BE886575A - Derives de noyaux peptidiques cycliques, leur preparation et leur utilisation comme agents antifongiques - Google Patents

Description

  Cette invention concerne de nouveau.-. composés antifongiques semi-synthétiques que l'on prépare par acylation de noyaux peptidiques cycliques obtenus par désacylation enzymatique de l'antibiotique peptidique cyclique correspondant.

  
L'antibiotique peptidique cyclique est un composé antifongique ayant la formule générale :

  

 <EMI ID=1.1> 


  
 <EMI ID=2.1> 

  
comme la formule I, supposent que les amino-acides représentés sont en configuration L.

  
Les facteurs A, B, D et H de A-30912 sont des antibiotiques peptidiques cycliques de formule générale 1 où

  
 <EMI ID=3.1> 

  
Le facteur A de A-30912 a la formule I dans laquelle R<1>, R<3> et R4 sont tous OH et R<2> est H.

  
 <EMI ID=4.1> 

  
 <EMI ID=5.1>  

  
 <EMI ID=6.1> 

  
 <EMI ID=7.1> 

  
 <EMI ID=8.1> 

  
Chaque facteur est isolé du complexe A30912 qui contient les autres facteurs arbitrairement appelés facteurs B, C, D, E, F et G. Le complexe A-30912 et les facteurs A à G individuels sont décrits par M. Hoehn et K. Michel dans le-brevet des E.U.A. N[deg.] 4.024.245. Le facteur A de l'antibiotique A-30912 est identique à l'antibiotique A-22802 qui est décrit dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.024.246. Il a. également été trouvé que le facteur A est identique à

  
 <EMI ID=9.1> 

  
Chim. Acta, 57, 2459 (1974) et brevet suisse N[deg.] 568.386] et à l'antibiotique SL 7810/F [voir C. Keller-Juslen et al.

  
 <EMI ID=10.1> 

  
Le facteur A de l'antibiotique A-30912 est préparé par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ; (b) Asperqillus nidulans NRRL 8112 ;
(c) Asperqillus nidulans var . echinulatus A-32204, NRRL
3860 ; (d) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 ; ou (e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

  
On a également trouvé que le facteur B est identique

  
 <EMI ID=11.1> 

  
[voir le brevet belge N[deg.] 834.289].

  
On prépare le facteur B de l'antibiotique A-30912 par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus

  
 <EMI ID=12.1> 

  
A-32204, NRRL 3860 (c) Asperqillus rucjulosus NRRL 8039 ; ou
(d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 1440.

  
On a également trouvé que le facteur D est identique

  
 <EMI ID=13.1> 

  
Ilelv. Chim. Acta, 62, 1252 (1979)] et à l'antibiotique SL
7810/F-IJI Ivoir le brevet belge N[deg.] 834.2891.

  
On prépare le facteur D de l'antibiotique A-30912 par fermentation aérobie en immersion en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus

  
 <EMI ID=14.1> 

  
echinulatus A-32204, NRRL 3860 ; (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 (voir le brevet belge N[deg.] 834.289) ; ou (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

  
Le facteur H est un facteur de l'antibiotique A-30912 découvert plus tard, et il est décrit dans la demande de

  
 <EMI ID=15.1> 

  
ici par voie de référence.

  
Le facteur H de A-30912 est préparé par fermentation en utilisant l'un de plusieurs organismes différents, à savoir : (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ; ou (b) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

  
Une sous-culture de A. nidulans var. roseus a été déposée et fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Laboratory,

  
U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, où elle est disponible au public

  
sous le numéro NRRL 11440.

  
Quand on utilise une souche de A. nidulans var.

  
 <EMI ID=16.1> 

  
A-30912, on obtient un ensemble complexe de facteurs qui

  
pour des raisons de commodité est appelé complexe antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du complexe antibiotique A-42355, tandis que les facteurs B, D

  
et Il sont des facteurs mineurs. Les préparations 2 à 7 suivantes illustrent la préparation du complexe A-42355

  
et l'isolement et la purification des différents facteurs de A-30912.

  
Dans la molécule antibiotique de formule I, la chaîne latérale linoléoyle (R) est fixée au noyau peptidique cyclique sur le groupement a-amino du reste ornithine. On a trouvé de façon surprenante que la chaîne latérale linoléoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans modifier l'intégrité chimique du noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme de la famille Actinoplanaceae, de préférence le micro-organisme Actinoplancs utahensis NRRL 12052 ou un de ses variants. 

  
Pour effectuer la désacylation, on ajoute le facteur approprié de l'antibiotique A-30912 &#65533; une culture du micro-organisme

  
et on laisse la culture incuber avec le substrat jusqu'à ce que la désacylation soit pratiquement complète. Le noyau cyclique ainsi obtenu est séparé du bouillon de fermentation par des procédés connus dans le domaine. Au contraire des

  
 <EMI ID=17.1> 

  
cyclique (ne possédant pas la chaine latérale linoléoyle) est essentiellement exempt d'activité antifongique.

  
L'antibiotique S31794/F-1, qui est décrit dans la

  
 <EMI ID=18.1> 

  
et dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 4.173.629, est produit par Acrophialophora limonispora nov. spec. Dreyfuss et Muller NRRL 8095. S31794/F-1 a les caractéristiques suivantes :
p.f. 178-180[deg.]C (avec décomposition) (amorphe) ou 181-183[deg.]C

  
 <EMI ID=19.1> 

  
 <EMI ID=20.1> 

  
 <EMI ID=21.1> 

  
 <EMI ID=22.1> 

  
étalon interne) ayant les caractéristiques suivantes (à l'état cristallisé) :

  

 <EMI ID=23.1> 
 

  
 <EMI ID=24.1> 

  
matériau cristallisé pendant deux heures sous vide poussé à
100[deg.]C) comme suit : 55,5-56,5 % de carbone, 7,5-7,7 % d'hydrogène, 10,5-10,8 &#65533; d'azote et 25,5-26,0 % d'oxygène ; il est facilement soluble dans le méthanol, l'éthanol, la pyridine, le diméthylsulfoxyde et faiblement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique, le bonzène et l'hexane ; et a une activité antifongique, en particulier contre Candida albicans.

  
On prépare l'antibiotique S31794/F-1 par culture aérobic en immersion de Acrophialophora limonispora NRRL

  
8095 comme décrit dans les préparations 8 et 9. Ce microorganisme fait partie de la collection de cultures

  
permanentes du Northern Regional Research Center, U.S.

  
 <EMI ID=25.1> 

  
Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, où elle est disponible au public sous le numéro d'accès NRRL indiqué.

  
L'antibiotique S31794/F-1 a une activité antifongique, en particulier contre les souches Candida comme Candida albicans. Ainsi, la production et l'isolement de l'antibiotique peuvent être contrôlés par bioautographe en utilisant une espèce Candida comme Candida albicans.

  
f)ans la molécule de l'antibiotique S31794/F-1 <EMI ID=26.1> 

  
de façon surprenante que la chaîne latérale myristoyle peut être coupée du noyau par une enzyme sans nuire à l'intégrité chimique du noyau. L'enzyme utilisée pour effectuer la réaction de désacylation est produite par un micro-organisme

  
 <EMI ID=27.1> 

  
organisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052 ou un de ses variants. Pour effectuer la désacylation, on ajoute l'antibiotique S31794/F-1 à une culture du micro-organisme et on laisse la culture incuber avec le substrat jusqu'à ce que la désacylation soit pratiquement complète. Le noyau  <EMI ID=28.1> 

  
par des procèdes connus dans le domaine. Au contraire de l'antibiotique S31794/F-1, le noyau cyclique (ne présentant pas la chaîne latérale myristoyle) est essentiellement exempt d'activité antifongique.

  
Les noyaux peptidiques cycliques fournis par les réactions de désacylations enzymatiques susmentionnées des antibiotiques de formule I sont représentés par la formule générale II.

  

 <EMI ID=29.1> 


  
13 

  
Le composé de formule II où R , R et R sont tous des groupements hydroxy et R2est H est le noyau du facteur A de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau de A-30912A". Le noyau de A-30912A a une formule

  
 <EMI ID=30.1> 

  
de A-30912 et, pour des raisons de commodité, sera appelé ici "noyau de A-30912B". Le noyau de A-30912B a une formule

  
 <EMI ID=31.1>  

  
 <EMI ID=32.1> 

  
Le composé de formule II dans laquelle R , R et

  
 <EMI ID=33.1> 

  
S 31794/F-l et sera appelé ici "noyau de S 31794/F-l". Le

  
 <EMI ID=34.1> 

  
un poids moléculaire de 840,87.

  
L'enlèvement de la chaîne latérale fournit un

  
 <EMI ID=35.1> 

  
peptide cyclique. Comme le verra l'homme de l'art, les noyaux peuvent être obtenus sous la forme de l'amine libre ou sous la forme d'un sel d'addition d'acide . Bien que l'on puisse utiliser un quelconque sel d'addition d'acide approprié, on préfère ceux qui sont non toxiques et acceptables sur le plan pharmaceutique.

  
Le procédé de préparation de chaque noyau à partir de l'antibiotique approprié à l'aide d'une fermentation utilisant Actinoplanes utahensis NRRL 12052 est décrit dans la demande de brevet déposée le même jour que la présente demande de brevet sous le N[deg.]

  
Des cultures d'espèces représentatives d'Actino-

  
 <EMI ID=36.1> 

  
Régional Research Laboratory sous les numéros d'accès suivants :

  

 <EMI ID=37.1> 
 

  
L'efficacité d'une quelconque souche donnée de

  
 <EMI ID=38.1> 

  
pour La mise en oeuvre de la désacylation de cette invention est déterminée par le mode opératoire suivant. On inocule avec le micro-organisme un milieu de culture approprié. On

  
 <EMI ID=39.1> 

  
jours sur un agitateur rotatif. Puis on ajoute à la culture l'un des antibiotiques utilisés comme substrat. On maintient

  
 <EMI ID=40.1> 

  
la culture pour son activité en utilisant une analyse par Candida albicans. La perte de l'activité antibiotique est une indication que le micro-organisme a produit l'enzyme nécessaire pour la désacylation. Ceci doit cependant être vérifié en utilisant l'un des procédés suivants : 1) analyse

  
 <EMI ID=41.1> 

  
déterminer la présence du noyau intact ; ou 2) réacylation avec une chaîne latérale appropriée (par exemple linoléoyle,

  
 <EMI ID=42.1> 

  
On sait que d'autres substances antibiotiques

  
possèdent le môme noyau que celui de facteur A de l'antibiotique A-30912. Ces antibiotiques diffèrent du facteur A de l'antibiotique A-30912 en ce que des groupements acyle différents sont présents 3 la place du groupement linoléoyle
(R) de la formule I. De tels antibiotiques sont : (a) le facteur A de A-30912-tétrahydrogéné ( tétrahydro-SL 7810/F ;

  
 <EMI ID=43.1> 

  
un composant du complexe d'aculaécinc (préparée par fermentation en utilisant Aspergillus aculcatus NRRL 8075)

  
et est décrit dans le brevet des E.U.A. N[deg.] 3.978.210. Comme décrit dans le brevet belge N[deg.] 859.067, dans l'aculaêcine A, la chaîne latérale palmitoyle est présente à la place du groupement linoléoyle. Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur A de A-30912 par

  
 <EMI ID=44.1>   <EMI ID=45.1> 

  
en utilisant les modes opératoires décrits ici.

  
On sait également qu'une autre substance antibiotique possède le monte noyau que le facteur B de l'antibiotique A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur B de l'antibiotique A-30912 en ce qu'un groupement acyle différent est présent à la place du groupement linoléoyle R de la formule I, est le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-II ; tétrahydro échinocandine C) décrit par R. Traber et al., Helv.

  
 <EMI ID=46.1> 

  
 <EMI ID=47.1> 

  
groupement stéaroyle. Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné peut être prépare à partir du facteur B de A-30912 par

  
 <EMI ID=48.1> 

  
sous pression positive. Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné peut être utilisé comme substrat à la place du facteur B de l'antibiotique A-30912 pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.

  
On sait en outre qu'une autre substance antibiotique possède le même noyau que le facteur D de A-30912. Cette substance, qui diffère du facteur D de l'antibiotique

  
A-30912 en ce qu'un groupement acyle différent est présent à la place du groupement linoléoyle (R) de la formule I, est

  
 <EMI ID=49.1> 

  
 <EMI ID=50.1> 

  
R est un groupement stéaroyle. Le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut être préparé à partir du facteur D de l'antibiotique A-30912 par hydrogénation catalytique en

  
 <EMI ID=51.1> 

  
facteur D de A-30912 tétrahydrogéné peut être utilisé comme substrat à la place du facteur D de A-30912 antibiotique pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici.

