BE877801A

BE877801A - Acide desoxyribonucleique insolubilise

Info

Publication number: BE877801A
Application number: BE0/196383A
Authority: BE
Original assignee: American Hospital Supply Corp
Priority date: 1979-07-19
Filing date: 1979-07-19
Publication date: 1979-11-16

Description


  Acide désoxyribonucléique insolubilisé-

  
La présente invention concerne des épreuves par immunofluorescence et plus particulièrement une épreuve par immunofluorescence indirecte en phase solide pour la mise en

  
 <EMI ID=1.1> 

  
ribonucléique natif.

  
On connaît depuis plus de 10 ans l'utilisation

  
de l'albumine de sérum de boeuf méthylée comme véhicule pour acide nucléique à des fins d'immunisation /Plescia et al,

  
 <EMI ID=2.1>   <EMI ID=3.1> 

  
principale de ces chercheurs était de produire des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique dénaturé (en hélice

  
 <EMI ID=4.1> 

  
mine de sérum de boeuf méthylée insolubles de plus petit poids moléculaire.

  
 <EMI ID=5.1> 

  
à-dire produit de conjugaison, albumine de sérum de boeuf mé-

  
 <EMI ID=6.1> 

  
utilisé comme substrat pour la mise en évidence des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif. Les autorités compétentes avaient bien au contraire recommandé de ne pas utiliser de produits de conjugaison albumine de sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique natif pour des immunisa-

  
 <EMI ID=7.1> 

  
méthylée avec 1 \acide désoxyribonucléique natif conduit à la formation d'un caillot fibreux compact qu'il est virtuellement impossible d'injecter.

  
Des moyens classiques pour la mise en évidence des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif

  
sont entre autres-le dosage radioimmunologique et l'agglutination de latex. Toutefois, le premier mode opératoire est onéreux et lent et le second est relativement peu sensible.

  
Il serait donc nécessaire de disposer d'un moyen peu onéreux, sensible et rapide pour- éviter ces inconvénients. Comme précisé ci-après, l'invention procure ce moyen d'investigation. 

  
Le procédé de l'invention pour mettre en évidence et/ou doser quantitativement les anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif et d'autres anticorps dans la sérum de divers patients atteints d'une affection spécifique comprend les stades suivants:

  
 <EMI ID=8.1> 

  
nucléique natif avec du sérum d'un patient atteint de lupus érythémateux systémique pendant une durée suffisante;

  
B. on lave le mélange de sérum et de produit floculé et on en sépare le liquide surnageant;

  
C. on ajoute au produit floculé lavé un anticorps

  
 <EMI ID=9.1>  .mélange marqué à,incuber pendant une durée suffisante;

  
D. on lave le produit floculé incubé et on en sépare le liquide surnageant et

  
E. on met un culot du mélange d'anticorps en suspension dans un milieu de lavage et on détermine la fluorescence du produit floculé, laquelle est proportionnelle à la concentration des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif.

  
Suivant l'invention, les anticorps à l'égard de l'_acide désoxyribonucléique sont mis en évidence par

  
une épreuve d'immunofluorescence indirecte en phase solide au moyen d'un produit de conjugaison stable et insoluble formé par l'albumine de sérum de boeuf méthylée et par l'acide désoxyribonucléique natif en double hélice.

  
D.'autres produits de conjugaison insolubles peuvent

  
 <EMI ID=10.1> 

  
thyroglobuline humaine ou d'un extrait nucléaire de thymus de veau avec de l'albumine de sérum de boeuf méthylée. Ces produits de conjugaison insolubles sont utilisés comme sub- <EMI ID=11.1> 

  
autoimmunes.

  
Suivant l'invention, on utilise un produit de conjugaison stable et insoluble albumine de sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique natif dans une épreuve d'immunofluorescence indirecte en phase solide pour mettre en évidence les anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif.

  
Suivant une forme de réalisation de l'invention,

  
on met à incuber pendant une durée suffisante des quantités

  
 <EMI ID=12.1> 

  
métbylée - acide désoxyribonucléique natif et du sérum d'un patient atteint de- lupus érythémateux systémique. Après incubation, le mélange est lavé avec une solution et le liquide surnageant en est séparé. Ensuite, un anticorps anti-immunoglobuline marqué à la fluorescéine est ajouté au produit floculé lavé et le mélange marqué est mis à incuber pendant une durée suffisante. Le produit floculé incubé est alors lavé et le liquide surnageant en est séparé.

