JPH0737986B2 - 免疫的検出方法 - Google Patents
免疫的検出方法Info
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- JPH0737986B2 JPH0737986B2 JP63075447A JP7544788A JPH0737986B2 JP H0737986 B2 JPH0737986 B2 JP H0737986B2 JP 63075447 A JP63075447 A JP 63075447A JP 7544788 A JP7544788 A JP 7544788A JP H0737986 B2 JPH0737986 B2 JP H0737986B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、主として臨床検査における病原体、あるいは
疾患マーカー等の検出、さらには広く産業上の極微量検
出分野に用いることのできる免疫的検出方法に関する。
疾患マーカー等の検出、さらには広く産業上の極微量検
出分野に用いることのできる免疫的検出方法に関する。
従来の技術 天然に存在する、あるいは人工的に作製した抗体を用い
た検出方法は、高特異性及び高感度の点に特徴を有し、
極小量の存在割合の目的物質を検出する目的で現在用い
られている。このような目的には、例えば、血液中から
病原体、あるいは腫瘍、心筋梗塞、脳血栓等の疾患時に
特異的に分泌されるいわゆる疾患マーカーなどの臨床検
査業務や、大気中から極微量の物質を検出する目的など
がある。近年このような目的で、例えば石川栄治、河合
忠、宮井潔著「酵素免疫測定法第３版」（医学書院1987
年、31〜54頁）に記載されているように多くの種類の免
疫測定法が開発されている。この方法は、検出物質が高
分子（タンパク質）か低分子（ハプテン）かによって２
分される。本発明では主としてハプテン系を対象として
おり、このための代表例である、ELISA法の実験手順を
段階を追って説明する。
た検出方法は、高特異性及び高感度の点に特徴を有し、
極小量の存在割合の目的物質を検出する目的で現在用い
られている。このような目的には、例えば、血液中から
病原体、あるいは腫瘍、心筋梗塞、脳血栓等の疾患時に
特異的に分泌されるいわゆる疾患マーカーなどの臨床検
査業務や、大気中から極微量の物質を検出する目的など
がある。近年このような目的で、例えば石川栄治、河合
忠、宮井潔著「酵素免疫測定法第３版」（医学書院1987
年、31〜54頁）に記載されているように多くの種類の免
疫測定法が開発されている。この方法は、検出物質が高
分子（タンパク質）か低分子（ハプテン）かによって２
分される。本発明では主としてハプテン系を対象として
おり、このための代表例である、ELISA法の実験手順を
段階を追って説明する。
（Ａ） 抗原のコーティング キャリアー蛋白、例えば血清アルブミン（BSA）に、検
出物質あるいはこれに官能基を導入した誘導体を結合し
たコンジュゲートをバッファーに溶解して抗原溶液とす
る。
出物質あるいはこれに官能基を導入した誘導体を結合し
たコンジュゲートをバッファーに溶解して抗原溶液とす
る。
マイクロプレート（塩化ビニルあるいはポリスチレン製
96ウェルプレート）に抗原溶液を100μL/ウェル注入
し、20℃で１夜保存する。
96ウェルプレート）に抗原溶液を100μL/ウェル注入
し、20℃で１夜保存する。
（Ｂ） ブロッキング BSAのバッファー溶液を250μL/ウェル注入し、0.5〜２
時間室温で放置する。その後、バッファーまたは純水で
３〜５回洗浄する。
時間室温で放置する。その後、バッファーまたは純水で
３〜５回洗浄する。
（Ｃ） 抗体の反応 検出物質溶液を注入し、振とうしながら抗体溶液をさら
に加える。常温で３〜５時間保存した後、アスピレータ
で抗体溶液を除去し、バッファーまたは純水で３〜５回
洗浄する。
に加える。常温で３〜５時間保存した後、アスピレータ
で抗体溶液を除去し、バッファーまたは純水で３〜５回
洗浄する。
（Ｄ） 第２抗体の反応 酵素、例えばペルオキシダーゼで標識した抗体に対する
抗体（第２抗体）の溶液を注入し、常温で0.5〜２時間
放置する。その後、バッファーまたは純水で３〜５回洗
浄する。
抗体（第２抗体）の溶液を注入し、常温で0.5〜２時間
放置する。その後、バッファーまたは純水で３〜５回洗
浄する。
（Ｅ） 基質の反応と停止 発色剤、例えばＯ−フェニレンジアミン（セレン検出
用）をバッファーに溶解し、使用直前に30％過酸化水素
水を加えた溶液（基質溶液）を注入し、室温で発色反応
を行う。５〜20分後、硫酸で反応を停止する。
用）をバッファーに溶解し、使用直前に30％過酸化水素
水を加えた溶液（基質溶液）を注入し、室温で発色反応
を行う。５〜20分後、硫酸で反応を停止する。
（Ｆ） 測定 マイクロプレート用吸光光度系を用いて492nmの吸光度
を測定する。最終的に検出物質が多いほど吸光度が弱い
ことから、物質の検出を行う。
を測定する。最終的に検出物質が多いほど吸光度が弱い
ことから、物質の検出を行う。
発明が解決しようとする課題 前項で記載したように従来の免疫的検出方法は多くの手
