides entièrement assemblées sont séchées sous vide pendant plusieurs heures.

Pour chaque composé, on peut éliminer les groupes de blocage et on peut cliver les peptides de la résine par des réactifs appropriés de déblocage et de clivage bien connus dans le domaine de la synthèse des peptides en phase solide et décrits notamment dans "The Peptides" (volume 2 ou 5, voir ci-dessus). On peut par exemple priver les peptides de leur protection et les cliver à partir du support solide par traitement avec un acide fort tel que l'acide f 1 uorhydrique liquide (HF) ou l'acide trifluorométhanesulfo-nique (TFMSA), éventuellement en présence d'additifs tels que 1 ' éthanedithiol ou le thioanisol à titre d'épurateurs de cations. Plus précisément, on peut traiter les résines peptides, par exemple avec 25 à 100 pl d'éthanedithiol, 1 ml d'anisol et 9 ml d'acide fluorhydrique liquide par gramme de résine à 0°C pendant 45 à 60 minutes dans un appareil Teflon HF (Peninsula).

25

En variante, un procédé modifié de clivage en deux stades (Tarn et al., Tetrahedron Letters, 23, 2939-2940, 1982) pourrait servir et dans celui-ci, on peut traiter la résine peptide avec 3 ml de sulfure de diméthyle et 1 ml d'acide fluorhydrique pendant 2 heures à 0°C et on évapore avant le traitement avec HF à 90%. On peut alors éliminer les réactifs volatils sous vide à une température de bain de glace. On peut laver le résidu avec deux ou trois volumes de 30 ml chacun de Et20 et EtOAc et on filtre. On peut extraire les peptides de la résine en lavant avec 4 x 20 ml d'AcOH à 10% et filtration. On peut lyophiliser les filtrats aqueux combinés pour obtenir le produit brut final.

On effectue en général les purifications directement sur le peptide brut par CLHP préparative. On applique les peptides sur des colonnes en un volume minimal de AcOH à 1% ou TFA à 0,1%. On débute en général l'élution des gradients à 10% de tampon B, 10 à 25% B en 10 minutes et 25 à 35% B en 3 heures (tampon A : 0,1% TFA/H20, tampon B : 0,1% TFA/CH3CN) à un débit de 8,0 ml/min. On effectue la détection UV à 220 nm. On collecte les fractions à intervalles de 1,5 à 2,5 minutes et on inspecte par CLHP analytique. On groupe et on lyophilise les fractions qu'on considère être de haute pureté.

On vérifie la pureté des produits finals par CLHP analytique sur une colonne à phase inversée, comme indiqué plus haut. En général, on utilise une élution de gradient de 20 à 40% B (tampon A : 0,022% TFA/H2 0, tampon B : 0, 022% TFA/CH3CN) en 15 minutes à 2,0 ml/min. La détection UV est à 210 nm. On estime la pureté de tous les produits comme étant d'environ 97 à 99%.

26

Les analyses d'amino-acides des peptides individuels sont effectuées et les valeurs obtenues sont en dedans de limites acceptables. En général, on soumet tous les produits finals à une spectrométrie de masse avec bombardement rapide par atomes (FAB-MS). Tous les produits libèrent des ions apparentés anticipés M + H en des limites acceptables.

Les composés nouveaux selon l'invention possèdent des propriétés pharmacologiques précieuses. On montrera qu' ils sont des bronchodilatateurs puissants dépourvus d'effets cardiovasculaires secondaires. Ainsi, étant donné qu'ils sont des bronchodilatateurs hautement actifs, ces composés sont des agents pharmaceutiques précieux pour le traitement des troubles bronchoconstricteurs, par exemple l'asthme.

On peut combiner les composés nouveaux de formule I avec divers véhicules pharmaceutiques ordinaires pour obtenir des compositions pouvant servir au traitement des troubles bronchoconstricteurs tels que l'asthme. Le dosage de ces composés dépend de divers facteurs tels que le composé employé et la composition particulière. Un spécialiste modérément qualifié peut déterminer le dosage efficace en partant de la concentration efficace (ce^q) indiquée.

Les composés nouveaux de formule I forment des sels d'addition avec des acides pharmaceutiquement acceptables en utilisant des acides minéraux et organiques variés tels que les acides sulfurique, phosphorique, chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, nitrique, sulfamique, citrique, lactique, pyruvique, oxalique, maléique, succinique, tartri-que, cinnamique, acétique, trifluoracétique, benzoique, sali-cylique, gluconique, ascorbique et les acides apparentés.

27

On peut administrer les composés par voie parenté-raie (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire), par voie orale ou intranasale. Une voie préférée pour l'administration parentérale est par aérosol par administration 5 orale ou intranasale.

Les exemples suivants servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

10 Exemple 1

Résine Boc-Ala-BHA

On fait gonfler dans 30 ml de chlorure de méthylène une résine réticulée de copolystyréne de benzhydrylami ne et 15 1% de divinylbenzène (3,0 g, 2,1 meq, 100 à 200 ASTM-mesh, Omni Bîochem), on filtre et on lave en utilisant les stades 7 et 8 du protocole du tableau 1. On remet en suspension la résine dans 30 ml d chlorure de méthylène et on ajoute 568 mg (3,0 mmoles) de Boc-Ala et 310 mg (1,5 mmole) de dicyclo-20 hexylcabodiimi de. On secoue le mélange pendant 15 heures à température ambiante, on filtre et on effectue les stades 10 à 14 du protocole du tableau 1. L'analyse à la ninhydrine de Kaiser est négative. On coiffe les groupes aminé n'ayant pas réagi en traitant la résine avec 1 ml d'anhydride acé-25 tique dans 30 ml de chlorure de méthylène pendant 30 minutes, on filtre et on lave par les stades de protocole 13 et 14. On sèche la résine sous vide pendant 16 heures pour obtenir 3,1 g de résine Boc-Ala-BHA. On soumet une portion de cette résine à l'analye des amino-acides, ce qui indique une char-30 ge de 0,20 mmole de Ala/g.

28

Exemple 2

Résine Boc-Thr(Bzl)-BHA

On traite 10,0 g (7,0 meq) de résine benzhydrylami ne 5 (100-200 ASTM mesh, Omni) comme dans l'exemple 1, sauf qu'on couple la résine avec 3,1 g (10,0 mmoles) de Boc-Thr (Bzl) et 1,0 g (5,0 mmoles) de dicyclohexy1carbodiimi de. On sèche la résine sous vide et on obtient 10,9 g de résine Boc-Thr( Bzl)-BHA. L'analyse des amino-acides indique une 10 charge de 0,2 mmole de Thr/g.

Exemple 3

Résine Boc-Ser(Bzl)-BHA

15 On traite comme dans l'exemple 1, 0,75 g (0,53 meq)

de résine de benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM mesh, Omni) sauf qu'on couple la résine avec 222 mg (0,75 mmole) de Boc-Ser (Bzl) et 77 mg ( 0, 375 mmole) de dicyc1ohexy1 carbodiimi de. On sèche la résine sous vide et on obtient 0,80 g de résine 20 Boc-Ser(Bzl)-BHA. L'analyse des amino-acides indique une charge de 0,16 mmole de Ser/g.

Exemple 4

Résine Boc-Met-BHA

2 5

On traite comme dans l'exemple 1, 0,75 g (0,53 meq) de résine de benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM mesh, Omni) sauf qu'on couple la résine avec 187 mg (0,75 mmole) de Boc-Met et 77 mg (0, 375 mmole) de dicyclohexylcarbodiimi de. On sèche 30 la résine sous vide et on obtient 0,81 g de résine Boc-Met-BHA. L'analyse d1 amino-acides indique une charge de 0,19 mmole de Met/g.

29

Exemple 5

Ac-/"Lys12, Nie17, Val26, Al a28J-VIP

On soumet une portion de 0,253 g (0,05 mmole) de la 5 résine Boc-Ala-BHA de l'exemple 1 à une synthèse en phase solide en utilisant le protocole précité. On effectue tous les couplages en utilisant des équivalents molaires égaux de Boc-amino-acide et diisopropylcarbodiimide. On incorpore la Boc-asparagine et la Boc-glutamine à titre d'esters 10 actifs respectifs par addition d'un excès 1,5 molaire de

HOBT au mélange de couplage. Les durées de réaction sont en général de 2 à 18 heures pour l'achèvement du stade de couplage. On effectue 27 cycles de couplage dont un cycle de chacun des composés suivants : Boc-Leu (124 mg, 0,5 mmol ),

15

Boc-Val (109 mg, 0,5 mmol ). , Boc-Ser(Bzl) (147 mg, 0,5 mmol ) , Boc-Asn (116 mg, 0,5 mmol ) , Boc-Leu (124 mg, 0,5 mmol ) , Boc-Tyr(2,6-DCB) (220 mg, 0T5 mmol ) , Boc-Lys(2-C1-Z) (207 20 mg.0,5 mmol ), Boc-Lys(2-C1-Z) (207 mg, 0»5 mmol ) , Boc-Val (109 mg, 0,5 mmol ), Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmol ) , Boc-Nle (116 mg, Or5 mmol Boc-Gln (123 mg, 0,5 mmol ) , Boc-Lys(2-C1-Z) (207 mg. 0,5 mmol ), Boc-Arg(Tos) (214 mg. 0,5mmol ) , Boc-Leu (124 mg, 0,5 mmol ), Boc-Lys(2-C1-Z) (207 mg. 0,5 mmol ) , 25 Boc-Thr (Bzl) (154 mg, 0,5 mmol ), Boc-Tyr (2,6-DCB) (220 mg. 0,5 mmol ), Boc-Asn (116 mg, 0,5 mmol), Boc-Asp(OcHx) (158 mg. 0,5 mmol ), Boc-Thr (Bzl) (154 mg, 0,5 mmol ) , Boc-Phe (133 mg, 0,5 mmol ). Boc-Val (108 mg, 0,5 mmol ), Boc-Ala (95 mg,

30 0,5 mmol ), Boc-Asp(OcHx) (158 mg, 0,5 mmol ), Boc-Ser(Bzl) (148 mg, 0,5 mmol ), et Boc-His(Tos) (204 mg, 0,5 mmol ).

30

On fait passer la résine de peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on fait réagir à deux reprises avec 0,5 ml d' anhydride acétique et 167 ml de DIPEA dans 10 ml de chlorure de méthylène pendant 50 minutes. On lave la résine par 5 les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 407 mg.

On débloque et on clive la résine de peptide par traitement avec 10 ml de HF liquide contenant 1 ml d'anisole et 100 ml d'éthanedithiol pendant 1 heure à 0°C. On évapore 10 le mélange de réaction à siccité sous vide, on lave avec 2x30 ml de Et20 et on extrait avec 3x30 ml d'AcOH à 10%. On lyophilise le filtrat aqueux et on obtient 135 mg d'une poudre blanche.

15 On purifie le peptide brut par CLHP préparative.

On l'applique à une colonne Whatman Magnum 20-0DS-3 (2x50 cm) et on élue avec un gradient linéaire de 25 à 35% B (tampon A : 0,1% TFA/H20, tampon B : 0,1% TFA/CH3 CN) en 3 heures à 8,0 ml/minute. On coupe le pic principal par CLHP analyti-20 que (analyse des fractions collectées), on groupe et on lyophilise pour obtenir 26,6 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et on obtient une analyse correcte des amino-acides. FAB-MS: calculé MH 3265,8 trouvé 3266,5.

25

Exemple 6

Ac-/"Lys12, Nie17, Val26, Al a27, Thr28/-VIP

On soumet une portion de 0,25 g (0,05 mmole) de ré-30 sine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 2 à une synthèse en phase solide comme dans l'exemple 5, sauf qu'on remplace Boc-Leu dans le premier cycle par 95 mg (0,5 mmole) de Boc-Ala.

31

On débloque 399 mg de résine peptide pour obtenir 117 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 32,4 mg d'une poudre amorphe blanche. Le produit est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1 'amino-acide. FAB-MS : 5 MH calculé 3253,7 ; trouvé : 3253,4.

Exemple 7

Ac-Ays12,Nle17,Ala26,Thr28/-VIP

10 On soumet une portion de 0,254 g (0,05 mmole) de résine Boc-Thr(Bz1)-BHA de l'exemple 2 à une synthèse en phase solide comme dans l'exemple 5, sauf qu'on remplace Boc-Val du second cycle par Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmole). On débloque 399 mg de résine peptide et on obtient 100 mg de 15 peptide brut. La purification par CLHP donne 29,4 mg d'une poudre blanche amorphe. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. FAB-MS : MH calc. 3267,8 ; trouvé : 3267,5.

20 Exemple 8

Ac - /"Lys12,Nie17,Ala2®,Val26,Thr28/-VIP

On soumet une portion de 0,25 g (0,05 mmole) de résine Boc-Thr(Bz1)-BHA de l'exemple 2 à une synthèse en pha-25 se solide comme dans l'exemple 5, sauf qu'on remplace dans le troisième cycle Boc-Ser(Bzl) par 95 mg (0,5 mmole) de

Boc-Ala. On débloque 394 mg de résine peptide et on obtient 125 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 31,9 mg de poudre amorphe blanche. Le composé est 30 homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. FAB-MS : MH calc : 32 7 9, 8 ; trouvé : 3279, 8.

32

Exemple 9

Ac-Ays12,Nle17,Ala24, Val 26, Thr28J-VIP

On soumet une portion de 0,25 g (0,05 mmole) de ré-5 sine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 2 à une synthèse en phase solide comme dans l'exemple 5 sauf qu'on remplace Boc-Asn dans le quatrième cycle par 95 mg (0,5 mmole) de Boc-Ala. On débloque 373 mg de résine peptide et on obtient 83,5 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 28,7 mg d' 10 une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

FAB-MS : MH calc. 3252,8 , trouvé : 3252,1.

Exemple 10 15 Résine Boc-Thr(Bzl)-BHA

On fait gonfler dans 50 ml de chlorure de méthylène 0,5 g(2,6 meq) d'une résine réticulée de copolystyréne de benzhydrylami ne et 1% de divinylbenzène (200-400 ASTM mesh, 20 Vega Biochem), on filtre et on lave en utilisant les stades 7 et 8 du protocole du tableau 1. On remet la résine en suspension dans 60 ml de chlorure de méthylène et on ajoute 2,32 g (7,5 mmoles) de Boc-Thr(Bzl) et 774 mg (3,75 mmoles) de dicyc1ohexy1 carbodiimi de. On agite le mélange pendant 25 4 heures à température ambiante, on filtre et on exécute les stades .10 à 14 du protocole du tableau 1. L'analyse de ninhydrine de Kaiser est négative. On coiffe les groupes aminé n'ayant pas réagi en traitant la résine avec 5 ml d' anhydride acétique et 5 ml de DIPEA dans 50 ml de chlorure 30 de méthylène pendant 60 minutes, on filtre et on lave par les stades de protocole 13 à 14. On sèche la résine sous vide pendant 16 heures et on obtient 5,8 g de résine Boc-Thr (Bzl)-BHA. On soumet une portion de cette résine à l'analyse des amino-acides qui indique une charge de 0,276 mmole Thr/g.

33

Exemple 11

Ac-Z'Lys12,Nle17,Ala23, Val 26,Thr28J- VIP

On soumet 1,0 g (0,27 mmole) de résine Boc-Thr(Bzl)-5 BHA de l'exemple 10 à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430A de Applied Biosystems. On effectue tous les couplages en utilisant des anhydrides symétriques préformés préparés à partir de l'acide Boc-amino et de dicyclohexy1 carbodiimi de. De façon routinière, 10 on effectue un double couplage de Boc-asparagine, Boc-

glutamine et Boc-arginine(tosyle) en qualité d'esters actifs respectifs HOBT. On effectue 27 cycles de couplage chacun avec Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol ),

Boc-Val (435 mg. 2,0 mmol ). Boc-Ser(Bzl) (590 mg. 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol .). Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmolj . Boc-Tyr (2. 6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol ). Boc-Lys (2-C1-Z ) (830 mg, 2,0 mmol ), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol ), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol.), Boc-Ala (378 mg. 2,0 mmol j, Boc-Nle (462 mg. 2,0 mmolj, Boc-Gln (492 mg, 2,0 mmol). 2^ Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol ), Boc-Arg(Tos) (856 mg,

2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg. 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol ). Boc-Thr (Bzl) (618 mg,> 2,0 mmol.), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol). Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol). Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol ), Boc-Thr (Bzl) (618

25

mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (530 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol ), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), et Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol).

34

On enlève la résine peptide du synthétiseur et on soumet au stade 1 à 8 du protocole, puis on fait réagir avec 1,0 ml d'anhydride acétique dans 20 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les 5 stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 2,25 g de résine peptide.

On traite une portion de 1,5 g (0,18 mmole) de cette résine avec 6 ml de sulfure de diméthyle et 2 ml de 10 HF liquide pendant 2 heures à 0°C. On évapore le mélange de réaction et on traite le résidu avec 1 ml d'anisole et 9 ml de HF liquide pendant 45 minutes à 0°C. On évapore le mélange de réaction et on lave le résidu avec 2 x 30 ml de Et£0 et 4 x 30 ml de EtOAc. On extrait la résine avec 15 3x15 ml de AcOH à 10% et 2 x 20 ml de H2O. On lyophilise les filtrats aqueux combinés et on obtient 800 mg'd'un solide blanc.

On purifie une portion de 400 mg (0,09 mmole) de cette matière par CLHP préparative comme dans l'exemple 5, 20 sauf qu'on effectue un gradient linéaire de 10 à 40% en trois heures. On coupe le pic principal par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 47,0 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse cor-25 recte de 1'amino-acide.

Exemple 12

Ac-/Lys12,Nie17,Al a22,Val26,Thr28/-VIP

30 On soumet une portion de 0,75 g (0,2 mmole) de ré

sine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 10 à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430A de Applied Biosystems, comme dans l'exemple 11.