  
Un culot du mélange d'anticorps est mis en suspension dans un milieu,-de lavage et la fluorescence du produit

  
 <EMI ID=13.1> 

  
tion et l'émission respectivement. Comme la fluorescence

  
du produit floculé est proportionnelle à la concentration des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif, il est possible de mettre ces anticorps en évidence.

  
Le mélange incubé peut être lavé avec un milieu de lavage comme de la solution physiologique salée tamponnée

  
 <EMI ID=14.1> 

  
 <EMI ID=15.1>  

  
est marqué au moyen d'un agent fluorescent, par exemple l'iso-

  
 <EMI ID=16.1> 

  
Les intensités de fluorescence mesurées sur le sérum d'un patient atteint de lupus érythémateux systémique sont comparées à l'intensité de fluorescence de fond d'un sérum témoin normal. La différence de fluorescence entre les sérums est_la base pour la détermination des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif que contient le sérum du patient atteint de lupus érythémateux systémique.

  
L'épreuve permettant de mettre les anticorps en

  
 <EMI ID=17.1> 

  
indirecte en phase solide pour laquelle on utilise un produit de conjugaison stable et insoluble formé par un polymère soluble choisi parmi l'acide désoxyribonucléique natif en double hélice, l'immunoglobuline G de lapin, la thyroglobuline humaine et un extrait nucléaire de thymus de veau avec l'albumine de sérum de boeuf méthylée qui insolubilise ce polymère-

  
Suivant l'invention, lorsque le polymère soluble

  
 <EMI ID=18.1> 

  
 <EMI ID=19.1> 

  
que natif en cas de lupus érythémateux systémique.

  
Lorsque le polymère soluble est l'immunoglobuline G de lapin, 1 \épreuve permet de déceler les anticorps à l'égard de l'immunoglobuline G telle qu'elle apparaît dans l'arthrite rhumatoide. Lorsque le polymère soluble est la thyroglobuline

  
 <EMI ID=20.1> 

  
L'extrait nucléaire de thymus de veau insolubilisé permet. de déceler les anticorps antinucléaires.

  
Suivant la présente invention, d'autres substances

  
 <EMI ID=21.1> 

  
boeuf méttylée pour former le produit de conjugaison insoLu&#65533; 

  
ble permettant de déceler les anticorps à l'égard d'antigènes dans différentes affections. Ces substances solubles sont notamment l'albumine de sérum humain méthylée et un. extrait nucléaire cellulaire soluble comme l'antigène nucléaire extractible) pour le diagnostic d'affections mixtes, des tissus conjonctifs. 

  
Dans le produit de conjugaison insoluble, l'albumine de sérum de boeuf méthylée peut être remplacée pour l'insolubilisation des polymères solubles, par exemple de l'acide désoxyribonucléique natif. La Demanderesse a en effet découvert

  
 <EMI ID=22.1> 

  
dans la mise en évidence des anticorps lorsque l'albumine de sérum humain métbylée est utilisée pour insolubiliser les polymères solubles.

  
Le précipite insoluble, c'est-à-dire le produit de conjugaison, albumine de sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique natif conserve la structure en double

  
 <EMI ID=23.1> 

  
montre l'analyse à la sonde fluorescente effectuée sur le précipité suivant le procédé de Morgan et Pulleyblank (Bio-

  
 <EMI ID=24.1> 

  
celui de l'acide désoxyribonucléique natif avant son insolubilisation. En d'autres termes, le produit de conjugaison conserve les propriétés de fluorescence, aux valeurs élevées du pH, qui sont caractéristiques de l'acide désoxyribonucléique natif en double hélice.