  
Dans le facteur H de l'antibiotique A-30912, le  <EMI ID=52.1> 

  
le facteur A de l'antibiotique A-30912, le groupement 5hydroxy n'est pas substitué. On verra donc que l'on peut préparer le facteur H de façon synthétique en méthylant le facteur A selon des procédés classiques pour préparer un éther aliphatique à partir d'un alcool. On verra également quç le facteur A peut être alkylé avec d'autres groupements alkyle inférieur pour former des homologues à groupements alkyloxy de la molécule du facteur H. Les homologues à groupements alkyloxy du facteur H que l'on peut préparer par synthèse 3 partir du facteur A, sont connus sous le nom d'homologues du type facteur H de A-30912. Les composés de

  
 <EMI ID=53.1> 

  
un groupement alkyloxy en C2-C6 sont ici appelés comme les "noyaux du type A-30912H".

  
On verra également que la chaîne latérale linoléoyle

  
 <EMI ID=54.1> 

  
de A-30912 peut être hydrogénée selon des techniques classiques pour former le facteur H de A-30912 tétrahydrogéné ou le dérivé tétrahydrogéné correspondant des homologues à groupements alkyloxy (R est un groupement stéaroyle). On peut également préparer les dérivés tétrahydrogénés en hydrogénant d'abord le facteur A de l'antibiotique A-30912 pour obtenir le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné puis en formant le dérivé alkyloxy désiré.

  
Il est entendu que le facteur H de l'antibiotique

  
 <EMI ID=55.1> 

  
dérivé tétrahydrogéné d'un homologue du facteur H à groupement alkyloxy en C2-C6 peuvent être utilisés comme substrat pour la désacylation enzymatique en utilisant les modes opératoires décrits ici. 

  
 <EMI ID=56.1> 

  
demande décrit de nouveaux composés obtenus par acylation d'un noyau peptidique cyclique de formule II. Les composés de la présente invention ont la structure chimique décrite par la formule III :

  

 <EMI ID=57.1> 


  
 <EMI ID=58.1> 

  

 <EMI ID=59.1> 
 

  
dans lesquelles A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle ; A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle, sulfonyle ou -NH- ; X est un radical

  
 <EMI ID=60.1> 

  
carbamyle ou alkylcarbamyle en C.-C, ; X est un atome de chlore, de brome ou d'iode ; R 6 est un atome d'hydrogène ou

  
 <EMI ID=61.1> 

  
m, n et p valent 0 ou 1, mais si m = 0, n doit être égal à zéro ; pourvu que la somme des atomes de carbone des groupements R6 et W soit supérieure à 4 mais ne puisse pas dépasser 21 ; que, quand X est un groupement mercapto, A et A ne puissent pas être un groupement sulfinyle ou sulfonyle ; et que, quand A et A sont des groupements sulfinyle ou sulfonyle, ils soient dans des états d'oxydation égaux.

  
Un sous-groupe préféré de composés de formule III sont ceux où R1 a la formule (a) où m et n = 0, p = 1 et

  
 <EMI ID=62.1> 

  
L'Homme de l'art verra que, dans le noyau substitué du groupement R , la fonction

O

  
** 
-C-W-A - et la fonction -AR peuvent être placées sur le noyau benzène en position ortho, méta ou para l'une par rapport à l'autre. On préfère que.ces groupements soient en position para. Le substituant représenté par X peut être placé en une quelconque position disponible du noyau benzène non occupée par ces deux groupements.

  
Tels qu'utilisés ici, les termes "alkyle" ou "alcényle" désignent les chaînes hydrocarbonées ramifiées ou droites. Par "alcényle", on désigne un groupement hydrocarboné insaturé contenant une, deux ou trois doubles liaisons qui peuvent être en configuration cis ou trans.

  
 <EMI ID=63.1> 

  
préfère pour R6 pour les besoins de la présente invention sont :

  

 <EMI ID=64.1> 
 

  

 <EMI ID=65.1> 


  
indépendamment un entier de 0 à 15, pourvu

  
 <EMI ID=66.1> 

  
15 ou inférieure à 2.

  
 <EMI ID=67.1> 

  
 <EMI ID=68.1> 

  
sont :

  

 <EMI ID=69.1> 


  
 <EMI ID=70.1> 

  
sont les groupements W préférés pour les besoins de cette invention sont :

  

 <EMI ID=71.1> 


  
 <EMI ID=72.1> 

  
des groupements W préférés pour les besoins de cette invention, sont :

  

 <EMI ID=73.1> 


  
L'invention fournit en particulier un composé de formule :

  

 <EMI ID=74.1> 


  
 <EMI ID=75.1> 

  
 <EMI ID=76.1> 

  
H ou tous deux OH,

  
et

  
 <EMI ID=77.1> 

  
 <EMI ID=78.1> 

OH,

  
et

  
 <EMI ID=79.1> 

  

 <EMI ID=80.1> 
 

  

 <EMI ID=81.1> 


  
où A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle ; A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle, sulfonyle ou -NH-; X est un atome d'hydrogène ou

  
 <EMI ID=82.1> 

  
m, n et p sont 0 ou 1 mais si m = 0, n doit être égal à zéro ; pourvu : que la somme des atomes de carbone dans les groupements R6 et W soit supérieure à 4 mais ne puisse dépasser 21 ; que, quand X est un groupement mercapto, A et A1 ne puissent pas être des groupements sulfinyle ou sulfonyle ; et que, quand A et A1 sont des groupements sulfinyle ou sulfonyle, ils soient dans des états d'oxydation égaux.

  
Les composés de formule III inhibent la croissance des champignons pathogènes comme le montrent les modes opératoires d'essai biologique classiques. Les composés sont donc utilisables pour lutter contre la croissance des champignons sur les surfaces environnementales (en tant qu'antiseptiques) ou dans le traitement des infections provoquées par des champignons. L'activité antifongique des composés a été démontrée vis-à-vis de Candida albicans in vitro dans des essais de diffusion de disque sur plaque de gélose ou des essais de diffusion sur tube de gélose, ou dans des essais in vivo chez des souris infectées par C. albicans. Les composés sont donc particulièrement utilisables pour le traitement d'infections provoquées par des souches de C. albicans (candidose).

   Les composés de formule III ont également présenté une activité in vitro dans des essais de diffusion de disque sur plaque de gélose vis-à-vis de Tricophyton mentagrophytes, un organisme dermatophyte. On a également trouvé une activité dans les essais de diffusion de disque sur plaque de gélose in vitro vis-à-vis de Saccharomyces pastorianus et de Neurospora crassa. Certains composés (comme indiqué dans l'Exemple 24, Tableau 11) donnent des taux significatifs dans le sang après administration par voie orale chez les souris.

  
Quand on l'administre à un chien par administration intraveineuse à raison de 100 mg/kg par jour pendant cinq

  
 <EMI ID=83.1> 

  
(n-octyloxy)benzoyle, ne présente aucun signe extérieur de toxicité, bien que l'on observe des taux accrus en transaminase glutamo-pyruvique sérique.

  
On prépare les composés de formule III en acylant un noyau approprié sur le groupement a-amino de l'ornithine avec la chaîne latérale appropriée, en utilisant les procédés classiques dans le domaine pour la formation d'une liaison amide. L'acylation est généralement effectuée en faisant réagir le noyau avec un dérivé activé du composé substitué de formule IV (a) , (b) ou (c) , correspondant au

  
 <EMI ID=84.1> 

  

 <EMI ID=85.1> 
 

  
(A, A , W, m, n, p et R sont tels que définis précédemment).

  
Par l'expression "dérivé activé", on désigne un dérivé qui rend la fonction carboxy de l'agent d'acylation réactive à la copulation avec le groupement amino primaire pour former la liaison amide qui lie la chaîne latérale au noyau. Des dérivés activés appropriés, leurs procédés de préparation et leurs procédés d'utilisation comme agents d'.acylation d'une amine primaire sont connus de l'homme de l'art. Les dérivés activés préférés sont : (a) un halogénure d'acide (par exemple un chlorure d'acide), (b) un anhydride d'acide (par exemple un anhydride d'acide alcoxyformique

  
ou un anhydride d'acide aryloxyformique) ou (c) un ester

  
 <EMI ID=86.1> 

  
succinimide). D'autres procédés d'activation de la fonction carboxy comprennent la réaction de l'acide carboxylique avec un carbonyldiimide (par exemple le N,N'-dicyclohexylcarbo-

  
 <EMI ID=87.1> 

  
intermédiaire réactif qui, en raison de son instabilité, n'est pas isolé, la réaction avec t'amine primaire étant alors effectuée in situ.

  
Un procédé préféré de préparation des composés de formule III est le procédé par l'ester actif. On préfère

  
 <EMI ID=88.1> 

  
de l'acide correspondant à la chaîne latérale désirée
(formule IV) comme agent d'acylation. Dans ce procédé,

  
on fait réagir un excès de l'ester actif avec le noyau

  
à la température ambiante dans un solvant organique non réactif comme le diméthylformamide (DMF) . La durée de la réaction n'est pas déterminante, bien que l'on préfère une durée d'environ 24 à environ 120 heures. A la fin de la réaction, on enlève le solvant et on purifie le résidu par chromatographie, par exemple sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol, ou par chromatographie liquide sous pression élevée (CLPE) à phase inversée en utilisant une résine à

  
 <EMI ID=89.1> 

  
mélange d'eau, de méthanol et d'acétonitrile comme mélange solvant. 

  
On prépare commodément les esters 2,4,5-trichlorophényliques en traitant l'acide constituant la chaîne latérale (formule IV) par le 2,4,5-trichlorophénol en présence d'un agent de copulation, comme le N,N'-dicyclohexylcarbodiimide. D'autres procédés de préparation des esters actifs apparaîtront à l'homme de l'art.

  
Les acides substitués de formule IV et leurs dérivés activés sont des composés connus ou bien peuvent

  
être préparés à partir de composés connus par des procédés connus dans le domaine. Les acides benzoïques, phénylalkylcarboxyliques, phénylalcénylcarboxyliques, phénoxyalkylcarboxyliques, phénoxyalcénylcarboxyliques, phénylthioalkylcarboxyliques, phénylthioalcénylcarboxyliques, phénylsulfinylalkylcarboxyliques, phénylsulfinylalcénylcarboxyliques, phénylsulfonylalkylcarboxyliques, phénylsulfonylalcénylcarboxyliques, pyridinylcarboxyliques, pyridinylalkylcarboxyliques et pyridinylalcénylcarboxyliques de formule IV sont préparés par des modes opératoires similaires. Pour illustrer ces modes opératoires, on donne une description de

  
 <EMI ID=90.1> 

  
Les acides alcoxybenzolques ou alcényloxybenzoïques peuvent être commodément préparés à partir d'un acide hydroxybenzolque approprié en faisant réagir un

  
halogénure d'alkyle ou d'alcényle approprié avec le sel disodique de l'acide hydroxybenzolque approprié. Les acides

  
 <EMI ID=91.1> 

  
préparés commodément par traitement du diméthylthiocarbamate de S-(4-carbométhoxyphényle) substitué de façon appropriée de formule générale CH3C02C6H3XS(CO)N(CH3)2 par l'hydroxyde de sodium aqueux à 65-85 %, puis addition du bromure d'alkyle ou d'alcényle approprié et poursuite du chauffage pendant

  
2 à 4 heures. On peut préparer les diméthylthiocarbamates

  
de S-(4-carbométhoxyphényle) à partir des acides hydroxybenzolques appropriés par le procédé de M. Newman et H. Kanes, J. Orge Chem., 31, 3980 (1966).