順を必要とし、また反応が固相と液相の共存する不均一
系で進行、最終的な検出に酵素反応を用いているため、
本質的に長時間を要していた。
順を必要とし、また反応が固相と液相の共存する不均一
系で進行、最終的な検出に酵素反応を用いているため、
本質的に長時間を要していた。
課題を解決するための手段 目的検出物質と特異的に結合する抗体に、一切の化学的
修飾を施さずに用い、当該抗体と結合する類似物質と当
該抗体の有する蛍光を消光する機能を有する蛍光消光物
質とが化学的に結合したプローブ物質を用い、あらかじ
め抗体とプローブ物質を混合することによって抗体とプ
ローブ物質を結合させ、抗体が本来有している蛍光を消
光しておく。その後目的検出物質を導入することによっ
て、抗体とプローブ物質を解離させ、蛍光が再び増大す
る現象を用いて検出を行う。
修飾を施さずに用い、当該抗体と結合する類似物質と当
該抗体の有する蛍光を消光する機能を有する蛍光消光物
質とが化学的に結合したプローブ物質を用い、あらかじ
め抗体とプローブ物質を混合することによって抗体とプ
ローブ物質を結合させ、抗体が本来有している蛍光を消
光しておく。その後目的検出物質を導入することによっ
て、抗体とプローブ物質を解離させ、蛍光が再び増大す
る現象を用いて検出を行う。
作用 上記の手段をとることにより、反応がすべて均一系（液
相）で進行し、さらに酵素反応も用いないため検出時間
の著しい短縮を行うことが可能となる。
相）で進行し、さらに酵素反応も用いないため検出時間
の著しい短縮を行うことが可能となる。
実 施 例 一般的に抗体は280nmの励起で340nm付近に蛍光を発す
る。この蛍光はタンパク質を構成するアミノ酸のうちト
リプトファンを中心として発するもので、通常全てのタ
ンパク質に見られ、当然抗体も一般的にこの現象を有す
る。この蛍光は、種々の消光物質により消光されるが、
特によく知られた消光物質としてはニトロベンゼン、ジ
ニトロベンゼン、トリニトロベンゼン等があり、蛋白あ
るいはハプテンと結合するためにスルフォン酸基、ハロ
ゲン、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基
などの官能基が導入されていても同様の効果がある。な
かでも2,4−ジニトロフルオロベンゼンはサンガー法に
よるアミノ酸配列決定の試薬として容易に入手でき、ハ
プテン、蛋白を問わずアミノ基に容易に結合するので望
ましいと思われる。以下、本発明の原理確認のため実験
的に行った実施例について説明する。
る。この蛍光はタンパク質を構成するアミノ酸のうちト
リプトファンを中心として発するもので、通常全てのタ
ンパク質に見られ、当然抗体も一般的にこの現象を有す
る。この蛍光は、種々の消光物質により消光されるが、
特によく知られた消光物質としてはニトロベンゼン、ジ
ニトロベンゼン、トリニトロベンゼン等があり、蛋白あ
るいはハプテンと結合するためにスルフォン酸基、ハロ
ゲン、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基
などの官能基が導入されていても同様の効果がある。な
かでも2,4−ジニトロフルオロベンゼンはサンガー法に
よるアミノ酸配列決定の試薬として容易に入手でき、ハ
プテン、蛋白を問わずアミノ基に容易に結合するので望
ましいと思われる。以下、本発明の原理確認のため実験
的に行った実施例について説明する。
実施例１ まず、プローブ物質の合成方法を簡単に説明する。玉
置、福田、岸田、高橋、日本法医学雑誌（Jpn,J.,Legal
Med.,37（４）,417,1983）に記載された方法で、以下
の構造式を有するＮ−（４−アミノブチル）メタンフェ
タミン、（MANH2）を合成した。
置、福田、岸田、高橋、日本法医学雑誌（Jpn,J.,Legal
Med.,37（４）,417,1983）に記載された方法で、以下
の構造式を有するＮ−（４−アミノブチル）メタンフェ
タミン、（MANH2）を合成した。
アセトン中でMANH2と2,4−ジニトロフルオロベンゼンを
等モル混合し１時間撹拌をおこなったのち分取用薄層ク
ロマトグラフィーで精製した。この結果、以下の構造式
を有するプローブ物質、MANH2DNPを得た。
等モル混合し１時間撹拌をおこなったのち分取用薄層ク
ロマトグラフィーで精製した。この結果、以下の構造式
を有するプローブ物質、MANH2DNPを得た。
本実施例で用いた抗体は、発明者らによって作製された
抗メタンフェタミンモノクローナル抗体（αMAMAB1）で
ある。この抗体はメタンフェタミン（MA）に対し、約10
7のアフィニティーを有していた。以下、実験的な検出
の方法について手順を述べる。
抗メタンフェタミンモノクローナル抗体（αMAMAB1）で
ある。この抗体はメタンフェタミン（MA）に対し、約10
7のアフィニティーを有していた。以下、実験的な検出
の方法について手順を述べる。
バッファー（pH7のリン酸バッファーを0.45μのフ
ィルターに通したもの）でαMAMAB1を溶解して１×10-7
Mの濃度とした。この溶液360μＬを蛍光測定用ミクロセ
ル波長280nm（バンドパス5nm）の励起光、蛍光波長340n