  
De même, le produit de conjugaison insoluble formé  <EMI ID=25.1> 

  
 <EMI ID=26.1> 

  
désoxyribonucléique natif, conserve le caractère antigénique du polymère soluble. Cette propriété est mise en évidence

  
 <EMI ID=27.1> 

  
désoxyribonucléique soluble inhibe spécifiquement la réac-

  
 <EMI ID=28.1> 

  
duit de floculation insoluble albumine de sérum de boeuf

  
 <EMI ID=29.1> 

  
nuciéique natif soluble libre n'est décelable dans le liquide surnageant après plusieurs lavages. Par conséquent, le produit de conjugaison albumine de sérum de boeuf méthylée -

  
 <EMI ID=30.1> 

  
Les exemples suivants illustrent plus en détail les formes de réalisation préférées et avantages de l'invention.

  
EXEMPLE 1 -

  
Synthèse du produit de conjugaison albumine de sérum de boeuf

  
 <EMI ID=31.1> 

  
Conformément à l'invention, on prépare comme décrit ci-après le produit de conjugaison pour déceler les anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif.

  
 <EMI ID=32.1> 

  
thymus de veau, d'Escherichia coli ou de sperme de saumon dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate en une concentration de 1,0 mg/ml. On dissout ensuite dans de l'eau de l'albumine de sérum de boeuf méthylée en une concentration de 10 mg/ml. On mélange les deux solutions dans un rapport optimal préalablement établi pour assurer la préci- <EMI ID=33.1> 

  
méthylée à 10 mg/ml pour 1 mg d'acide désoxyribonucléique natif) et on met le mélange à incuber pendant 2 heures à 37[deg.]C.

  
On lave le précipité avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate en opérant par centrifugation jusqu'à ce qu'on ne puisse plus déceler d'acide désoxyribonucléique natif dans le liquide surnageant rejeté.

  
On met le culot en suspension dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate. On homogénéise le produit floculé au moyen d'un broyeur à tissu en verre pour obtenir une suspension plus uniforme, puis on étalonne la concen.tration en produit floculé en utilisant un fluoromètre Turner

  
 <EMI ID=34.1> 

  
fuge la suspension et on met le culot en suspension dans

  
un volume convenable de solution physiologique salée tamponnée au phosphate additionnée de 5% d'albumine de sérum de

  
 <EMI ID=35.1> 

  
qu'on lyophilise. Après reconstitution, on vérifie la présence d'acide désoxyribonucléique natif libre soluble par addition de bromure d'éthidium au liquide surnageant limpide après centrifugation. Celui-ci ne contient pas d'acide désoxyribonucléique natif libre et la fluorescence observée à
540/590 nanomètres n'augmente par conséquent pas.

  
On prépare le produit de conjugaison insoluble pour la mise en évidence des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif dans le sérum de patients atteints de lupus érythémateux systémique-

  
On prépare en substance comme décrit ci-dessus les produits de conjugaison insolubles immunoglobuline G de lapin, albumine de sérum de boeuf méthylée, thyroglobuline humaine albumine de sérum de boeuf méthylée et extrait nucléaire de thymus de veau - albumine de sérum de boeuf méthylée. Les seules différences sont les valeurs optimales du rapport

  
de l'albumine de sérum de boeuf méthylée à l'immunoglobuline G, à la thyroglobuline ou à l'extrait nucléaire de thymus de

  
 <EMI ID=36.1> 

  
bilisation du produit floculé résultant.

  
EXEMPLE 2 -

  
 <EMI ID=37.1> 

  
sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique natif avec 100/ul d'un sérum convenablement dilué (par exemple 1:2, 1:4 ou 1:10) provenant d'un patient atteint de lupus érythémateux syst.émique. On met le mélange à incuber pen-

  
 <EMI ID=38.1> 

  
lange par centrifugation à trois reprises avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate, c'est-à-dire en ajoutant 4 ml de solution physiologique salée tamponnée au phosphate, en centrifugeant le tube à essai à 2000 g et

  
en séparant par aspiration le liquide surnageant limpide.

  
 <EMI ID=39.1> 

  
(c'est-à-dire 1:400) et on met le mélange à incuber pendant
30 minutes à la température ambiante. On lave deux fois par centrifugation le mélange de produit floculé et d'anticorps marqué-

  
On met le culot de mélange de produit :floculé et d'anticorps en suspension dans 2,0 ml de solution physiologique salée tamponnée au phosphate et on mesure la fluorescence à 490/520 nanomètres pour l'excitation et l'émission, respectivement. On effectue l'épreuve par fluorescence à l'aide d'un spectrofluorumètie à monochromateurs, en l'occurrence le

  
 <EMI ID=40.1> 

  
On compare les intensités relevées sur le sérum

  
de patients atteints de lupus érythémateux systémique à l'intensité de fond d'un sérum témoin normal.

