BE859178A

BE859178A - Souche de cellules et culture de virus

Info

Publication number: BE859178A
Application number: BE181287A
Authority: BE
Original assignee: Cutter Lab
Priority date: 1977-09-29
Filing date: 1977-09-29
Publication date: 1978-01-16

Description

Souche de cellules et culture de virus.

La présente invention concerne la préparation d'une nouvelle souche de cellules, la culture de virus dans cette souche, ainsi que la préparation de vaccins à partir de ces virus.

Bien que l'on utilise fréquemment des cellules animales primaires comme milieux de culture pour la croissance des virus, on sait habituellement que ces cellules sont généralement inopportunes, car il est nécessaire de répéter la production des cultures à partir de tissus frais - ce qui est incommode du point de vue <EMI ID=1.1> tes pour la préparation industrielle de vaccins. De même,

les cellules primaires véhiculent fréquemment des impuretés bactériennes et virales.

Des recherches sont constamment effectuées afin de découvrir des lignes de cellules ou des souches

de cellules stables viables et économiquement appropriées pour la propagation des virus en vue de la préparation de vaccins humains et vétérinaires. On a trouvé un certain nombre de cultures de cellules, mais très peu d'entre elles sont acceptables pour l'une ou plusieurs raisons. Par exemple, certaines de ces cultures deviennent instables

après une certaine période et elles ne maintiennent pas des taux de croissance uniformes. D'autres acquièrent un potentiel de carcinogénèse. Pour certaines encore, les taux

de multiplication et les rapports de scission d'un passage

au suivant sont insatisfaisants.

On a trouvé une nouvelle souche de cellules que l'on peut soumettre à une culture et une sous-culture jusqu'à environ 35 passages sans observer aucun changement dans les caractéristiques, cette souche étant appropriée

pour la croissance d'un certain nombre de virus destinés

à la préparation de vaccins. La nouvelle souche de cellules de la présente invention est une souche de cellules diploldes dérivant de tissus embryonnaires de pommons canins.

Les cellules dérivent tout d'abord de poumons hachés dans

un milieu de croissance, de préférence, un milieu MEM

d'Eagle additionné de sérum de veau foetal et contenant

des antibiotiques, ainsi qu'un fongicide. On congèle la matière cellulaire maîtresse de la quinzième sous-culture

s et, à partir de cette matière cellulaire maîtresse, on

obtient des cultures de cellules après vingt passages sup- <EMI ID=2.1>

cultures étant conservées en vue d'études de caractérisation. Le doublement de la population de cellules lors de chaque passage a lieu entre 2-4 jours à 35-37[deg.]C.

Les caractéristiques suivantes (obtenues d'après des études effectuées sur des cellules provenant de la matière cellulaire maîtresse et de la matière cellulaire maîtresse + 20 passages) définissent la nouvelle souche de cellules de la présente invention :

1. Les cellules sont analogues à des fibroblastes.

2. Les cellules sont diploldes comme le démontre leur

caryologie.

3. Les cellules sont exemptes de bactéries, de champignons et d'agents viraux accidentels.

5. Le nombre modal de chromosomes diploïdes de 78 et les

tests d'immunofluorescence confirment que les cellules sont des cellules canines.

La présenta invention concerne également un

cellules diploldes de poumon canin foetal dans un milieu nutritif approprié pour la croissance d'un certain nombre de virus. De préférence, ce système de culture de cellules comprend du sérum de veau foetal. Une composition préférée du système de culture de cellules comprend un inoculum d'environ 4 x 10 cellules de poumon canin foetal dans

une solution comprenant environ 80 à 90 % de milieu MEM d'Eagle, environ 0,15 % de milieu BSS d'Earle avec

du bicarbonate et entre 10 et 20 % de sérum de veau

foetal (de préférence 20 %). On peut utiliser des milieux de cultures de tissus ayant d'autres formulations pour supporter les cellules de poumon canin foetal.