m（バンドパス10nm）で強度約45（FL0）の蛍光を発した
（第１図、ａ部分）。
ィルターに通したもの）でαMAMAB1を溶解して１×10-7
Mの濃度とした。この溶液360μＬを蛍光測定用ミクロセ
ル波長280nm（バンドパス5nm）の励起光、蛍光波長340n
m（バンドパス10nm）で強度約45（FL0）の蛍光を発した
（第１図、ａ部分）。
MANH2DNP3×10-7Mのバッファー溶液20μＬを加える
と、消光が起こり蛍光強度が28（FL1）に減少した。こ
の消光反応は約15秒で平衡状態に達した（第１図、ｂ部
分）。
と、消光が起こり蛍光強度が28（FL1）に減少した。こ
の消光反応は約15秒で平衡状態に達した（第１図、ｂ部
分）。
上記の溶液にMAの３×10-2Mバッファー溶液20μＬ
（最終濃度１×10-4M）を加えると、抗体とMAが結合
し、MANH2DNPが脱離したため消光が阻害され、その結果
蛍光強度が約40（FLx）に増大した。この反応は約30秒
で平衡に達した（第１図、ｃ部分）。以上記載のよう
に、の段階の溶液にMAを導入し、蛍光強度の増大から
MAを検出することができた。この実験条件での検出感度
を確かめるため、で各濃度のMAを用いたときの蛍光強
度の変化を図２に示す。なお、図２でMA濃度は最終濃度
で示した。縦軸は で示した。
（最終濃度１×10-4M）を加えると、抗体とMAが結合
し、MANH2DNPが脱離したため消光が阻害され、その結果
蛍光強度が約40（FLx）に増大した。この反応は約30秒
で平衡に達した（第１図、ｃ部分）。以上記載のよう
に、の段階の溶液にMAを導入し、蛍光強度の増大から
MAを検出することができた。この実験条件での検出感度
を確かめるため、で各濃度のMAを用いたときの蛍光強
度の変化を図２に示す。なお、図２でMA濃度は最終濃度
で示した。縦軸は で示した。
第２図の結果から約10-6Mの濃度のMAが本発明の方法に
より検出できたことが証明された。
より検出できたことが証明された。
実施例２ MANH2DNPのかわりに以下に示す構造式の化合物をプロー
ブ物質として用いて実施例１と同様の操作を行った結
果、検出感度は10−6.5に落ちたものの、同様の効果が
得られた。
ブ物質として用いて実施例１と同様の操作を行った結
果、検出感度は10−6.5に落ちたものの、同様の効果が
得られた。
実施例３ MANH2DNPのかわりに以下に示す構造式の化合物をプロー
ブ物質として用いて実施例１と同様の操作を行った結
果、検出感度は実施例２と同じく10−6.5に落ちたもの
の、同様の効果が得られた。
ブ物質として用いて実施例１と同様の操作を行った結
果、検出感度は実施例２と同じく10−6.5に落ちたもの
の、同様の効果が得られた。
以上、主としてMAの検出を例にとって本発明の説明を行
ったが、もちろんその他の化学物質すべてに応用可能な
一般的方法である。また、実施の手軽さから蛍光消光物
質として、ジニトロベンゼンの誘導体を用いたが、トリ
ニトロベンゼン、ニトロベンゼンであっても同様の効果
が得られることは容易に考えられる。
ったが、もちろんその他の化学物質すべてに応用可能な
一般的方法である。また、実施の手軽さから蛍光消光物
質として、ジニトロベンゼンの誘導体を用いたが、トリ
ニトロベンゼン、ニトロベンゼンであっても同様の効果
が得られることは容易に考えられる。
発明の効果 本発明によれば、従来５時間委常用していた免疫的検出
を１分以下に短縮することが可能となった。
を１分以下に短縮することが可能となった。
第１図は、本発明を実施した際の抗体の蛍光強度の時間
的変化を示すグラフ、第２図は各MA濃度における蛍光消
光阻害の変化を示したグラフである。
的変化を示すグラフ、第２図は各MA濃度における蛍光消
光阻害の変化を示したグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】目的検出物質と特異的に結合する抗体に一
切の化学的修飾を施さずに用い、当該抗体と結合する類
似物質と当該抗体を構成するアミノ酸より発する蛍光を
消光する機能を有した蛍光消光物質とが化学的に結合し
たプロープ物質を用い、あらかじめ抗体とプロープ物質
を混合することによって消光されていた抗体の蛍光が目
的検出物質の導入により増大する現象を用いた免疫的検
出方法。 - 【請求項２】蛍光を消光する機能を有した蛍光消光物質
が、ニトロベンゼン、ジニトロベンゼン、トリニトロベ
ンゼンまたはそれらの誘導体である特許請求の範囲第１
項記載の免疫的検出方法。 - 【請求項３】目的検出物質が、メタンフェタミン、アン
フェタミンあるいはエフェドリンである特許請求の範囲
第１項記載の免疫的検出方法。 - 【請求項４】抗体と結合する類似物質が以下の構造式を
有している特許請求の範囲第１項記載の免疫的検出方
法。 ただし、ｎは０もしくは１以上の正数、R1は水素原子も
しくは水酸基、R2は水素原子もしくはアルキル基、Ｘは
水素原子もしくはメトキシ基を表わすものとする。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63075447A JPH0737986B2 (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | 免疫的検出方法 |
