CH646701A5 - Noyaux peptidiques cycliques et leur preparation. - Google Patents

Description

40 L'invention fournit un noyau peptidique cyclique de formule

646701

dans laquelle R1 est H ou OH et; quand R1 est H, R2 est H et R3 et R4 sont tous deux H ou tous deux OH, et quand R1 est OH, R2 est H, R3 est OH ou un groupement alkyloxy en Q-

O

II

C6 et R4 est OH, ou bien R2 est un groupement -C-NH2 et R3 et R4 sont tous deux OH, et ses sels d'addition d'acides.

Dans un mode de réalisation des noyaux de cette invention, R1, R3 et R4 sont OH et R2 est H. Le noyau de ce mode de réalisation est connu comme noyau de A-30912A. On prépare le noyau de A-30912A en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II où R est un groupement linoléoyle, stéaroyle ou palmitoyle et R1, R2, R3 et R4 sont tels que dans le noyau de A-30912A.

Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle, l'antibiotique est connu comme facteur A de A-30912, quand R est un groupement stéaroyle, l'antibiotique est connu comme facteur A de A-30912-tétrahydrogéné et quand R est un groupement palmitoyle, l'antibiotique est connu comme aculéacine A.

Facteur A de A-30912.

Le facteur A de A-30912 est un facteur du mélange A-30912 qui contient également les facteurs B, C, D, E, F et G. Le mélange A-30912 et les différents facteurs A à G sont décrits dans le brevet des E.U.A. N° 4 024 245. Le facteur A de A-30912 est identique à l'antibiotique A-22082 qui est décrit dans le brevet des E.U.A. N° 4 024 246.

Depuis la délivrance des brevets des E.U.S. N° 4 024 245 et 4 024 246, on a trouvé que le facteur A de A-30912 est identique à l'échinocandine B antibiotique [Voir F. Benz et al., Helv. Chim. Acta 57,2459-2477 (1974) et le brevet suisse N° 568 386]. L'antibiotique SL 7810/F a également été identifié comme étant l'échinocandine B [C. Keller-Juslen, et al., Te-trahedron Letters 1976 (46), 4147-4150, et le brevet belge N° 834289].

Keller-Juslen, et al. ont proposé la structure de formule II où R est un groupement linoléoyle, R1, R3 et R4 sont OH et R2 est H pour le facteur A de l'antibiotique A-30912.

Facteur A de A-30912 tétrahydrogéné

Le facteur A de A-30912 tétrahydrogéné (SL 7810/F tétrahydrogéné, tétrahydroéchinocandine B), qui est décrit dans le brevet belge N° 834 289 et par F. Benz et al., Helv. Chim. Acta 57,2459-2477 (1974), a la formule II dans laquelle R est un groupement stéaroyle, R1, R3 et R4 sont OH et R2 est H. Pour des raisons de commodité, cette substance sera appelée ici tétrahydro-A-30912A.

Aculéacine A

L'aculéacine A est un composant du mélange aculéacine qui comprend un composant principal (aculéacine A) et six composants mineurs (aculéacines B, C, D, E, F et G). Les composants de l'aculéacine sont décrits dans le brevet des E.U.A. N° 3 978 210. Ainsi qu'il est décrit dans le brevet belge N° 859 067, l'aculéacine A a vraisemblablement la même structure peptidique cyclique que tétrahydro-A-30912A mais la chaîne latérale stéaroyle est remplacée par une chaîne palmitoyle.

Noyau de A-30912A

Le nouveau noyau peptidique cyclique de ce mode de réalisation, c'est-à-dire le noyau du facteur A de A-30912 (échi-nocandine B, SL 7810/F), du facteur A de A-30912 tétrahydrogéné, et de l'aculéacine A, a la formule I dans laquelle R1, R3 et R4 sont OH et R2 est H.

Ce noyau (noyau de A-30912A) est un matériau amorphe blanc qui est soluble dans les solvants comme l'eau, le di-

méthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le méthanol et qui est insoluble dans des solvants comme le chloroforme, le toluène et l'éther diéthylique.

Le noyau de A-30912A a une formule brute de 5 C34H51N7015 et un poids moléculaire de 797,83.

Le spectre d'absorption infrarouge du noyau de A-30912A en pastilles de KBr est indiqué sur la Figure I. On observe les maximas d'absorption suivants: 3340 large (OH, liaison hydrogène), 2970,2930 et 2890 (étirement de CH, alipha-io tiques dans les groupements CH3, CH2, CH), 1660 et 1625 (plusieurs groupements carbonyleC=0), 1510-1550,1430-1450 (déformation «wagging» de CH), 1310-1340,1230-1260,1080,835,650 large et 550 large, cm-1.

Le titrage électrométrique du noyau de A-30912A dans le 15 diméthylformamide aqueux à 66% indique la présence d'un groupement titrable avec un pHa d'environ 7,35 (pH initial 7,32).

On peut séparer le noyau de A-30912A par Chromatographie liquide sous pression élevée (CLPE). Le noyau de A-2o 30912A a un temps de rétention approximatif (k') de 11,52 minutes quand on le mesure par CLPE en utilisant les conditions suivantes:

Colonne: 4 x 400 mm

25 Garniture: gel de silice/Ci8

Solvant: mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium, d'acé-

tonitrile et d'eau

Débit: 3 ml/mn

Pression: 172,5 bars

30 Détecteur: UV à longueur d'onde variable à 230 nm

Sensibilité: 0-0,4 A.U.F.S.

On a découvert un procédé d'enlèvement enzymatique de la chaîne latérale d'acide gras R (R sera défini ci-après), pour 35 obtenir le noyau peptidique cyclique. Le procédé qui sera maintenant expliqué en détail, consiste à mettre l'antibiotique dans un milieu aqueux en contact avec une enzyme produite par un microorganisme de la famille Actinoplanaceae jusqu'à désacylation substantielle.

40 Un procédé préféré selon cette invention consiste à utiliser une enzyme produite par le microorganisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052 pour couper la chaîne latérale d'acides gras. La désacylation est généralement effectuée en ajoutant l'antibiotique approprié à une culture de A. utahensis et en 45 faisant incuber la culture jusqu'à ce qu'on obtienne la désacylation. Les noyaux ainsi obtenus sont séparés du bouillon de fermentation par des procédés connus dans le domaine. Ces noyaux sont utiles en ce qu'on peut les réacyler pour obtenir de nouvelles substances antibiotiques.