la présente invention peut être utilisé pour la culture de différents virus, notamment les rhabdovirus, par

les paramyxovirus, par exemple, le virus de parainfluenza type 3 et le virus de la maladie des chiens (souche de Cabasso) ; les orbivirus, par exemple, le virus de la

langue bleue et les virus herpès, par exemple, le virus de rhinotrachéite bovine infectieuse. En combinaison avec le milieu nutritif, la souche de cellules de la présente invention a démontré une nette supériorité vis-à-vis

d'un certain nombre d'autres lignes de cellules ou souches de cellules concernant son aptitude à supporter la croissance d'un certain nombre de virus, en particulier, le

virus rabique, en donnant des titres très élevés du

virus. De même, un intérêt particulier réside dans l'uti- lisation de ce système de culture de cellules pour la

propriês non seulement pour la médecine vétérinaire, mais également pour la médecine humaine.

La production de vaccins rentre également dans le cadre de la présente invention. Les virus cultivés à partir du système de culture de cellules de la présente invention sont soumis à un traitement complémentaire en vue d'obtenir des vaccins par des procédés connus dans la technique. Dès lors, le produit final d'une culture de-virus peut être utilisé tel quel ; de même, il peut Être atténué ou rendu inactif par n'importe quel procédé connu afin d'obtenir une matière antigène non pathogène que l'on peut incorporer sous une forme de dosage administrable comme vaccin afin de stimuler la production d'anti- <EMI ID=8.1> forme de dosage peut contenir des préparations appropriées pour l'administration intranasale, orale ou parentérale et elle peut contenir des adjuvants physiologiquement

que des sels et/ou des agents tampons.

La souche de cellules de poumon canin

"American Type Culture Collection", Rockville, Maryland
20852, sous le No. A.T.C.C. CL-175.

des exemples ci-après:

On hache finement le tissu de poumon obtenu d'un foetus femelle prélevé dans des conditions aseptiques chez une chienne ayant atteint à peu près son 50ème jour de gestation, on le soumet à une trypsinisation pendant

5 minutes à 37[deg.]C en utilisant une solution de trypsine

à 0,25 %, puis on le laisse croître dans un flacon de

75 cm<3> dans un milieu constitué de 89,85 % de milieu

MEM d'Eagle dans 0,15 % de milieu BSS d'Earle avec du bicarbonate de sodium (1,43 g/1) additionné de 10 %

de sérum bovin foetal. On incorpore des antibiotiques
(pénicilline, 100 unités/ml, et streptomycine, 100 mcg/ml), de même qu'un fongicide (amphotëricine B, 2,5 mcg/ml).

35-37[deg.]C entre deux et trois jours. Après la trypsinisation et la culture dans le même milieu pendant deux passages supplémentaires, on obtient une meilleure croissance

des cellules en portant la teneur en sérum bovin foetal

la quinzième sous-culture, on modifie davantage .le milieu <EMI ID=15.1>

les cellules obtenues dans la quinzième sous-culture

afin d'obtenir une matière cellulaire maîtresse d'ensemencement que l'on utilise dans le même milieu modifié et que l'on .soumet à une sous-culture pendant 20 passages supplémentaires (matière cellulaire maîtresse + 20). Ensuite, on caractérise les cellules du quinzième passage
(matière cellulaire maîtresse) et les cellules du 35ème passage (matière cellulaire maîtresse + 20).

Les cellules du quinzième passage et du
35ème passage sont toutes deux analogues à des fibroblastes et elles sont exemptes de levure, de bactéries et de champignons suivant les déterminations conformes à la norme P-72 du "United States Department of Agriculture
(USDA) Animal & Plant Health Inspection Service, APHIS, Veterinary Services (antérieurement "Veterinary Biologics Services" (VBS) (= Ministère de l'Agriculture des EtatsUnis d'Amérique, Service d'Inspection Sanitaire des Animaux et des Plantes, Service Vétérinaire (antérieurement Service Biologique Vétérinaire).

Les résultats de 1 ' analyse des chromosomes des cellules sont indiqués dans le tableau Ici-après:
ces résultats démontrent que les cellules sont des cellules canines et ils révèlent également la rétention du caryotype diplolde.