  
Quand on désire préparer un composé de formule III où A est un groupement sulfinyle ou sulfonyle, on peut utiliser pour l'acylation du noyau le dérivé sulfoxyde ou sulfone approprié de l'acide (alcénylthio)- ou (alkylthio)benzoïque (formule IV). Les sulfoxydes ou sulfones appropriés peuvent être préparés par oxydation du thioéther correspondant, en utilisant des agents d'oxydation classiques, comme l'acide m-chloroperbenzolque, l'hypochlorite de t-butyle,

  
le métaperiodate de sodium ou le peroxyde d'hydrogène. Si une double liaison est présente dans le thioéther, il faut utiliser des conditions très modérées pour éviter l'époxydation. Si l'on utilise des quantités équimolaires des réactifs, le produit est un sulfoxyde (A est un groupement sulfinyle) que l'on oxyde facilement en sulfone

  
(A est un groupement sulfonyle) par une mole supplémentaire d'agent d'oxydation. Les acides hydroxybenzoïques et leurs dérivés substitués utilisés comme substances de départ dans les procédés décrits ici sont des composés connus ou bien ils peuvent être préparés par des procédés classiques connus dans le domaine.

  
Quand ils sont utilisés de façon systémique, la dose des composés de formule III variera selon le composé particulier que l'on utilise, la sévérité et la nature de l'infection et l'état physique du sujet que l'on traite. La thérapeutique doit être amorcée à de faibles doses, la

  
 <EMI ID=92.1> 

  
antifongique désiré. Les composés peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire par injection sous la forme d'une solution ou suspension aqueuse stérile à laquelle on peut ajouter, si on le désire, divers agents classiques pharmaceutiquement acceptables comme des agents

  
 <EMI ID=93.1> 

  
ou des agents de mise en suspension. D'autres additifs, comme du sel ou du glucose, peuvent être ajoutés pour rendre les solutions isotoniques. Les proportions et la nature

  
de ces additifs seront évidentes pour l'homme de l'art.

  
Certains composés de formule III donnent des taux dans le sang significatifs après administration orale (voir l'Exemple 24, Tableau 11) et peuvent être administrés de façon systémique par voie orale. Pour l'utilisation par voie orale, de tels composés peuvent être administrés en combinaison avec des supports ou excipients pharmaceutiquement acceptables, sous forme de capsules, comprimés ou poudres. La nature et la proportion de ces supports ou excipients sont bien connues de l'homme de l'art.

  
Quand on Les utilise pour traiter des infections vaginales dues à Candida, les composés de formule III peuvent être administrés en combinaison avec des excipients classiques pharmaceutiquement acceptables convenant pour l'utilisation intravaginale. Les compositions conçues pour l'administration intravaginale sont connues de l'homme de l'art. 

  
La préparation et l'utilisation des composés de la présente invention sont illustrées dans les exemples suivants :

  
Préparation 1

  
Fermentation d'Actinoplanes utahensis NRRL 12052

  
On prépare une culture mère d'Actinoplanes

  
 <EMI ID=94.1> 

  
inclinée de gélose. Le milieu utilisé pour préparer la culture inclinée est choisi parmi l'un des suivants :

  
Milieu A

  

 <EMI ID=95.1> 


  
 <EMI ID=96.1> 

  
le pli à 7,2 par addition de NaOH ; après passage à l'autoclave,

  
 <EMI ID=97.1> 

  
:: La solution minérale de Czapek a la composition suivante :

  

 <EMI ID=98.1> 


  
Milieu B
 <EMI ID=99.1> 
 
 <EMI ID=100.1> 
 <EMI ID=101.1> 

  
Jersey, U.S.A.

  
On inocule la culture inclinée avec Actinoplanes

  
 <EMI ID=102.1> 

  
à.30[deg.]C pendant environ 8 à 10 jours. On utilise à peu près  la moitié de la culture pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante : 

  

 <EMI ID=103.1> 


  
 <EMI ID=104.1> 

  
New York, U.S.A.

  
On fait incuber le milieu végétatif inoculé dans

  
 <EMI ID=105.1> 

  
pendant environ 72 heures sur un agitateur tournant sur un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

  
On peut utiliser ce milieu végétatif incubé directement pour inoculer un milieu végétatif de second stade. Ou bien et de préférence, on peut le conserver pour un usage ultérieur en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour une celle  conservation dans de nombreuses petites ampoules comme suit :
dans chaque ampoule, on place 2 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol et de lactose [voir W.A.

  
 <EMI ID=106.1> 

  
organisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10,
364-367 (1973) pour les détails]. Les suspensions ainsi préparées sont conservées dans là phase vapeur de l'azote liquide.

  
 <EMI ID=107.1> 

  
stade (ayant la composition décrite ci-avant). On fait incuber comme décrit précédemment le milieu végétatif de premier stade inoculé.

  
Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml du milieu végétatif de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de second stade ayant la même composition que le milieu végétatif de premier stade. On fait incuber le milieu de second stade dans un flacon Erlcnmeyer de 2 litres à large encolure à 30[deg.]C pendant

  
 <EMI ID=108.1> 

  
de diamètre à 250 tours par minute.

  
On utilise le milieu végétatif de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, pour inoculer
100 1 d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un

  
des suivants :

  
 <EMI ID=109.1> 

  

 <EMI ID=110.1> 


  
 <EMI ID=111.1> 

  
par passaqe à l'autoclave à 121[deg.]C pendant 45 minutes sous une pression d'environ 1,1 à 1,24 bar.

  
Milieu II
 <EMI ID=112.1> 
  <EMI ID=113.1> 

  
 <EMI ID=114.1> 

  
Milieu III

  

 <EMI ID=115.1> 


  
Stérilisé séparément et ajouté de façon aseptique

  
 <EMI ID=116.1> 

  
On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans une cuve de fermentation de 165 1 à une température d'environ 30[deg.]C pendant environ 42 heures. On agite le milieu de fermentation avec des agitateurs classiques à environ 200 tours par minute et on l'aère avec de l'air stérile pour maintenir le taux d'oxygène dissous supérieur à 30 % à la saturation par l'air à la pression atmosphérique.

  
Préparation 2

  
Préparation du mélange antibiotique A-42355

  
A. Fermentation en flacon agité

  
 <EMI ID=117.1> 

  
roseus NRRL 11440 et on la maintient sur une gélose inclinée de 18 x 150 ml, préparée avec un milieu ayant la composition suivante :

  

 <EMI ID=118.1> 
 

  

 <EMI ID=119.1> 


  
La culture inclinée est inoculée avec Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 puis on fait incuber la culture à 25[deg.]C pendant environ sept jours. On recouvre d'eau la,culture inclinée mûre et on la gratte avec une anse

  
stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile.

  
On utilise 1 ml de la culture inclinée en suspension pour inoculer 55 ml de milieu végétatif dans un flacon de

  
250 ml. Le milieu végétatif a la composition suivante :

  

 <EMI ID=120.1> 


  
 <EMI ID=121.1> 

  
On fait incuber le milieu végétatif inoculé à 25[deg.]C pendant 48 heures, à 250 tours par minute, sur un agitateur de type rotatif. Après 24 heures, on homogénéise le milieu pendant une minute à faible vitesse dans un mélangeur

  
 <EMI ID=122.1> 

  
les 24 heures restantes. Ou bien, on peut faire incuber le milieu végétatif inoculé pendant 48 heures puis l'homogénéiser pendant 15 secondes à faible vitesse.

  
Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour inoculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité ou pour inoculer un milieu végétatif de second stade. On peut également le conserver pour une utilisation ultérieure, en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour cette conservation dans de nombreuses petites ampoules, comme suit :

  
On mélange les cultures végétatives volume/volume avec une solution de suspension ayant la composition suivante:

  

 <EMI ID=123.1> 


  
On répartit les suspensions préparées dans de petits tubes stériles à bouchon vissé (4 ml par tube). On conserve ces tubes dans la phase vapeur de l'azote liquide.

  
On peut utiliser une suspension conservée ainsi préparée pour inoculer des cultures inclinées ou des milieux d'ensemencement liquides. On fait incuber les cultures inclinées à 25[deg.]C à la lumière pendant 7 jours.

  
B. Fermentation en réservoir

  
Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml de la culture végétative de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif de second stade ayant la même composition que celui du milieu végétatif. Le milieu de second stade est incubé dans un flacon Erlenmeyer à large ouverture de deux litres, à
25[deg.]C pendant 24 heures, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

  
Le milieu de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, est utilisé pour inoculer 100 litres d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants :

  
Milieu IV
 <EMI ID=124.1> 
 
 <EMI ID=125.1> 
(pH initial 6,8-7,0)

  
 <EMI ID=126.1> 

  
 <EMI ID=127.1> 

  
.:::::: N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.

U.S.A.

  
:::::::: P2000, Dow Corning, Midland, Michigan, U.S.A.

  
Milieu V

  

 <EMI ID=128.1> 


  
On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 165 1 à une température de 25*C pendant 7 jours. On aère le milieu de fermentation avec de 1[deg.]air stérile, en maintenant le niveau d'oxygène dissous

  
 <EMI ID=129.1> 

  
C. Milieu végétatif de troisième stade

  
Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus grands que ceux utilisés pour la fermentation par
100 litres, il est recommandé d'utiliser une culture végétative de troisième stade pour ensemencer le réservoir plus grand. Un milieu végétatif de troisième stade préféré a la composition suivante : 

  

 <EMI ID=130.1> 
 

  

 <EMI ID=131.1> 


  
Préparation 3

  
Séparation du mélange antibiotique A-42355

  
On agite soigneusement le bouillon de fermentation entier (4127 litres), obtenu par le procédé décrit dans l'Exemple 1 en utilisant le milieu de production II, avec
4280 litres de méthanol pendant une heure, puis on filtre, en utilisant un adjuvant de filtration (Hyflo Supercel, une terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.). On ajuste

  
 <EMI ID=132.1> 

  
filtrat acidifié deux fois avec des volumes égaux de

  
 <EMI ID=133.1> 

  
concentre sous vide jusqu'à un volume de 20 litres. On ajoute ce concentré à 200 litres d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355. On sépare le précipité par filtration et l'on obtient 2775 g du mélange A-42355 sous forme d'une poudre blanc gris.

  
Séparation et identification des facteurs de A-30912

  
Préparation 4

  
Séparation du facteur A de A-30912

  
On dissout 1 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 7 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit dans une colonne en verre de 3,7 cm de diamètre intérieur et de 35 cm de.longueur

  
 <EMI ID=134.1> 

  
sous faible pression de caractéristiques élevées) MichelMiller, Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ 08360] garnie de

  
 <EMI ID=135.1> 

  
microns), qui a été préparée comme décrit dans la Préparation  <EMI ID=136.1> 

  
Une pompe F.M.I. avec une conception de piston sans vannes
(débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le solvant dans la colonne à un débit de 9 ml/minute à 7 bars, des fractions étant recueillies toutes les minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé

  
d'une unité optique (ISCO Type 6) .

  
Préparation 5

  
Séparation du facteur B de A-30912

  
On sépare le mélange A-42355 comme décrit dans la Préparation 3, mais on chromatographie les extraits chloroformiques.concentrés (285 1) sur une colonne de gel de silice (150 1 de gel de silice Grace, qualité 62) à un débit de 2 1/minute. On lave la colonne avec 200 litres de chloroforme, on l'élue avec 500 litres d'acétonitrilë, puis on l'élue continuellement avec un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau à un débit de 1 1/minute. On recueille des fractions ayant un volume de 200 litres et on les analyse séparément pour déterminer leur activité biologique. L'analyse biologique est effectuée par une analyse sur disque de papier sur plaque de gélose, ensemencée par Candida albicans. On réunit les fractions 77 à 103 (1365 litres) et on les concentre sous vide. La solution concentrée (4,5 litres) contient un précipité qu'on enlève par filtration et l'on

  
 <EMI ID=137.1> 

  
concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprie de méthanol. On ajoute la solution méthanolique à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B. On sépare également ce précipité par filtration et on le sèche, et l'on obtient 24 g supplémentaires de mélange A-42355 enrichi de facteur B sous 'forme d'une poudre grise.

  
Le mélange A-42355 enrichi en facteur B ainsi obtenu  <EMI ID=138.1> 

  
la.Préparation 10, à l'aide du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, comme décrit dans la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 10 ml/ . minute à environ 7 bars, en utilisant une pompe FMI à piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les minutes. On

  
 <EMI ID=139.1> 

  
Préparation 15. On réunit les fractions 102-110 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui donne 22 mg du facteur B de A-30912.