  
EXEMPLE 3 -  Epreuves par immunofluorescence

  
On applique l'épreuve par immunofluorescence décrite dans l'exemple 2 pour déceler les anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif dans le sérum de différents patients atteints de lupus érythémateux systémique. Pool déceler convenablement les anticorps dans le sérum de ces pa-

  
 <EMI ID=41.1> 

  
vidus normaux.

  
On trouvera ci-après une liste d'intensités relevées sur des sérums témoins normaux dont chacun provient d'un individu différent avec indication de la moyenne et de l'écart type,

  
ce qui permet d'apprécier la reproductibilité des opérations.

  
 <EMI ID=42.1> 

  
Fluorescence du sérum d'un individu normal

  

 <EMI ID=43.1> 


  
moyenne - écart type = 0,179 &#65533; 0,006

  
 <EMI ID=44.1>  buline G humaine de chèvre marquée à la fluores.céine.

  
Les intensités de fluorescence reprises ci-après relevées sur le sérum de patients atteints de lupus érythémateux systémique permettent la comparaison avec les résultats ci-dessus. Ces valeurs sont celles relevées sur le sérum

  
 <EMI ID=45.1> 

  
témique.

  
Fluorescence du sérum de patients atteints de lupus érythémateux systémique

  

 <EMI ID=46.1> 


  
 <EMI ID=47.1> 

  
buline G humaine de chèvre marquée à la fluorescéine.

  
Comme le montrent les tableaux ci-dessus, la fluorescence du sérum d'un patient atteint de lupus érythémateux systémique est spécifiquement supérieure à la fluorescence

  
de fond d'un sérum témoin normal. On peut déduire des expériences que le sérum de patients atteints de lupus érythémateux systémique contient des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif.

  
 <EMI ID=48.1> 

  
phase solide pour la mise en évidence des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique

  
Pour déterminer si la réaction observée est celle de l'acide désoxyribonucléique avec un anticorps à 1 'égard de cet acide désoxyribonucléique, on exécute les expériences ci-après d'inhibition de la fixation. On répartit du sérum d'un patient atteint de lupus érythémateux systémique et du

  
 <EMI ID=49.1> 

  
de l'acide désoxyribonucléique libre (en quantité de 0 à lOO&#65533;ug) et on met les différents mélanges à incuber pendant

  
 <EMI ID=50.1> 

  
comme dans l'exemple 2.

  

 <EMI ID=51.1> 


  
NA. = non applicable

  
 <EMI ID=52.1> 

  
corps d'un sérum de patient atteint de lupus érythémateux systémique sur le produit de conjugaison albumine de sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique lors d'une préincubation du sérum avec de l'acide désoxyribonucléique soLu&#65533; 

  
ble. Le degré d'inhibition est proportionnel à la concentration de l'inhibiteur.

  
EXEMPLE 5' -

  
Comparaison de l'épreuve par immunofluorescence indirecte

  
 <EMI ID=53.1> 

  
immunologique, on examine le sérum de 10 patients atteints de lupus érythémateux systémique tant par immunofluorescence indirecte en phase solide qu'au moyen d'une trousse de dosage

  
 <EMI ID=54.1> 

  

 <EMI ID=55.1> 


  
 <EMI ID=56.1> 

  
fluorescence indirecte en phase solide est aussi sensible que le dosage radio-immunologique.

  
EXEMPLE 6 -

  
Mise en évidence des anticorps antinucléaires avec un extrait

  
 <EMI ID=57.1>  On purifie les noyaux cellulaires de thymus de veau et on extrait le produit nucléaire par exposition aux ultrasons à 60 kHz pendant 3 minutes dans du tampon au phosphate hypotonique. On précipite l'extrait nucléaire avec de l'albumine de sérum de boeuf méthylée et on lave le précipité une

  
 <EMI ID=58.1> 

  
le précipité comme substrat pour déceler des anticorps antinucléaires en appliquant le mode opératoire de l'exemple 2. On identifie en outre des sérums donnant une réaction positive aux anticorps antinucléaires en utilisant .une trousse de lames porte-objets disponible dans le commerce et on exprime La concentration en anticorps sous la forme du titre.