50

Préparation du noyau de A-30912A

Préparation du substrat

Le noyau de A-30912A selon cette invention peut être préparé à partir du facteur A de A-30912, du facteur A de A-55 30912 tétrahydrogéné ou de l'aculéacine A. Ces substrats peuvent être utilisés sous forme de matériaux purifiés mais il n'est pas essentiel qu'il soit purifé. Ainsi, par exemple, le mélange A-30912 dont le facteur A de A-30912 est le composant principal, peut être utilisé comme substrat de préparation du no-60yau de A-30912A.

Facteur A de A-30912

Le facteur A de A-30912 peut être obtenu par fermentation aérobie de:

65 1) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113;

2) une souche de Aspergillus nidulans NRRL 8112;

3) une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860;

5

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4) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039; ou

5) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus, NRRL 11440.

Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour produire le facteur A de A-30912, on obtient un mélange de facteurs que l'on appelle, pour des raisons de commodité, mélange antibiotique A-42355. Le facteur A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sont des facteurs mineurs du mélange A-42355.

Tétrahydro-A-30912A

On prépare tétrahydro-A-30912A à partir du facteur A de A-30912 par des techniques d'hydrogénation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle.

Aculéacine A

On prépare l'aculéacine A par fermentation d'une souche de Aspergillus aculeatus NRRL 8075 comme décrit dans le brevet des E.U.A. N° 3 978 210 qui est incorporé ici par voie de référence.

Selon un autre mode de réalisation du noyau de cette invention, R' et R2 sont tous deux H et R3 et R4 sont tous deux OH. Le noyau de ce mode de réalisation est connu comme noyau de A-30912B. On prépare le noyau de A-30912B en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II dans laquelle R est un groupement linoléoyle ou stéaroyle et R1, R2, R3 et R4 sont comme dans le noyau de A-30912B.

Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle, l'antibiotique est connu comme facteur B de A-30912 et quand R est un groupement stéaroyle, l'antibiotique est connu sous le nom de facteur B de A-30912 tétrahydrogéné.

Facteur B de A-30912

Le facteur B de A-30912 est un facteur du mélange A-30912 qui contient également les facteurs A, C, D, E, F et G. Le mélange A-30912 est décrit dans le brevet des E.U.A. N° 4024 245.

On a trouvé que le facteur B de A-30912 est identique à l'échinocandine C antibiotique [Voir R. Traber et al., Helv. Chim. Acta 62,1252-1267 (1979)] et à l'antibiotique SL 7810/ F-ll (Brevet belge N° 834 289).

Traber et al. ont proposé la structure de formule II dans laquelle R1 et R2 sont tous deux H, R3 et R4 sont tous deux OH et R est un groupement linoléoyle pour l'échinocandine C antibiotique. Pour la tétrahydro-échinocandine C antibiotique, Traber et al. proposent la formule II dans laquelle R1 et R2 sont tous deux H, R3 et R4 sont tous deux OH et R est un groupement stéaroyle.

Facteur B de A-30912 tétrahydrogéné

Le facteur B de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-II; tétrahydroéchinocandine C), qui est décrit dans le brevet belge N° 834 289 et par R. Traber et al., Helv. Chim. Acta 62,1252-1267 (1979), a la formule II dans laquelle R1 et R2 sont tous deux H, R3 et R4 sont tous deux OH et R est un groupement stéaroyle. Pour des raisons de commodité, ce matériau sera appelé tétrahydro-A-30912B.

Noyau de A-30912B

Le nouveau noyau peptidique cyclique de ce mode de réalisation, c'est-à-dire le noyau du facteur B de A-30912 (échi-nocandine C, SL 7810/F-II) et de tétrahydro-A-30912B, a la structure représentée par la formule I, dans laquelle R1 et R2 sont tous deux H et R3 et R4 sont tous deux OH.

Le noyau de A-30912B a une formule brute de C34H5iN70!4 et un poids moléculaire de 781,83.

Préparation du noyau de A-30912B s Préparation du substrat

On peut préparer le noyau de A-30912B à partir du facteur B de A-30912 ou de tétrahydro-A-30912B. Comme ce facteur B n'est pas le composant principal des mélanges antibiotiques dans lesquels il est produit, il doit être purifié pour io enlever les autres facteurs coproduits avant de l'utiliser comme substrat.

Facteur B de A-30912

Ce facteur peut être obtenu par fermentation aérobie de: i5 1) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113;

2) une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860;

3) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039; ou

4) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus, NRRL 20 11440.

Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour produire le facteur B de A-30912, on obtient un mélange de facteurs qui, pour des raisons de commodité, est appelé mélange antibiotique A-42355. Le facteur A 25 de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sont des facteurs mineurs du mélange A-42355.

Tétrahydro-A-30912B so On prépare tétrahydro-A-30912B à partir du facteur B de A-30912 par des techniques d'hydrogénation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle.

Dans un autre mode de réalisation des noyaux de cette in-35 vention, R1, R2, R3 et R4 sont tous des atomes d'hydrogène. Le noyau de ce mode de réalisation est appelé noyau de A-30912D. On prépare le noyau de A-30912D en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II où R est un groupement linoléoyle ou stéaroyle et R1, R2, R3 et R4 sont 40 comme dans le noyau de A-30912D.

Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle, l'antibiotique est appelé facteur D de A-30912 et quand R est un groupement stéaroyle, l'antibiotique est appelé facteur D de A-30912 tétrahy-« drogéné.

Facteur D de A-30912

Le facteur D de A-30912 est un facteur du mélange A-30912 qui contient également les facteurs A, B, C, E, F et G. 50 Le mélange A-30912 est décrit dans le brevet des E.U.A. N° 4024 245.

On a trouvé que le facteur D de A-30912 est identique à l'échinocandine D antibiotique [Voir R. Traber et al., Helv. Chim. Acta 62,1252-1267 (1979)] et à l'antibiotique SL 7810/ ss F-III (Brevet belge N° 834 289).

Traber et al. ont proposé la structure de la formule II dans laquelle R1, R2, R3 et R4 sont tous H et R est un groupement linoléoyle pour l'échinocandine D antibiotique. Pour la tétrahydroéchinocandine D, Traber et al. ont proposé la struc-60 ture de formule II dans laquelle R1, R2, R3 et R4 sont chacun H et R est un groupement stéaroyle.

Pour des raisons de commodité, le facteur D de A-30912 tétrahydrogéné (tétrahydro-SL 7810/F-III; tétrahydro-échinocandine D) sera appelé tétrahydro-A-30912D.

65

Noyau de A-30912D

Le nouveau noyau peptidique cyclique de ce mode de réalisation, c'est-à-dire le noyau du facteur D de A-30912 (èchi-

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nocandine D, SL 7810/F-III) et de tétrahydro-A-30912D, a la structure représentée dans la formule I dans laquelle R1, R2, R3 et R4 sont des atomes d'hydrogène.