  
Préparation 6

  
Isolement du facteur D de A-30912

  
On réunit et on chromatographie sur une colonne de

  
 <EMI ID=140.1> 

  
concentrés de deux essais de fermentation (3800 1 et 4007 1) obtenus par le procédé décrit dans la Préparation 3. On lave la colonne avec du chloroforme puis on élue avec de l'acétonitrile et un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau.'On recueille des fractions ayant un volume d'environ 200 1 et on les soumet 5 une analyse biologique sur disque de papier sur gélose ensemencée avec Candida albicans. On réunit les fractions actives (850 1) et on les concentre sous vide. On ajoute la

  
 <EMI ID=141.1> 

  
pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur D. On enlève ce précipité par fiitration et on le sèche, ce qui donne 32 g de mélange A-42355 enrichi en facteur D sous forme d'une poudre grise.

  
On dissout le mélange A-42355 enrichi en facteur D ainsi obtenu (1,0 g) dans 5 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. Oh filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (colonne Michel- <EMI ID=142.1> 

  
1 ' intermédiaire d'une boucle à l'aida d'un système à vannes.

  
La colonne a été garnie de résine à phase inversée de gel de

  
 <EMI ID=143.1> 

  
Préparation 10. Le garnissage a été effectué dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, selon le mode opératoire de garnissage de la Préparation ! ! . Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 3,1 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les 2 minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 2.80 nm comme décrit dans la Préparation 4. On réunit les fractions 96-108 et on les concentra sous vide pour obtenir une huile. On dissout cette huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 89 mg du facteur D de A-30912.

  
Préparation 7

  
 <EMI ID=144.1> 

  
On dissout 5,0 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 35 ml du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, on filtre la solution résultante et on l'introduit sur une colonne de verre de 3,7 cm de diamètre intérieur x 42 cm
(colonne Michel-Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système de vannes. La colonne est garnie de

  
 <EMI ID=145.1> 

  
microns) (Préparation 10) dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme décrit dans la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 13 ml/ minute à environ 8,3 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes, et l'on recueille une fraction toutes les deux minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans la Préparation 19, paragraphe C. On réunit les fractions 112-132 avec les fractions 106-117 d'une seconde purification similaire. Les fractions réunies sont concentrées sous vide jusqu'à une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 173 mg du facteur H brut de A-30912. 

  
 <EMI ID=146.1> 

  
réintroduit sur une colonne de verre de 2,0 cm de diamètre intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 5,5 bars, et on recueille une fraction toutes les 3 minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm. On réunit les fractions 17 et 18 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout 1 'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 29 mg du facteur il de A-30912. Identification des facteurs de A-30912

  
Les différents facteurs de A-30912 peuvent être identifie* par chromatographie sur couche mince (CCM) . Les Rf

  
 <EMI ID=147.1> 

  
silice (Merck, Darmstadt) ,un système solvant 7:3 de benzène et de méthanol et un bioautographe par Candida albicans sont indiqués dans le Tableau VII.

TABLEAU VII

  

 <EMI ID=148.1> 


  
Les Rf approximatifs des facteurs A, B, C, D et H de A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant une

  
 <EMI ID=149.1> 

  
Darmstadt, 20 x 20 cm) et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau VIII. 

  
 <EMI ID=150.1> 

  

 <EMI ID=151.1> 


  
Systèmes solvants

  

 <EMI ID=152.1> 


  
On peut également identifier les facteurs A, B, D et H de A-30912, par chromatoqraphie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées (CLPFCE) analytique, dans les conditions suivantes :

  

 <EMI ID=153.1> 
 

  

 <EMI ID=154.1> 


  
Les durée':; de rétention approximatives pour les facteurs A, B, D et Il de A-309L2 dans ces conditions sont résumées dans le Tableau IX.

TABLEAU IX

  

 <EMI ID=155.1> 

Préparation 8

  
Préparation de l'antibiotique S31794/F-1

  
On produit l'antibiotique S31794/F-1 par culture en immersion d'Acrophialophora limonispora NRRL 8095, en agitant, remuant et/ou aérant à pH 3-8, de préférence 5-7,

  
 <EMI ID=156.1> 

  
heures, de préférence pendant 120 à 288 heures.

  
On isole l'antibiotique S31794/F-1 par traitement du bouillon de culture (90 L) avec un mélange 4:1 (90 L) d'acétate d'éthyle et d'isopropanol et en homogénéisant pendant 30 minutes à la température ambiante. On sépare la phase organique et on l'évapore sous vide à environ 40[deg.]C. On chromatographie le résidu ainsi obtenu sur environ dix fois sa quantité de gel de silice, en utilisant des mélanges de chloroforme et de méthanol (95;5 à 60:40). On réunit les fractions qui ont une activité antifongique et on les chromatographie sur 100 fois leur quantité de "Sephadex LH-20" avec du méthanol. Les fractions provenant de la colonne de Sephadex et qui ont une activité antifongique sont réunies et rechromatographiées sur 100 fois leur quantité de gel de silice (0,05-0,2 mm) avec un système solvant
71:25:4 de chloroforme, de méthanol et d'eau.

   Les fractions éluées qui ont une activité antifongique sont réunies et évaporées sous vide pour obtenir l'antibiotique brut S31794/F-1. On dissout ce produit dans de petites quantités de méthanol et on le précipite avec de l'éther diéthylique pour obtenir S31794/F-1 sous forme d'une poudre amorphe

  
 <EMI ID=157.1>   <EMI ID=158.1> 

  
Préparation 9

  
Séparation de l'antibiotique S31794/F-I

  
On introduit l'antibiotique S31794/F-1 brut, obtenu comme décrit dans la Préparation 8 après chromatographie sur Sephadex, sur une colonne de gel de silice (colonne MichelMiller) par l'intermédiaire d'une boucle 3 l'aide d'un système à vannes. On utilise le mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11. On déplace le solvant dans la colonne en utilisant une pompe FMI avec une conception de piston sans vannes. On contrôle l'élution de l'antibiotique en utilisant un appareil de contrôle UV à

  
280 nm comme dans la Préparation 22. On réunit les fractions ayant une activité antifongique et on les concentre sous

  
vide pour obtenir l'antibiotique S31794/F-1.

  
S31794/F-1 a les Rf suivants par chromatographie

  
 <EMI ID=159.1> 

  

 <EMI ID=160.1> 


  
S31794/F-1 peut également être détecté par de la vapeur d'iode.

  
Préparation 10

  
Préparation de la résine 3 phase inversée de gel de.silice/

  
C18

  
Etape 1 : Hydrolyse

  
On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (Quantum Corp., maintenant Whatman) à un mélange de 1650 ml d'acide sulfurique concentré et de 1650 ml d'acide nitrique concentré dans un ballon à fond rond de 5 1 et on agite pour obtenir une suspension appropriée. On chauffe le mélange sur un bain de vapeur pendant une nuit (16 heures) avec un réfrigérant  <EMI ID=161.1> 

  
Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans un ballon à fond rond et mis en suspension dans 3,5 1  de toluène. On chauffe le ballon au bain de vapeur pendant deux heures pour chasser toute l'eau résiduelle par

  
 <EMI ID=162.1> 

  
trichlorosilane (Aldrich Chemical Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pendant une nuit (16 heures) avec une lente agitation mécanique à 60[deg.]C. On prend soin d'éviter que l'agitateur ne soit trop près de la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage des particules de gel de silice.

  
On laisse le mélange refroidir. On recueille le gel de silice silanisé, on le lave avec 3 1 de toluène et 3 1 d'acétone, puis on le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures). On met le gel de silice séché en suspension dans 3,5 1 d'un mélange 1:1 d'acé tonitrile et d'eau dans un ballon de 5 1, on agite soigneusement à la température ambiante pendant deux heures, on filtre, on lave avec 3 1 d'acétone et on sèche à l'air pendant une nuit.

  
Etape 3 : Deuxième silylation

  
On répète le mode opératoire de la première

  
 <EMI ID=163.1> 

  
chauffe la suspension à reflux à 60[deg.]C pendant deux heures, tout en agitant soigneusement. On recueille le produit final

  
 <EMI ID=164.1> 

  
 <EMI ID=165.1> 

  
(16-20 heures).

  
Préparation 11

  
Mode opératoire de garnissage en suspension pour les colonnes Michel-Miller Renseignements généraux

  
 <EMI ID=166.1> 

  
des débits compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette technique de garnissage en suspension ; ceci dépend du volume et des dimensions de la colonne. La pression de garnissage doit être supérieure à la pression utilisée pendant la séparation réelle de 2 à 3,5 bars ; ceci assure qu'il ne se produit pas de tassement ultérieur de l'adsorbant pendant les séparations.

  
Une diminution soudaine de la pression peut provoquer des craquelures ou des canaux dans le matériau de garnissage, ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. Il est donc important de laisser la pression descendre lentement jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe.

  
Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre

  
 <EMI ID=167.1> 

  
5795-10, 110 ml ; 5795-16, 300 ml ; 5795-24, 635 ml ; et 5796-
34, 34 ml.

  
Le temps nécessaire pour garnir une colonne en verre peut varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimension de la colonne et l'expérience de l'opérateur. Etapes :

  
1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par un accouplement (le volume de la colonne réservoir doit être deux fois celui de la colonne). Placer les deux colonnes verticalement avec la colonne réservoir au-dessus.

  
2. Peser le matériau de garnissage (100 g pour 200 ml de colonne).

  
3. Ajouter environ 5 volumes de solvant au matériau de garnissage ; utiliser un mélange de:.70-80 % de méthanol et de 20-
30 % d'eau.

  
4. Bien agiter jusqu'à ce que toutes les particules soient mouillées, laisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour assurer une imprégnation complète des particules par le solvant. Décanter la liqueur surnageante.

  
5. Délayer la résine avec suffisamment de solvant pour

  
 <EMI ID=168.1> 

  
réservoir. La colonne doit être prêremplie avec le même solvant et la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant avant de verser la suspension.

  
L'utilisation de volumes de suspension plus grands peut également donner de bons résultats ; cependant, ceci nécessite
(a) un réservoir plus grand ou (b) plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de garnissage.

  
6. Fermer le réservoir avec le bouchon de Teflon en-dessous

  
 <EMI ID=169.1> 

  
N[deg.] 4.131.547, bouchon N[deg.] 3) ; relier à la pompe ; et commencer immédiatement le pompage du solvant dans les dispositifs au débit maximum si l'on utilise une pompe.Ace Cat..No. 13625-25, ou un système de distribution de solvant similaire (20 ml/minute).

  
7. Continuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement remplie de l'adsorbant. La pression ne doit pas dépasser la tolérance maximale de la colonne pendant cette opération

  
 <EMI ID=170.1> 

  
colonnes analytiques). Dans la plupart des cas, des pressions inférieures 3 14 bars seront suffisantes.

  
 <EMI ID=171.1> 

  
le débit et la pression diminuera.

  
9. Après remplissage de la colonne par l'adsorbant, arrêter

  
la pompe ; laisser la pression tomber à zéro ; débrancher le réservoir ; remplacer le réservoir par une pré-colonne ; remplir la pré-colonne de solvant et d'une petite quantité

  
 <EMI ID=172.1> 

  
la colonne soit complètement garnie. Pour une information supplémentaire, voir le mode opératoire général. Toujours laisser la pression descendre lentement après arrêt de la pompe ; ceci empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux préférentiels dans le matériau de garnissage.

  
10. Supprimer la pression et débrancher soigneusement la pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques millimètres (2-4) de garnissage au sommet de la colonne ; placer 1 ou 2 filtres au sommet de la colonne ; appuyer  <EMI ID=173.1> 

  
introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par la paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse davantage. Si le matériau de garnissage doit continuer à se déposer (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions importantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée.

  
Préparation 12

  
Préparation du noyau de A-30912A

  
 <EMI ID=174.1> 

  
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de culture inclinée A et le milieu de production I et en faisant incuber le milieu de production pendant environ 42 heures.

  
On ajoute au milieu de fermentation une quantité de facteur A de A-30912 (340 g de substrat brut qui contient environ

  
 <EMI ID=175.1> 

  
d'éthanol). On contrôle la désacylation du facteur A de A-
30912 par titrage vis-â-vis de Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à désacylation complète

  
 <EMI ID=176.1> 

  
albicans.

  
B. Séparation du noyau de A-30912A

  
On filtre le bouillon de fermentation entier (100 litres), obtenu comme décrit dans le paragraphe A et contenant le noyau provenant d'environ 20 g de facteur A de A-30912.

  
On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu (environ 93 1) sur une colonne contenant 4,5 1 de résine HP (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) à un débit de 200 ml/minute. On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes (volume de colonne) d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage.