35

On effectue tous les couplages comme dans l'exemple 11,

sauf qu'on remplace Boc-Ala et Boc-Tyr(2,6-DCB) dans les cycles 5 et 6 respectivement par 499 mg (2,0 mmoles) de Boc-Leu et 378 mg (2,0 mmoles) de Boc-Ala. On enlève la ré-5 sine peptidique du synthétiseur, on débloque par les stades de protocole 1 à 8 et on traite avec l'anhydride acétique comme dans l'exemple 11. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour donner 1,6 g de résine pepti de.

10

On traite une portion de 0,8 g (0,1 mmole) de cette résine avec HF comme dans l'exemple 11, on obtient après lyophilisation, 400 mg d'un solide blanc. On purifie le peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 11, sauf qu' 15 on exécute un gradient linéaire de 25 à 35%. On coupe le pic principal par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 17,3 mg d' une poudre blanche amorphe. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1 ' amino-acide. 20 FAB-MS : calc. 3203,7, trouvé : 3203,8.

Exemple 13

Ac - /"Lys12, NI e17, Al a21, Val 26, Thr 28J-VI P

25 On soumet une portion de 0,7 g (0,19 mmole) de ré

sine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 10 à une synthèse en pha se solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430A de

Applied Biosystems comme dans l'exemple 11. On effectue tous les couplages comme dans l'exemple 11, sauf qu'on rem-

30 place Boc-Ala et Boc-Lys(2-C1-Z) dans les cycles 5 et 7 respectivement par 499 mg (2,0 mmoles) de Boc-Leu et 378 mg (2,0 mmoles) de Boc-Ala. On retire la résine peptide du synthétiseur et on débloque par les stades 1 à 8 du protocole comme dans l'exemple 11, puis on traite avec un mélange

36

d'anhydride acétique à 15% et de chlorure de méthylène pendant 15 minutes à température ambiante. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 1,4 g de résine peptide.

5

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11 et on obtient après lyophilisation 750 mg d'un solide blanc. On purifie une portion de 250 mg de ce peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 12. On coupe 10 le pic principal par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 20 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

15 Exemple 14

Ac-/Lys12,Nie17,Al a20,Val 26,Thr28/-VIP

On soumet une portion de 0,7 g (0,19 mmole) de résine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 10 à une synthèse en 20 phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430A de

Applied Biosystems comme dans l'exemple 11. On effectue tous les couplages comme dans l'exemple 11 sauf qu'on remplace Boc-Ala et Boc-Lys(2-C1-Z) dans les cycles 5 et 8, respectivement par 499 mg (2,0 mmoles) de Boc-Leu et 378 mg (2,0 25 mmoles) de Boc-Ala. On retire la résine peptide du synthétiseur, on débloque avec les stades de protocole 1 à 8 et on traite avec l'anhydride acétique comme dans l'exemple 11. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 1,2 g de résine peptide. 30 On traite la résine peptide avec HF comme dans 1'

exemple 11 pour obtenir, après lyophilisation, 270 mg d'un solide blanc.

37

On purifie le peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 12. On coupe le pic principal par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe, et on lyophilise pour obtenir 12,4 mg de poudre amorphe blanche. Ce 5 composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. FAB-MS : calc. 3238,7, trouvé 3238,2.

Exemple 15

Ac-/Lys12,Nie17,Al a19,Val 26,Thr28/-VIP

10

On fait gonfler dans 160 ml de chlorure de méthylène 17,7 g (2,6 meq) de résine réticulée de copolystyréne de benzhydryl-amine et de 1% de divinylbenzène (200-400 ASTM mesh, Vega Biochem), on filtre et on lave par les stades 7 et 8 du pro-15 tocole du tableau 1. On remet la résine en suspension dans 160ml de chlorure de méthylène et on ajoute 6,25 g (20,2 mmoles) de Boc-Thr(Bzl) et 2,10 g (10,1 mmoles) de dicyclo-hexylcarbodiimi de. On agite ce mélange pendant 8 heures à température ambiante, on filtre et on effectue les stades 20 10 à 14 du protocole. L'analyse de ninhydrine de Kaiser est négative. On coiffe les groupes aminé qui n'ont pas réagi en traitant la résine avec 5 ml d'anhydride acétique et 5 ml de DIPEA dans 150 ml de chlorure de méthylène pendant 60 minutes, on filtre et on lave par les stades 13 et 25 14 du protocole. On sèche la résine sous vide-pendant 16 heures et on obtient 18,0 g de résine Boc-Thr(Bzl)-BHA. On soumet une portion de cette résine à une analyse de 1'amino-acide qui indique une charge de 0,17 mmole de Thr/g.

On soumet 18,0 g (3,06 mmoles) de résine Boc-Thr 30 (Bzl)-BHA à une synthèse en phase solide par le protocole précité. On effectue tous les couplages en utilisant les anhydrides symétriques préformés qui sont préparés à partir de Boc-amino-acide et de dicyclohexylcarbodiimi de.

i

V

38

On couple la Boc-asparagine et la Boc-glutamine en qualité d'esters actifs respectifs HOBT. On effectue 5 cycles de couplage et pour chaque cycle on utilise :

Boc-Leu (6,1 g. 24,5 mmol), Boc-Val (5,32 g, 24,5 mmol), j 5 Boc-Ser(Bzl) (7,23 g, 24,5 mmol), Boc-Asn (3,13 g. 13,5 j mmol), et Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol). j

On sèche la résine sous vide et on obtient 22,9 g de résine Boc-hexapeptide.

10

On fait passer une portion de 0,768 g (0,1 mmole) de cette résine par 22 cycles de couplage, chacun avec :

Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol"). Boc-Lys(2-Cl-Z) (332 mg, 0,8 mmol.), Boc-Lys (2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmol.), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol ), Boc-Nle (185 mg, 0,8 mmol). Boc-Gln (108 mg. 0,44 mmol ). Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg. 0,8 mmol). Boc-Arg(Tos) (342 mg. 0,8 mmol). Boc-Leu (199 mg. 0,8 mmol ), Boc-Lys(2-Cl-Z) (332 mg, 0,8 mmol ). Boc-Thr (Bzl ) (247 mg, 0,8 mmol.), Boc-Tyr (2, 6-DCB) (352 mg.

20

0,8' mmol ), Boc-Asn (102 mg. 0,44 mmol ). Boc-Asp(OcHx) (252 mg. 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmol). Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol.), Boc-Val (174 mg. 0,8 mmol). Boc-Ala (151 mg. 0,8 mmol), Boc-Asp (OcHx) (252 mg, 0,8 mmol ), Boc-Ser(Bzl)

(236 mg. 0,8 mmol). et Boc-His(Tos) (328 mg. 0,8 mmol).

2 5 _ .

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 1,0 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% de DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 30 et on sèche sous vide pour obtenir 1,12 g.

39

On traite une portion de 0,725 g (0,065 mmole) de cette résine comme dans l'exemple 11, avec 3 ml de sulfure de diméthyle et 1 ml de HF liquide pendant 2 heures à 0°C. On évapore le mélange de réaction et on traite le résidu avec 5 0,5 ml d'anisole et 4,5 ml de HF liquide pendant 45 minutes à 0°C. On évapore le mélange de réaction et on lave le résidu avec 1 x 15 ml de Et£0 et 3 x 15 ml de EtOAc. On extrait la résine avec 3 x 20 ml de AcOH à 10%. On lyophilise les filtrats aqueux combinés et on obtient 367 mg d'un so-10 1i de brut.

On purifie cette matière brute par CLHP prépara-tive comme dans l'exemple 5 sauf qu'on effectue un gradient linéaire de 10 à 40% en 4 heures. On coupe le pic principal 15 par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 23 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide .

20 Exemple 16

Ac- Ays 12 , Al a17, Val25, Thr 28J7-VIP

On soumet une portion de 3,5 g (0,96 mmoie) de résine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 10 à une synthèse en phase 25 solide. On effectue tous les couplages en utilisant des anhydrides symétriques préformés préparés à partir de Boc-amino-acide et de dicyclohexy1carbodiimi de. On couple la Boc-asparagine et la Boc-glutamine à titre d'esters actifs respectifs HOBT. On effectue deux cycles de couplage dont 30 l'un avec 1,78 g (7,7 mmoles) de Boc-Leu et l'autre avec

1,68 g, (7,7 mmoles) de Boc-Val pour obtenir 3,72 g de résine Boc-tri pepti de.

On couple une portion de 3,41 g (0,88 mmole) de cette résine avec 2,28 g (7,7 mmoles) de Boc-Ser(Bzl) en un cycle et on obtient 3,52 g de résine Boc-tetrapeptide.

On couple une portion de 3,2 g (0,80 mmole) de cette résine avec deux cycles comportant respectivement 822 mg (3,54 mmoles) de Boc-Asn et 1,6 g (6,4 mmoles) de Boc-Leu pour obtenir 3,2 g de résine Boc-hexapeptide.

On couple une portion de 2,56 g (0,64 mmole) de cette résine avec 3 cycles dont le premier comprend 2,26 g (5,1 mmoles) de Boc-Tyr(2,6-DCB), le second 2,13 g (5,1 mmoles) de Boc-Lys(2-C1-Z) et le troisième 2,13 g (5,1 mmoles) de Boc-Lys(2-C1-Z) et on obtient 3,2 g de résine Boc-nonapepti de.

On couple une portion de 2,8 g (0,56 mmole) de cette résine avec deux cycles dont l'un est de 978 mg (4,5 mmoles) de Boc-Val et l'autre de 851 mg (4,5 mmoles) de Boc-Ala et on obtient 2,8 g de résine Boc-undecapeptide.

On couple une portion de 0,39 g (0,078 mmole) de cette résine avec 17 cyles qui sont respectivement Boc-Ala (118

mg. 0,62 mmol). Boc-Gln (85 mg. 0,34 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (260 mg. 0,62 mmol), Boc-Arg(Tos) (269 mg, 0,62 mmol). Boc-Leu (156 mg, 0,62 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (260 mg. 0,62 mmol). Boc-Thr(Bzl) (194 mg. 0,62 mmol). Boc-Tyr(2.6-DCB) (276 mg. 0,62 mmol). Boc-Asn (80 mg. 0,34 mmol). Boc-Asp(OcHx) (198 mg. 0,62 mmol). Boc-Thr(Bzl) (194 mg. 0,62 mmol). Boc-Phe (166 mg. 0,62 mmol). Boc-Val (136 mg. 0,62 mmol). Boc-Ala (119 mg, 0,62 mmol). Boc-Asp(OcHx) (198 mg. 0,62 mmol), Boc-Ser(Bzl) (185 mg. 0,62 mmol). et Boc-His(Tos) (257 mg. 0,62 mmol).)

41

On sèche la résine peptide sous vide et on obtient 0,55 g de résine octacosapeptide. On traite une portion de 0,275 g (0,039 mmole) de cette résine avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 10 ml de DIPEA à 6%/chlorure de méthylène pen-5 dant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,27 g de résine peptide .

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 15 et on obtient, après lyophilisation, 139 mg d'un 10 solide blanc. On purifie ce peptide brut par CLHP prépara-tive comme dans l'exemple 15. Le pic principal est coupé par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 6,6 mg d'une poudre blanche amorphe. Ce composé est homogène par CLHP et donne 15 une analyse correcte de 1'amino-acide.

Exemple 17

Ac-/Lys12,Al a16,Nie17,Val 26, Thr287-VI P

20 On traite 9,5 g (3,61 mmoles) de résine de benzhy-

drylamine (200 à 400 ASTM-mesh, Bachem) comme dans l'exem ple 10, sauf qu'on couple la résine avec 3,35 g (10,8 mmo les) de Boc-Thr(Bzl) et 1,12 g (5,42 mmoles) de dicyclo-

hexylcarbodiimi de pendant 18 heures. On sèche la résine sous

25 vide pendant 16 heures et on obtient 9,8 g de résine

Boc-Thr(Bzl)-BHA. On soumet une portion de cette résine à

l'analyse de 1'amino-acide qui indique une charge de 0,17

mmole de Thr/g.

10

15

42

On soumet 9,8 g (1,7 mmole) de résine Boc-Thr(Bzl ) -BHA à une synthèse en phase solide en utilisant le protocole ci-dessus. On effectue tous les couplages en utilisant desanhydrides symétriques préformés préparés à partir d" acide Boc-amino et de dicyc1ohexy1carbodiimi de. On couple aussi bien la Boc asparagine que la Boc-glutamine à titre d'esters actifs respectifs HOBT. On effectue 5 cycles de couplage en utilisant pour chaque cycle respectivement :

Boc-Leu (1,5 g. 6.0 mmol), Boc-Val (1,3 g, 6,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (1,8 g, 6,0 mmol), Boc-Asn (773 mg, 3,3 mmol). et Boc-Leu (1,5 g. 6,0 mmol).i

On sèche la résine sous vide et on obtient 12,2 g de résine Boc-hexapepti de.

On couple une portion de 8,2 g (1,13 mmole) de cette résine en six cycles dont chacun comprend respectivement : Boc-Tyr(2,6-DCB)

(1,77 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), et, 20 Boc-Lys(2-C1-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Val (876 mg, 4,0

mmol), Boc-Ala (762 mg, 4,0 mmol), et Boc-Nle (932 mg, ,

i

4,0 mmoles) et on obtient 10,2 g de résine Boc-decapeptide.

On soumet une portion de 0,9 g (0,1 mmole) de cette 25 résine à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430A de Applied Biosystems comme dans 1' exemple 11. On effectue 16 cycles de couplage dont chaque cycle comporte respectivement :

Boc-Ala ( 378 mg, 2,0 mmoles), Bol - Lys(2-C1-Z) (830 mg, 30 2,0 mmoles),

¥■

43

Boc-Arg(Tos) (856 mg. 2,0 mmol). Boc-Leu (499 mg. 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg. 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 5 mg. 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol),

Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2t0 mmol), Boc-Phe (530 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg. 2,0 mmol). Boc-Ser(Bzl) (590 mg. 2,0 mmol). et Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol).|

10 On enlève la résine peptide du synthétiseur et' on fait passer par les stades 1 à 8 du protocole, puis on fait réagir avec 0,6 ml d'anhydride acétique dans 12 ml de chlorure de méthylène/DIPEA à 6% pendant 20 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour ob-15 tenir 1,3 g de résine peptide.

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11 pour obtenir après lyophilisation 155 mg d'un solide blanc. On purifie le peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 5, sauf qu'on effectue un gradient li-20 néa.ire de 20 à 40%. On coupe le pic principal par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 35,2 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et on obtient une analyse correcte de 1'amino-acide.

25

Exemple 18

Ac-Ays12,Ala15,Nle17,Val26,Thr28/-VIP

On soumet une portion de 0,25 g (0,05 mmole) de ré-30 sine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 2 à une synthèse en phase solide comme dans l'exemple 5 sauf qu'on remplace dans le 13ème cycle Boc-Lys(2-Cl-Z) par 95 mg (0,5 mmole) de Boc-Ala.

Of,

44

On débloque la résine peptide et on obtient 128 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 35,8 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : MH calc. 3238,7, 5 trouvé : 3237,9.

Exemple 19

Ac-/Lys12,Ala14,Nle17,Val 26,Thr28/-VIP

10 On soumet une portion de 0,25 g (0,05 mmole) de ré

sine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 2 à une synthèse en phase solide comme dans l'exemple 5, sauf que dans le 14ème cycle, on remplace Boc-Arg(Tos) par 95 mg (0,5 mmole) de Boc-Ala. On débloque 368 mg de résine peptide et on obtient 15 112 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 24,7 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

FAB-MS : MH calc 3210,7, trouvé 3210,8.

2 0 Exemple 20

Ac-/lys12,Ala13,Nie17,Val26,Thr287-VIP

On soumet une portion de 0,255 g (0,05 mmole) de résine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 2 à une synthèse en pha-25 se solide comme dans l'exemple 5, sauf qu'on remplace au

15ème cycle Boc-Leu par 95 mg (0,5 mmole) de Boc-Ala. On débloque 416 mg de résine peptide et on obtient 125 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 24,2 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP 30 et donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : MH calc: 3253,7, trouvé: 3253,6.

fl

45

Exemple 21

Ac-/"Ala12,Nle17, Val 26, Thr28/-VI P

On soumet une portion de 0,254 g (0,05 mmole) de ré-5 sine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 2 à une synthèse en phase solide comme dans l'exemple 5, sauf que dans le premier cycle, on remplace Boc-Lys(2 - Cl-Z) par 95 mg (0,5 mmole) de Boc-Ala. On débloque la résine peptide pour obtenir 128 mg de peptide brut. La'purification par CLHP donne 27,0 mg d' 10 une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'ami no-acide. FAB-MS : MH calc : 3238,7 , trouvé : 3238,1.

Exemple 22

15 Ac-/7\1 a11, Lys12, Nie17, Val 26, Thr 28/-VI P

On fait gonfler dans 160 ml de chlorure de méthylène 25,0 g (17,5 meq) de résine réticulée benzhydrylamine-co-polystyrêne/1% divinylbenzène (200-400 ASTM mesh, Bachem), 20 on filtre et on lave par les stades 7 et 8 du protocole du tableau 1. On remet la résine en suspension dans 160 ml de chlorure de méthylène et on ajoute 16,2 g (52,5 mmoles) de Boc-Thr(Bzl) et 5,4 g (26,2 mmoles) de dicyclohexylcarbo-diimide. On agite le mélange pendant 6 heures à température 25 ambiante , on filre et on effectue ensuite les stades 10 à 14 du protocole du tableau 1. L'analyse à la ninhydrine de Kaiser est négative. On coiffe les groupes aminé qui n'ont pas réagi en traitant la résine avec 5 ml d'anhydride acétique et 5 ml de DIPEA dans 150 ml de chlorure de méthylène 30 pendant 60 minutes, on filtre et on lave par les stades de protocole 13 et 14. On sèche la résine sous vide pendant 16 heures et on obtient 29,6 g de résine Boc-Thr(Bzl)-BHA. On soumet une portion de la résine à une analyse d'amino-acide qui indique une charge de 0,21 mmole de Thr/g.

4,

<

46

On soumet une portion de 14,0 g (2,94 mmoles) de cette résine à une synthèse en phase solide en utilisant le même protocole que dans l'exemple 15. On effectue 11 cycles de couplage respectivement de :

5 Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol). Boc-Val (5,1 g.