Le noyau de A-30912D a une formule brute de C34H5IN70I2 et un poids moléculaire de 749,83.

Préparation du noyau de A-30912D Préparation du substrat

On peut préparer le noyau de A-30912D à partir du facteur D de A-30912 ou de tétrahydro-A-30912D. Comme le facteur D de A-30912 n'est pas le composant principal des mélanges antibiotiques dans lesquels il est produit, il doit être purifié pour enlever les facteurs produits simultanément avant de l'utiliser comme substrat.

Facteur D de A-30912

Le facteur D de A-30912 peut être produit par fermentation aérobie en immersion de:

1) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113;

2) une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus A

32204, NRRL 3860;

3) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039; ou

4) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus, NRRL

11440.

Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 11440 pour obtenir le facteur D de A-30912, on obtient un mélange de facteurs que l'on appelle pour des raisons de commodité mélange antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sont des facteurs mineurs du mélange A-42355.

Tétrahydro-A-30912D

On prépare tétrahydro-A-30912D à partir du facteur D de A-30912 par des techniques d'hydrogénation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle.

Dans encore un autre mode de réalisation des noyaux de cette invention, R1 et R4 sont tous deux OH, R2 est H et R3 est un groupement alkyloxy en Ci-C6. Les noyaux de ce mode de réalisation sont appelés noyau de type A-30912H. On prépare les noyaux de type A-30912H en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II dans laquelle R est un groupement linoléoyle ou stéaroyle et R1, R2, R3 et R4 sont comme dans les noyaux de type A-30912H.

Quand R dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II est un groupement linoléoyle et R3 est un groupement méthoxy, l'antibiotique est appelé facteur H de A-30912 et, quand R est un groupement stéaroyle et R3 est un groupement méthoxy, l'antibiotique est appelé facteur H de A-30912 tétrahydrogéné.

Quand R, dans l'antibiotique peptidique cyclique de formule II, est un groupement linoléoyle et R3 est un groupement alkyloxy en C2-C6, les antibiotiques sont appelés homologues à groupement alkyloxy inférieur du facteur H de A-30912 et quand R est un groupement stéaroyle et R3 est un groupement alkyloxy en C2-C6, les antibiotiques sont appelés homologues à groupement alkyloxy inférieur du facteur H de A-30912 tétrahydrogéné.

Facteur H de A-30912

Le facteur H de A-30912 est un facteur du mélange A-30912 qui contient également les facteurs A, B, C, D, E, F et G. Le mélange A-30912 est décrit dans le brevet des E.U.A. N° 4 024 245. Le facteur H de A-30912 est un facteur de A-30912 découvert par la suite. Le facteur H de A-30912 est décrit dans la demande de brevet français N° 80 12212

Homologues du facteur H de A-30912

Après la découverte de la structure du facteur H de A-30912, on a mis en valeur le fait que les homologues à groupement alkyloxy inférieur du facteur H de A-30912 seraient des 5 produits utiles. Avant ce moment, les dérivés alkyloxy que l'on avait préparés n'avaient pas été reconnus comme ayant une utilité et étaient préparés seulement comme outils de détermination de la structure. Les homologues à groupement alkyloxy en C2-C6 du facteur H de A-30912 sont préparés à io partir du facteur A de A-30912.

Le facteur H de A-30912 peut être produit par fermentation de:

1) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113;

2) une souche de Aspergillus nidulans NRRL 8112;

15 3) une souche de Aspergillus nidulans var. echinulatus

A-32204, NRRL 3860

4) une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8039

comme décrit dans le brevet belge N° 834 289; ou

5) une souche de Aspergillus nidulans var. roseus, NRRL 20 11440.

Comme chaque noyau de A-30912H contient une partie amino, ils peuvent exister sous la forme de sels. Ces sels sont également utilisables comme intermédiaires et pour des besoins de purification. Les sels pharmaceutiquement accepta-25 bles des noyaux de A-30912H sont particulièrement utiles parce qu'ils réduiront au minimum la purification des produits finals. Les sels «acceptables sur le plan pharmaceutique» désignent les sels dont la toxicité du produit en tant que tout vis-à-vis des animaux à sang chaud n'est pas accrue. 30 Les sels d'addition d'acides des noyaux de A-30912H peuvent être préparés par des modes opératoires de réaction classique avec un acide minéral ou organique. Des exemples des acides minéraux et organiques comprennent les acides chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, sulfurique, phos-35 phorique, acétique, benzoïque, sulfamique, tartrique, citrique, maléique, succinique, ascorbique, glycolique, lactique, fumarique, palmitique, cholique, pamoïque, mucique, D-glu-tamique, d-camphorique, glutarique, phtalique, laurique, stéarique, salicylique, méthanesulfonique, benzènesulfoni-40 que, sorbique, picrique, cinnamique et d'autres acides appropriés.

Préparation des noyaux de A-30912H

Préparation du substrat 45 On peut préparer le noyau de A-30912H, c'est-à-dire le composé de formule I dans laquelle R1 et R4 sont tous deux OH, R2 est H et R3 est un groupement méthoxy, à partir du facteur H de A-30912 ou de tétrahydro-A-30912H. Comme le facteur H de A-30912 n'est pas un composant principal des 50 mélanges antibiotiques dans lesquels il est produit, il doit être purifié pour enlever les autres facteurs antibiotiques produits simultanément, avant son utilisation comme substrat.

On prépare les substrats des noyaux A-30912H de formule I où R1 et R4 sont tous deux OH, R2 est H et R3 est un groupe-55 ment alkyloxy en C2-C6 (homologues de A-30912H) par réaction du facteur A de A-30912 ou de tétrahydro-A-30912A avec un alcool approprié pour préparer le dérivé à groupement alkyloxy en C2-C6 correspondant. Comme le facteur A de A-30912 est le composant principal des mélanges antibioti-60 qUes dans lesquels il est produit, ce procédé est également une façon préférée de préparer le facteur H de A-30912 et tétrahy-dro-A-30912H.

Facteur H de A-30912 65 On peut obtenir le facteur H de A-30912 par fermentation aérobie en immersion d'une souche de Aspergillus rugulosus NRRL 8113 ou d'une souche de Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

7

646 701

Quand on utilise une souche de A. nidulans var. roseus NRRL 1140 pour produire le facteur A-30912, on obtient un mélange de facteurs que l'on appelle pour des raisons de commodité mélange antibiotique A-42355. Le facteur A de A-30912 est le facteur principal du mélange antibiotique A-42355. Les facteurs B, D et H de A-30912 sont les facteurs mineurs du mélange A-42355.