<EMI ID=18.1> .............

norme VBS- P-72 démontrent que les cellules sont exemptes d'agents viraux accidentels.

et d'oncogénicité sur des hamsters stressés à la cortisone conformément à la norme VBS P-72, annexe B, publiée par "The Veterinary Biologics Division of the USDA, 1er juillet 1970." On n'a observé aucune formation de tumeur et l'on n'a détecté aucune anomalie dans les poches des joues, non plus que dans les organes des cavités du corps des hamsters. L'essai de détermination de cellules non canines par la technique d'immuno-fluorescence suivant la norme VBS P-72, annexe D, publiée le ler juillet 1970, a confirmé l'identité canine de la souche de cellules et a démontré l'absence de contamination par des espèces de cellules hétérologues utilisées concurremment dans les laboratoires de la demanderesse.

EXEMPLE 2. Procédé général de culture de virus dans la

souche de cellules.

On infecte des cellules de tissus embryonnaires de poumons canins en suspension ou après formation d'une monocouche confluente dans des récipients de culture tels que des tubes ou des flacons de 907 grammes. Dans les récipients de culture contenant les cellules, on ajoute des virus en dilution appropriée, par exemple, sous

représentant une multiplicité d'infection de 0,0001 à 1,0. Si l'on ajoute le virus aux cellules en suspension, il faut

virus dilue que l'on ajoute aux monocouches de cellules, reste en contact avec les cellules pendant une période comprise entre 0,5 et 1 heure à 34-37[deg.]C afin que l'adsorp- tion puisse avoir lieu.

croissance constitué d'environ 80-85 % de milieu MEM

environ 0,15 %, additionnée de 15 à 20 % de sérum de veau foetal, fournit les éléments nutritifs nécessaires pour permettre la formation de monocouches. L'exclusion d'impuretés microbiennes est favorisée par la présence de combinaisons de formulations antibiotiques telles'que

100 unités de pénicilline/ml et 100 mcg de streptomycine/

ml ou 30 unités de néomycine/ml et 30 unités de polymyxine/ ml plus 2,5 mcg d'amphotéricine/ml. On règle le pH du milieu de croissance et de maintien par l'addition de tarapon HEPES 0,01 M et de bicarbonate de sodium à 0,19 %.

Après incubation à 34-37[deg.]C pendant une période suffisante pour permettre la reproduction virale,

on récolte des fluides infectés lorsque, dans le cas de virus cytolytiques, 70 à 90 % des cellules infectées exercent un effet cytopathogène typique. Pour les virus non cytolytiques, les fluides infectés sont récoltés lorsqu'on

a atteint le maximum de croissance virale comme indiqué

par des titrages préalables de courbes de croissance, soit spécifiquement 2-7 jours après l'infection. On peut également envisager des cycles multiples de récoltes vi- rales de fluides infectés dans le cas de virus non ; cytolytiques en éliminant le milieu usé, en ajoutant un milieu frais et en poursuivant l'incubation des cellules infectées jusqu'à ce qu'on ait atteint un nouveau maximum

de croissance virale en 1-3 jours.

EXEMPLE 3. Culture de rhabdovirus dans la souche de

cellules.

Afin d'adapter des rhabdovirus au système

de culture de cellules, on cultive des souches PV-12 ou

HEP Flury de virus rabique dans des cellules de tissus <EMI ID=24.1> afin de préparer un virus d'ensemencement. Trois ou quatre jours après l'infection des cellules en suspension, lorsque les essais aux anticorps fluorescents indiquent
10 à 50 % de cellules fluorescentes, on détache les cellules infectées de la paroi en verre du récipient de culture avec une solution de trypsine/acide éthylènediamine-tétracétique et on les remet en suspension dans le milieu de croissance. On ajoute les cellules provenant de chaque récipient de culture utilisé dans le premier cycle de croissance dans chacun des deux récipients de

les essais aux anticorps fluorescents auxquels on soumet les cellules infectées, indiquent une valeur de 100 %

de cellules positives aux antigènes rabiques. On récolte les fluides infectés, on les rassemble et on les conserve en parties aliquotes à -70[deg.]C. Les titres de ces récoltes

lules.