23,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (6,9 g. 23,5 mmol), Boc-Asn (3,0 g, 13,0 mmol), Boc-Leu (5,9 g. 23,5 mmol) Boc-Tyr(2.6-DCB) (10,3 g. 23,5 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (9,8 g. 23,5 mmol). Boc-Val (5,1 g, 23,5 10 mmol), Boc-Ala (4,4 g. 23,5 mmol). et Boc-Nle (5,4 g. 23;5 mmo 1) pour donner 26 g de résine Boc-decapeptide.

On couple une portion de 17,3 g (1,96 mmole) de cette résine avec 4 cycles qui sont respectivement chacun: 15 Boc-Gln (2,12 g. 8,6j mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (6,5 g. 15,7 mmol). Boc-Arg(Tos) (6,7 g, 15,7 mmol). et Boc-Leu (3,9 g. 15,7 mmol).

On sèche la résine sous vide et on obtient 19,7 g de résine 20 Boc-hexadecapeptide.

On fait passer une portion de 1,0 g (0,1 mmole) de cette résine par 12 cycles de couplage dont chacun comprend t

respectivement :

Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg. 0,8 mmol). Boc-Ala (152 mg, 0,8 25 mmol). Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg. 0,8 mmol). Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (173 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (152 mg. 0,8 mmol). Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), et 30 Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol).

1

47

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 1,2 g.

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11 et on obtient après lyophilisation 600 mg d'un solide blanc. On purifie une portion de 400 mg de ce peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 11. Le pic principal est coupé par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 63 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide.

Exemple 23

Ac-/Ala10,Lys12,Nie17,Val 26,Thr28/-VIP

On fait passer une portion de 1,0 g (0,1 mmole) de résine Boc-hexadecapeptide de l'exemple 22 par 12 cycles de couplage, respectivement chacun avec Boc-Lys(2-Cl-Z) (332 mg, 0,8

mmol). Boc-Thr(Bzl) (247 mg. 0,8 mmol). Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol). Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol). Boc-Val (173 mg. 0,8 mmol). Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg. 0,8 mmol). Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol). et Boc-His(Tos) (328 mg. 0,8 mmol).

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on taite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 1,1 g.

48

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11 pour obtenir, après lyophi1isation,700 mg d'un solide blanc. On purifie une portion de 290 mg de ce peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 11, sauf 5 qu'on effectue un gradient linéaire de 20 à 40%. Le pic principal est coupé par analyse CLHP analytique des fractions recueillies, on groupe et on lyophilise pour obtenir 35,7 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte des amino-acides.

10

Exemple 24

Ac-/Al a9, Lys12, Nie17, Va 1 26, Thr 2 8_7 - VI P

On soumet une portion de 0,58 g (0,075 mmole) de la 15 résine Boc-decapeptide de l'exemple 17 à une synthèse en phase solide comme dans l'exemple 15. On effectue 16 cycles de couplage dont chacun comporte :

Boc-Gln (102 mg, 0,41 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (314 mg, 0,75 mmol), Boc-Arg(Tos) (324 mg, 0,75 mmol), Boc-Leu (188 20 mg,' 0,75 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (314 mg, 0,75 mmol),

Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,75 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (333 mg, 0,75 mmol), Boc-Ala (143 mg, 0,75 mmol), Boc-Asp(OcHx) (238 mg, 0,75 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,75 mmol). Boc-Phe (200 mg, 0,75 mmol), Boc-Val (164 mg, 0,75 mmol), Boc-Ala

2 5

(143 mg, 0,75 mmol), Boc-Asp(OcHx) (238 mg, 0,75 mmol),

Boc-Ser(Bzl) (223 g, 0,75 mmole), et Boc-His(Tos) (310 mg, 0,75 mmole). On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 1,0 ml d'anhydride 30 acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/ch1 orure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,9 g.

49

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11 pour obtenir, après lyophilisation, 336 mg d'un solide blanc. On purifie ce peptide brut par CLHP prépara-tive comme dans l'exemple 11 sauf qu'on effectue un gradient 5 linéaire de 10 à 40% en deux heures à 4,0 ml/min. Le pic principal est coupé par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 11,8 mg d'une poudre blanche amorphe. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de l'amino-10 acide.

Exemple 25

Ac-/Ala8,Lys12,Nle17, Va 1 26 , Thr 28_7-VI P

15 On fait passer une portion de 2,0 g (0,2 mmole de résine Boc-hexadecapeptide de l'exemple 22 par quatre cycles de couplage dont chacun respectivement avec :

Boc-Lys(2-C1-Z) (664 mg. 1,6 mmol). Boc-Thr(Bzl) (495 mg. 1,6 mmol). Boc-Tyr(2,6-DCB)

20

(705 mg. 1,6 mmol), et Boc-Asn (204 mg. 0,88 mmol)

pour obtenir 2,2 g de Boc-ei cosapepti^de.

On fait passer une portion de 1,1 g (0,1 mmole) de 25 cette résine peptide par 8 cycles de couplage comportant respectivement :

Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg. 0,8 mmol). Boc-Val (174 mg. 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8

30

mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg. 0,8 mmol). et Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol).

50

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sè-5 che sous vide pour obtenir 1,1 g.

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11 pour obtenir après lyophilisation 573 mg d'un solide blanc. On purifie ce peptide brut par CLHP prépara-10 tive comme dans l'exemple 11, sauf qu'on effectue un gradient linéaire de 10 à 40%. Le pic principal est coupé par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 69,0 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une ana-15 lyse correcte de 1'amino acide.

Exemple 26

Ac-/7\1a7, Lys12, Nie17, Val 26, Thr28J-VI P

20 . On fait passer une portion de 1,1 g (0,1 mmole) de résine Boc-eicosapeptide de l'exemple 25 par 8 cycles de couplage dont chacun comporte Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8

mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8

9 K

mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), et Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol).

On fait passer la résine peptide par les stades de protocole 1 à 8 et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 15 30 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 1,1 g.

°Î7

51

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11 pour obtenir, après lyophilisation, 700 mg d'un solide blanc. On purifie une portion de 400 mg de ce peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 11, 5 sauf qu'on effectue un gradient linéaire de 10 à 45%. On coupe le pic principal par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 29 mg d'une poudre blanche amorphe. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de l'amino-10 acide.

Exemple 27

Ac-/7\la6,Lys12,Nle17,Val25,Thr28/-VI P

15 On fait passer une portion de 1,0 g (0,1 mmole) de résine Boc-hexadecapeptide de l'exemple 22 par 12 cycles de couplage utilisant respectivement Boc-Lys(2-Cl-Z) (332 mg, 0,8

mmol). Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0.8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol),

20

Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmol). Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (173 mg, 0.8 mmol), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Bçc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), et Boc-His(Tos)

(328 mg, 0,8 mmo1).,

2 5 !

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on 30 sèche sous vide pour obtenir 1,3 g.

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11, pour obtenir, après lyophilisation, 531,4 mg d' un solide blanc.

52

On purifie ce peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 11. Le pic principal est coupé par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 200 mg d'une matière semi-5 purifiée. On purifie ce composé par filtration sur gel

Sephadex G-25 dans AcOH à 10% pour obtenir 104,5 mg d'une poudre blanche qu'on purifie de nouveau par CLHP pour obtenir 20 mg d'une poudre blanche amorphe. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de l'amino-10 acide.

Exemple 28

Ac-/Al a5, Lys12, Nie17, Val 26,Thr287-VIP

15 On fait passer une portion de 3,0 g (0,3 mmole) de résine Boc-hexadecapeptide de l'exemple 22 par 7 cycles de couplage chacun comportant : Boc-Lys(2-Cl-Z) ( 956 mg, 2,4

mmol), Boc-Thr(Bzl) (742 mg, 2,4 mmol). Boc-Tyr(2.6-DCB) (1,05 g, 2,4 mmol). Boc-Asn (302 mg. 1,3 mmol),

2 0

Boc-Asp(OcHx) (757 mg. 2,4 mmol). Boc-Thr(Bzl) (742 mg. 2,4 mmol), et. Boc-Phe (637 mg, 2,4 mmol)

i pour obtenir 3,6 g de résine Boc-tricosapeptide.

25 On fait passer une portion de 1,2 g (0,1 mmole)

de cette résine par 5 cycles dont chacun comporte Boc-Ala (151 mg,

0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol). Boc-Asp(OcHx) (252

mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol).

Boc-His(Tos) (328 mg, 0?8 mmol).

30

On fait passer la résine peptide par les stades de protocole

1 à 8 et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans

15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes.

On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous

35 vide pour obtenir 1,13 g.

t

53

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11, pour obtenir, après lyophilisation, 600 mg d'un solide blanc. On purifie ce peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 11, sauf qu'on effectue un gra-5 dient linéaire de 10 à 40%. Le pic principal est coupé par une analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 64 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

10

Exemple 29

Ac-Z"A1 a3, Lys12, Nie17, Val 26, Thr 28J7-VI P

On fait passer une portion de 1,2 g (0,1 mmole) de

15 résine Boc-tricosapeptide de l'exemple 28 par 5 cycles comprenant chacun :

Boc-Val (174 mg. 0,8 mmol). Boc-Ala (151 mg.

0,8 mmol). Boc-Ala (151 mg. 0,8 mmol). Boc-Ser(Bzl) (236 mg.

0,8 mmol). et Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol).

20 On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on taite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 1,2 g.

25

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11 pour obtenir, après lyophilisation, 700 mg d'un solide blanc. On purifie ce peptide brut à deux reprises par CLHP préparative comme dans l'exemple 11 sauf qu'on effectue 30 un gradient linéaire de 10 à 45% et de 20 à 45%. Le pic principal est coupé par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 9,6 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

1

54

Exemple 30

Ac-/"Al a2, Lys12, Nie17, Va 1 26, Thr 28J-VI P

On soumet à une synthèse en phase solide comme dans 5 l'exemple 5 une portion de 0,25 g (0,05 mmole) de résine Boc-Thr-(Bzl)-BHA de l'exemple 2 sauf qu'on remplace dans le 26ême cycle Boc-Ser(Bzl) par Boc-Ala (95 mg) (0,5 mmole). On débloque 381 mg de résine peptide et on obtient 112 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 41,2 mg d' 10 une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de l'ami no-acide.

FAB-MS : MH calc: 3279,8, trouvé : 3279,5.

Exemple 31

15 Ac - /"Al a1, Lys12,Nie17, Val 26,Thr28/-VIP

On fait passer une portion de 1,2 g (0,1 mmole) de résine Boc-tricosapeptide de l'exemple 28 par 5 cycles dont chacun comprend :

20 Boc-Val (174 mg, 0;8 mmol). Boc-Ala (151 mg,

078 mmol). Boc-Asp(OcHx) (252 mg. 0,8 mmol). Boc-Ser(Bzl)

(236 mg. 0,8 mmol), et Boc-Ala (151 mg, 0.8 mmol). ' »

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 25 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 1 g.

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11 pour obtenir, après lyophilisation, 640 mg d'un 30 solide blanc. On purifie ce peptide brut à deux reprises par CLHP préparative comme dans l'exemple 11, sauf qu'on effectue le gradient linéaire de 20 à 50% et 25 à 40%.

1

55

Les pics principaux sont coupés par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise et on obtient 45 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1' 5 amino-acide. FAB-MS : calc: 3229,7, trouvé 3228,8.

Exemple 32

Ac-ZGly1, Lys12, Nie17, Val 26, Thr 28J-VI P

10 On fait passer une portion de 4,0 g (0,4 mmole) de résine Boc-hexadecapeptide de l'exemple 22 par 10 cycles de couplage comportant respectivement Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,33 g, 3,2

mmol), Boc-Thr(Bzl) (990 mg, 3,2 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,41 g, 3,2 mmol), Boc-Asn (409 mg. 1,76 mmol), 15 Boc-Asp(OcHx) (1,02 g, 3,2 mmol), Boc-Thr(Bzl) (990 mg. 3,2 mmol), Boc-Phe (849 mg, 3,2 mmol), Boc-Val (695 mg, 3;2 mmol), Boc-Ala (606 mg, 3,2 mmol), et Boc-Asp(OcHx) (1,02 mg, 3j2 mmol)

20 pou.r obtenir 6,0 g de résine Boc-hexacosapepti de.

On fait passer une portion de 0,629 g (0,08 mmole)

»

de cette résine par deux cycles, respectivement avec Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmole), et Boc-Gly (70 mg, 0,4 mmole). 25 On fait passer cette résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on taite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 546 mg.

30 On traite la résine peptide avec HF comme dans 1'

exemple 11 pour obtenir après lyophilisation 210 mg d'un solide blanc.

t

•r

56

On purifie le peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 5. Le pic principal est coupé par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise pour obtenir 24,0 mg d'une poudre amorphe blanche 5 amorphe. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

FAB-MS : calc. 3215,7, trouvé: 3215,4.

Exemple 33

10 Ac/leu5, Lys12, Nie17, Val 26, Thr28_7-VI P

On fait passer une portion de 1,0 g (0,1 mmole) de résine Boc-hexadecapeptide de l'exemple 22 par 12 stades de couplage dont chacun comporte respectivement :

15 . Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg, 0,8

mmol), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Leu (199 mg, 0,8

20

mmol). Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), et Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol).

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du 25 protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,8 g.

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' 30 exemple 11 pour obtenir, après lyophilisation, 238 mg d'un solide blanc. On purifie ce peptide brut à deux reprises par CLHP préparative comme dans l'exemple 11.

57

Les pics principaux sont coupés par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on regroupe et on lyophilise et on obtient 17,4 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1' 5 amino-acide.

Exemple 34

Boc-3-(l'-naphtyl)-alanine (Boc-l-Nal)

10 On dissout 1,0 g (4,6 mmoles) de 3-( 1 '-naphtyl )-

alanine et 512 mg (4,8 mmoles) de carbonate de sodium dans 20 ml de H20 et 20 ml de dioxanne. On ajoute lentement 1,26 g (5,77 mmoles) de dicarbonate de di-t-buyle dans 5 ml de dioxanne. On agite le mélange pendant 16 heures à tem-15 pérature ambiante. La majeure partie du dioxanne s'évapore sous vide et le résidu est repris dans 35 ml de H^O. On lave cette solution avec 3 x 25 ml de Et20, on acidifie avec 10% d'acide citrique/H20 jusqu'à pH 2 et on extrait avec 4 x 50 ml de chlorure de méthylène. On sèche les cou-20 ches combinées de chlorure de méthylène sur MgSO^, on filtre et on concentre sous vide en une mousse huileuse. On re cristallise cette matière dans un mélange de EtOAc et d' éther de pétrole à -20°C et on obtient 1,35 g (93%) de cris taux blancs, PF 144-146°C. /* /n -47,8° (c 1, EtOH ) .

1

25 H RMN compatible avec la structure.

Exemple 35

Ac-/"1-Nal5, Lys12,Nie17,Val25,Thr28/-VIP

30 On traite 30 g (21,4 meq) de résine réticulée de copolystyréne de benzhydrylami ne et 1% de divinylbenzène (200-400 ASTM mesh, Bachem) comme dans l'exemple 22, sauf qu'on utilise 19,9 g de Boc-Thr(Bzl) (63,4 mmoles) et 6,6 g de dicyclohexy!carbodiimi de (32,1 mmoles).

58

On agite ce mélange pendant 18 heures à température ambiante, on filtre, et on effectue les stades 10 à 14 du protocole du tableau 1. L'analyse à la ninhydrine de Kaiser est négative. On coiffe les groupes aminé qui n'ont pas réagi en traitant la résine avec 8 ml d'anhydride acétique et 8 ml de DIPEA dans 200 ml de chlorure de méthylène pendant 60 minutes, on filtre et on lave par les stades 13 et 14 du protocole. On sèche la résine sous vide pendant 16 heures et on obtient 34,2 g de résine Boc-Thr(Bz1)-BHA. On soumet une portion de cette résine à une analyse de 1'amino-acide qui indique une charge de 0,47 mmole de Thr/g.

On soumet une portion de 0,75 g (0,35 mmole) de cette résine Boc-Thr(Bzl)-BHA à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430A de Applied Biosystems, comme dans l'exemple 11. On effectue 21 cycles de couplage dont chacun utilise respectivement:

Boc-Leu (499 mg. 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg. 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol). Boc-Leu (499 mg. 2,0 mmol). Boc-Tyr(2.6-DCB) (880 mg. 2,0 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg. 2,0 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg. 2,0 mmol). Boc-Val (435 mg,.2,0 mmol). Boc-Ala (378 mg. 2,0 mmol). Boc-Nle (462 mg. 2,0 mmol), Boc-Gln (492 mg. 2,0 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg. 2,0 mmol),. Boc-Arg(Tos) (856 mg. 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg. 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg. 2,0 mmol). Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg. 2,0 mmol). Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), et Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol)j pour donner 2,59 g de résine Boc-docosapeptide.

59

On soumet une portion de 0,74 g (0,1 mmole) de cette résine à une synthèse en phase solide comme dans 1' exemple 15. On effectue 6 cycles dont chacun comprend respectivement : Boc-l-Nal (126 mg, 0,4 mmole),

5 Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg. 0,4 mmol).

Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol). Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol), et Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol).

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on fait réagir à deux reprises avec 1,0 ml d' 10 anhydride acétique et 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 60 minutes. On lave la résine en utilisant les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,8 g. On débloque la résine peptide comme dans 1 'exemple 5 pour obtenir 366 mg de peptide brut. On purifie le peptide par 15 CLHP comme dans l'exemple 5, sauf qu'on effectue un gradient linéaire de 27 à 37%, pour obtenir 49,6 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide .

FAB-MS : MH calc : 3345,9, trouvé: 3345,5.

20

Exemple 36

Boc-p-fluoro-phénylalanine (Boc-p-F-Phe).