| EP89105554A EP0343346B1 (en) | 1988-03-29 | 1989-03-29 | Fluorescence immunoassay method utilizing pseudo-antigens combined with fluorescent quenchers |
| DE68922879T DE68922879T2 (de) | 1988-03-29 | 1989-03-29 | Fluoreszenzimmunoassaymethode unter Verwendung von mit Fluoreszenzlöschern verknüpften Pseudoantigenen. |
| US07/830,442 US5229302A (en) | 1988-03-29 | 1992-02-03 | Fluorescence immunoassay method utilizing pseudo-antigens combined with fluorescent quenchers |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63075447A JPH0737986B2 (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | 免疫的検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01248062A JPH01248062A (ja) | 1989-10-03 |
| JPH0737986B2 true JPH0737986B2 (ja) | 1995-04-26 |
Family
ID=13576521
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63075447A Expired - Fee Related JPH0737986B2 (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | 免疫的検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0343346B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0737986B2 (ja) |
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| US7632929B2 (en) | 2000-04-20 | 2009-12-15 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Methamphetamine-like hapten compounds, linkers, carriers and compositions and uses thereof |
| US7202348B2 (en) * | 2000-04-20 | 2007-04-10 | The University Of Arkansas For Medical Sciences | Monoclonal antibody antagonists for treating medical problems associated with d-amphetamine-like drugs |
| WO2001081424A1 (en) * | 2000-04-20 | 2001-11-01 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Monoclonal antibody antagonists for treating medical problems associated with d-amphetamine-like drugs |
| US6669937B2 (en) * | 2000-04-20 | 2003-12-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Monoclonal antibody antagonists for treating medical problems associated with d-amphetamine-like drugs |
| ES2415655T3 (es) | 2006-06-15 | 2013-07-26 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Anticuerpos monoclonales que reconocen selectivamente Metanfetamina y compuestos similares a Metanfetamina |