  
Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de  <EMI ID=177.1> 

  
chaque fraction éluée. On concentre l'une de ces parties jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont testés pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de 

  
 <EMI ID=178.1> 

  
A-30912A, sous vide jusqu' à un petit volume, et on lyophilise pour obtenir environ 97 g du noyau brut.

  
C. Purification du noyau de A-30912A par chromatographie

  
liquide sur phase inversée

  
On dissout 25 g du noyau de A-30912A brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe C, dans 300 ml d'un mélange
96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile; d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne d'acier inoxydable de 4 1 (8 cm x 80 cm) remplie de Lichroprep

  
 <EMI ID=179.1> 

  
Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal.,91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumention

  
 <EMI ID=180.1> 

  
avec une unité optique (ISCO Type 6). On recueille par minute des fractions ayant un volume d'environ 500 ml.

  
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912A, on les évapore sous vide et on les lyophilise; ce qui donne 2,6 g du noyau. La quantité de solvant nécessaire pour achever ce mode opératoire de séparation chromatographique varie de 7 à 8 1. D. Caractéristiques du noyau de A-30912A <EMI ID=181.1>  (b) poids moléculaire : 797,83.
(c) solide amorphe blanc, soluble dans l'eau, le <EMI ID=182.1> 

  
méthanol ; insoluble dans le chloroforme, le toluène et l'éther diéthylique.

  
(d) Spectre d'absorption infrarouge (pastille de

  
KBr)

  
présente des maximas d'absorption à :

  
3340 large (OU, liaison hydrogène) 2970, 2930 et 2890

  
 <EMI ID=183.1> 

  
1660 et 1625 (plusieurs groupements carbonyle C=0) ; 1510-
1550 ; 1430-1450 (déformation de CH "wag"), 1310-1340 ; 1230-

  
 <EMI ID=184.1>  <EMI ID=185.1>  formamide aqueux à 66 % indique la présence

  
 <EMI ID=186.1> 

  
7,35 (pH initial 7,32) .

  
(f) durée de rétention en chromatographie liquide sous pression élevée (K') : 11,52 minutes dans les conditions suivantes :

  
Colonne : 4 x 300 mm

  
 <EMI ID=187.1> 

  
Solvant : mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium, d'acétonitrile et d'eau

  
Débit: 3 ml/minute

  
Pression : 172,5 bars

  
Détecteur : UV à longueur d'onde variable,

  
 <EMI ID=188.1> 

  
Sensibilité : 0-0,4 A.U.F.S.

  
préparation 13

  
On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de la Préparation 12, mais on utilise comme substrat A-30912A tétrahydrogéné.

  
Préparation 14

  
On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie

  
par le procédé de la Préparation 12 mais en utilisant comme substrat l'aculéacine A. 

  
Préparation 15

  
 <EMI ID=189.1> 

  
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après incubation de la culture pendant environ
48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur B

  
 <EMI ID=190.1> 

  
On contrôle la désacylation du facteur B de A-
30912 par essai sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.

  
B. Séparation du noyau de A-30912B

  
On filtre le bouillon de fermentation ainsi obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau

  
 <EMI ID=191.1> 

  
résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution selon le mode opératoire suivant : on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide comme le chlorure

  
de myristoyle. Ce produit et l'autre partie non traitée sont titrés pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912B. On concentre l'éluat contenant le

  
noyau de A-30912B sous vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

  
C. Purification du noyau de A-30912B par chromatographie

  
liquide à phase inversée

  
On dissout le noyau de A-30912B brut, obtenu comme  <EMI ID=192.1> 

  
Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-
18 rue du Canal, Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml par minute, en utilisant le même solvant.

  
 <EMI ID=193.1> 

  
de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Supcrior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6).

  
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912B, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912B purifié.

  
Préparation 16

  
On prépare le noyau de A-30912B et on le purifie par le procédé de la Préparation 15, mais on utilise comme substrat A-30912B tétrahydrogéné.

  
Préparation 17

  
Préparation du noyau de A-30912D

  
A. DcsacylaLion du facteur D de A-30912

  
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation i, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur D de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

  
On contrôle la désacylation du facteur D de . A-30912 par essai sur disque de papier vis-â-vis de Candida albicans ou de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.

  
B. Séparation du noyau de A-30912D

  
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe À. On rejette le gâteau  <EMI ID=194.1> 

  
poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu.

  
Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant :
on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée... On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie non traitée pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912D. L'éluat contenant le noyau

  
de A-30912D est concentré sous vide jusqu'à un petit volume et lyophilisé pour obtenir le noyau brut.

  
C. Purification du noyau de A-30912D par chromatographie

  
liquide en phase inversée

  
On dissout dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine le noyau de A-30912D brut obtenu comme.décrit dans le paragraphe C. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon,
16-18 rue du Canal; 91160 Long jumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, ce qui donne un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le

  
 <EMI ID=195.1> 

  
un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Modél UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) avec une unité optique (ISCO Type 6).

  
En se basant sur l'absorption à 280 nm, on combine les fractions contenant le noyau de A-30912D, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912D purifié.

Préparation 18

  
On prépare le noyau de A-30912D et on le purifie par le procédé de la Préparation 17, mais on utilise comme

  
 <EMI ID=196.1> 

  
Préparation 19

  
Préparation du noyau de A-30912H

  
A:, Désacylation du facteur H de l'antibiotique A-30912

  
On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de  production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur H de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

  
On contrôle la désacylation du facteur H de A-30912 par une analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.

  
 <EMI ID=197.1> 

  
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). Oh rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la

  
 <EMI ID=198.1> 

  
contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant :  on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction élude. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite avec un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On détermine l'activité de ce produit et de l'autre partie aliquote non traitée vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-3091211. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-30912H sous vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

  
 <EMI ID=199.1> 

  
liquide en phase inversée

  
On dissout le noyau de A-30912H brut, obtenu

  
comme décrit dans le paragraphe C, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de  Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon,

  
16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner

  
la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant.

  
On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil

  
de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5,  Instrumentation Specialtiès Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6).

  
Préparation 20

  
On prépare le noyau de A-30912H et on le purifie

  
par le procédé de la Préparation 19 mais on utilise comme substrat A-30912H tétrahydrogéné.

  
Préparation 21

  
Préparation du noyau S31794/F-1

  
A. Désacylation de l'antibiotique S31794/F-1

  
On effectue une fermentation de A. utahensis comme  décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation l'antibiotique S31794/F-1 dissous dans une petite quantité

  
de méthanol.

  
On contrôle la désacylation de S31794/F-1 par

  
analyse avec disque de papier vis-à-vis de Candida albicans.

  
On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.

  
 <EMI ID=200.1> 

  
On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien, on fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine IIP-20 (polymère

  
très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. On lave ensuite la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pli 6,5-7,5 pour chasser le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant :
on prélève deux parties aliquotes à partir de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On titre ce produit et l'autre partie aliquote non traitée pour déterminer leur activité vis-à-vis de Candida albicans.

   Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de S31794/F-1. On

  
 <EMI ID=201.1> 

  
jusqu'à un petit volume, et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

  
C. Purification du noyau de S31794/F-1 par chromatographie

  
liquide en phase inversée

  
On dissout dans un mélange 96:2:1:1 d'eau,

  
 <EMI ID=202.1> 

  
S31794/F-I brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B.

  
On chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon,
16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne ) une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 5) .

  
En se basant sur 1 Absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de S31794/F-1, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de S31794/F-1 purifié.

  
Préparation 22

  
Préparation de A-30912A tétrahydrogéné

  
On dissout le facteur A de A-30912 dans l'éthanol.

  
 <EMI ID=203.1> 

  
utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur A de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912A té tr ahydrogéné .

  
Préparation 23

  
Préparation de A-30912B tétrahydrogéné

  
On dissout dans l'ëthanol le facteur B de A-30912.

  
 <EMI ID=204.1> 

  
platine que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur B de A-30912 par hydrogénation sous pression-positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée

  
 <EMI ID=205.1> 

  
on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir A-30912B tétrahydrogéné.

  
Préparation 24

  
 <EMI ID=206.1> 

  
On dissout dans de l'éthanol le facteur D de

  
 <EMI ID=207.1> 

  
Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur D de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée
(environ 2 à 3 heures) . On filtre le mélange réactionnel et  <EMI ID=208.1> 

  
Préparation 25

  
 <EMI ID=209.1> 

  
On dissout le facteur H de A-30912 dans de l'éthanol. On réduit Pt02 dans l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire par voie catalytique le facteur H de A-30912, par hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée
(environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel

  
et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une

  
 <EMI ID=210.1>  

Préparation 26

  
La préparation des acides de formule IV est exemplifiée par les composés des Tableaux 1 à 7 ci-dessous qui donnent la préparation de divers acides alcoxybenzoïques, acides (alkylthio)benzoiques, acides alcoxy-

  
 <EMI ID=211.1> 

  
alcoxycinnamiques, acides alcoxyphénoxyacêtiques et acides alcoxynicotiniques.

  
La préparation de ces acides de formule IV est

  
 <EMI ID=212.1> 

  
du Tableau 1 et des acides (alkylthio)benzolques du Tableau

  
2. Le mode opératoire géhéral pour la préparation de ces acides est décrit dans les paragraphes suivants.

  
 <EMI ID=213.1> 

  
On ajoute un équivalent du bromure d'alkyle à la solution

  
 <EMI ID=214.1> 

  
après quoi on la verse dans un grand volume (600 ml) d'eau et on l'acidifie avec de l'acide chlorhydrique. On recueille par filtration et on cristallise dans le méthanol l'acide alcoxybenzolque qui précipite de la solution.

  
Les acides (alkylthio)benzoIques du Tableau 2 sont préparés selon le mode opératoire général suivant :

  
A une suspension d'hydrure de sodium (un équivalent, dispersion à 50 % dans de l'huile minérale) dans du DMF (100 ml

  
pour 50 mmoles), refroidie à 0[deg.]C, on ajoute lentement un équivalent de 2-hydroxybenzoate de méthyle. On agite le mélange réactionnel sous atmosphère d'azote jusqu'à ce que le dégagement d'hydrogène s'arrête. A la solution de 4carbométhoxyphénolate de sodium ainsi obtenue, on ajoute du chlorure de N,N-diméthylthiocarbamoyle [(CH3)2N(CS)Cl]

  
(un équivalent) en une fois. On chauffe la suspension résultante à 70[deg.]C pendant 1-3 heures puis on la verse dans

  
 <EMI ID=215.1> 

  
grand excès). On extrait la suspension deux fois avec un  <EMI ID=216.1> 

  
séchage sur sulfate de magnésium, on filtre les extraits organiques et on les évapore jusqu'à une huile. On purifie

  
 <EMI ID=217.1> 

  
produit sous atmosphère d'azote à 220[deg.]C pendant 30 à 60 minutes pour obtenir le diméthylthiocarbamate de S-(4-

  
 <EMI ID=218.1> 

  
cristallise dans le méthanol. Au diméthylthiocarbamate de S-(4-carbométhoxyphényle), dissous dans le DMSO&#65533; on ajoute 2 équivalents.d'hydroxyde de sodium (solution aqueuse à

  
 <EMI ID=219.1> 

  
bromure d'alkyle (1 équivalent). On poursuit le chauffage pendant 2 à 4 heures après quoi on verse le mélange dans un grand volume d'eau. Par acidification, il se forme un précipité que l'on recueille par filtration. On cristallise l'acide (alkylthio)benzolque dans le méthanol. 

  

 <EMI ID=220.1> 


  

 <EMI ID=221.1> 
 

  

 <EMI ID=222.1> 


  

 <EMI ID=223.1> 
 

  

 <EMI ID=224.1> 


  

 <EMI ID=225.1> 
 

  

 <EMI ID=226.1> 


  

 <EMI ID=227.1> 
 

  

 <EMI ID=228.1> 


  

 <EMI ID=229.1> 
 

  

 <EMI ID=230.1> 


  

 <EMI ID=231.1> 
 

  

 <EMI ID=232.1> 


  

 <EMI ID=233.1> 
 

  

 <EMI ID=234.1> 


  

 <EMI ID=235.1> 
 

  
Préparation 27

  
 <EMI ID=236.1> 

  
des acides de formule IV, y compris les acides alcoxybenzoïques et les acides alkylthiobenzoiques selon le même mode opératoire général. Le Tableau 8 ci-dessous donne la

  
 <EMI ID=237.1> 

  
certain nombre d'acides de formule IV, y compris les acides alcoxybenzolques du Tableau 1 et les acides (alkylthio)benzoïques du Tableau 2. Les composés décrits dans le Tableau 3 sont préparés selon le même mode opératoire général. Le mode opératoire suivant est donné à titre illustratif :

  
 <EMI ID=238.1> 

  
d'acide alcoxybenzolque ou d'acide (alkylthio)benzolque, 1,1 mole.de 2,4,5-trichlorophénol et 1 mole de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 15-18 heures, après quoi on le filtre. On évapore le filtrat à siccité sous pression réduite et on cristallise le résidu dans un mélange d'acétonitrile et d'eau. On sèche le produit sous vide. 