On dissout 988 mg (4,91 mmoles) de p-f1uoro-phényl-25 alanine.H20 et 525 mg (4,95 mmoles) de carbonate de sodium dans 30 ml de 50% de dioxanne/H20. On ajoute lentement 1,3 g (5,95 mmoles) de dicarbonate de di-t-butyle dans 3 ml de dioxanne. On agite le mélange pendant 16 heures à température ambiante et on évapore. On dissout le résidu dans 20 ml 30 de H20, on lave avec 3 x 20 ml de EtgO, on acidifie à pH 2 avec HC1 au dixième et on extrait avec 3 x 30 ml de EtOAc.

%

60

On sèche les couches combinées EtOAc sur MgSO^, on filtre et on concentre en une huile. On cristallise cette matière dans EtOAc/hexane et on obtient 1,14 g {82%) d'aiguilles blanches fines, P.F 52-54°C.

5 / oC /D + 23,13° (c 1, EtOAc). *H RMN compatible avec la structure.

Analyse : calculé pour C^H^gFNO^ : C 59, 39 ; H 6,40 ; N 4,94 ; trouvé : C 59,51 ; H 6,60 ; N 4,95.

10 Exemple 37

Ac-/p-F-Phe6,Lys12,NIe17,Val 26, Thr 28J-VI P

On soumet 0,68 g (0,1 mmole) de résine Boc-docosa-peptide de l'exemple 35 à une synthèse en phase solide com-15 me dans l'exemple 15. On effectue six cycles chacun comportant respectivement :

Boc-p-F-Phe (113 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol), et Boc-His(Tos)

20

(328 mg, 0,8 mmol).

On fait ensuite passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole, on fait réagir à deux reprises avec 1,0 ml d'anhydride acétique et 15 ml de 6% DIPEA/ 25 chlorure de méthylène pendant 60 minutes. On,lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,7 g. On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 et on obtient 270 mg de peptide brut. On purifie le peptide par CLHP comme dans l'exemple 5 et on obtient 84,1 mg 30 de poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

FAB-MS : MH calc. 3313,8 , trouvé 3313,0.

61

Exemple 38 Ac-/"G1 u8,Lysi2,Nle17,Val26,Thr28J-VIP

On fait passer une portion de 7,48 g (1,0 mmole) de résine Boc-hexapeptide de l'exemple 15 par 10 cycles de couplage dont chacun utilise respectivement :

Boc-Tyr(2.6-DCB) (1,76 g. 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Val (869 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (1,5 g, 8,0 mmol), Boc-Nle (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Gln (1,08 g, 4,4 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (1,71 g, 4,0 mmol), et Boc-Leu (998 mg, 4,0 mmol).

On sèche la résine peptide sous vide et on obtient 9,6 g de résine Boc-hexadecapeptide.

On fait passer une portion de 7,68 g (0,8 mmole) de cette résine par un cycle de couplage avec Boc-Lys(Fmoc ) (1,5 g , 3,2 mmoles) pour obtenir 8,32 g de résine Boc-heptadecapepti de.

On fait passer une portion de 6,24 g (0,6 mmole) de cette résine par 2 cycles de couplage dont chacun utilise respectivement Boc-Thr(Bzl) (742 mg, 2,4 mmoles) et Boc-Tyr

«

(2,6-DCB) (1,06 g, 2,4 mmoles) pour obtenir 6,28 g de résine Boc-nonadecapeptide.

On fait passer une portion de 2,09 g (0,2 mmole) de cette résine par 9 cycles de couplage dont chacun comporte l'utilisation respective de Boc-Asn

(204 mg, 0,88 mmol), Boc-Glu(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol). Boc-Asp(OcHx) (258 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg. 0,8 mmol), et Boc-His(Bom) (330 mg. 0,88 mmol).

62

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,25 ml d'anhydride acétique et 70 ml DIPEA dans 20 ml de chlorure de méthylène pendant 20 minutes. On traite cette résine avec 20% pipé-5 ridine /DMF pendant 20 minutes, on lave par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 2,28 g.

On traite une portion de 0,57 g (0,05 mmole) de cette résine comme dans l'exemple 11 avec 6 ml de sulfure 10 de diméthyle et 2 ml de HF liquide pendant 2 heures à 0°C. On évapore le mélange de réaction et on traite le résidu avec 0,1 ml d'anisole et 9 ml de HF liquide pendant 45 minutes à 0°C. On évapore le mélange de réaction et on lave le résidu avec 1 x 15 ml de Et20 et 3 x 15 ml de EtOAc. On 15 extrait la résine avec 3 x 15 ml de AcOH à 10%. On lyophilise les filtrats aqueux combinés et on obtient 250 mg d' un solide blanc.

On purifie cette matière brute par CLHP préparative comme dans l'exemple 5 sauf qu'on effectue un gradient li-20 néaire de 10 à 40% en 4 heures. Le pic principal est coupé par analyse CLHP analytique des fractions collectées, on groupe et on lyophilise et on obtient 40,0 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

25

Exemple 39

Boc-3-(2'-naphtyl)-alanine (Boc-2-nal )

On traite 1,05 g (4,83 mmoles) de 3-(2'-naphtyl )-30 alanine et 510 mg (4,83 mmoles) de carbonate de sodium avec 1,26 g (5,77 mmoles) de dicarbonate de di-t-butyle,

comme dans l'exemple 34.

63

Après traitement, on évapore les couches de chlorure de méthylène en une huile limpide qu'on cristallise dans EtOAc/ éther de pétrole pour obtenir 1,25 g (82%) d'un produit aciculaire blanc, PF 92-94°C.

/ /D + 43,15° (c 1, EtOH). 1 HRMN compatible avec la structure.

Analyse calculée pour C28H21N04 : C 68,56 ï H 6'71 i N 4>44

trouvé : C 68,66 ; H 7,02 ; N 4,31

Exemple 40

Ac-/'2-Nal10, Lys12, Nie17, Val 26, Thr28J-VI P

On soumet une portion de 0,85 g (0,4 mmole) de résine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 35 à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430A d' Applied Biosystems, comme dans l'exemple 11. On effectue 17 cycles de couplage, chacun respectivement avec :

Boc-Leu (499 mg. 2,0 mmol), Boc-Val (435 rag».2,0 mmol). Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). Boc-Asn (464 mg. 2,0 mmol). Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB)

(880 mg. 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg. 2,0 mmol),

%

Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg. 2,0 mmol). Boc-Val (435 mg. 2,0 mmol). Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol). Boc-Nle (462 mg. 2,0 mmol). Boc-Gln (492 mg. 2,0 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg. 2,0 mmol). Boc-Arg(Tos) (856 mg. 2,0 mmol). Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg. 2,0 mmol), et Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol)

pour obtenir 2,8 g de résine Boc-octadecapeptide.

On fait passer une portion de 0,7 g (0,1 mmole) de cette résine par 10 cycles chacun utilisant respectivement:

«r

64

Boc-2-Nal (252 mg,

0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0r8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0?8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), et Boc-His(Tos) (328 mg. 0,8 mmol).

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 1,0 ml d'anhydride acé-10 tique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,9 g. On débloque la résine peptide pour obtenir 210 mg de peptide brut purifié par CLHP pour obtenir 46,8 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène 15 par CLHP et donne une analyse correcte de 1 ' amino-acide. FAB-MS : MH calc 3329,8 ; trouvé : 3328,8.

Exemple 41

Ac-/p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Val26,Thr287-VIP

20

On fait passer une portion de 0,7 g (0,1 mmole) de résine Boc-octadecapeptide de l'exemple 40 par 10 cycles

«

dont chacun utilise respectivement :

Boc-p-NH(Z)-Phe (331 mg, 0?8 mmol), Boc-Asn

25 (102 mg, 0?44 mmol). Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol),

Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmol). Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg. 0,8 mmol). Boc-Ala (151 mg. 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg. 0,8 mmol). Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0;8 mmol). et Boc-His(Tos) (328 mg. 0.8 mmol).

30 On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du pro tocole et on traite avec 1,0 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes.

65

On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,9 g. On débloque la résine peptide comme dans 1'exemp1e 5 pour obtenir 247 mg de peptide brut. On purifie le peptide par CLHP comme dans l'exemple 5 et 5 on obtient 32,7 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1' amino-acide. FAB-MS : MH calc : 3294,8 ; trouvé : 3294,1.

Exemple 42

10 Boc-0-méthy1 -tyrosine (Boc-O-Me-Tyr)

On traite 1,0 g (5,1 mmoles) de 0-méthy1-tyrosine et 1,08 g (10,2 mmoles) de carbonate de sodium avec 1,7 g (7,7 mmoles) de dicarbonate de di-t-butyle comme dans 1' 15 exemple 34 sauf qu'on utilise 25 ml de H20 et 12 ml de dioxanne. Après traitement, on évapore les couches de chlorure de méthylène en une huile limpide qu'on cristallise dans Et2Û/éther de pétrole pour obtenir 1,1 g (73%) d'un solide blanc, PF 94-96°C.

20

Exemple 43

Ac-/"0-Me-Tyr10, Lys12, Nie17, Val 26,Thr287- VIP

On soumet une portion de 0,85 g (0,4 mmole) de ré-25 sine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 35 à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide, modèle 430A de Applied Biosystems, comme dans l'exemple 11. On effectue 13 cycles de couplage dont chacun utilise respectivement:

¥"

66

Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol). Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Sec(Bzl) (590 mg. 2,0 mmol), Boc-Asn (464 5 mg. 2,0 mmol). Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg. 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg. 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg. 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg. 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (492 mg. 2,0 mmol), et Boc-Lys(2-C1-Z) (830

10 mg, 2,0 mmoles) pour obtenir 1,9 g de résine Boc-tetradeca-pepti de.

On fait passer cette résine par 4 cycles de couplage comme dans l'exemple 15, dont chacun utilise respectivement : Boc-Arg(Tos) (685 mg,|

15

1,6 mmol), Boc-Leu (399 mg. 1,6 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (664 mg, 1.6 mmol) et Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol)

pour obtenir 2,1 g de résine Boc-octadecapeptide.

On fait passer une portion de 0,5 g (0,1 mmole) de 20 cette résine par un cycle de couplage comme dans l'exemple 15 avec Boc-O-Me-Tyr (118 mg, 0,4 mmole) pour donner 0,5 g de résine Boc-nonadecapeptide.

On fait passer la résine par 9 cycles de couplage comme dans 1'exemple 5 en utilisant pour chaque cycle res-25 pectivement : Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmole),

Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg. 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol). Boc-Ala (189 mg. 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1;0 mmoiy, et

O U

Boc-His(Tos) (409 mg, 1.0 mmol).|

67

On fait passer la résine de peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 1,0 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 et 14 et on sèche sous vide. On débloque la résine peptide comme dans 1' exemple 5 et on obtient 154 mg de peptide brut. On purifie le peptide par CLHP comme dans l'exemple 5 pour obtenir 36,4 mg d'une poudre blanche amorphe. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. FAB-MS : MH calculé 3309,8 ; trouvé 3309,2.

Exemple 44

Boc-m-Fluoro-DL-Tyrosine(benzyle)

Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl))

On dissout 1,94 g (9,74 mmoles) de m-fluoro-DL-tyrosine dans 10,1 ml de NaOH binormal. On ajoute 1,22 g (4,87 mmoles) de CuS0^5H2Û dans 5 ml de Ha0. On chauffe le mélange à 50-60°C pendant 10 minutes et on refroidit dans la glace. On ajoute 42 ml de méthanol sous agitation vigoureuse. Tout en agitant dans un bain de glace, on ajoute goutte à goutte 2,25 g (13,1 mmoles) de bromure de benzyle. Après 30 minutes, on réchauffe le mélange à la température ambiante et on laisse sous agitation pendant 16 heures. On élimine par filtration le précipité bleu acier et on lave avec 20 ml de H20/MeOH à 20%, 20 ml de MeOH et 20 ml d'acétone, puis on sèche sous vide pour obtenir 3,14 g. On met en suspension cette matière dans 100 ml de 50% Et0H/H20 et on chauffe au reflux. On ajoute 3,62 g (9,7 mmoles) de Na2 .EDTA.H20 et on dilue la solution avec 150 ml de 50% EtOH/H20. On filtre à chaud la solution et on refroidit le filtrat pendant 48 heures. On élimine par filtration le précipité blanc cassé et on sèche pour obtenir 3,57 g.

68

On met en suspension une portion de 3,42 g (9,7 mmoles) du solide et 2,05 g (19,3 mmoles) de carbonate de sodium dans 75 ml de H20 et 25 ml de dioxanne. On ajoute 3,2 g (14,6 mmoles) de dicarbonate de di-t-butyle dans 3 5 ml de dioxanne et on agite le mélange à température ambiante pendant 16 heures. La majeure partie du dioxanne s'est évaporée sous vide et on reprend le résidu dans 75 ml de H20. On lave la solution avec 3 x 25 ml de E12 0 acidifié à pH 2 avec de l'acide citrique à 10%, puis on extrait avec 10 3 x 40 ml de chlorure de méthylène. On sèche les couches combinées de chlorure de méthylène sur MgSO^, on filtre et on concentre en une mousse huileuse. On cristallise dans Et20/éther de pétrole pour obtenir 1,8 g (47%) d'une poudre blanche, P.F 122-122, 5°C. 1HRMN compatible avec la 15 structure.

Exemple 45

Ac-Ays12, Nie17, m-F-Tyr22, Val26, Thr28/-VIP

20 On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole ci-dessus comme dans 1' exemple 5. On effectue 28 cycles de couplage en utilisant dans chaque cycle respectivement :

25

. Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol) Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-m-F-Tyr(Bzl) (195 mg, 0,5 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg. 1,0 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol), Boc-Gln (246 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Thc(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol), et Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmol).

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 10 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 60 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 639 mg.

On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 pour obtenir 200 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 25,6 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : MH cal: 3313,8, trouvé : 3313,7.

<

70

Exemple 46

Ac-/lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29,30, Met31./-VIP

On soumet une portion de 0,188 g (0,075 mmole) de 5 résine benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Advanced Chem-Tech) à une synthèse en phase solide en utilisant le même protocole que dans l'exemple 5. On effectue 31 cycles de couplage en utilisant dans chacun l'un des composés ci-après :

10 Boc-Met (187 mg, 0,75 mmol), Boc-Gly (131 mg, 0,75

mmol), Boc-Gly (131 mg, 0,75 mmol), Boc-Thr(Bzl) (232 mg, 0,75 mmol) Boc-Leu (187 mg, 0,75 mmol), Boc-Val (163 mg, 0,75 mmol), Boc-Ser(Bzl) (221 mg, 0,75 mmol). Boc-Asn (174 mg, 0,75 mmol), Boc-Leu (187 mg, 0,75 mmol), 15 Boc-Tyr(2,6-DCB) (330 mg. 0,75 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (311 mg, 0,75 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z) (311 mg, 0,75 mmol), Boc-Val (163 mg, 0,75 mmol), Boc-Ala (142 mg, 0,75 mmol), Boc-Nle (173 mg. 0,75 mmol), Boc-Gln (185 mg, 0,75 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (311 mg. 0,75 mmol), Boc-Arg(Tos) (321 mg. 20 0,75 mmol), Boc-Leu (187 mg, 0,75 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (311 mg, 0,75 mmol), Boc-Thr(Bzl) (232 mg, 0,75 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (330 mg, 0,75 mmol)t Boc-Asn (174 mg, 0,75 mmol), Boc-Asp(OcHx) (236 mg. 0,75 mmol), Boc-Thr(Bzl) (232 mg, 0t75 mmol). Boc-Phe (199 mg, 0,75 mmol), Boc-Val (163 25 mg, 0,75 mmol). Boc-Ala (142 mg. 0,75 mmol). Boc-Asp(OcHx) (236 mg. 0,75 mmol), Boc-Ser(Bzl) (221 mg, 0;75 mmol). et Boc-His(Tos) (307 mg, 0,75 mmol). La résine peptide est soumise ensuite aux stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 10 ml de 6% DIP EA/ 30 chlorure de méthylène pendant 60 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 444 mg.

71

On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 pour obtenir 177 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 23,5 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et assure 5 une analyse correcte de 1'amino-acide.

FAB-MS : MH calc : 3541,1, trouvé : 3540,1.

Exemple 47

Ac-/'Lys12, Nie17, Val 25, Thr 28, G1 y29'30, Cys ( Acm ) 31/-VIP

10

On prépare comme dans l'exemple 10 par dérivation 10,0 g (7,0 meq) de résine réticulée de copolystyréne de benzhydrylami ne et 1% de divinylbenzène (200 à 400 ASTM mesh, Bachem) sauf qu'on utilise 3,4 g (11,6 mmoles) de 15 Boc-Cys(Acm), 2,1 g (15,8 mmoles) de HOBT et 2,2 mg (10,5 mmoles) de dicyc1ohexy1 carbodiimi de. On agite le mélange pendant 8 heures à température ambiante pour obtenir une analyse négative de ninhydrine de Kaiser. On sèche la résine sous vide pendant 16 heures et on obtient 12 g de résine 20 Boc-Cys(Acm)-BHA. On soumet une portion de cette résine à

l'analyse d'amino-acide qui indique une charge de 0,44 mmole de Cys/g.