Homologues de A-30912H

On prépare les homologues de A-30912H en faisant réagir le facteur A de A-30912 ou tétrahydro-A-30912A avec l'alcool correspondant approprié pour former le dérivé à groupement alkyloxy désiré de formule II dans laquelle R1 et R4 sont tous deux OH, R2 est H et R3 est un groupement alkyloxy en C2-C6. Ceci est un procédé préféré de préparation du facteur H de A-30912 et de tétrahydro-A-30912H. On peut préparer les homologues de A-30912H de formule II où R est un groupement stéaroyle et R3 un groupement alkyloxy en C2-C6: a) en préparant tétrahydro-A-30912A et en le faisant réagir avec l'alcool approprié pour former le dérivé à groupement alkyloxy, ou b) en faisant réagir le facteur A de A-30912 avec l'alcool approprié pour former le dérivé à groupement alkyloxy puis en réduisant les doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle.

Les dérivés tétrahydrogénés

On prépare tétrahydro-A-30912A, tétrahydro-A-30912H, et les composés de formule II où R3 est un groupement alkyloxy en C2-C6 et R un groupement stéaroyle à partir des facteurs A et H de A-30912 et à partir des composés de formule II où R3 est un groupement alkyloxy en C2-C6 et R est un groupement linoléoyle, par des techniques d'hydrogénation classiques, en effectuant la réduction jusqu'à ce que l'on ait réduit les deux doubles liaisons de la chaîne latérale linoléoyle.

Dans encore un autre mode de réalisation des noyaux de cette invention, R1, R3 et R4 sont OH et R2 est un groupement carboxamide. Le noyau de ce mode de réalisation est connu comme noyau de S 31794/F-1. On prépare le noyau de S 31794/F-l en désacylant un antibiotique peptidique cyclique de formule II dans laquelle R est un groupement myristoyle et R1, R2, R3 et R4 sont comme dans le noyau de S 31794/F-1.

S 31794/F-l

On obtient le noyau de S 31794/F-1 de cette invention en désacylant l'antibiotique peptidique cyclique S 31794/F-l.

L'antibiotique S 31794/F-l, qui est décrit dans la demande de brevet allemande publiée après examen N° 2 628 965 et le brevet des E.U.A. N° 4 173 629, est un composé antifongique produit par Acrophialophora limonispora nov. spec. Drey-fuss et Muller NRRL 8095. S 31794/F-l a les caractéristiques suivantes: p.f. 168-180 °C (décomposition) (amorphe) ou

181-183 °C. (décomposition) (cristallisé);

[a]^ = —24° (c = 0,5, méthanol) ou +37° (c = 0,5, méth-

anol, à l'état cristallisé); maxima d'absorption UV dans le 1 %

méthanol à 194 nm (E ^ cm = 807), 225 nm (épaulement)

(e{ ^ = 132), 276 nm (E*. = 12,8), 284 nm (épaule-I cm i cm

PPM

PPM

PPM

176,2

75,5

51,2

175,0

74,0

39,7

5 173,7

71,0

38,8

172,6

70,5

36,6

172,0

69,7

34,8

171,8

68,0

32,8

171,7

62,2

30,6

iol68,6

58,3

26,7

157,7

57,0

23,5

132,5

56,2

19,7

129,0

55,4

14,3

115,9

52,9

11,1

ment) (e! ^ JK 1 cm

10,5); Spectre de RMN du carbone 13C dans le deuterométhanol (190 mg dans 1,5 ml de deuterométh-anol), le tétraméthylsilane étant utilisé comme étalon interne) avec les caractéristiques suivantes (à l'état cristallisé):

i5 76,6

une analyse élémentaire approximative (après séchage du matériau cristallin pendant deux heures sous vide poussé à 100 °C) comme suit: 55,5-56,5% de carbone, 7,5-7,7% 20 d'hydrogène, 10,5-10,8% d'azote et 25,5-26,0% d'oxygène. S 31794/F-l est facilement soluble dans le méthanol, l'éthanol, la pyridine et le diméthylsulfoxyde et est faiblement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthyli-que, le benzène et l'hexane et a une activité antifongique, en 25 particulier vis-à-vis de Candida Albicans.

On pense que l'antibiotique S 31794/F-l a la formule II dans laquelle R est un groupement myristoyle, R1, R3 et R4 sont OH et R2 est un groupement carboxamide.

30 Noyau de S 31794/F-l

On pense que le nouveau noyau peptidique cyclique de cette invention, c'est-à-dire le noyau de l'antibiotique S 31794/F-1, a la structure représentée par la formule I dans laquelle R1, R3 et R4 sont OH et R2 est un groupement carbox-35 amide.

Le noyau de S 31794/F-l a une formule brute de C35H52N8016 et un poids moléculaire de 840,87.

Préparation du noyau de S 31794/F-l 40 Préparation du substrat

On prépare le noyau de S 31794/F-l de cette invention à partir de l'antibiotique S 31794/F-l.

On prépare l'antibiotique S 31794/F-l par culture aérobie en immersion à'Acrophialophora limonispora NRRL 8095. Ce 45 microorganisme fait partie de la collection de cultures permanentes du Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, où il est disponible au public sous le numéro NRRL indiqué. 50 Comme les noyaux contiennent chacun un groupement amino, ils peuvent exister sous forme de sels. Ces sels sont également utilisables comme intermédiaires et pour la purification. Les sels pharmaceutiquement acceptables des noyaux sont particulièrement utilisables car la purification des pro-55 duits finals est minimisée. Les sels «pharmaceutiquement acceptables» désignent les sels dont la toxicité du produit en tant que tout vis-à-vis des animaux à sang chaud n'est pas accrue.

Les sels d'addition d'acides des noyaux peuvent être formés par des modes opératoires de réaction classique avec un 60 acide minéral ou organique. Des acides minéraux et organiques types comprennent les acides chlorhydrique, bromhydri-que, iodhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, ben-zoïque, sulfamique, tartrique, citrique, maléique, succinique, ascorbique, glycolique, lactique, fumarique, palmitique, cho-65 lique, pamoïque, mucique, D-glutamique, d-camphorique, glutarique, phtalique, laurique, stéarique, salicylique, métha-nesulfonique, benzènesulfonique, sorbique, picrique, cinna-mique, et d'autres acides appropriés.

646701

La Chromatographie liquide sous faible pression de caractéristiques élevées (CLFPCE) à phase inversée utilisant un absorbant gel de silice/C18 est un procédé préféré pour la purification finale des différents antibiotiques. Dans ce procédé, on place le mélange antibiotique brut dissous dans un solvant sur une colonne équilibrée avec le même solvant. Puis, on élue la colonne avec le solvant. Les fractions recueillies sont contrôlées par bioautographe par Candida albicans et/ou par UV (en se basant sur les durées de rétention relatives). On réunit les fractions contenant des facteurs antibiotiques identiques. Il est parfois nécessaire d'effectuer une séparation chromato-graphique supplémentaire pour obtenir les différents facteurs sous forme purifiée.