  

 <EMI ID=239.1> 


  

 <EMI ID=240.1> 


  

 <EMI ID=241.1> 
 

  

 <EMI ID=242.1> 


  

 <EMI ID=243.1> 
 

  

 <EMI ID=244.1> 


  

 <EMI ID=245.1> 
 

  

 <EMI ID=246.1> 


  

 <EMI ID=247.1> 


  

 <EMI ID=248.1> 
 

  
EXEMPLE 1

  
Préparation des dérivés de A-30912A

  
Le Tableau 9 ci-dessous donne la préparation des dérivés du noyau de A-30912A préparés à partir des esters 2,4,5-trichlorophény liques du Tableau 8. On prépare les dérivés du noyau de A-30912, indiqués dans le Tableau 9, en général selon le mode opératoire suivant :

  
Au noyau de A-30912A dissous dans 10 à 50 ml de

  
 <EMI ID=249.1> 

  
alcoxybenzoïque ou de l'acide (alkylthio)benzoique (rapport molaire 1:2). On agite le mélange réactionnel pendant 15 à
18 heures, après quoi on l'amène à siccité pour obtenir un résidu. On lave le résidu deux fois avec un mélange d'éther diéthylique (50 ml) et de chlorure de méthylène (50 ml). On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu résultant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une colonne de

  
 <EMI ID=250.1> 

  
système solvant susmentionné comme éluant. On contrôle les fractions de la chromatographie par CCM sur gel de silice
(Merck) en utilisant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on chasse le solvant pour obtenir le produit sous forme d'un résidu. On peut analyser le produit par CLPE â phase inversée comme suit : pour les composés à groupement alcoxy et pour les

  
 <EMI ID=251.1> 

  
l'échantillon dans un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On injecte la solution d'échantillon (1 mg/ml) dans une colonne en acier

  
 <EMI ID=252.1> 

  
Bondapak (Waters Associates, Milford, Mass., U.S.A.), et

  
on élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile.

  
 <EMI ID=253.1> 

  
système solvant est un mélange 2:1:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 103,5 bars avec un débit de 30 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600A (Waters Associâtes, Inc.) et une vitesse du papier de 0,5 cm/minute. On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm. Les produits peuvent également être analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ (MSDC). 

  

 <EMI ID=254.1> 


  

 <EMI ID=255.1> 
 

  

 <EMI ID=256.1> 


  

 <EMI ID=257.1> 
 

  

 <EMI ID=258.1> 


  

 <EMI ID=259.1> 
 

  

 <EMI ID=260.1> 


  

 <EMI ID=261.1> 
 

  

 <EMI ID=262.1> 


  

 <EMI ID=263.1> 


  

 <EMI ID=264.1> 
 

EXEMPLE 2

  
Préparation des dérivés de A-30912B

  
On prépare les dérivés du noyau de A-30912B en

  
 <EMI ID=265.1> 

  
décrits dans la Préparation 27, selon le mode opératoire suivant :

  
Au noyau de A-30912B dissous dans 10 à 50 ml de

  
 <EMI ID=266.1> 

  
alcoxybenzoique ou de l'acide (alkylthio)benzoique (rapport

  
 <EMI ID=267.1> 

  
heures, après quoi on l'amène à siccité pour obtenir un résidu. On lave le résidu (deux fois chaque) avec un

  
 <EMI ID=268.1> 

  
de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu restant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une

  
 <EMI ID=269.1> 

  
 <EMI ID=270.1> 

  
contrôle les fractions de la chromatographie par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on chasse le solvant pour obtenir le produit sous forme d'un résidu. Le produit peut être analysé par CLPE à phase inversée comme suit : dans les composés à groupement alcoxy

  
 <EMI ID=271.1> 

  
dissout l'échantillon dans un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On injecte la solution d'échantillon (1 mg/ml) dans une colonne en acier

  
 <EMI ID=272.1> 

  
Bondapak (Waters Associates Inc.) et on élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Pour les composés à groupement

  
 <EMI ID=273.1> 

  
2:1:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 103,5 bars à un débit de 3 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600 A (Waters Associates, Inc.) et une vitesse de papier de 0,5 cm/minute. 

  
On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm. Les produits peuvent également être analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ (MSDC).

  
En suivant ce mode opératoire général, on obtient

  
 <EMI ID=274.1> 

  
34 5

  
deux H, R et R sont tous deux OH et R est :

  
 <EMI ID=275.1> 

  
6-(n-octyloxy)nicotinoyle

  
6-(n-dodécyloxy)nicotinoyle

  
Mieux préparé par le procédé au chlorure d'acide, par

  
 <EMI ID=276.1> 

  
benzoyle avec le noyau dans la pyridine à la température ambiante sous azote pendant 24 heures.

  
EXEMPLE 3

  
Préparation des dérivés de A-30912D

  
On prépare les dérivés du noyau de A-30912D en général à partir des esters 2,4,5-trichlorophényliques illustrés dans la Préparation 27, selon le mode opératoire suivant :

  
Au noyau de A-30912D dissous dans 10 à 50 ml de DMF, on ajoute l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide alcoxybenzoîque ou de l'acide (alkylthio)benzolque (rapport molaire 1:.2). On agite le mélange réactionnel pendant 15-18  <EMI ID=277.1> 

  
résidu. On lave le résidu (deux fois chaque) avec un mélange de 50 ml d'éther diéthylique et de 50 ml de chlorure de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu restant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une colonne de 100 ml de gel de silice (Woelm, 90-210 u) en utilisant comme éluant le système solvant susmentionné. On contrôle les fractions de la chromatographie par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on chasse le solvant pour obtenir le produit sous forme d'un résidu. Le produit peut être analysé par CLPE à phase inversée comme suit : pour les composés à groupement alcoxy

  
 <EMI ID=278.1> 

  
dissout l'échantillon dans un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On injecte la solution

  
d'échantillon (1 mg/ml) dans une colonne en acier

  
 <EMI ID=279.1> 

  
Bondapak (Waters Associates Inc.) et on élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 d'eau, de méthanol et d'acêtonitrile. Pour les composés à groupement

  
 <EMI ID=280.1> 

  
2:1:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 103,5 bars à un débit de 3 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600 A (Waters Associates, Inc.) et une vitesse de papier de 0,5 cm/minute. On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm. Les produits peuvent également être analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ
(MSDC) .

  
En suivant ce mode opératoire général, on obtient

  
123  les composés suivants de formule III où R , R , R et R sont tous H et R est : 

  
p-(n-octylthio)benzoyle

  
 <EMI ID=281.1>   <EMI ID=282.1> 

  
6- (n-octyloxy) nicotinoyle

  
6-(n-dodécyloxy)nicotinoyle

  
:: Mieux préparé par le procédé au chlorure d'acide, par

  
exemple en faisant réagir le chlorure de p-(n-octyl)benzoyle avec le noyau dans la pyridine à la température ambiante sous azote pendant 24 heures.

  
EXEMPLE 4

  
Préparation des dérivés du noyau de A-30912H

  
On prépare les dérivés du noyau de A-30912H ou de ses homologues à groupement alkyloxy, en général à partir des esters 2,4,5-trichlorophényliques illustrés dans la Préparation 27, selon le mode opératoire suivant :

  
Au noyau de A-30912H dissous dans 10 à 50 ml de

  
 <EMI ID=283.1> 

  
alcoxybenzoïque ou de l'acide (alkylthio)benzolque (rapport molaire 1:2). On agite le mélange réactionnel pendant 15-18 heures, après quoi on l'amène à siccité pour obtenir un résidu. On lave le résidu (deux fois chaque) avec un mélange de 50 ml d'éther diéthylique et de 50 ml de chlorure de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu restant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une

  
 <EMI ID=284.1> 

  
utilisant comme éluant le système solvant susmentionné. On contrôle les fractions de la chromatographie par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on chasse le solvant pour obtenir le produit- sous forme:: d'un résidu. Le produit, peut être analysé par CLPE à phase inversée comme suit : dans les composés à groupement alcoxy

  
 <EMI ID=285.1> 

  
dissout l'échantillon dans un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Or. injecte la solution d'échantillon (1 mg/ml) dans une colonne en acier

  
 <EMI ID=286.1> 

  
Bondapak (Waters Associates Inc.) et on élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Pour les composés à groupement

  
 <EMI ID=287.1> 

  
2:.1:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 103,5 bars à un débit de 3 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600 A (Waters Associates, Inc.) et une vitesse de papier de 0,5 cm/minute. On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV Varian Vari-Chrom à 230 nm. Les produits peuvent

  
également être analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ (MSDC).

  
Selon ce mode opératoire général, on obtient les

  
 <EMI ID=288.1> 

  
 <EMI ID=289.1> 

  
p- (n-octylthio) benzoyle

  
p- (n-décylthio) benzoyle

  
 <EMI ID=290.1>   <EMI ID=291.1> 

  
Mieux préparé par le procédé au chlorure d'acide, par

  
exemple en faisant réagir le chlorure de p-(n-octyl)benzoyle avec le noyau dans la pyridine à la température ,ambiante sous azote pendant 24 heures.

EXEMPLE 5

  
Préparation des dérivés de S31794/F-1

  
On prépare les dérivés du noyau de S31794/F-1 en

  
 <EMI ID=292.1> 

  
illustrés dans la Préparation 27 selon le mode opératoire suivant :

  
Au noyau de S31794/F-1 dissous dans 10 à 50 ml de DMF, on ajoute l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide alcoxybenzoïque ou de l'acide (alkylthio)benzoique (rapport molaire 1:2). On agite le mélange réactionnel pendant 15-18

  
 <EMI ID=293.1> 

  
résidu. On lave le résidu (deux fois chaque) avec un mélange de 50 ml d'éther diéthylique et de 50 ml de chlorure de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu restant dans un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le chromatographie sur une colonne de 100 ml de gel de silice (Woelm, 90-210 u) en utilisant comme éluant le système solvant susmentionné. On contrôle les fractions de la chromatographie par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions contenant le produit désire et on chasse le solvant pour obtenir le produit sous forme d'un résidu. Le produit peut être analysé par CLPE à phase inversée comme suit : dans les composés à groupement alcoxy

  
 <EMI ID=294.1> 

  
dissout l'échantillon dans un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On injecte la solution d'échantillon (1 mg/ml) dans une colonne en acier inoxydable de. 0 , 63 cm x 30 cm garnie de résine C18 Micro  <EMI ID=295.1> 

  
 <EMI ID=296.1> 

  
effectue l'élution à une pression de 103,5 bars à un débit de 3 ml/minute en utilisant une pompe Waters 600 A (Waters Associates, Inc.) et une vitesse de papier de 0,5 cm/minute.

  
On contrôle l'éluant avec un appareil de détection UV

  
 <EMI ID=297.1> 

  
également être analysés par spectrométrie de masse à désorption de champ (MSDC).

  
En suivant ce mode opératoire général, on obtient

  
13 

  
les composés suivants de formule III ou R , R et R sont

  
 <EMI ID=298.1> 

  
 <EMI ID=299.1> 

  
 <EMI ID=300.1> 

  
exemple en faisant réagir le chlorure de p-(n-octyl)benzoyle avec le noyau dans la pyridine à la température ambiante sous azote pendant 24 heures.

  
Le mode opératoire suivant illustre la préparation des composés de formule III. Les composés particuliers préparés par le mode opératoire donné ci-dessous sont les composés de formule III où R5 est un groupement p-(n-octyloxy)benzoyle.