On prépare le virus de parainfluenza type

3 à partir de cellules ATCC pu-=15 infectées de virus, cette matière représentant 3-4 transferts de culture de tissu

du virus. Quatre à six jours après l'inoculation des cultures de cellules de tissus embryonnaires de poumons canins, les cellules manifestent une nette dégénérescence au moment de leur récolte. On rassemble les cellules et les fluides et on les conserve en parties aliquotes.â
-70[deg.]C. Les titres de ces récoltes de virus se situent <EMI ID=29.1>

de culture de tissu).

de la maladie des chiens (souche de Cabasso) à partir

de suspensions d'embryons de poulets à infection virale, cette matière représentant 40-45 transferts de souscultures du virus. Trois à quatre jours après l'inoculation de la suspension de cellules de tissus embryonnaires de poumons canins, les cellules présentent une certaine dégénérescence au moment de leur récolte. On rassemble

les cellules et les fluides et on les conserve en parties aliquotes à -70[deg.]C. Les titres de ces récoltes de virus

EXEMPLE 5. Culture du virus herpès dans la souche de

cellules.

On prépare le virus de rhinotrachéite bovine infectieuse à partir de cellules primaires infectées de reins de bovidés, cette matière représentant 3-4 transferts de culture de tissus du virus. Quatre à six jours après l'inoculation des cultures de tissus embryonnaires de poumons canins, environ 75 % des cellules sont affectées au moment de leur récolte. On rassemble les cellules et les fluides et on les conserve en parties aliquotes à -70[deg.]C. Le titrage des récoltes de virus indique spécifiquement un intervalle de

EXEMPLE 6. Culture d'orbivirus dans la souche de cellules.

On prépare le virus de la langue bleue à partir d'une suspension d'embryons de poulets à infection virale, cette matière représentant 45-50 transferts de sous-cultures du virus. Quatre à sept jours après l'inoculation des cultures de tissus embryonnaires de poumons canins, environ 75 % des cellules sont affectées au moment <EMI ID=33.1>

et on les conserve en parties aliquotes à -70[deg.]C. Le titrage des récoltes de virus indique spécifiquement un intervalle de 105,0 à 106,5 TCID50/ml.

REVENDICATIONS

1. Système de culture de cellules approprié pour la production de virus, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules diploldes d'une souche de cellules de poumon canin foetal dans un milieu de culture nutritif.

2. Système de culture de cellules suivant

Claims

la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu nutritif comprend du sérum de veau foetal.

3. Système de culture de cellules suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient entre environ 10 et environ 20 % du sérum.

4. Procédé de préparation d'un vaccin, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à :

a) maintenir une culture viable de cellules diploïdes d'une souche de cellules de poumon canin foetal dans un milieu de culture nutritif ; b) inoculer ce milieu avec un virus auquel ces cellules sont sensibles ; c) cultiver ce virus dans ce milieu, et d) en récolter le virus.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le virus est un membre choisi parmi

le groupe, comprenant le virus rabique, le virus de la <EMI ID=35.1> <EMI ID=36.1>

virus de la langue bleue.

Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le virus est le virus rabique.

7. Vaccin pouvant être utilisé chez un animal en vue de stimuler la production d'anticorps, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé suivant la revendication 4.

8. Vaccin suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le virus est le virus rabique,

tandis que ce vaccin peut être administré à un être

humain.

9. Procédé pour la culture du virus rabi- que, caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer un sys- tème de culture de cellules comprenant des cellules di- ploldes d'une souche de cellules de poumon canin dans

un milieu de culture nutritif avec le virus.

10. Procédé de culture du virus de la rhi-

<EMI ID=37.1>

<EMI ID=38.1>

prenant des cellules diploldes d'une souche de cellules de poumon canin dans un milieu de culture nutritif avec le virus.

11. Procédé de culture du virus de parainfluenza :type 3; caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer un système de culture de cellules comprenant

<EMI ID=39.1>

canin dans un milieu de culture nutritif avec le virus.

<EMI ID=40.1>

<EMI ID=41.1>

inoculer un système de culture de cellules comprenant

<EMI ID=42.1> <EMI ID=43.1>

13. Procédé de culture du virus de la langue bleue, caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer un système de culture de cellules comprenant des cellules diploïdes d'une souche de cellules de poumon canin dans un milieu de culture nutritif avec le virus.