On obtient le mélange antibiotique brut de A-30912 ou A-42355, par exemple, par extraction du bouillon entier ou des mycéliums avec du méthanol ou du chloroforme. Le mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile est un système solvant préféré pour la Chromatographie de ces antibiotiques.

L'antibiotique S 31794/F-l brut est obtenu par extraction du bouillon entier par un mélange 4:1 d'acétate d'éthyle et d'isopropanol et Chromatographie des extraits.

Les différents facteurs peuvent être identifiés par Chromatographie sur couche mince (CCM). Le gel de silice est un ad-sorbant préféré.

Les Rf des facteurs A à G de A-30912, en utilisant une CCM sur gel de silice à teneur élevée en carbone, un système solvant 7:3 de benzène et de méthanol et un bioautographe Candida albicans, sont donnés dans le Tableau I

Tableau I

Facteur de A-30912 Rf

A 0,35

B 0,45

C 0,54

D 0,59

E 0,27

F 0,18

G 0,13

Les Rf approximatifs des facteurs A, B, C, D et H de A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant une CCM sur gel de silice riche en carbone et bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau II

Tableau II Facteur de A-30912

Rf-Systèmes solvants

a b

c d

Facteur A

0,28

0,14

0,28

0,43

Facteur B

0,39

0,21

0,42

0,47

Facteur C

0,46

0,31

0,51

0,58

Facteur D

0,50

0,38

0,57

0,61

Facteur H

0,42

0,27

0,36

0,53

Systèmes solvants:

a: acétate d'éthyle:méthanol (3:2)

b: acétate d'éthyle:méthanol (7:3)

c: acétonitrile:eau (95:5)

d: acétate d'éthyle:éthanol:acide acétique (40:60:0,25) Les facteurs A, B, D et H de A-30912 peuvent également être identifiés par CLFPCE analytique en utilisant les conditions suivantes:

Solvant:

Volume d'échantillon: s Dimension de l'échantillon: Température de la colonne: Débit: io Pression: Détecteur:

Pompe: i5 Injection:

Mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile.

8 ni

8ng ambiante 1,8 ml/minute environ 14 bars

UV à 222 nm (Appareil de contrôle par abs-orbance UV-visible à longueur d'onde variable ISCO, modèle 1800)

LDC Duplex Minipump Injection en boucle

Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A, B, D et H de A-30912 dans ces conditions sont résumées dans le Tableau III.

20

Tableau III Facteur De A-30912

A

25 fi

H D

Durée de rétention (secondes)

792 870 990 1 140

Colonne: Verre, 0,8 x 15,0 cm Garniture: Nucléosil 10-C18 (Machery-Nagel and Com- 1 pany); garnissage effectué en utilisant le mode opératoire de garnissage en suspension de la préparation 11.

Préparation de l'enzyme 30 A. Microorganisme producteur

L'enzyme qui est utilisable pour la désacylation des antibiotiques de cette invention est produite par certains microorganismes de la famille Actinoplanaceae, de préférence le microorganisme Actinoplanes utahensis NRRL 12052. 35 L'enzyme peut être la même enzyme que celle que l'on a utilisée pour désacyler les pénicillines. Ce travail a été décrit dans le brevet des E.U.A. N° 3 150 059. Bien qu'un procédé préféré de culture de A. utahensis NRRL 12052 pour la production de cette enzyme soit décrit dans la préparation 1, 40 l'homme de l'art verra que d'autres procédés peuvent être utilisés.

Les Actinoplanaceae sont une famille relativement récente de microorganismes de l'ordre Actinomycetales. Décrite pour la première fois par le Dr. John N. Couch, cette famille a été 45 créée en 1955 [/. Elisha Mitchell Sci. Soc. 71, 148-155 (1955)]. Les caractéristiques de la famille et de nombreux genres distincts se trouvent dans: «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology», 8th Ed., R.E. Buchanan and N.E. Gibbons, Eds., The Williams & Willems Co., Baltimore, Md., 501974, pages 706-723. Dix genres ont ainsi été distingués depuis:

I. Actinoplanes (c'est-à-dire le genre type et de fait le genre de loin le plus commun);

II. Spirillospora;

III. Streptosporangium;

IV. Amorphosporangium;

V. Ampullarieila;

VI. Pilimelia;

VII. Pianomonospora;

Vili. Planobispora;

IX. Dactylosporangium; et

X. Kitasatoa.

60

5 Certaines des espèces et variétés qui ont été isolées et caractérisées jusqu'à présent sont: Actinoplanesphilippinensis, Actinoplanes armeniacus, Actinoplanes utahensis, et Actinoplanes missouriensis; Spirillospora albida; Streptosporangium ro-

9

646701

seum, Streptosporangium vulgare, Streptosporangium roseum var. hollandensis, Streptosporangium album, Streptosporangium virid.ia.lbum, Amorphosporangium auranticolor, Ampulla-riella regularis, Ampullariella campanulata, Ampullariella lobata, Ampullariella digitata, Pilimelia terevasa, Pilimelia anu-lata, Planomonospora parontospora, Planomonospora vene-zuelensis, Planobispara longispora, Planobispora rosea, Dacty-losporangium aurantiacum, et Dactylosporangium thailandese.

Le genre Actinoplanes est une source préférée de l'enzyme qui est utilisable pour cette invention. Dans le genre Actinoplanes, l'espèce Actinoplanes utahensis est une source particulièrement préférée de l'enzyme.

Des cultures des espèces représentatives sont disponibles au public au Northern Regional Research Center, Voir ci-dessus, sous les numéros d'accès suivants:

Actinoplanes utahensis Actinoplanes missouriensis Actinoplanes sp. Actinoplanes sp. Streptosporangium roseum var. hollandensis

NRRL 12052

NRRL 12053

NRRL 8122

NRRL 12065

NRRL 12064

A. utahensis NRRL 12052 a été obtenu à partir d'une culture mère qui a été déposée à la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 (A. utahensis ATCC 14539). La culture de A. utahensis ATCC 14539 peut également être utilisée comme source de l'enzyme.

A. missouriensis NRRL 12053 a été obtenu à partir d'une culture qui est également déposée à l'ATCC (A. missouriensis ATCC 14538) et qui est une autre source de l'enzyme.