On soumet une portion de 1,0 g (0,44 mmole) de 25 cette résine à une synthèse en phase solide à -1'aide d'un synthétiseur de peptide modèle 9500 de Biosearch. On effectue tous les couplages en utilisant des excès quintuples des équivalents molaires égaux d'acide Boc-amino et de di-cyclohexylcarbodiimide. On couple la Boc-asparagine et la 30 Boc-glutamine en qualité d'esters actifs respectifs HOBT. On effectue 30 cycles de couplage en utilisant respectivement dans chaque cas :

*

f

72

Boc-Gly (465 mg. 2,6 mmol), Boc-Gly (465 mg, 2,6 mmol), Boc-Thr(Bzl) (757 mg, 2,5 mmol), Boc-Leu (633 mg, 2,5 mmol), Boc-Val (532 mg, 2,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (780 mg, 2,6 mmol), Boc-Asn (580 mg, 2,5 mmol). Boc-Leu (633 mg. 2,5 mmol).

j

5 Boc-Tyr(Bzl) (947 mg, 2,5 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,02 g,

2,5 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1.02 g, 2,5 mmol), Boc-Val (532 j mg, 2,5 mmol), Boc-Ala (500 mg, 2,6 mmol), Boc-Nle (680 mg, ' 2,9 mmol), Boc-Gln (650 mg, 2,6 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (l,02j g, 2,5 mmol), Boc-Arg(Tos) (1,13 g, 2,6 mmol), Boc-Leu (633 10 mg, 2,5 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,02 g, 2,5 mmol),

Boc-Thr(Bzl) (757 mg, 2,5 mmol), Boc-Tyr(Bzl) (947 mg, 2,5 mmol), Boc-Asn (580 mg. 2,5 mmol). Boc-Asp(OcHx) (835 mg, 2f6 mmol), Boc-Thr(Bzl) (757 mg. 2,5 mmol). Boc-Phe (780 mg. 2,9 mmol). Boc-Val (532 mg. 2,5 mmol), Boc-Ala (500 mg, 2,6 15 mmol), Boc-Asp(OcHx) (835 mg, 2,6 mmol), Boc-Ser(Bzl) (780 mg, 2,6 mmol), et Boc-His(Tos) (1.08 g. 2,6 mmol).

On supprime la protection de la résine peptide et on traite pendant 30 minutes avec de l'anhydride acétique. On sèche 20 la -résine sous vide et on obtient 3,2 g de résine peptide.

On débloque une portion de 1,5 g de cette résine peptide comme dans l'exemple 11 et on obtient 525 mg de peptide brut. La purification par CLHP, comme dans l'exemple 25 5, donne 47 mg d'une poudre blanche amorphe.

Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

FAB-MS : MH calc : 3583,1 ; trouvé : 3583,6.

73

Exemple 48

Ac-/Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29'30,Thr317-VIP

Ori soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de rési-5 ne benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide, comme dans l'exemple 5. On effectue 3 cycles de couplage dont chacun comprend respectivement: Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol), et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de cou-10 plage, comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr (Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol). On débloque la résine peptide (700 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 200 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 15 63,8 mg d'une poudre blanche amorphe. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1 'amino-acide. FAB-MS : MH calc. 3511,0, trouvé 3510,1.

Exemple 49

2 0 Ac-/Lys12,Nie17,Val26,Thr28,Ala29'30,Met31J-VIP

On soumet une portion de 0,188 g (0,075 mmole) de résine benzhydry1 ami ne (ASTM-mesh 100-200, Advanced Chem-Tech) à une synthèse en phase solide, comme dans l'exemple 25 46, sauf que dans le second et troisième cycles, on remplace Boc-Gly par Boc-Ala (142 mg, 0,75 mmol). On débloque la résine peptide (447 mgjcomme dans l'exemple 5 pour obtenir 192 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 10,8 mg d'une poudre amorphe blanche. 30 Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. FAB-MS : MH calc. 3569,1, trouvé: 3568,9.

4

74

Exemple 50

Ac-/Lys12,Nie17,Va 126,Thr28,Al a29-3!7-VIP

On soumet une portion de 0,25 g (0,05 mmole) de ré-5 sine Boc-Ala-BHA de l'exemple 1 à une synthèse en phase solide comme dans l'exemple 5, sauf qu'avant les 27 cycles de l'exemple 5, on exécute 3 cycles comportant chacun respectivement : Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmol), Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmol) et Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmol). On débloque la 10 résine peptide (431 mg ), comme dans l'exemple 5, pour obtenir 117 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 28,8 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. FAB-MS : MH calc : 3509,0, 15 trouvé : 3508,2.

Exemple 51

Ac-/Lys12,Nie17,Val26,Thr28,Gly29,Lys307-VIP

20 On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de ré

sine benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le même protocole que dans l'exemple 5. On effectue deux cycles de couplage respectivement avec Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmole) et Boc-Gly (175 mg, 25 1,0 mmole). On effectue 28 cycles de couplage comme dans 1' exemple 45, sauf qu'au 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr (Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol). On débloque la résine peptide (873 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 272 mg de peptide brut. La purification par CLHP, 30 comme dans l'exemple 5, donne 59,0 mg d'une poudre blanche, amorphe. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : MH calc. 3481,0, trouvé 3481,3.

75

Exemple 52

Ac-/Lys12'14,Nie17,Al a19,Val26, Thr28J-VIP

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de ré-5 sine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le même protocole que dans 1' exemple 5. On effectue 28 cycles de couplage comme dans 1' exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), dans 10 le lOême cycle, on remplace Boc-Val par Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol) et dans le 15ème cycle, on remplace Boc-Arg(Tos) par Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol). On débloque la résine peptide ( 778 mg ) comme dans l'exemple 5 pour obtenir 158 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans 15 l'exemple 5, donne 31,7 mg de poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. FAB-MS : MH calc. 3239,7, trouvé 3239,9.

Exemple 53

2 0 Ac-/"2-Nal10, Lys12,Al a17, Val26, Thr28/-VIP

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmol) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide en utilisant le protocole de l'exemple 5. 25 On effectue 28 cycles comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, Boc-m-F-Tyr(Bzl) est remplacé par Boc-Tyr^,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), on remplace dans le 12ème cycle Boc-Nle par Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol) et dans le 19ëme cycle, on remplace Boc-Tyr(2,6-DCB) par Boc-2-Nal 30 (315 mg ,, 1,0 mmol). On débloque la résine peptide (600 mg ) comme dans l'exemple 5, pour obtenir 210 mg de peptide brut. La purification par CLHP, comme dans l'exemple 5, donne 26,5 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. 35 FAB-MS : MH calc : 3287,8 , trouvé 3287,5.

76

Exemple 54

AC-/G1 u8, Lys12, Nie17, Val 26,Thr28, Al a 2 9 ' 30, Me t31J-VI P

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de ré-5 sine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide en utilisant le même protocole que dans l'exemple 5. On effectue trois cycles de couplage comportant chacun respectivement Boc-Met (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). 10 On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bzl ) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol) et que dans le 21ème cycle, on remplace Boc-Asp(OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). On débloque la résine peptide (651 mg), comme 15 dans l'exemple 5, pour obtenir 185 mg de peptide brut. La purification par CLHP, comme dans l'exemple 5 donne 22 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1 'ami no-acide.

FAB-MS : MH calc: 3583,2, trouvé : 3582,5.

20

Exemple 55

Ac-/"G lu8, Lys12,Nie17,Val25,Thr28,Gly29'30,Phe3 ^-VIP

On soumet une portion de 0,188 g (0,075 mmole) de 25 résine benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Advanced Chem-Tech) à une synthèse en phase solide comme dans l'exemple 46, sauf qu'on remplace au 1er cycle Boc-Met par Boc-Phe (199 mg, 0,75 mmol) et que dans le 21ème cycle, on remplace Boc-Asp(OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (253 mg, 0,75 mmol). On dé-30 bloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 et on obtient 78 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 8,0 mg d'une poudre blanche amorphe. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. FAB-MS : MH calc: 3571,0 ; trouvé: 35 3569,8.

77

Exemple 56

_ . _ . 6 8 . 12 ... 17 . 19 ,. .26 28 , Ac-[p-F-Phe .Glu .Lys .Nie .Ala .Val .Thr . i

29.30 31

Gly .Cys(Acm) ]-VIP

5

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue trois cycles de couplage respectivement avec 10 Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol), et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), on remplace au lOème cycle Boc-Val par 15 Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), on remplace dans le 21ème cycle Boc-Asp(OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol) et dans le 23ème on remplace Boc-Phe par Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol). On débloque la résine peptide (699 mg) comme dans 1' exemple 5 et on obtient 270 mg de peptide brut. La purifi-20 cat-ion par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 36,5 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1 'amino-acide.

FAB-MS : MH calc: 3588,1, trouvé : 3587,7.

25 Exemple 57

Ac.-/p-F-Phe6,p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17, Va 1 25, Thr28/-VI P

On soumet une portion de 0,85 g (0,4 mmole) de résine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 35 à une synthèse en pha-30 se solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430A de

Applied Biosystems. On effectue 17 cycles de couplage comme dans l'exemple 40 pour obtenir 2,28 g de résine Boc-octadecapepti de.

*■

78

On soumet une portion de 0,57 g (0,1 mmole) de cette résine à une synthèse en phase solide comme dans 1* exemple 15 et on fait passer par 10 cycles, chacun utilisant respectivement : Boc-p-NH(Z)-Phe

5 (166 mg, 0,4 mmol). Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol),

Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol). Boc-p-F-Phe (113 mg. 0,4 mmol). Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg. 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg. 0,4 mmol). et Boc-His(Tos) (164 mg. 0,4 mmol).|

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 20 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 15 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 603 mg. On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5, pour obtenir 252 mg de peptide brut. On purifie le peptide par CLHP comme dans 1' exemple 5 eton obtient 40,4 g de poudre amorphe blanche. 20 Le .composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc:3212,8, trouvé : 3212,6.

»

Exemple 58

25 Ac-/Lys12,Ala17,Val26,Thr28,Gly29'30,Cys(Acm')317-VIP

On soumet une portion de 1,0 g (0,44 mmole) de la résine Boc-Cys(Acm)-BHA de l'exemple 47 à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 9500 de 30 Biosearch. On effectue 30 cycles de couplage comme dans 1' exemple 47, sauf qu'au 14ème cycle, on remplace Boc-Nle par Boc-Ala (500 mg, 2,6 mmol). On supprime la protection de la résine peptide et on traite avec de l'anhydride acétique pendant 30 minutes. On sèche la résine sous vide et on ob-35 tient 2,4 g de résine peptide.

79

On débloque une portion de 1,2 g de cette résine peptide comme dans l'exemple 11 et on obtient 370 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 70 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est 5 homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : MH calc : 3542,0, trouvé : 3541,7.

Exemple 59

Ac-/Glu8,Lys12'14,Nle17,Val 26,Thr28,G1y29'30,Met31J-VI P

10

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide en utilisant le protocole de l'exemple 5. On effectue trois cycles de couplage comportant chacun res-15 pectivement Boc-Met (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 45 sauf qu'au 7ême cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmole). On remplace au 15ême cycle Boc-Arg(Tos) 20 par Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol) et on remplace dans le 21ème cycle Boc-Asp(OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). On débloque la résine peptide (814 mg) comme dans 1' exemple 5 pour obtenir 200 mg de peptide brut. La purification par CLHP, comme dans l'exemple 5, donne 20,6 mg d'une 25 poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d1 amino-acide.

FAB-MS : MH calc: 3527,1, trouvé 3526,7.

Exemple 60

30 Ac-/p-NH2-Phe10,Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr287-VIP

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne (100 à 200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5.

80

On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), on remplace dans le lOème cycle Boc-Val par Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol) et 5 dans le 19ême cycle, on remplace Boc-Tyr(2,6-DCB) par Boc-p-NH(Z)-Phe (208 mg, 0,5 mmol). On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 et on obtient 138 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5,

donne 23,1 mg de poudre amorphe blanche. Le composé est 10 homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : MH calc. : 3266,7, trouvé : 3266,6.

Exemple 61

15 Ac-[p-F-Phe6.Glu8.Lys12.Nie17.Val26.Thr28,

Gly29'3 0.Cys(Acm)31]-VIP

i

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une syn-20 thèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue 3 cycles de couplage dont chacun utilise respectivement : Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 45, sauf qu'on rem-25 place Boc-m-F-Tyr(Bzl) dans le 7ème cycle par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), dans le 21ème cycle, on remplace Boc-Asp(OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol), dans le 23ème cycle, on remplace Boc-Phe par Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol). On débloque la résine peptide (900 mg) comme dans 30 l'exemple 5 pour obtenir 255 mg de peptide brut. La purifi-ccation par CLHP, comme dans l'exemple 5, donne 20,5 mg d'une poudre blanche amorphe. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : MH calc: 3616,1 ; trouvé : 3615,6.

81

Exemple 62

Ac-Z'Glu8, Lys12, Al a17,19, Val 26, Thr28,Gly29, 30,Met31J-VIP

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de rési-5 ne benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue trois cycles de couplage chacun respectivement avec Boc-Met (249 mg, 1,0 mmole), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de coupla-10 ge comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), dans le lOème cycle, on remplace Boc-Val par Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), dans le 12ème cycle, on remplace Boc-Nle par Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol) et dans le 21ëme 15 cycle, on remplace Boc-Asp (OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). On débloque la résine peptide ( 736 mg ) comme dans l'exemple 5 pour obtenir 240 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 38,8 mg d'une poudre amoprhe blanche. Le composé est homogène par CLHP et 20 donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS: MH calc: 3485,0 ; trouvé : 3484,6.

Exemple 63

Ac-Z"Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29'30,Ala317-VIP

25

On soumet une portion de 0,25 g (0,05 mmole) de résine Boc-Ala de l'exemple 1 à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue 3 cycles de couplage chacun comportant respectivement : Boc-Gly (87 mg, 30 0,5 mmol), Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmol) et Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmol). On effectue 27 cycles de couplage comme dans 1' exemple 5, sauf que dans le 20ème cycle, on remplace ij

82

Boc-Asp(OcHx) par Boc-Glu (Bzl) (167 mg, 0,5 mmol). On débloque la résine peptide (380 mg ) comme dans l'exemple 5 et on obtient 115 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 31,6 mg d'une poudre blanche amorphe. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-aci de.

FAB-MS : MH calc: 3495,0 ; trouvé : 3495,1.

Exemple 64

Ac-[Glu8,Lys12.Nie17.Ala19.Val26.Thr28, Gly29 » 3°.Met31]-VIP

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue 3 cycles de couplage dont chacun comprend respectivement Boc-Met (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 45 sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), dans le lOème cycle, on remplace Boc-Val par Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol) et dans le 21ème cycle, on remplace Boc-Asp (OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). On débloque la résine peptide (800 mg)-comme dans 1' exemple 5 et on obtient 200 mg de peptide brut. La purification par CLHP, comme dans l'exemple 5, donne 20,8 mg d' une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc: 3527,1 ; trouvé : 3527,1.

83

Exemple 65

Ac-[p-F-Phe6.Lys12,Nie17,Ala19.Val26.Thr28,

Giy29'30« Cys(Acm)31]-VIP

5

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le même protocole que dans 1'

exemple 5. On effectue 3 cycles de couplage avec, respecti-10 vement Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg,

1,0 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), on remplace dans le lOème cycle 15 Boc-Val par Boc Ala (189 mg, 1,0 mmol) et dans le 23ème cycle, on remplace Boc-Phe par Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol). On débloque la résine peptide (708 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 263 mg de peptide brut. La purification par CLHP, comme dans l'exemple 5, donne 48,8 mg d'une poudre 20 amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne un analyse correcte d ' ami no-aci de .

FAB-MS : MH calc: 3574,1 ; trouvé 3573,9.

Exemple 66

25 Ac-Z"Glu8JLys12,Nle17, Val 26, Thr28,Gly29'30, Ser31./-VIP

On soumet une portion de 0,313 g (0,05 mmole) de résine Boc-Ser(Bzl) de l'exemple 3 à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue 3 cycles 30 de couplage utilisant respectivement Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmol), Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmol) et Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmol). On effectue 27 cycles de couplage comme dans 1' exemple 5 sauf qu'au 20ème cycle, on remplace Boc-Asp(OcHx )

84

par Boc-Glu(Bzl) (167 mg, 0,5 mmol). On débloque la résine peptide (511 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 148 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 56,7 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par 5 CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide .

FAB-MS : MH calc. 3511,0, trouvé : 3510,3.

Exemple 67

Ac-/"p-F-Phe5, Glu8, Lys12, NI e17, Al a19, Val 26, Thr28J-VIP

10

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide en utilisant le protocole de l'exemple 5. On effectue 28 cycles de couplage comme dans 1' 15 exemple 45 sauf qu'au 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr (Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), dans le lOëme cycle, on remplace Boc-Val par Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), dans le 21ème cycle, on remplace Boc-Asp(OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol) et dans le 23 cycle, on 20 remplace Boc-Phe par Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol). On débloque la résine peptide (700 mg) comme dans l'exemple 5, pour donner 230 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 52,5 mg d'une poudre amorphe blanche.- Le composé est homogène par CLHP et donne 25 une analyse correcte de 1 ' ami no-aci de . FAB-MS' : MH calc: 3299,8 ; trouvé : 3299,6.

Exemple 68

Ac-/"G lu8, Orn12,Nie17,Val26,Thr28/-VIP

30

On fait passer une portion de 5,5 g (0,6 mmole) de résine Boc-dodecapeptide de l'exemple 22 par 4 cycles de couplage comprenant respectivement :

85

Boc-Gln (655 mg, 2,66 mmol), Boc-Lys (2-Cl-Z) (2,01 g, 4,84 mmol), Boc-Arg(Tos) (2,07 g, 4,84 mmol) et Boc-Leu (1,21 g, 4,84 mmol). On sèche la résine sous vide et on obtient 6,12 g de résine Boc-hexadecapeptide.

On fait passer une portion de 2,0 g (0,2 mmole) de cette résine dans 12 cycles de couplage comportant chacun respectivement :

Boc-Orn(Fraoc) (182 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (250 mg. 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Glu(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol). Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0r8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol). et -Boc-His(Bom) (150 mg. 0,4 ramol).|

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique et 38,4 ml de DIPEA dans 30 ml de chlorure de méthylène pendant 90 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 2,4 g.

On traite une portion de 1,2 g (0,1 mmole) de cette résine à deux reprises avec 20% de pipéridine/DMF pendant 1 minute et 20 minutes respectivement et on lave par les stades 10 à 14. On débloque la résine peptide comme dans 1' exemple 5 pour obtenir 420 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 63,1 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et assure une analyse correcte de 1'amino-acide .

FAB-MS : MH calc : 3295,8 ; trouvé : 3295,6.

86

Exemple 69

Ac-Ays12,Nle17,Al a25, Leu26, Lys27'28, Gly29' 30, Thr31_7-VI P

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de ré-5 sine benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue trois cycles de couplage comportant chacun : Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de 10 couplage, comme dans l'exemple 45, sauf que dans les premier et second cycles, on remplace Boc-Thr(Bzl) et Boc-Leu par Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), on remplace dans le 3ème cycle Boc-Val par Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), on remplace dans le 4ème cycle Boc-Ser(Bzl) par Boc-Ala (189 mg, 15 1,0 mmol ) et on remplace dans le 7ëme cycle Boc-m-F-Tyr (Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol).