  

 <EMI ID=59.1> 


  
 <EMI ID=60.1> 

  
Les anticorps antinucléaires des classes IgG et IgM

  
 <EMI ID=61.1> 

  
phase solide. Les échantillons de sérum de titre élevé ont une fluorescence élevée en proportion. Parfois .(voir échan-

  
 <EMI ID=62.1> 

  
dérance d'une classe d'anticorps (IgM) sur une autre.

Claims

<EMI ID=63.1>

1 - Procédé de mise en évidence des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif dans du sérum, caractérisé en ce que:

A. on met à incuber un produit de conjugaison insoluble albumine de sérum de boeuf méthylée - acide désoxyribonucléique natif avec du sérum d'un patient atteint de lupus érythémateux systémique pendant une durée suffisante;

B. on lave le mélange de sérum et de produit floculé et on en sépare le liquide surnageant;

C. on ajoute au produit floculé lavé un anticorps <EMI ID=64.1>

E. on met un culot du mélange d'anticorps en sus-

<EMI ID=65.1>

cence du produit floculé, laquelle est proportionnelle à la concentration des anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif.

2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on détermine la fluorescence du produit floculé

<EMI ID=66.1>

tivement.

3 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on met des volumes égaux du produit de conjugaison

<EMI ID=67.1>

à la température ambiante.

<EMI ID=68.1>

en ce qu'on lave avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate le mélange de produit floculé et de

<EMI ID=69.1> <EMI ID=70.1>

subi l'incubation.

5 - Procédé suivant la revendication 1, caract érisé en ce que le produit de conjugaison, insoluble albumine de sérum

<EMI ID=71.1>

la forme en double hélice de l'acide désoxyribonucléique natif.

6 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de marquage fluorescent est un sérum anti-

<EMI ID=72.1>

immunoglobuline polyspécifique de chèvre marqué à la fluoresc éine.

7 - Epreuve pa: immunofluorescence indirecte en phase solide, caractérisée en ce qu'on utilise un produit de. conjugaison stable et insoluble obtenu à partir d'un polymère soluble choisi parmi l'acide désoxyribonucléique natif en double hélice, l'immunoglobuline G de lapin, la thyroglobuline humaine et l'extrait nucléaire de thymus de veau, avec l'albumine de sérum de boeuf méthylée qui insolubilise le polymère.

8 --Epreuve suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le polymère soluble est l'acide désoxyribonucléique natif et l'épreuve permet de déceler les anticorps à l'égard de l'acide désoxyribonucléique natif en cas de lupus érythémateux systémique.

9 - Epreuve suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le polymère soluble est l'immunoglobuline G de lapin et l'épreuve permet de déceler les anticorps à l'égard de

l'immunoglobuline G- en cas d'arthrite rhumatoïde .

10 - Epreuve suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le polymère soluble est la thyroglobuline humaine et l'épreuve permet de déceler les anticorps à l'égard de la thyroglobuline en cas de thyroïdite autoimmune. 11 - Epreuve suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le polymère soluble est un extrait nucléaire de thymus de veau et l'épreuve permet de déceler les anticorps antinucléaires.

12 - Epreuve suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le produit de conjugaison insoluble d'albumine de sérum de boeuf méthylée et de polymère soluble conserve le pouvoir antigénique du polymère soluble.

13 - Epreuve suivant la revendication 7, caractérisée en ce que l'albumine de sérum de boeuf méthylée peut être remplacée par de l'albumine de sérum humain- méthylée.

<EMI ID=73.1>

phase solide, caractérisée en ce qu'on utilise un produit

de conjugaison stable et insoluble obtenu à partir d'un extrait nucléaire cellulaire .soluble 'insolubilisé par l'albumine de sérum de boeuf méthylée.

<EMI ID=74.1>

risée en ce que l'extrait nucléaire cellulaire soluble est l'antigène nucléaire extractible.

16 - Epreuve suivant la revendication 15, caractérisée en ce que l'antigène nucléaire extractible est utilisé pour déceler les anticorps à l'égard d'affections mixtes des tissus conjonctifs.