L'efficacité d'une quelconque souche donnée de microorganisme appartenant à la famille Actinoplanaceae pour la mise en œuvre de la désacylation de cette invention est déterminée par le mode opératoire suivant. On inocule avec le microorganisme un milieu de culture approprié. On fait incuber la culture à environ 28 °C pendant 2 ou 3 jours sur un agitateur rotatif. Puis on ajoute à la culture un des antibiotiques utilisés comme substrat. On maintient le pH du milieu de fermentation à environ pH 6,5. On contrôle l'activité de la culture en utilisant un dosage par Candida albicans. Ce mode opératoire est décrit dans le paragraphe E. La perte de l'activité antibiotique est une indication que le microorganisme produit l'enzyme nécessaire pour la désacylation. Ceci doit cependant être vérifié en utilisant l'un des procédés suivants:

1) Analyse par CLPE pour déterminer la présence du noyau intact; ou

2) Réacylation avec une chaîne latérale appropriée pour restaurer l'activité.

B. Conditions de production de l'enzyme

La production de l'enzyme s'effectue dans des conditions permettant la croissance d'Actinoplanaceae, c'est-à-dire à une température comprise entre environ 25 et environ 30 °C et à un pH compris entre environ 5,0 et environ 8,0, avec agitation et aération. Le milieu de culture doit contenir:

a) une source de carbone assimilable comme du saccharose, du glucose, du glycérol, etc ...;

b) une source d'azote comme la peptone, l'urée, le sulfate d'ammonium, etc...;

c) une source de phosphate comme un phosphate soluble;

et d) des sels minéraux qui se révèlent généralement être efficaces pour l'amélioration de la croissance des microorganismes.

On obtient, en général, une quantité effective de l'enzyme en environ 40 à environ 60 heures après le début du cycle de croissance et elle persiste pendant un certain temps après que l'on a atteint la croissance effective. La quantité d'enzyme produite varie d'une espèce d'organisme à une autre et en s fonction de conditions de culture différentes.

Comme le verra l'homme de l'art, les microorganismes, comme Actinoplanes utahensis NRRL 12052, qui produisent l'enzyme sont sujets à variations. Par exemple, on peut obtenir des variants et mutants artificiels de ces souches par traite-10 ment par divers mutagènes connus comme les rayons ultraviolets, les rayons X, les ondes de fréquence élevées, les rayons radioactifs, et les produits chimiques. Tous les variants et mutants naturels et artificiels que l'on obtient à partir des Actinoplanaceae et qui produisent l'enzyme peuvent être utilisés 15 dans cette invention.

C. Conditions de désacylation

Le substrat est de préférence ajouté à la culture d'Actinoplanaceae une fois que la culture a incubé pendant au moins 20 environ 48 heures. La concentration du substrat dans le milieu de transformation peut varier de façon importante. Pour une utilisation maximale de l'enzyme et pour une désacylation pratiquement complète en 24 heures, la concentration du substrat sera cependant généralement comprise entre environ 25 0,5 et environ 1,0 mg/ml. On peut utiliser des concentrations inférieures mais elles ne permettent pas d'utiliser au maximum l'enzyme; on peut également utiliser des concentrations supérieures, mais le substrat ne peut pas être totalement dés-acylé si l'on ne prolonge pas la durée de fermentation. 30 La transformation des substrats antibiotiques en noyaux correspondants de cette invention se fait pour le mieux quand le pH du milieu de fermentation est maintenu entre environ 6,0 et environ 7,0. A pH 6 ou moins, la désacylation se fait lentement; lorsque le pH monte au-dessus de 6,0, le substrat et 35 le noyau qui se forme sont de moins en moins stables. Pour un maximum de stabilité, on préfère un pH de 6,0, mais à ce pH, la désacylation se fera moins rapidement (environ 30 à environ 36 heures). Pour une désacylation plus rapide (environ 24 heures) sans pertes importantes, on préfère un pH d'environ 40 6,5. Dans les fermenteurs agités, le pH peut être réglé par des appareils de détection et de commande. Quand ceci n'est pas pratique, comme dans des fermenteurs en flacons, on peut régler le pH en ajoutant du tampon phosphate 0,1 M au milieu avant addition du substrat.

45 Après addition du substrat, il faut poursuivre l'incubation de la culture pendant environ 24 heures ou plus. La pureté du substrat affectera la vitesse de désacylation. Par exemple, un substrat ayant une pureté supérieure à 50% est désacylé à un taux d'environ 0,8 à environ 1,2 mg/ml d'antibiotique en 24 so heures. Quand on utilise des substrats de pureté inférieure, la désacylation se fait moins rapidement.

Le substrat peut être introduit en plusieurs fois. Par exemple, dans de petits réservoirs, on peut introduire 0,3 à 0,5 mg/ml d'antibiotique à des intervalles de 12 heures pendant 55 au moins cinq additions, et dans des réservoirs plus grands, on peut ajouter deux fois 0,7 mg/ml.

La désacylation peut être effectuée sur un large intervalle de températures, par exemple d'environ 20 à environ 45 °C. Il est cependant préférable d'effectuer la désacylation à des tem-60 pératures d'environ 25 à environ 30 °C, et une température d'environ 26 °C particulièrement préférée, pour une désacylation et une stabilité optimales du substrat et du noyau.

D. Le substrat es II est préférable d'utiliser comme substrats des antibiotiques purifiés. Les substrats antibiotiques ont une activité antifongique mais non antibactérienne. Ainsi, les substrats peuvent abriter des cellules bactérielles ou des spores qui pour-

646701

10

raient se développer dans le milieu de fermentation de désacy- plan enzymatique peuvent être réutilisés. Par exemple, les lation. De telles impuretés peuvent nuire à la réaction de dés- mycéliums de A. utahensis NRRL 12052 conservent une acti-

acylation ou à la stabilité des antibiotiques de départ ou des vité de désacylase après conservation pendant un mois ou noyaux obtenus. Il est donc important que les substrat soient plus sous réfrigération (4-8 °C) ou à l'état congelé (—20 °C).

stériles. Comme le passage à l'autoclave détruit la majeure 5 Une solution tampon préférée est le tampon phosphate 0,1

partie des substrants antibiotiques, il est préférable de stèrili- M.

ser les préparations par traitement par l'oxyde d'éthylène dans un système sous pression. G. Enzymes immobilisées

Un autre procédé de mise en œuvre de la désacylation con-

E. Contrôle de la désacylation 10 siste à immobiliser l'enzyme par des procédés connus dans le Les substances de départ sont des antibiotiques antifongi- domaine. (Voir, par exemple, «Biomédical Applications of ques qui sont particulièrement actifs vis-à-vis de Candida albi- Immobilized Enzymes and Proteins», Thomas Ming Swi cans. Pour cette raison, une analyse utilisant C. albicans est Chang, Ed., Plenum Press, New York, 1977; Vol. 1). L'enzy-préférable pour déterminer les quantités de substrats présents, me immobilisée peut ensuite être utilisée dans une colonne (ou