| EP2140263B1 (en) | 2007-04-20 | 2017-01-04 | The Board of Trustees of The University of Arkansas | Hapten compounds and compositions and uses thereof |
| US9023353B2 (en) | 2013-03-13 | 2015-05-05 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Anti-(+)—methamphetamine monoclonal antibodies |
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| US4199559A (en) * | 1974-08-12 | 1980-04-22 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| GB1583869A (en) * | 1977-08-19 | 1981-02-04 | Technicon Instr | Competitive binding analysis by fluorescence |
| CA1084838A (en) * | 1977-06-10 | 1980-09-02 | Edwin F. Ullman | Quencher conjugated antifluorescer in fluorescent immonoassay |
| US4277437A (en) * | 1978-04-05 | 1981-07-07 | Syva Company | Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay |
| US4318707A (en) * | 1978-11-24 | 1982-03-09 | Syva Company | Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays |
| US4256834A (en) * | 1979-04-09 | 1981-03-17 | Syva Company | Fluorescent scavenger particle immunoassay |
| US4261968A (en) * | 1979-05-10 | 1981-04-14 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4419583A (en) * | 1980-05-31 | 1983-12-06 | Noeller Hans Guenter | Polarization fluoroimmunoassay with pulsed light source |
| US4654300A (en) * | 1982-04-02 | 1987-03-31 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Fluorescent microbead quenching assay |
| EP0150905A3 (en) * | 1984-01-05 | 1987-01-14 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Anti-idiotype assay using fluorescent energy transfer |
| FR2585836B1 (fr) * | 1985-08-02 | 1987-11-27 | Commissariat Energie Atomique | Procede homogene de detection et/ou de determination par luminescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir |
-
1988
- 1988-03-29 JP JP63075447A patent/JPH0737986B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-03-29 DE DE68922879T patent/DE68922879T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-29 EP EP89105554A patent/EP0343346B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0343346A1 (en) | 1989-11-29 |
| EP0343346B1 (en) | 1995-05-31 |
| DE68922879D1 (de) | 1995-07-06 |
| JPH01248062A (ja) | 1989-10-03 |
| DE68922879T2 (de) | 1995-12-14 |
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|---|---|---|---|
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