  
Préparation 28

  
 <EMI ID=301.1> 

  
On ajoute une solution de 19,2 g (150 mmoles) d'acide p-hydroxybenzoique dans 120 ml d'hydroxyde de sodium aqueux à 10 % à 480 ml de DMSO préalablement chauffés à
80[deg.]C. On ajoute goutte à goutte à la solution 28,95 g

  
(150 mmoles) de bromure de n-octyle. On agite le mélange réactionnel pendant 4 heures à la température ambiante, après quoi on le verse dans 1200 ml d'eau glacée. On ajoute
30 ml d'acide chlorhydrique concentré et on laisse le mélange reposer jusqu'à la fin de la précipitation. On recueille le précipité, on le sèche et on le cristallise dans un mélange d'acétonitrile et d'eau, p.f. 97-99[deg.]C.

  
 <EMI ID=302.1> 

  

 <EMI ID=303.1> 


  
Préparation 29

  
 <EMI ID=304.1> 

  
5,39 g (27,2 mmoles) de 2,4,5-trichlorophénol et 4,94 g
(24,7 mmoles) de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 18 heures puis on le filtre. On évapore le filtrat pour obtenir une huile que l'on cristallise dans un mélange d'acétonitrile et d'eau

  
 <EMI ID=305.1> 

  
 <EMI ID=306.1> 

  
J = 4 Hz), 7,23 (s, 1H) , 7,3 (s, 1H) , 8,08 (d, 1H, J =

  
4 Hz).

  
EXEMPLE 8

  
Acylation du noyau de A-30912A

  
On dissout dans 150 ml de diméthylformamide
14,2 g (17,8 mmoles) du noyau de A-30912A et 15,32 g (35,7  <EMI ID=307.1> 

  
température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout

  
le résidu lavé dans 80 ml de 25 % d'acétate d'éthyle dans du méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc.,) en utilisant du gel de silice comme phase stationnaire. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants contenant de 20 % à 40 % de mêthanol dans de l'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice
(Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912A et on les lyophilisé pour

  
 <EMI ID=308.1> 

  
A-30912A. On en obtient 7,13 g ; M+ + 23 = 1052 (par SMDC) .

  
EXEMPLE 9

  
Acylation du noyau de A-30912B

  
On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8

  
mmoles du noyau de A-30912B et 35,7 mmoles d'ester 2,4,5-

  
 <EMI ID=309.1> 

  
agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange à 25 % d'acétate d'éthyle dans du méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc.) en utilisant le gel de silice comme

  
phase stationnaire. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants contenant de 20 % à 40 % de méthanol dans de l'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau A-30912B et on les

  
 <EMI ID=310.1>  du noyau de A-30912B.

EXEMPLE 10

  
En suivant le mode opératoire de l'Exemple 9 mais en substituant le bromure d'alkyle approprié, l'acide p-
(alkyloxy)benzolque approprié et l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(alkyloxy)benzoique approprié, on obtient les composés suivants de formule III :

  

 <EMI ID=311.1> 


  
EXEMPLE 11

  
 <EMI ID=312.1> 

  
On dissout dans 150 ml de DMF 17,8 mmoles du noyau de A-30912D et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5-

  
 <EMI ID=313.1> 

  
agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage.

  
On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange de 25 % d'acétate d'éthyle dans du méthanol et on le purifie par

  
CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc.) en utilisant du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants

  
 <EMI ID=314.1> 

  
d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du

  
 <EMI ID=315.1> 

  
d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau A-30912D et on les lyophilise

  
 <EMI ID=316.1> 

  
A-30912D.

EXEMPLE 12

  
En suivant le mode opératoire de l'Exemple 11 mais en substituant le bromure d'alkyle approprié, l'acide

  
 <EMI ID=317.1>  obtient les composés suivants de formule III :

  

 <EMI ID=318.1> 

EXEMPLE 13

  
Acylation du noyau de A-309i2H

  
On dissout dans 150 ml de DMF 17,8 mmoles de noyau de A-30912H et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5-trichloro-

  
 <EMI ID=319.1> 

  
solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout.le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange contenant 25 % d'acétate

  
 <EMI ID=320.1> 

  
utilisant une unité "Prep LC/System 500" (Waters Associates, Inc.) en utilisant du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants contenant de 20 % à 40 % de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les

  
 <EMI ID=321.1> 

  
A-J0912H.

  
EXEMPLE 14

  
En suivant le mode opératoire de l'Exemple 13 mais en utilisant le bromure d'alkyle approprié, l'acide palkyloxybenzoïque approprié et l'ester 2,4,5-trichloro-

  
 <EMI ID=322.1> 

  
les composés suivants de formule III :

  

 <EMI ID=323.1> 
 

  
 <EMI ID=324.1> 

  
Le mode opératoire suivant illustre la préparation du dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912H à

  
 <EMI ID=325.1> 

  
opératoire de l'Exemple 1. On méthyle le dérivé ainsi obtenu en. traitant le produit (20 mg) avec 0,06 ml de 3 % d'HCl dans du méthanol dans 1 ml de DMF. On laisse la solution reposer sous agitation pendant 16 heures, après quoi on chasse le solvant sous pression réduite et on obtient un résidu. On purifie le résidu par CLPE à phase inversée en

  
 <EMI ID=326.1> 

  
EXEMPLE 16

  
Acylation du noyau de S31794/F-1

  
On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles du noyau de S31794/F-1 et 35,7 mmoles de l'ester 2,

  
 <EMI ID=327.1> 

  
On agite la solution à la température ambiante pendant 16-
20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du c' lorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange contenant 25 % d'acétate d'éthyle dans du méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité "Prep LC/System 500"
(Waters Associates, Inc.) en utilisant du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants contenant de 20 % à 40 % de méthanol dans

  
 <EMI ID=328.1> 

  
utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de S31794/F-1 et

  
on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de S31794/7-1.

  
EXEMPLE 17 

  
En suivant le mode opératoire de l'Exemple 16 mais

  
 <EMI ID=329.1> 

  
alkyloxybenzolque approprié et l'ester 2,4,5-trichloro-

  
 <EMI ID=330.1>   <EMI ID=331.1> 

  

 <EMI ID=332.1> 


  
Le mode opératoire Suivant illustre la préparation des composés de formule III où.A est un groupement sulfonyle ou sulfinyle.

  
Préparation 30

  
 <EMI ID=333.1> 

  
p- (alkylsulfonyl) benzolgue

  
 <EMI ID=334.1> 

  
décylthio)benzoate de 2,4,5-trichlorophényle dans 20 ml de chlorure de méthylène refroidie dans un bain de glace, on ajoute 442 mg (2,0 mmoles) d'acide m-chloroperbenzolque.  Après avoir laissé le mélange réactionnel se réchauffer jusqu'à la température ambiante (15 minutes), on le lave deux fois avec 25 ml d'hydroxyde de sodium 0,1 N. On

  
 <EMI ID=335.1> 

  
l'avoir séchée sur sulfate de sodium anhydre. On obtient

  
 <EMI ID=336.1> 

  
précédemment en utilisant 108 ma d'acide perbenzolque dans
20 ml de chlorure de méthylène et une durée de réaction de
50 minutes. Le produit est purifié comme décrit ci-dessus et l'on obtient 26G mg de produit.

  
 <EMI ID=337.1> 

  

 <EMI ID=338.1> 


  
On peut préparer d'autres esters 2,4,5-trichloro-

  
 <EMI ID=339.1> 

  
mode opératoire décrit ci-dessus, les produits obtenus étant tels qu'indiqués ci-dessous : 

  

 <EMI ID=340.1> 

EXEMPLE 18

  
Acylation du noyau de A-30912A

  
On laisse sous agitation à la température ambiante pendant 18 heures une solution de 400 mg (0,5 mmole) du noyau de A-30912A et de 260 mg (0,514 mmole) de l'ester

  
 <EMI ID=341.1> 

  
benzoïque dans 50 ml de diméthylformamide. On évapore le mélange réactionnel à siccité sous vide et on extrait le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et du chlorure de méthylène. Puis on applique le résidu, dissous dans une quantité minimale d'un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol, sur une colonne de gel de silice
(50 ml) et on élue avec le même système solvant. On suit le cours de la chromatographie par CCM sur gel de silice
(Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions

  
 <EMI ID=342.1> 

  
et on les lyophilise. On obtient 415 mg du dérivé p-(ndécylsulfonyl)benzoylé du noyau de A-30912A. L'analyse de spectre de masse avec désorption de champ indique que

  
 <EMI ID=343.1> 

  
est constitué par un seul composant.

  
En suivant le mode opératoire précédent, on peut préparer comme indiqué ci-dessous d'autres dérivés p-(alkylsulfonyl)benzoylés du noyau de A-30912A. 

  

 <EMI ID=344.1> 
 

  
Préparation 3]

  
Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide

  
 <EMI ID=345.1> 

  
 <EMI ID=346.1> 

  
octylthio)benzoate de 2,4,5-trichlorophényle dans 50 ml de chlorure de méthylène, refroidie dans un bain de glace, on ajoute goutte à goutte une solution de 1,39 g (8 mmoles) diacide m-chloroperbenzoïque dans 50 ml de chlorure de méthylène. On agite la solution à 5[deg.]C pendant environ deux heures puis à la température ambiante pendant environ deux heures. Après addition de 2 à 3 gouttes d'un solution à 20 %

  
 <EMI ID=347.1> 

  
solution à 10 % de NaHC03 et deux fois avec de l'eau. On

  
sèche la couche organique sur sulfate de magnésium et on la concentre sous vide, ce qui donne un résidu qu'on cristallise dans un mélange 1:4 d'éther diéthylique et d'éther de pétrole, pour obtenir 1,7 g d'un produit qui est un mélange des dérivés sulfinylé et sulfonylé.

  
EXEMPLE 19

  
Acylation du noyau de A-30912A

  
On fait réagir une solution de 800 mg (1 immole)

  
 <EMI ID=348.1> 

  
dans la Préparation 31 (922 mg, 2 moles) comme décrit dans l'Exemple 18 pour obtenir 952 mg de produit mixte. On chromatographie ce produit sur gel de silice (100 g d'une

  
 <EMI ID=349.1> 

  
3:2 d'acétate d'éthyle et de méthanol. On rechromatographie sur gel de silice les premières fractions obtenues de cette colonne (554.mg), en utilisant comme solvant d'élution de l'acétate d'éthyle auquel on ajoute des quantités croissantes de méthanol. On réunit les fractions en se basant sur les

  
 <EMI ID=350.1> 

  
octylsulfonyl)benzoylé du noyau de A-30912A (58 mg), on

  
élue le dérivé p-(n-octylsulfinyl)benzoylé du noyau de A-30912A et l'on obtient 145 mg de ce produit.

  
EXEMPLE 20

  
Acylation du noyau de A-30912B

  
On effectue l'acylation du noyau de A-30912B par le mode opératoire décrit dans l'Exemple 18 en utilisant l'ester  <EMI ID=351.1> 

  
approprié.

  
Des exemples des dérivés à groupement p-(alkylsulfonyl)benzoyle du noyau de A-30912B sont ceux de formule I II dans laquelle .^,5 est groupement p- (n-octylsulfonyl) benzoyle, p-(n-décylsulfonyl)benzoyle, p-(n-dodécylsulfonyl)-

  
 <EMI ID=352.1> 

  
Quand A est un groupement sulfinyle, on modifie en conséquence les conditions précédentes. Quand la réaction donne un mélange de produits, par exemple le produit sulfinylé et le produit sulfonylé, des séparations chromatographiques peuvent être nécessaires pour obtenir le

  
 <EMI ID=353.1> 

  
est un groupement p-(n-octylsulfinyl)benzoyle est un exemple d'un tel produit.

  
EXEMPLE 21

  
Acylation du noyau de A-30912D

  
On effectue l'acylation du noyau de A-30912D par le mode opératoire décrit dans l'Exemple 18, en utilisant

  
 <EMI ID=354.1> 

  
(n-tétradécylsulfonyl)benzoyle.

  
Quand A est un groupement sulfinyle, les conditions précédentes sont modifiées en conséquence. Quand la réaction donne un mélange de produits, par exemple le produit sulfinylé et le produit sulfonylé, des séparations chromatographiques peuvent être nécessaires pour obtenir le produit sulfinylé désiré. Le composé de formule III dans

  
 <EMI ID=355.1> 

  
est un exemple d'un tel produit.

EXEMPLE 22

  
Acylation du noyau de A-30912H

  
On effectue l'acylation du noyau de A-30912H par le mode opératoire décrit dans l'Exemple 18, en utilisant  <EMI ID=356.1> 

  
benzoïque approprié.