Les noyaux qui se forment sont solubles dans l'eau mais sont 15 tout autre type approprié de réacteur) pour effectuer la dés-

inactifs sur le plan biologique. Une diminution de l'activité acylation.

biologique est donc un essai présomptif rapide de désacyla- En outre, le microorganisme peut lui-même être immobili-

tion. Des échantillons de bouillons et des extraits alcooliques sé et utilisé pour catalyser la réaction de désacylation.

des solides de fermentation doivent tous deux être analysés car les substrats ne sont que légèrement solubles dans le 20 Utilité des noyaux bouillon. Les noyaux et leurs sels d'addition d'acides sont des intermédiaires utilisables pour la préparation de composés anti-

F. Utilisation des cellules restantes fongiques synthétiques.

Un autre procédé de désacylation consiste à recueillir les cellules à'Actinoplanaceae du milieu de culture, à mettre à 25 Ces composés sont représentés par la formule suivante III

nouveau les cellules en suspension dans une solution tampon dans laquelle R]3 R2, R3 et R4 sont tels que définis pour la foret à effectuer la désacylation comme décrit dans le paragraphe mule I et R5 a diverses définitions (Voir les demandes corres-

C. Quand on utilise ce procédé, les mycéliums actifs sur le pondantes mentionnées page 23, ligne 39 ci-dessus.

III

On prépare les composés de formule III en acylant le leurs procédés d'utilisation comme agents d'acylation d'une noyau approprié sur le groupement a-amino de la partie orni- amine primaire sont connus de l'homme de l'art. Les dérivés thine du noyau par la chaîne latérale acyle appropriée en utili- activés préférés sont:

sant des procédés connus dans le domaine pour former une 60 (a) un halogénure d'acide (par exemple un chlorure liaison amide. L'acylation est généralement effectuée en fai- d'acide),

sant réagir le noyau avec un dérivé activé de l'acide corres- (b) un anhydride d'acide (par exemple un anhydride d'aci-

pondant à la chaîne latérale acyle désirée. de alcoxyformique ou un anhydride aryloxyformique) ou

L'expression «Dérivé activé» désigne un dérivé qui rend la (c) un ester activé (par exemple un ester 2,4,5-trichloro-fonction carboxy de l'agent d'acylation réactif à la copulation 65 phénylique).

avec le groupement amino primaire pour former la liaison D'autres procédés d'activation de la fonction carboxy amide qui lie la chaîne latérale acyle au noyau approprié. Les comprennent la réaction de l'acide carboxylique avec un car-dérivés activés appropriés, leurs procédés de préparation et bonyldiimide (par exemple le N,N'-dicyclohexylcarbodiimide

11

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ou le N,N'-diisopropylcarbodiimide) pour obtenir un intermédiaire réactif qui, en raison de son instabilité, n'est pas isolé, la réaction avec l'amine primaire étant alors effectuée in situ.

Si un amino acide particulier contient un groupement fonctionnel acylable autre que le groupement amino, il est entendu pour l'homme de l'art qu'un tel groupement doit être protégé avant la réaction de l'amino acide avec le réactif utilisé pour fixer le groupement N-alcanoyle ou N-alcénoyle. Des groupements protecteurs appropriés peuvent être un quelconque groupement connu dans le domaine comme utilisable pour la protection d'un groupement fonctionnel de chaîne latérale dans la synthèse des peptides. De tels groupements sont bien connus et le choix d'un groupement protecteur particulier et son procédé d'utilisation seront facilement appréciés de l'homme de l'art [Voir, par exemple, «Protective Groups In Organic Chemistry», M. McOmie, Editor, Plenum Press, N.Y., 1973].

Les composés de formule III inhibent la croissance des champignons pathogènes et sont donc utilisables pour lutter contre la croissance des champignons sur des surfaces environnementales (en tant qu'antiseptique) ou dans le traitement d'infections provoquées par des champignons. Les composés sont, en particulier, actifs vis-à-vis de Candida albicans et sont donc particulièrement utiles pour traiter la Candidose. L'activité des composés peut être déterminée par des modes opératoires d'essais microbiologiques classiques, comme in vitro par des essais de diffusion de disques sur plaque de gélose ou des essais de diffusion sur gélose, ou in vivo dans des essais sur des souris infectées par C. albicans. Les composés sont également actifs vis-à-vis de trichophyton mentagrophytes (organisme dermatophyte), Saccharomycespastorianus et Neurospora crassa.

Certains composés (Comme indiqué dans l'Exemple de Référence 19, Tableau VIII) donnent des taux significatifs dans le sang après administration par voie orale chez les souris.

Quand on administre à un chien par voie intraveineuse à une dose de 100 mg/kg par jour pendant 5 jours, le composé de formule III où R5 est un groupement p-(n-octyloxy)-ben-zoyle, on n'observe aucun signe extérieur de toxicité bien que l'on observe des taux temporairement accrus de transaminase glutamo-pyruvique sérique.

Quand on les utilise de façon systématique, la dose de composés de formule III variera selon le composé particulier que l'on utilise, la sévérité et la nature de l'infection, et l'état physique du sujet que l'on traite. La thérapie doit être amorcée à de faibles doses, et la dose doit être accrue jusqu'à ce que l'on obtienne l'effet antifongique désiré. Les composés peuvent être administrés par voie intraveineuse ou intramusculaire par injection sous forme d'une solution ou suspension aqueuse stérile à laquelle on peut ajouter, si on le désire, des agents classiques pharmaceutiquement acceptables comme des agents de conservation, des agents tampons, des agents de solubilisation ou de mise en suspension. D'autres additifs, comme la solution saline ou le glucose, peuvent être ajoutés pour rendre les solutions isotoniques. Les proportions et la nature de ces additifs seront évidentes pour l'homme de l'art.

Certains composés de formule III donnent des taux dans le sang significatifs après administration par voie orale (Voir l'Exemple de référence 19, Tableau VIII) et peuvent être administrés de façon systématique par voie orale. Pour l'utilisation par voie orale, de tels composés peuvent être administrés en combinaison avec des supports ou excipients pharmaceutiquement acceptables sous forme de capsules, de comprimés ou de poudres. La nature et la proportion de ces supports ou excipients sont connus de l'homme de l'art.