On débloque la résine peptide (700 mg) comme dans l'exemple 5 pour obtenir 140 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 31,0 mg d'une poudre amor-20 phe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

FAB-MS : MH calc. 3551,1, trouvé : 3550,8.

Exemple 70

2 5 Ac-/"G lu8, Lys12,Nie17,Val26, Thr28,Ala29-31/-VIP

On soumet une portion de 0,251 g (0,05 mmole) de résine Boc-Ala de l'exemple 1 à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue 3 cycles de 30 couplage dont chacun comprend respectivement Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmol), Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmol) et Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmol). On effectue 27 cycles de couplage comme dans l'exemple 5, sauf qu'au 20ëme cycle, on remplace Boc-Asp (OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (167 mg, 0,5 mmol).

C

87

On débloque la résine peptide (399 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 63,1 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 19,0 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène à CLHP et donne une analyse correcte 5 d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc. 3523,0 ; trouvé : 3522,5.

Exemple 71

Ac-/Lys12,Ala17'19,Va 126,Thr28/-VIP

10

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide en utilisant le protocole de l'exemple 5. On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 15 45, sauf qu'au 7ëme cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bz1)

par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol) et on remplace Boc-Val dans le lOème cycle et Boc-Nle dans le 12ème cycle par Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 et on obtient 200 mg de peptide 20 brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5,

donne 52,4 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : MH calc. 3225,7 ; trouvé : 3226,0.

2 5 Exemple 72

Ac-rGlu8,Lys12,Nle17,Va.l26,Thr28,61y29,Lys307-VIP

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmol) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse 30 en phase solide selon le protocole de l'exemple 5. On effectue 2 cycles de couplage respectivement avec Boc-Lys (2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol).

1

*■

88

On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bzl ) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol) et dans le 21ème cycle, on remplace Boc-Asp(OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 5 1,0 mmol). On débloque la résine peptide (870 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 206 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 65,7 mg d'une poudre blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide.

10 FAB-MS : MH calc. 3495,0 ; trouvé : 3494,6.

Exemple 73

Ac-[p-NH2-Phe10.Lys12.Nle17.Val26,Thr28.

15 Gly29'30.Cys(Acm)31]-VIP |

On soumet une portion de 0,25 g (0,05 mmole) de résine benzhydrylami ne (100-200 ASTM mesh, Advanced ChemTech) à une synthèse en phase solide en utilisant le protocole de 20 l'exemple 5. On effectue quatre cycles de couplage respectivement avec Boc-Cys(Acm) (146 mg, 0,5 mmol), Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmol), Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmol) et Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmol). On effectue 27 cycles de couplage,

comme dans l'exemple 5, excepté qu'au 18ème cycle, on rem-25 place Boc-Tyr(2,6-DCB) par Boc-p-NH(Z)-Phe (-207 mg, 0,5

mmol). On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 pour obtenir 294 mg de peptide brut.

La purification par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 20,1 mg de poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par 30 CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc : 3583,1 ; trouvé : 3582,8.

89

Exemple 74

Ac-[Glu8,Lys12.Nie17.Val26.Thr28.Gly29'30,

Cys(Acm)31]-VIP

5 On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de ré

sine benzhydry1 ami ne (100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide en utilisant le protocole de l'exemple 5. On effectue 3 cycles de couplage, chacun utilisant respectivement Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 10 mg, 1,0 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr(Bzl) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol) et dans le 21ème cycle, on remplace Boc-Asp(OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). On dé-15 bloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 et on obtient 450 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 108 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide.

20 FAB-MS calc. 3598,2, trouvé : 3598,0.

Exemple 75

Ac-/Glu8,Lys12,Nie17,Val26,Thr28,Gly*9'30,Met31/-VIP

25 On soumet une portion de 0,269 g (0,05 mmole) de ré

sine Boc-Met de l'exemple 4 à une synthèse en phase solide en utilisant le protocole de l'exemple 5. On effectue trois cycles de couplage respectivement avec Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmole), Boc-Gly (87 mg, 0,5 mole) et Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 30 0,5 mmol). On effectue 27 cycles de couplage comme dans 1' exemple 5, sauf qu'on remplace dans le 20ème cycle Boc-Asp (OcHx) par Boc-Glu(Bzl) (167 mg, 0,5 mmol). On débloque

1

90

la résine peptide (906 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 128 mg de peptide brut. La purification par CLHP donne 24,2 mg d'une poudre amorphe blanche. On traite une portion de 21,2 mg de cette matière avec 0,9 mg de bêta-5 mercapto-éthanol dans 2,1 ml de H20 à 37°C pendant 48 h.

On purifie de nouveau par CLHP comme dans l'exemple 5 et on obtient 13,1 g d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : MH calc : 3550,1 ; trouvé 3550,0.

10

Exemple 76

CH3S(CH2)2C0-/Lys12,Nle17,Val26,Thr287-VIP(2-28)

On soumet une portion de 0,85 g (0,4 mmole) de ré-15 sine Boc-Thr(Bzl)-BHA de l'exemple 35 à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430A de Applied Biosystems, comme dans l'exemple 11. On effectue 26 cycles de couplage, chacun comportant :

Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 20 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2;0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg. 2,0 mmol). Boc-Tyr(2.6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol). Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol). Boc-Val (435 mg. 2,0 mmol). Boc-Ala (378 mg. 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg. 2,0 25 mmol). Boc-Gln (492 mg, 2,0 mmol). Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol). Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol). Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (232 mg. 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (631 mg. 2,0 30 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (631 mg, 2,0 mmol), et Boc-Ser(Bzl) (591 mg. 2,0 mraol)j

35

pour obtenir 2,8 g de résine Boc-heptacosapeptide.

91

On fait passer une portion de 0,7 g (0,1 mmole) de cette résine par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 128 mg (1,06 mmole) d'acide 3-(methy1thio)propionique et 110 mg (0,53 mmole) de dicyclohexylcarbodiimi de dans 5 20 ml de chlorure de méthylène pendant 2 heures. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide. On débloque la résine peptide (588 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 245 mg de peptide brut. On purifie le peptide par CLHP comme dans l'exemple 5 pour obtenir 28,8 mg d'une pou-10 dre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc. 3218,8 ; trouvé 3218,5.

Exemple 77

15 CH3S0(CH2)2C0-Z"Lys12,Nle17, Val 26,Thr287-VIP(2-28)

On dissout 20,0 mg (6,2 mmoles) de CH3S(CH2)2C0-/"Lys12, NI e17,Val26,Thr28/-VIP(2-28) de l'exemple 76 dans 2,0 ml de AcOH à 1%. On ajoute 764 pl d'une solution di-20 luée dans H20 à 1:100 de H202 à 30%. On agite cette solution à température ambiante pendant 5 heures et on lyophilise. On purifie le peptide par CLHP comme dans l'exemple 5 pour obtenir 14,6 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte 25 d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc : 3234,8 ; trouvé 3234,6.

Exemple 78

Ac-/N-CH3-Ala1,Lys12,Nle17,Val26,Thr287-VIP

30

On fait passer une portion de 2,0 g (0,16 mmole) de résine Boc-hexacosapeptide de l'exemple 32 par 2 cycles de couplage, le premier avec Boc-Ser(Bzl) (378 mg, 1,28 mmol) et l'autre avec Boc-N-CH3-Al a (260 mg, 1,28 mmol).

92

On fait passer la moitié de cette résine peptide (0,08 mmole) par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 3,5 h. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous 5 vide pour obtenir 0,8 g.

On traite la résine peptide avec HF comme dans 1' exemple 11 pour obenir, après lyophilisation, 484 mg d'un solide blanc.- On purifie ce peptide brut par CLHP préparative comme dans l'exemple 5. Le pic principal est coupé par 10 l'analyse CLHP analytique des fractions collectées, on regroupe et on lyophilise pour obtenir 22,5 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : calc: 3243,8; trouvé : 3243,1.

15

Exemple 79

Résine Boc-Cys(Acm)-BHA

On traite 5,0 g (3,5 meq) de résine benzhydry1 ami ne 20 (100-200 ASTM mesh, Omni) comme dans l'exemple 1, sauf qu'

on couple la résine avec 1,46 g (5,0 mmoles) de Boc-Cys(Acm) et 516 mg (2,5 mmoles) de dicyclohexycarbodiimi de. On sèche la résine sous vide et on obtient 5,0 g de résine Boc-Cys (Acm)-BHA. L'analyse d'amino-acide indique une charge de 25 0,19 mmole de Cys/g.

Exemple 80

Ac-[Leu5,Orn12,Ala17,19, Thr25, Val26,Thr28, Gly29,30.Cys(Acra)31]-VlP

On soumet une portion de 0,263 g (0,05 mmole) de résine Boc-Cys(Acm)-BHA de l'exemple 79 à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5.

30

i

93

On effectue 3 cycles de couplage comportant chacun respectivement Boc-Gly (87 mg, 0,5 mmol), Boc-Gly (87 mg, 0,5 moled) et Boc-Thr(Bzl) (155 mg, 0,5 mmole). On effectue 27 cycles de couplage comme dans l'exemple 5, sauf qu'au 5 3ème cycle, on remplace Boc-Ser(Bzl) par Boc-Thr(Bzl)

(154 mg, 0,5 mmol), dans le 9ème cycle, on remplace Boc-Val et on remplace Boc-Nle dans le llème cycle par Boc-Ala (95 mg, 0,5 mmol). Dans le 16ème cycle, on remplace Boc-Lys(2-Cl-Z) par Boc-Orn(Z) (183 mg, 0,5 mmol) et dans le 10 23ème cycle, on remplace Boc-Val par Boc-Leu (124 mg, 0,5 mmol). On débloque la résine peptide (489 mg) comme dans l'exemple 5 pour obtenir 125 mg de peptide brut. On purifie le peptide par CLHP et on obtient 6,7 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une 15 analyse correcte d'amino-acide. FAB-MS : MH calc : 3528,0 ; trouvé 3527,4.

Exemple 81

Ac-[p-F-Phe6.2-Nal10.Lys12.Nie17,Val26.Thr28, 20 Gly29,30,Met31]-VIP

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmol) de résine benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse

»

en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue trois cycles de couplage comportant chacun respectivement: 25 Boc-Met (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de couplage, comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-M-F-Tyr(Bzl ) par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), dans le 19ème cycle, on remplace Boc-Tyr(2,6-30 DCB) par Boc-2-Nal (157 mg, 0,5 mmol) et dans le 23ème cycle, on remplace Boc-Phe par Boc-p-F-Phe (283 mg, 1,0 mmol). On débloque la résine peptide (756 mg) comme dans l'exemple 5 pour obtenir 280 mg de peptide brut. La purification par CLHP, comme dans l'exemple 5, donne 32,2 mg d'une poudre 35 amorphe blanche.

1

94

Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. FAB-MS : MH calc. 3593, 1 , trouvé : 3593,1.

5 Exemple 82

Ac-[p-F-Phe6.Glu8,Lys12'14,Nie17.Ala19.Val26.

Thr28,Gly29'30.Cys(Acm)31]-VIP

10 On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de ré

sine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue trois cycles de couplage, chacun respectivement avec Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 15 mmol) et Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). On effectue 28 cycles de couplage comme dans l'exemple 45, sauf que dans le 7ème cycle, on remplace Boc-m-F-Tyr par Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), dans le lOème cycle, on remplace Boc-Val par Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), dans le 15ème cycle, on rempla-20 ce Boc-Arg(Tos) par Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol),

dans le 21ême cycle, on remplace Boc-Asp(OcHx) par Boc-Glu (Bzl) (337 mg, 1,0 mmol) et dans le 23ème cycle, on remplace Boc-Phe par Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5'mmol). On débloque la résine peptide (800 m g") comme dans l'exemple 5 et on obtient 25 100 mg de peptide brut. La purification par CLHP, comme dans l'exemple 5, donne 33,1 g d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'ami no-aci de.

FAB-MS : MH calc: 3560,1 ; trouvé 3559,8.

30

•r

95

Exemple 83

Ac-/*Lys12,Nle17,Ala19, Va 1 26, Thr28, Al a29~31J-VIP

On soumet une portion de 1,1 g (0,3 mmol) de résine 5 benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430 A de Applied Biosystems. Comme dans l'exemple 11, on effectue 21 cycles individuels de couplage et on obtient 1,8 g de résine Boc-henéicosapeptide.

10 On soumet 1,2 g (0,2 mmole) de cette résine à 4 cy cles individuels de couplage comme ci-dessus, pour obtenir 1,3 g de résine Boc-pentacosapeptide.

On fait passer 0,65 g (0,1 mmole) de cette résine par 6 cycles de couplage, comme dans l'exemple 5, chaque 15 cycle comportant respectivement :

Boc-Phe (530 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (652 mg, 3,0 mmol), Boc-Ala (568 mg, 3,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (946 mg, 3,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (886 mg, 3,0 mmol), et Boc-His(Tos) (1,23 g, 3,0 mmol).j

20

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on taite avec 1,0 ml d'anhydride acétique dans 30 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 25 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous 25 vide.

On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 et on obtient 180 mg de peptide brut. On purifie le peptide par CLHP comme dans l'exemple 5 et on obtient 46,9 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et 30 donne une analyse correcte d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc.' 3481,0 , trouvé : 3480,8.

96

Exemple 84

Ac-/lys12,Nie17,Ala19,Val26,Thr28,Gly29,Lys30/-VIP

On soumet une portion de 0,7 g (0,31 mmole) de ré-5 sine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430 A de Applied Biosystems comme dans l'exemple 11. On effectue 24 cycles individuels de couplage et on obtient 1,8 g de résine Boc-tetracosapeptide.

10 On fait passer une portion de 0,6 g (0,1 mmole) de cette résine par 6 cycles de couplage comme dans l'exemple 1, chaque cycle utilisant respectivement :

Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 15 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol). et Boc-His(Tos) (328, O r 8 mmo1). |

On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acé-20 tique dans 20 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide.

%

On débloque la résine peptide (0,61 g) comme dans l'exemple 5 et on obtient 174 mg de peptide brut. On purifie 25 le peptide par CLHP comme dans l'exemple 5 et on obtient 43,6 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé présente une analyse correcte d'amino-acide et est homogène par CLHP. FAB-MS : MH calc: 3453,0 ; trouvé : 3452,8.

30 Exemple 85

Ac-/N-Me-Ala1, Lys12,Nie17,Ala19,Val25,Thr2 8_7-VIP

On soumet une portion de 0,375 g (0,3 mmole) de résine benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM-mesh, Bachem) à une syn

97

thèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430 A de Applied Biosynthesis comme dans l'exemple 11. On effectue 26 cycles individuels de couplage et on obtient 1,8 g de résine Boc-hexacosapeptide.

5

On fait passer une portion de 0,6 g (0,1 mmole) de cette résine par deux cycles de couplage comme dans l'exemple 5, respectivement avec Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) et Boc-N-Me-Ala (81 g, 0,4 mmol). On fait passer la résine 10 peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec B0P (442 mg, 1,0 mmol), l'acide acétique (57 m 1 » mmol) et DIPEA (523 pi, 3,0 mmoles) dans 20 ml de DMF pendant 6 heures et ensuite, avec 1,0 ml d'anhydride acétique dans 20 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 30 minutes. On 15 lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,54 g.

On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 et on obtient 220 mg de peptide brut. On purifie le pep-20 tide par CLHP comme dans l'exemple 5 et on obtient 27,0 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc. 3215,7 ; trouvé 3215,6.

25 Exemple 86

Ac-/lys12,Nle17,Ala19,Ala25,Leu26,Lys27'287-VIP

On traite une portion de 10,0 g de résine p-méthyl-benzhydry1 ami ne (200-400 ASTM mesh, Biomega) avec DIC 30 (6,72 ml , 43 mmoles), HOBT (4,0 g, 29 mmoles) et l'acide p-(R,S-alpha-l-(9H-fluoren-9-y1)-méthoxyformamido-2,4-di-méthoxy-benzy1)phénoxyacétique (10,36 g, 19,2 mmol-, Nova Bi oc hem).

98

On lave la résine avec du chlorure de méthylène, du métha-nol et du chlorure de méthylène et on sèche sous vide pour donner 15,1 g de résine Fmoc-Tm-MBHA.

On soumet une portion de 0,34 g (0,22 mmole) de cette résine Fmoc-Tm-MBHA à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 431A de Applied Biosystems comme dans l'exemple 11, sauf qu'on utilise les protocoles de chimie de Fmoc (voir Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. et Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284, 1980). On exécute 20 cycles individuels de couplage pour obtenir 1,06 g de résine Fmoc-eicosapeptide.

On soumet une portion de 0,53 g (0,11 mmole) de cette résine à 8 cycles individuels de couplage comme ci-dessus pour obtenir 0,58 g de résine octacosapeptide. On traite la résine peptide avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 20 ml de 6% DIPEA/ chlorure de méthylène pendant 60 minutes et on sèche sous vide pour obtenir 489 mg.

On traite cette résine peptide avec 5 ml de TFA contenant 50 pi de 1,2 éthane-di-thiol, 50 pi de sulfure de diméthyle et 150 pi d'anisole pendant 2 heures à température ambiante. On filtre la résine et on lave avec 2 x 1 ml de TFA. On verse les filtrats combinés dans 200 ml de Et20 et on réfrigère à -20°C pendant 4 heures. On filtre le précipité, on lave avec 2 x 20,ml de EtgO, on extrait avec 2 x 20 ml d'AcOH à 10% et on lyophilise. On purifie le peptide par CLHP comme dans l'exemple 5, pour obtenir 35,7 mg d'une pou-fdre amorphe blanche. Le composé est homogène à CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide FAB-MS : MH calc: 3307,9 ; trouvé 3308,1.