  
Des exemples des dérivés p-alkylsulfonylbenzoylés

  
 <EMI ID=357.1> 

  
 <EMI ID=358.1> 

  
décylsulfonyl)benzoyle.

  
Quand A est un groupement sulfinyle, on modifie

  
en conséquence les conditions précédentes. Quand la réaction donne un mélange de produits, par exemple le produit sulfinylé et le produit sulfonylé, des séparations chromatographiques peuvent être nécessaires pour obtenir le produit sulfinylé

  
 <EMI ID=359.1> 

  
 <EMI ID=360.1> 

  
méthoxy, est un exemple d'un tel produit.

EXEMPLE 23

  
Acylation du noyau de S31794/F-1

  
On effectue l'acylation du noyau de S31794/F-l par le mode opératoire décrit dans l'Exemple 18, en utilisant l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide

  
 <EMI ID=361.1> 

  
Quand A est un groupement sulfinyle, on modifie en conséquence les conditions précédentes. Quand la réaction donne un mélange de produits, par exemple le produit sulfinylé et le produit sulfonylé, des séparations chromatographiques peuvent être nécessaires pour obtenir le produit sulfinylé désiré. Le composé de formule III dans

  
 <EMI ID=362.1> 

  
est un exemple d'un tel produit.

  
EXEMPLE 24

  
On peut démontrer et mettre en évidence l'activité antifongique des composés de formule III in vitro dans des essais de diffusion de disque et des essais de dilution sur gélose classiques, et in vivo dans des essais classiques sur les souris qui montrent l'efficacité vis-à-vis d'une infection fongique systémique. Les résultats des essais antifongiques de composés types de formule III (Exemples 3 et 4) sont donnés dans les Tableaux 10, 11, 12 et 13.

  
Les Tableaux 10 et 11 donnent les résultats de l'essai in vitro des composés des Exemples 3 et 4 par les méthodes de diffusion de disque sur plaque de gélose. Dans

  
 <EMI ID=363.1> 

  
(diamètre en mm) de la zone d'inhibition du micro-organisme observée que produit le composé d'essai. Dans le Tableau
11, l'activité est mesurée par la concentration inhibitrice minimale (CIM) de la substance (pg/disque) nécessaire pour inhiber la croissance de l'organisme d'essai. Le Tableau 12

  
 <EMI ID=364.1> 

  
 <EMI ID=365.1> 

  
un groupement p-(n-octyloxy)benzoyle] vis-à-vis de cinq souches de Candida albicans par la méthode de dilution sur gélose. Dans le Tableau 12, l'activité est mesurée par la

  
 <EMI ID=366.1> 

  
l'organisme d'essai.

  
Les résultats d'essais in vivo destinés à démontrer l'efficacité des composés des Exemples 1 et 18 vis-à -vis d'une infection provoquée par Candida albicans A-26 chez les souris sont donnés dans le Tableau 13, où l'activité est mesurée par la DE 50 (dose en mg/kg nécessaire pour guérir 50 % des animaux d'essai). Dans un essai séparé, dont les résultats sont également résumés dans le Tableau
13, l'activité est indiquée par la plus faible dose à laquelle on observe un essai antifongique significatif.

  
Dans cet essai, on infecte par voie intraveineuse avec Candida albicans A-26 des groupes de souris albinos mâles
(exemptes de pathogènes particuliers) pesant 18 à 20 g. On traite les animaux par rayons X 24 heures avant l'infection à environ 50 roentgens par minute pendant 8 minutes (dose totale de 400) pour réduire leurs réactions immunologiques à l'organisme infectieux. A 0, 4 et 24 heures après l'infection, on donne à chaque groupe de souris des doses progressives sous-cutanées du composé d'essai sous forme

  
 <EMI ID=367.1> 

  
glycol (PEG) dans de l'eau. On note le jour de la mort pour chaque animal. Une comparaison statistique par l'essai "t"

  
de Student du jour moyen de la mort est effectuée entre chaque groupe d'animaux infectés-traités à une dose particulière et un groupe de dix animaux infectés-non traités pour déterminer si le traitement prolonge de façon significative la durée de survie.

  
Le Tableau 14 donne les résultats de l'essai des composés des Exemples 1 et 18 en vue de leur absorption

  
après administration par voie orale. Dans cet essai, on gave des souris avec une dose de 416 mg/kg de composé d'essai

  
en suspension dans un mélange à 33 % de PEG 400 dans de l'eau. A des intervalles de temps, on prélève des échantillons de sang du sinus orbital et on détermine leur activité antibiotique comme suit : on place un disque de

  
 <EMI ID=368.1> 

  
ensemencée avec Aspergillus montevidensis A35137. Après

  
 <EMI ID=369.1> 

  
d'inhibition provenant des échantillons de sang à une référence obtenue à partir du composé d'essai et l'on calcule la quantité de composé dans l'échantillon de sang. 

  

 <EMI ID=370.1> 


  

 <EMI ID=371.1> 


  

 <EMI ID=372.1> 
 

  

 <EMI ID=373.1> 


  

 <EMI ID=374.1> 
 

  

 <EMI ID=375.1> 


  

 <EMI ID=376.1> 
 

  

 <EMI ID=377.1> 


  

 <EMI ID=378.1> 
 

  

 <EMI ID=379.1> 


  

 <EMI ID=380.1> 
 

  

 <EMI ID=381.1> 


  

 <EMI ID=382.1> 


  

 <EMI ID=383.1> 
 

  

 <EMI ID=384.1> 


  

 <EMI ID=385.1> 
 

  

 <EMI ID=386.1> 


  

 <EMI ID=387.1> 
 

  

 <EMI ID=388.1> 


  

 <EMI ID=389.1> 
 

  

 <EMI ID=390.1> 


  

 <EMI ID=391.1> 
 

  

 <EMI ID=392.1> 


  

 <EMI ID=393.1> 
 

  

 <EMI ID=394.1> 


  

 <EMI ID=395.1> 


  

 <EMI ID=396.1> 
 

  

 <EMI ID=397.1> 


  

 <EMI ID=398.1> 


  

 <EMI ID=399.1> 

Claims (1)

1. REVENDICATIONS

   1. Composa de formule : <EMI ID=400.1> <EMI ID=401.1>

   <EMI ID=402.1>

   deux H ou tous deux OH,

   et

   <EMI ID=403.1>

   <EMI ID=404.1>

   <EMI ID=405.1>

   et

   <EMI ID=406.1>

   <EMI ID=407.1> <EMI ID=408.1>

   où A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle ; A<1> est un radical divalent oxygène, soufre, sqlfinyle, sulfonyle ou -NH- ; X est un atome d'hydrogène

   <EMI ID=409.1>

   <EMI ID=410.1>

   <EMI ID=411.1>

   m, n et p sont 0 ou 1, mais si m = 0, n doit être égal à zéro ; pourvu que la somme des atomes de carbone des

   <EMI ID=412.1>

   dépasser 21 ; que, quand X est un groupement mercapto, A et A1 ne puissent être des groupements sulfinyle ou sulfonyle et que, quand A et A1 sont des groupements sulfinyle ou sulfonyle, ils soient dans des états d'oxydation égaux.

   2. Composé selon la revendication 1, où RS est un groupement benzoyle substitué de formule :

   <EMI ID=413.1>

   où A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle, X est un atome d'hydrogène, de chlore, de brome

   <EMI ID=414.1>

   3. Composé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, où A est un atome d'oxygène. 4. Composé selon la revendication 3, caractérisé en

   <EMI ID=415.1>

   <EMI ID=416.1>

   5. Composé selon la revendication 2, caractérisé

   <EMI ID=417.1>

   <EMI ID=418.1>

   6. Composé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que A est un atome de soufre.

   7. Composé selon la revendication 6, caractérisé

   <EMI ID=419.1>

   <EMI ID=420.1>

   9. Composé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que A est un groupement sulfonyle.

   10. Composé selon la revendication 9, caractérisé en ce que X est un atome d'hydrogène et R6 est un groupement

   <EMI ID=421.1>

   <EMI ID=422.1>

   *5

   en ce que R est un groupement p-(n-octylsulfonyl)benzoyle.

   <EMI ID=423.1>

   m, n et p sont égaux à zéro.

   13. Composé selon la revendication 12, caractérisé

   <EMI ID=424.1>

   14. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R5 a la formule (a), X est l'hydrogène, A est l'oxygène et n est zéro.

   15. Composé selon la revendication 14, caractérisé

   <EMI ID=425.1> <EMI ID=426.1>

   <EMI ID=427.1>

   <EMI ID=428.1>

   en ce que R a la formule (a), X est un atome d'hydrogène et A et A sont tous deux des atomes d'oxygène.

   17. Composé selon la revendication 16, caractérisé

   <EMI ID=429.1>

   18. Composé selon la revendication 1, caractérisé

   <EMI ID=430.1>

   19. Composé selon la revendication 18, caractérisé en ce que R est un groupement 6-(n-octyloxy)nicotinoyle,

   <EMI ID=431.1>

   20. Procédé de préparation d'un composé de formule III, caractérisé en ce qu'il consiste à acyler un noyau peptidique cyclique de formule

   <EMI ID=432.1>

   <EMI ID=433.1>

   <EMI ID=434.1>

   H ou tous deux OH, et

   <EMI ID=435.1>

   bien R<2> est un groupement

   0 <EMI ID=436.1>

   avec un dérivé activé du composé substitué de formule IV (a),

   <EMI ID=437.1>

   (R ) où R a la formule :

   <EMI ID=438.1>

   où A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou

   <EMI ID=439.1>

   sulfinyle, sulfonyle ou -NH- ; X est un atome d'hydrogène

   <EMI ID=440.1>

   <EMI ID=441.1>

   <EMI ID=442.1>

   m, n et p sont 0 ou 1, mais si m = 0, n doit être égal à zéro ; pourvu que la somme des atomes de carbone des

   <EMI ID=443.1>

   dépasser 21 ; que, quand X est un groupement mercapto, A et <EMI ID=444.1>

   <EMI ID=445.1>

   sulfonyle, ils soient dans des états d'oxydation égaux.

   21. Procédé selon la revendication 20,

   <EMI ID=446.1>

   substitué de formule :

   <EMI ID=447.1>

   3 dans laquelle A est un radical divalent oxygène, soufre, sulfinyle ou sulfonyle, X est un atome d'hydrogène, de

   chlore, de brome ou d'iode ou un groupement nitro, alkyle en

   <EMI ID=448.1>

   22. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 20 et 21, caractérisé en ce que A est un atome d'oxygène.

   23. Procédé selon la revendication 22,

   <EMI ID=449.1>

   <EMI ID=450.1>

   décyloxy)benzoyle ou p-(n-hexyloxy)benzoyle.

   25. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 20 et 21, caractérisé en ce que A est un atome de soufre.

   26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé

   <EMI ID=451.1>

   <EMI ID=452.1>

   tétradécylthio)benzoyle.

   28. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 20 et 21, caractérisé en ce que A est un groupement sulfonyle.

   29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que X est un atome d'hydrogène et R 5 est un groupement

   <EMI ID=453.1>

   30. Procédé selon la revendication 21, caractérisé

   <EMI ID=454.1>

   <EMI ID=455.1>

   et m, n et p valent zéro.

   32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que R5 est un groupement p-(n-octyl)benzoyle.

   33. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R5 a la formule (a), X est un atome d'hydrogène, A est un atome d'oxygène et n est zéro.

   34. Procédé selon la revendication 33, caractérisé

   <EMI ID=456.1>

   35. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que R5 a la formule (a), X est un atome d'hydrogène et A et A sont tous deux un atome d'oxygène.

   36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé

   <EMI ID=457.1>

   <EMI ID=458.1>

   37. Procédé selon la revendication 20, caractérisé

   <EMI ID=459.1>

   38. Procédé selon la revendication 37, caractérisé

   <EMI ID=460.1>

   6-(n-dodêcyloxy)nicotinoyle ou p-(n-décyloxy)cinnamoyle.

   39. Composition antifongique contenant comme ingrédient actif un composé selon la revendication 1.

   40. Composé de formule III, en substance tel que décrit ci-avant avec référence particulière aux Exemples 1 à 23.

   41. Procédé de préparation d'un composé de formule III, en substance tel que décrit ci-avant avec référence particulière aux exemples 1 à 23.