99

Exemple 87

c ç. p 70 1719 25

Ac-[Leu .p-F-Phe .Glu .Orn .Ala ' .Thr

Val26,Thr28.Gly29'3°.Cys(Acm)31]-VIP

5

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue 31 cycles de couplage comme dans l'exemple 45. On 10 débloque la résine peptide (936 mg) comme dans l'exemple 5 pour obtenir 300 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 37,2 mg de poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide. FAB-MS : MH calc : 15 3560,0 ; trouvé 35 60,2.

Exemple 88

20

Ac-[p-F-Phe6.Glu8,Lys12,Nie17.Val26,Thr28, Gly29,30.Thr31]-VIP

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue 31 cycles de couplage comme dans l'exemple 45. On 25 débloque la résine peptide (940 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 320 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 70,8 mg d'une poudre blanche amorphe. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

30 FAB-MS : MH calc : 3543,0 ; trouvé : 3543,1.

c

100

Exemple 89

Ac-[Glu8,Lys12.Nie17.Ala19.Val26.Thr28.

Gly29 * 3°.Thr31]-VIP

5

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmol) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200-ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue 31 cycles de couplage comme dans l'exemple 45. On 10 débloque la résine peptide (1,0 g) comme dans l'exemple 5 pour obtenir 335 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 83,0 mg de poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

15 FAB-MS : MH calc : 3497,1 ; trouvé : 3496,7.

Exemple 90

Ac-[Glu8.Lys12.Nie17.Ala25.Leu26.Lys27'28

20 Gly29'3°.Thr31]-VIP

On soumet une portion de 0,4g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On 25 effectue 31 cycles de couplage comme dans l'exemple 45. On débloque la résine peptide (1,0 g) comme dans l'exemple 5 et on obtient 313 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 66,4 mg de poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une ana-30 lyse correcte de 1'amino-acide .

FAB-MS : MH calc: 3565,1 ; trouvé : 3564,6.

•r

101

Exemple 91

Ac-[p-F-Phe6,Glu8.Lys12.Nie17,Ala25.Leu26 Lys27,28.Gly29'30,Thr31]-VIP

Ori soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue 31 cycles de couplage comme dans l'exemple 45. 10 On débloque la résine peptide (940 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 324 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 65,6 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1 'amino-acide. FAB-MS : MH calc: 15 3583,1, trouvé 3583,2.

Exemple 92

Ac-[2-Nal10.Lys12,Nie17.Ala19.Val26,Thr28, 2Q Gly29'30,Met31]-VIP

On soumet une portion de 0,4 g (0,1 mmole) de résine benzhydrylami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 5. On effectue 31 cycles de couplage comme dans l'exemple 45. On 25 débloque la résine peptide (960 mg) comme dans l'exemple 5 et on obtient 390 mg de peptide brut. La purification CLHP, comme dans l'exemple 5, donne 45,1 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte de 1'amino-acide.

30 FAB-MS : MH calc. 3547,1, trouvé : 3546,9.

4

102

Exemple 93

Ac-[Ala2.Glu8.Lys12.Nie17.Ala19,Val26.Thr28,

29-31 Ala ]-VIP

5 On soumet une portion de 0,3 g (0,2 mmole) de ré

sine benzhydry1 ami ne ( 100-200 ASTM mesh, Bachem) à une synthèse en phase solide sur le synthétiseur de peptide modèle 431 A de Applied Biosystems, comme dans l'exemple 11, sauf qu'on utilise les protocoles de chimie Fmoc (voir 10 exemple 86). On couple la résine avec l'acide p-(R,S-a1pha-l-(9H-(fluoren-9-yl)-méthoxyformamido-2,4-diméthoxy-benzy1 )-phénoxyacétique (NovaBiochem) dans le 1er cycle qu'on fait suivre de 29 cycles individuels de couplage pour obtenir 1,73 g de résine Fmoc-nonacosapeptide. 15 On soumet une portion de 0,8 g (0,1 mmole) de cette résine à deux cycles individuels de couplage comme ci-dessus pour obtenir 0,9 g de résine hentriacontapeptide. On traite la résine avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 20 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 60 minutes 20 et .on sèche sous vide pour obtenir 0,75 g. On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 86 pour obtenir 280 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans 1'

»

exemple 5, donne, 12,4 mg d'une poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte 25 d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc. 3479,0 ; trouvé : 3478,7.

Exemple 94

Ac-[Ala2.Lys12.Nie17.Ala25.Leu26.Lys27'28. 30 Gly29'30.Thr31]-VIP

On soumet une portion de 666 mg (0,3 mmole) de résine benzhydrylaminé (200-400 ASTM mesh, Biomega) à une

V

103

synthèse en phase solide par le protocole de l'exemple 15. On effectue 21 cycles de couplage comportant chacun l'utilisation de Boc-Thr(Bzl) (371 mg, 1,2 mmol), Boc-Gly (210 mg, 1,2

mmol), Boc-Gly (210 mg, 1,2 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (498 mg. 5 1,2 mmol). Boc-Lys(2-C1-Z), (498 mg, 1,2 mmol). Boc-Leu (299 mg. 172 mmol). Boc-Ala (227 mg. 1,2 mmol). Boc-Asn (307 mg, 1,32 mmol), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmol), Boc-Tyr(2.6-DCB) (528 mg. 1,2 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (498 mg, 1,2 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (498 mg. 1,2 mmol), 10 Boc-Val (261 mg. 1,2 mmol). Boc-Ala (227 mg, 1,2 mmol), Boc-Nle (278 mg, 1,2 mmol). Boc-Gln (325 mg. 1,32 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (498 mg. 1,2 mmol). Boc-Arg(Tos) (514 mg. 1,2 mmol), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (498 mg. 1,2 mmol). et Boc-Thr(Bzl) (371 mg. 1,2 mmol)

15

pour obtenir 1,8 g de résine Boc-heneicosapeptide.

On couple une portion de 1,2 g (0,2 mmole) de cette résine avec 8 cycles dont chacun utilise Boc-Tyr(2,6-DCB) 20 (352 mg. 0,8 mmol). Boc-Asn (204 mg. 0,88 mmol).

Boc-Asp(OcHx) (255 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (247 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol). Boc-Val (174 mg. 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), et Boc-Asp(OcHx) (255 mg, 0,8 mmol)

25 pour obtenir 1,5 g de résine Boc-nonacosapept'i de.

On couple une portion de 0,75 g (0,1 mmole) de cette résine avec 2 cycles comportant respectivement Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmole) et Boc-HIS(Tos) (102 mg, 0,4 mmol). On 30 fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 15 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 60 minutes.

V

104

On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,78 g. On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 pour obtenir 240 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 31,0 5 mg d'une poudre amorphe blanche. Ce composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc. 3535,1 ; trouvé 3534,6.

Exemple 95

10 * r^-1 8 T 12 17 19 25 _ 26

Ac-[Glu .Lys .Nie .Ala .Ala .Leu

27.28 29-31,

Lys .Ala ]-VIP

On soumet une portion de 0,88 g (0,4 mmole) de résine benzhydry1 ami ne ( 200-400 ASTM mesh, Biomega) à une 15 synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide modèle 430A de Applied Biosystems comme dans l'exemple 11. On exécute 14 cycles individuels de couplage et on obtient 1,88 g de résine Boc-tetradecapeptide.

20 On soumet 1,41 g (0,3 mmol) de cette résine à 9 cy cles individuels de couplage pour obtenir 1,71 g de résine Boc-tricosapeptide.

«

On soumet une portion de 0,57 g (0,1 mmole) de cette 25 résine à 8 cycles individuels de couplage comme ci-dessus pour obtenir une résine Boc-hentriacontapeptide. On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 20 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 60 minutes. On lave 30 la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,62 g. On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 et on obtient 222 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5, donne 20,0 g d'une poudre amorphe blanche.

105

FAB-MS : MH calc : 3535,1 ; trouvé : 3534,4.

Exemple 96 Ac[Glu8.Lys12.Nie17.Ala19,Ala25,Leu26.Lys27'28.

Ala29~31]-VIP

On soumet une portion de 0,56 g (0,1 mmole) de résine Boc-tricosapeptide de l'exemple 95 à une synthèse en phase solide sur un synthétiseur de peptide, modèle 430 A de Applied Biosystems, comme dans l'exemple 11. On effectue 8 cycles individuels de couplage, pour obtenir 0,59 g de résine Boc-hentriacontapeptide. On fait passer la résine peptide par les stades 1 à 8 du protocole et on traite avec 0,5 ml d'anhydride acétique dans 20 ml de 6% DIPEA/chlorure de méthylène pendant 60 minutes. On lave la résine par les stades 10 à 14 et on sèche sous vide pour obtenir 0,58 g. On débloque la résine peptide comme dans l'exemple 5 et on obtient 233 mg de peptide brut. La purification par CLHP comme dans l'exemple 5 donne 42,1 mg de poudre amorphe blanche. Le composé est homogène par CLHP et donne une analyse correcte d'amino-acide.

FAB-MS : MH calc : 3521,1 ; trouvé : 3521,1.

i

Exemple 97

Activité relaxante de la trachée des analogues de VIP

On étudie l'activité relaxante des analogues de VIP dans un modèle utilisant la trachée d'un cobaye.

(Wasserman, M.A et al., dans Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, éd., Raven Press, N.Y., 1982, pages 177-184). On prélève tous les tissus sur un cobaye albinos mâle pesant 400/ 600 g, anesthésié avec de 1 'uréthane (2 g/kg, i.p). Après exsanguination, on enlève la trachée et on la divise en 4 segments annulaires (3 mm de longueur).

106

On suspend chaque anneau par des fils d'acier inoxydable de jauge 30 dans un bain tissulaire chemisé de 10 ml et fixé par un fil de soie 4-0 à un transducteur de déplacement de force de Grass (modèle FT03C, Grass Instruments Co., Qui ncy, Ma) pour un enregistrement isométrique de la tension. On baigne le muscle lisse dans une solution modifiée de Krebs ayant la composition suivante : NaCl, 120 mM ; KC1, 4,7 mM ; CaCl2, 2,5 mM ; MgS04.7H20 : 1,2 mmole ;

NaHC03 : 25 mmoles ; K2HP04 monobasique : 1,2 mmole et dextrose 10 mmoles. On maintient les bains tissulaires à 37°C et on fait barboter continuellement avec 95% 02 et 5% C02-On enregistre les réponses sur un enregistreur Hewlett-Packard à 8 voies et à 4 voies (modèle 7702 B et 7754A, respectivement) de Hewlett-Packard, Paramus, NJ. On place les anneaux de trachée sous une tension de repos de 1,5 g qu' on détermine être optimale ou presque optimale dans des essais préliminaires. Des réajustages de tension fréquents sont nécessaires pendant la période de 60 minutes qui suit. On rince les tissus à intervalles de 15 minutes.

On obtient des courbes de réponse de concentration cumulative pour chaque tissu par des augmentations successives en (jl dans la concentrati on du bain de VIP ou d' analogues de VIP selon le procédé de Van Rossum (Arch. Int. Pharmacodyn., 143, 299-330, 1963). On n'obtient qu'une seule courbe de réponse de dose cumulative sur un seul tissu. Pour réduire au minimum la variabilité entre les tissus, on exprime les réponses relaxantes comme un pourcentage de la réponse maximale obtenue à VIP (10 5 M = 100%) qu' on ajoute à l'extrémité de chaque essai de réponse de concentration. On groupe les réponses obtenues d'au moins trois tissus et on détermine les valeurs CE^q par régression linéaire.

107

Les résultats résumés dans le tableau IA montre 1' activité relaxante dans la trachée des analogues de VIP par comparaison avec le VIP naturel. Les résultats résumés dans le Tableau montrent que les analogues de VIP ont des potentiels égaux ou supérieurs à ceux de VIP.

✓

108

Tableau IA

Activité relaxante des analogues de VIP sur le muscle lisse trachéal d'un cobaye

Composé CE50

VIP 10,0

1 12 17 26 28

Ac-[N-Me-Ala ,tys ,Nle ,Val ,Thr ]-VIP 7,2

r 5 _ 12 17,19 , 25 ,26 28 29,30 „ .31,

Ac-[Leu ,0rn ,Ala ,Thr ,Val ,Thr ,Gly ,Cys(Acm) ]-VIP 2,2

6 8 î2 17 19 26 28 29 30 31

Ac-[p-F-Phe ,Glu ,Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Gly ' ,Cys(Acm) J-VIP 1,9

6 10 12 17 26 28

Ac-[p-F-Phe ,p-NH--Phe ,Lys ,N1e ,Val ,Thr ]-VIP 1,2

« rs»i 8 . 12 ... 17 „ .26 28 29,30 „ .. ,31,

Ac—[G1u ,Lys ,Nle ,Val ,Thr ,Gly ,Cys(Acm) J-VIP 0,45

îo 12 17 26 28

Ac-[p-NH2-Phe ,Lys ,Nle ,Val ,Thr ]-VIP 0,36

Ac-[Glu8,Lys12fNle17,Val26,Thr28,G1y29,3°,Met31]-VIP 0,25

Ac-[Lys'2,Nle'7,Ala'9,Val26,Thr^,Ala29~3']-VIP 0,3

12 17 19 26 28 29 30

Ac-[Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Gly ,Lys ]-VIP 0,58

1 12 17 19 26 28

Ac-[N-Me-Ala ,Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr j-VIP 2,8

Ac-tLys12,Nle17,Ala19,Ala25,l.eu26,Lys27,28]-VIP 1,5

. f. 5 . 6 8 « 12 ,7«19 TU 25 „ t26 tu 28 n, 29«30 Ac-[Leu ,p-F-Phe ,Glu ,0rn ,Ala ,Thr ,Val ,Thr ,Gly ,

Cys(Acm)3^J-VIP 0,68

Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29'3°,Thr31]-VIP 0,32

Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr28tGly29'3°,Thr313-VIP 0,55

Ac-[Glu8fLys12,Nle17,A1a25fLeu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31]-VIP 0,27

Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Ala25,Leu26,Lys27'28,Gly29,30.Thr31]-VIP 0,33

Ac-[2-Nal10,tys12,Nle17,Ala19fVa126,Thr28tGly29'30,Het31]-VIP 0,24

Ac-[A1a2,Glu8,Lys12,Nle,7,Ala19lVal26,Thr28,Ala29"31J-VIP 0,23

Ac-[Ala2,Lys,2,Nle,7,Ala25,Leu26,lys27,28,Gly29,30.Thr31]-VlP 0,44

Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Ala19,Ala25,Leu26,Lys27,28,Ala29"31J-VIP 0,1

Ac-[Lys12,Nle,7.Ala,9,Ala25,Leu26,Lys27,28,Ala29"31]-VIP 0,24

109

Exemple 98

Activité bronchodilatatrice des analogues de VIP

On détermine l'activité bronchodilatatrice in 5 vivo des analogues de VIP chez les cobayes par la voie d' instillation trachéale d'administration. Cette technique utilise des cobayes mâles (souche Hartley, Charles River) pesant de 400 à 600 g. On anesthésie les animaux avec de l'uréthane (2 g/kg) par voie i.p et on insère une canule 10 en polyéthylène dans la veine jugulaire pour l'administration intraveineuse du médicament.

On pratique une trachéotomie sur les animaux et on dose des solutions d'eau distillée ou du composé testé d i s -15 sous dans l'eau distillée dans la trachée, sur environ trois quarts de la distance de la carène avec une pipette. La concentration de la solution de dosage est réglée pour débiter un volume constant de 100 pl. On place les animaux en supination pendant 1 minute pour faciliter la distribu-20 tion du médicament vers le poumon. Une minute après, on arrête la respiration spontanée avec du chlorure de succinyl-choline (1,2 mg/kg) qu'on administre par voie intraveineuse et on aère les animaux avec un petit respirateur Modèle 680 de Harvard, réglé à 40 aspirations par minute et à 4,0 25 cm3 de volume par aspiration. On expose les animaux à 1'

action d'une dose constrictive maximale d'histamine (50 pg/ kg, i,v) et la pression trachéale (cm d'eau) est enregistrée par un transducteur de pression Statham (P 32 AA).

30 On établit la moyenne du changement de la pression trachéale sur au moins 3 animaux témoins et 3 animaux traités par le médicament et on calcule le pourcentage d'inhibition.

110

Le pouvoir relatif des composés administrés par instillation est détermi né par administration de diverses doses du composé testé et d'un calcul de la dose inhibitrice moyenne (valeur DI^q). On détermine DI^q à partir de cour-5 bes de dosage logarithmiques produites par au moins trois doses qui provoquent des effets inhibiteurs entre 10% et 90%. Le coefficient de corrélation pour la ligne de régres sion dechaque antagoniste est toujours plus grande que 0,95.

10

Pour déterminer le déroulement dans le temps de l'inhibition de divers composés, le temps entre l'administration du composé et l'attaque par l'histamine est varié. On calcule le déroulement dans le temps de l'activi 15 té comme le temps pendant lequel l'inhibition baisse à 40%.

Les résultats résumés dans le tableau II montrent l'activité bronchodilatatrice in vivo des analogues de 20 VIP par rapport à VIP naturel. Ces résultats montrent que les analogues de VIP selon l'invention possèdent une activité égale ou supérieure à celle de VIP.

111

Tableau II

Activité bronchodi1atatrice cobayes.

Composé

des analogues de VIP chez les

Ac-fN-Me-Ala1,Lys12,N1e17,Val26,Thr28j-VIP 8,5

VIP 7,3

Ac-[p-F-Phe6,p-NH^-Phe1°,Lys12,N1e17,Va126,Thr28j-VIP 3,0

Ac-[Glu8,Lys12,Nle17,Val26fThr28,Gly29,30,Cys(Aan)31]-VIP 2,0

îo 12 17 26 28

Ac-[p-NH2-Phe ,Lys ,Nle ,Val ,Thr j-VIP 2,0

Ac-[Glu8,Lys12,Nie17,Val26,Thr28,Gly29,30,Met31j-VIP 1,7

Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,N1e17,Ala19,Val26,Thr28,G1y29'30,Cys(Acm)31]-VIP 0,30

. r, 5 n 12 „ 17,19 Tt 25 „ ,26 Tt 28 29,30 , /a .31,

Ac-[Leu ,0rn ,Ala ,Thr ,Val ,Thr ,Gly ,Cys(Acm) j-VIP 0,28

r r 6 .... 10 12 , 17 ,26 28, . ,,

Ac-[p-F-Phe ,p-NH2-Phe ,Lys ,Nle ,Val ,Thr j-VIP 0,17

Ac-[Lys12,Nie17,Ala19,Val26,Thr28,Ala29"31j-VIP 0,82

12 17 19 26 28 29 30

Ac-[Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr ,Gly ,Lys j-VIP 0,58

1 12 17 19 26 28

Ac-[N-Me-Ala ,Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr j-VIP 1,5

Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Ala25,Leu26,Lys27,28]-VIP 0,014

Ac-[Leu5,p-F-Phe6,Glu8,Orn12,Ala17'19,Thr25,Val26,Thr28,Gly29,30,

31

Cys(Acm) j-VIP ' 0,09

Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29,30,Thr31j-VIP 0,1

Ac-CGlu8,Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr28,Gly29'30,Thr31j-VIP 0,064

Ac-[Glu8,lys12,Nle17,A1a25,leu26, Lys27'28,Gly29'30,Thr31j-VIP 0,043

Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nie17,Ala25,Leu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31j-VIP 0,12

Ac-[2-Nal10,Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr28,Gly29,3°,Het3VviP 0,35

Ac-[Ala2,Glu8,Lys12,Nie17,Ala19,Val26,Thr28,Ala29 31 j-VIP 0,47

Ac-[Ala2,Lys12,Nie17,Ala25,Leu26,Lys27,28,Gly29,30,Thr31j-VIP 0,05

« rn 8 , 12 I7 I9 25 , 26 , 27,28 29-31. UTD „

Ac-[Glu ,Lys ,Nle ,Ala ,Ala ,Leu ,Lys ,Ala j-VIP 0,03

. r, 12 », 17 19 , 25 . 26 , 27,28 29-31. _ .

Ac-[Lys ,Nle ,Ala ,Ala ,Leu ,Lys ,Ala j-VIP 0,046

112

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de composés de formule générale :

5

dans laquelle R^ est His, Ala, N-CH3-Ala,D-Ala,Gly,pyro-Glu, B-Ala ou est supprimé ; est Ser ou Ala ; R^ est Asp Ala ; Rj. est Val, Leu ou Ala ; Rg est Trp, Ala ou

X~R1*"R2~R3 Ala"R5~R6~R7~R8~R9~R10 Rll"R12

10

R23~R24"R25~R26~R27~R28"Y

20

dans laquelle Q

25

113

10

n = 1,2 ; Xj et Xa représentent chacun indépendamment H,

OH, OCH

3'

F. Cl. I. CH

3'

CF

3- N02*

NHCOCH , NHCOC.H., ou C(CH,)_; X, =

3 6 b j j j

NH2. N(CH3)2 H ou F;

R = Thr ou Ala; R y 8

= Asp. Glu ou. Ala; Rg =

Ala; R,

= Tyr. ou. R

«10 -i-. — «6

Arg, Lys, Orn ou Ala; R

11

13

= Thr ou Ala; R Leu ou Ala; R

12

14

Asn ou

Arg, Lys ou Ala; R,_ = Lys ou Ala; R., = Gin ou Ala; R. _ 15 lo 1 /

Met. Nie ou Ala; R. _ = Val ou Ala; R„„ = Lys ou Ala;

R21

Ala; R

19

= Lys ou Ala; R

20

22

24

=? Asn ou Ala; R

25

Leu ou Ser, Thr ou Ala; R

= Tyr. ou Rfi;

26

Ile, Val, Leu ou Ala; R27 = Leu. Lys ou Ala; R Asn. Thr. Lys ou Ala; X = hydrogène.

28

15

20

O

X

•4 ,

•dans laquelle X^ est alkyle C1-3 ou haloalkyle C^_3

25

CH3S02-. CH3NHCO-, CH3OCO-, ou CH3S(0)n(CH2)2C0-.

-NHX5 ou R29-R30-H31-Z; X5 R29 = Gly 0U Ala; R30

l5'

où n = 0-2; Y = -OX, ■ H ou alkyle = Gly, Lys ou Ala; R31 = Gly, Ala. Met, Cys, Cys(Acm). Thr, Ser. Phe ou -NHX5; Z =

-OXc oU'-NHX_; b b

114

de sorte qu'on exclut le VIP naturel et un composé de formule :

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-R9-Tyr-Thr-R12-Leu-

R14"LyS~Gln"Nle~Ala~Val~LyS~LyS~Tyr-LeU~ASn~R2b"R26~

Leu-R28-Y'

dans laquelle:

X H. -CO-alkyle Cj_3,-co-phényle

Rg = Ala, Asn

R12 = Arg, Lys, Orn

R,. = Arg, Lys

14

R25 = Ser, Thr

Roc = Ile, Val

Z o

R28 = Asn, Thr

Y = -OXc, -NHX

b o

Xg = H, alkyle C^_3

et leurs sels d'addition avec des acides et des bases phar-maceutiquement acceptables,

caractérisé en ce qu'un polypeptide protégé et lié à la résine de la séquence des amino-acides correspondants est privé de protection et clivé de la résine par traitement avec un réactif convenable de suppression de protection et de clivage, éventuellement en présence d'autres additifs appropriés comme épurateurs de cations et, éventuellement, on convertit en un sel pharmaceutiquement acceptable.

115

2. Procédé selon la revendication 1, dans laquell est :

O

'X4

formule dans laquelle :

A:

X4 = alkyle Cx_3 . CH3S02-. ou

CH.S(O) (CH_)_CO-. et n = 1; R. = His. Ala. 3 n 2 2 1

N-CH3-Ala.Gly; R2 = Ser ou Ala; R3 = Asp eu Ala;

R_ = Val, Leu ou Ala; R, = Phe. p-F-Phe, Ala. 1-Nal; b o

R = Thr ou Ala; R = Asp. Glu ou Ala; R = Asn. 7 8 9

Ala; R1q = Tyr, p-NH2-Phe. 2-Nal, Ala. 0-CH3~Tyr;

R11 = Thr. Ala; R12 = Arg, Lys, Orn ouAla; R13

Leu. Ala; R, . = Arg. Lys, Ala; R. _ = Lys. Ala; R,,= 14 lb 16

Gin. Ala; R^? = Met, Nie ou Ala; Rig = Val. Ala;

R20 = Lys, Ala; R21 = Lys. Ala; R22 = Tyr. Ala m-F-Tyr; R__ = Leu. Ala; R_. = Asn, Ala; R__ = Ser,

«4 Zb

Thr ou Ala; R26 = Ile. Val, Leu ou Ala; R2? - Leu, Ala. Lys; R2g = Asn, Thr, Ala. Lys et Y = NH2 0

R29-R30"R3rZ °Ù 2 = °X5 °UNHX5 °Ù" X5 = ' H. et R2g = Gly. Ala; R3Q = Gly. Lys. Ala; et

R31 = Cys(Acm), Met, Ala.

V

116

3. Procédé selon la revendication 2, dans laquelle

X est :

A

X, = CH_; R, = His, N-CH_-Ala; R_ = Ser; R, 4 3 1 à Z à

= Asp; R = Val, Leu; R, = Phe, p-F-Phe; R = Thr; 5 o /

10 Rg = Asp. Glu; Rg = Asn; R^Q = Tyr, p-NH2-Phe,

2-Nal; R =Thr; R12 = Arg, Lys. Orn; R13 = Leu;

Nie, Ala; Rig = Val, Ala; R2Q = Lys; R2l = Lys; R22 = Tyr; R23 = Leu; R24 = Asn; R2& = Ser. Thr;

15

R26 = Ile, Val ; R27 = Leu ; R28 = Asn, Thr et Y = OH,

NH2 OU R2g-R^Q-R^j~^R29 = ' R30 = Lys , ^3^ -

Cys(Acm), Met, Ala ; et Z = -OH ou -NH2.

20

4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel

R10 = Tyr' P"NH2'Phe ; R12 = LyS' 0rn- ' R14 = Arg ' R17 = Nie, Ala ; R2g = Ser ; R2g = Val ; R2g = Thr et Y = OH, NH2-

25

5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel r12 = Lys-

6. Procédé selon la revendication 4, dans lequel R17 = Nie.

30

7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel R^

= N-CH3~Ala, ledit composé étant :

Ac-[N-CH -Ala1,Lys12,

Nie17,Val26,Thr28]-VIP.

«r

117

8. Procédé selon la revendication 6, dans lequel R10 = P"NH2~Phe, ledit composé étant :

Ac-[p-NH -Phe10.Lys12.Nle17.

5 Val26, Thr28J-VIP.

9. Procédé selon la revendication 6, dans lequel Rg = p-F-Phe et R^q = p-Nf^-Phe, ledit composé étant :

10 Ac-[p-F-Phe6.

10 12 17 26 28 p-NH2-Phe .Lys .Nie .Val .Thr ]-VlP.

10. Procédé selon la revendication 4, dans lequel

Y = R29"R3o"R3l"Z' 9r0UPe dans lequel R^g = Gly ; R3Q = Gly, 15 Lys ; R^ = Cys(Acm), Met, Ala ; et Z = -OH ou NH^.

11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel R3I = Cys(Acm).

12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel 20 R12- = Lys.

R17 = Nie.

R30 = Gly.

13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel e.

14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel y.

25 15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel rg = p-F-Phe et R^g = Ala, ledit composé étant Ac-/p-F-Phe^,

Lys12,Nle17,Ala19,Val26.Thc28.GXy29'30,

Cys(Acm)31] -VIP.

30 16. Procédé selon la revendication 14, dans lequel

Rg = p-F-Phe, Rg = Glu et Rig = Ala, ledit composé étant:

Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nie17,Ala19.Val26. Thr28,Gly29'30.Cys(Acm)31] -VIP.

118

17. Procédé selon la revendication 14, dans lequel Rg = Glu, ledit composé étant :

. Ac-[Glu8,Lys12,Nie17,Val26, Thr28, Gly29'30,Cys(Acm)31]-VIP

18. Procédé selon la revendication 11, dans lequel

Rg = Leu.

19.- Procédé selon la revendication 18, dans lequel 10 R^ = Orn.

20. Procédé selon la revendication 19, dans lequel R17 = Ala, Rig = Ala, R25 = Thr et R3Q = Gly, ledit composé étant :

Ac-[Leu5,Orn12,Ala17*19.Thr25,Val26, 15 Thr28,Gly29'3°,Cys(Acm)31]-VIP.

R31 = Met.

21. Procédé selon la revendication 10, dans lequel t.

22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel 20 R3q- = Gly.

23. Procédé selon la revendication 22, dans lequel Rj2=LysetR^7=Nle.

24. Procédé selon la revendication 23, dans lequel Rg = Glu, ledit composé étant :

25 . Ac-[Glu8,Lys12,Nie17,Val26,

28 29,30 31 Thr , Gly ' .Met J-VIP.

30

25. Procédé selon la revendication 1, dans lequel X = (CH3)C0- ; Rj = His ou N-CH3-Ala ; R2 = Ala ou Ser ; R3 = Asp ; Rg = Val ou Leu ; Rg = Phe ou p-F-Phe ;

119

R? = Thr, Rg = Asp ou Glu; Rg = Asn; R1Q = Tyr.

2-Nal ou p-NH2-Phe; R^ = Thr; R12 = Lys ou Orn;

R13 = Leu; H14 = Arg; RXJ = Lys; b16 = Gin;

S R.„ = Nie ou Ala; R,. - Ala ou Val; H - Lys;

3 17 19 «o

R21 = Lys; R22 = Tyr; R23 = Leu; R24 = Asn;

R25 = Al3' Thr °° Serî R26 = LSU °U Val; R27 = LyS

ou Leu; R _ = Lys ou Thr; et y = NH ou 28 ^

E29-H30"E31"Z: E29 = Al3 °U °ly: *30 = Al4< Gly 10 OU Lys; R = Ala. Met, Thr. Cys (Acm) ou absent ; et

15 26. Procédé selon la revendication 25, dans lequel

R1 = His.

27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel R5 = Val ;

20 r6 = Phe; R10 = 2-Nai ou Tyr; R12 =. Lys; R1? =

Nie; R25 = Ala ou Ser; et Y = R29~R3o"R3i"Z;

R = Ala ou Gly; et R,. =, Ala. Met ou Thr. 30 31

28. Procédé selon la revendication 26, dans lequel 25 le composé à synthétiser est choisi parmi :

Ac-[Lys12.Nle17.Ala19,Val26.Thr28.Ala29-31]-VIP Ac-[Lys12,Nle17,Ala19,Val26,Thr28,Gly29,Lys30J-VIP Ac-[Lys12,Nie17,Ala19,Ala25,Leu26,Lys27'28J-VIP 30 Ac-[Leu5,P-F-Phe6,Glu8,Orn12,Ala17'19,Thr25,Val26,Thr28,

29 30 "*1

Gly ' .Cys(Acm) J-VIP

120

Ac-[p-F-Phe6,Glu8,Lys12,Nle17,Val26,Thr28,Gly29'30,Thr31]-VIP

Ac-[Glu8,Lys12,Nie17. Ala19.Val26.Thr28.Gly29,30.Thr3^-VIP

_ 8 _ 12 17 25 _ 26 _ 27,28 _, 29,30 mu 31,

Ac-[Glu .Lys .Nie .Ala .Leu .Lys .Gly .Thr ]-VIP

5 » r « nu 6 8 T 12 »1 17 ,-1 25 _ 26 _ 27,28 „, 29.30 Ac-[p-F-Phe .Glu .Lys .Nle .Ala .Leu ,Lys .Gly

31

Thr ]-VIP

* ro « ,10 r 12 17 19 „ ,26 m. 28 „, 29. 30 „ 31, „T„ Ac-[2-Nal .Lys ,Nle ,Ala ,Val ,Thr .Gly .Met ]-VIP

2 8 12 17 19 26 28 29-31 Ac-[Ala .Glu .Lys .Nie ,Ala .Val .Thr ,Ala ]-VIP

2 12 17 25 26 27,28 29.30 31 Ac-[Ala .Lys .Nie .Ala .Leu .Lys .Gly' .Thr ]-VIP

10 g 12 17 19 25 26 27.28 29-31

Ac-[Glu .Lys .Nie .Ala .Ala .Leu .Lys .Ala ]-VIP

12 17 19 25 26 27.28 29-31 Ac-[Lys .Nie .Ala .Ala .Leu .Lys .Ala ]-VIP

29. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique, procédé qui consiste à mélanger un composé 15 préparé par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 28 et, éventuellement, une (ou plusieurs) autre substance thérapeutiquement active avec un véhicule théra-peutiquement inerte et à amener le mélange à une forme d' administration galénique.

20

30-. Utilisation d'un composé préparé par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 28, en vue de la préparation d'une composition pharmaceutique.

25

31. L'invention telle que décrite.

V

121

10

20

32. Composé lié à une résine et/ou protégé par celle-ci, répondant à la formule générale :

X~Rl"R2~R3"Ala~R5~R6"R7~R8~R9*R10~Rll"R12

R13"R14"R15"R16"R17'Ala"R19'R20"R2l"R22~

R23"R24~R25~R26~R27"R28"Y

dans laquelle est His, Ala, N-CH-j-Al a, D-Al a , G1 y, pyr o-Glu, B-Ala ou est supprimé ; R2 est Ser ou Ala ; R3 est Asp ou Ala ; R5 est Val, Leu ou Ala ; Rg est Trp, Ala ou

Q

15

n r'

H b dans laquelle Q =

CH2-Q ^2)

25

122

10

15

20

n = 1,2 ; Xj et X2 représentent chacun indépendamment H, OH, 0CH3, F. Cl. I. CH3. CF3. N02. NH2, N(CH3)2.'î

NHCOCH , NHCOC.HL, OU C(CH_)_; X_ = H OU F; j D D 3 3 3

R = Thr ou Ala; R = Asp. Glu ou. Ala; R = Asn ou Y o 9

Ala; R1q = Tyr. ou Rg; R^ = Thr ou Ala; R12 = Arg, Lys. Orn ou Ala; R^3 = Leu ou Ala; R^4 = Arg, Lys ou Ala; R15 = Lys ou Ala; Rlg = Gin oa Ala; R17 = Met, Nie ou Ala; Rig = Val ou Ala; R2Q = Lys ou Ala;

R21 = LyS °U Ala; R22 = TyE' °U R6; R23 = LSU °U

Ala; R„„ = Asn ou Ala; R„c = Ser, Thr ou Ala; R_, = 24 25 2o

Ile, Val, Leu ou Ala; R__ = Leu, Lys ou Ala; R =

2 / Z o

Asn, Thr, Lys ou Ala; X = hydrogène.

• dans laquelle X^ est alkyle ou haloalkyle ,

CH3S02-, CH3NHCO-, CH3OCO-, ou

CH3S(0)n(CH2)2C0-. où n = 0-2; Y = -OX5.

-NHX ou R_.-R__-R_n-Z; x_ = H ou alkyle C1_3, 5 29 30 31 5 1 J

R29 = GlY °U Al3î R30 = Gly' LyS °U Ala'' R31 = Gly* Ala. Met. Cys. Cys(Acm). Thr. Ser. Phe ou -NHX5; Z =

-OX_ OU' -NHX_ ;

D D

¥

123

de sorte qu'on exclut le VIP naturel et un composé de formule :

10

15

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-R9-Tyr-Thr-R12-Leu-

R14-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-R25-R26-

Leu-R^-Y.

X

R,

R

Y

X,

12 14 25 *26 28

dans laquelle:

H, -CO-alkyle C^.-CO-phényle

Ala, Asn

Arg. Lys. Orn

Arg, Lys

Ser, Thr

Ile, Val

Asn. Thr

-OXc. -NHX 5 o

H. alkyle C13 •

20

ORIGINAL

José CURA U,

fnnsfitben Propriété Industrielle^ 26bli, Bo\il. Princesse Cho MO^JTE-CAf ^

reïto-sa