Quand on les utilise pour traiter des infections vaginales dues à Candida, les composés de formule III peuvent être administrés en combinaison avec des excipients classiques pharmaceutiquement acceptables convenant pour l'utilisation intravaginale. Les compositions conçues pour l'administration intravaginale sont connues de l'homme de l'art.

s Pour permettre de mieux comprendre cette invention, on donne les exemples suivants:

Préparation 1

Fermentation d'Actinoplanes utahensis NRRL 12052 On prépare une culture mère A'Actinoplanes utahensis 10NRRL 12052 et on l'entretient sur une culture inclinée de gélose. Le milieu utilisé pour préparer la culture inclinée est choisi parmi l'un des suivants:

Milieu A 15 Ingrédient Farine d'avoine pour bébé Levure k2hpo4

Solution minérale de Czapek* 20 Gélose Eau désionisée

Quantité 60,0 g 2,5 g 1,0 g 5,0 ml 25,0 g q.s.p. 1 litre le pH avant passage à l'autoclave est environ 5,9; on ajuste le pH à 7,2 par addition de NaOH; après passage à l'autocla-25 ve, le pH est d'environ 6,7.

* La solution minérale de Czapek a la composition suivante:

Ingrédient 30 FeS04.7H20 (dissous dans 2 ml d'HCl concentré)

KCl

MgS04.7H20 Eau désionisée

35

Milieu B Ingrédient

Dextrine de pomme de terre Extrait de levure 40 Hydrolysat enzymatique de caséine *

Extrait de boeuf Dextrose Amidon de maïs 45 Peptone de viande Mélasse noire MgS04.7H20 CaC03

Solution minérale de Czapek so Gélose Eau désionisée

Quantité

2g 100 g 100 g q.s.p. 1 litre

Quantité 5,0 g 0,5 g

3,0 g 0,5 g 12,5 g 5,0 g 5,0 g 2,5 g 0,25 g 1,0 g 2,0 ml 20,0 g q.s.p. 1 litre

* N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, New Jersey, U.S.A.

55 On inocule la culture inclinée avec Actinoplanes utahensis NRRL 12052, et on fait incuber la culture inoculée à 30 °C pendant environ 8 à 10 jours. On utilise à peu près la moitié de la culture pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante:

60

Ingrédient

Farine d'avoine pour bébé

Saccharose

Levure

65 Grains séchés de distillation * K2HP04

Solution minérale de Czapek Eau désionisée

Quantité 20,0 g 20,0 g 2,5 g 5,0 g 1,0 g 5,0 ml q.s.p. 1 litre

646 701

12

ajuster à pH 7,4 avec NaOH; après passage à l'autoclave, le pH est d'environ 6,8.

* National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, New York, U.S.A.

On fait incuber le milieu végétatif inoculé dans un falcon Erlenmeyer de 250 ml à large encolure à 30 °C pendant environ 72 heures sur un agitateur tournant sur un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

On peut utiliser ce milieu végétatif incubé directement pour inoculer un milieu végétatif de second stade. Ou bien et de préférence, on peut le conserver pour un usage ultérieur en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour une telle conservation dans de nombreuses petites ampoules comme suit: dans chaque ampoule, on place 2 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol et de lactose [voir W.A. Dailey et C.E. Higgens, «Préservation and Storage of Microorganisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10,364-367 (1973) pour les détails]. Les suspensions ainsi préparées sont conservées dans la phase vapeur de l'azote liquide.

On utilise une suspension conservée (1 ml) ainsi préparée pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif de premier stade (ayant la composition décrite ci-avant). On fait incuber comme décrit précédemment le milieu végétatif de premier stade inoculé.

Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml du milieu végétatif de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de second stade ayant la même composition que le milieu végétatif de premier stade. On fait incuber le milieu de second stade dans un flacon Erlenmeyer de 2 litres à large encolure à 30 °C pendant environ 48 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

On utilise le milieu végétatif de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, pour inoculer 1001 d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants:

Milieu I

Ingrédient

Quantité (gjl)

Farine d'arachide

10,0

Peptone de viande soluble

5,0

Saccharose

20,0

kh2po4

0,5

k2hpo4

1,2

MgS04.7H20

0,25

Eau du robinet q.s.p. 1 litre

Milieu III

Ingrédient

Quantité (gjl)

Glucose

20,0

NH4C1

3,0

5Na2S04

2,0

ZnCl2

0,019

MgCl2.6H20

0,304

FeCl3.6H20

0,062

MnCI2.4H20

0,035

io CuCl2.2H20

0,005

CaC03

6,0

kh2po4*

0,67

Eau du robinet q.s.p. 1 litre

Le pH du milieu est environ 6,9 après stérilisation par passage à l'autoclave à 121 °C pendant 45 minutes sous une pression d'environ 1,1 à 1,24 bar.

15 * Stérilisé séparément et ajouté de façon aseptique Le pH final est d'environ 6,6.

On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans une cuve de fermentation de 1651 à une température d'environ 30 °C pendant environ 42 heures. On agite le milieu de 20 fermentation avec des agitateurs classiques à environ 200 tours par minute et on l'aère avec de l'air stérile pour maintenir le taux d'oxygène dissous supérieur à 30% à la saturation par l'air à la pression atmosphérique.

25 Préparation 2

Préparation du mélange antibiotique A-42355 A. Fermentation en flacon agité

On prépare une culture à'Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 et on la maintient sur une gélose inclinée de 18 30 x 150 ml, préparée avec un milieu ayant la composition suivante:

Ingrédient Quantité

Glucose 5 g

35 Extrait de levure 2 g

CaC03 3 g

Jus de légumes* 200 ml

Gélose" 20 g

Eau désionisée q.s.p. 1 litre

40

(pH initial 6,1)

* Jus V-8, Campbell Soup Co., Camden, N.J., U.S.A. ** Meer Corp.

La culture inclinée est inoculée avec Aspergillus nidulans 45 var. roseus NRRL 11440 puis on fait incuber la culture à 25 °C pendant environ sept jours. On recouvre d'eau la culture inclinée mûre et on la gratte avec une anse stérile pour libérer les spores. La suspension résultante est ensuite mise en suspension dans 10 ml d'eau désionisée stérile.

so On utilise 1 ml de la culture inclinée en suspension pour inoculer 55 ml de milieu végétatif dans un falcon de 250 ml. Le milieu végétatif a la composition suivante:

Milieu II

Ingrédient

Quantité (gjl)

Saccharose

30,0

Peptone

5,0

k2hpo4

1,0

KCl

0,5

MgS04.7H20

0,5

FeS04.7H20

0,002

Eau désionisée q.s.p. 1 litre

On ajuste le pH à 7,0 avec HCl; après passage à l'autoclave, le pH est d'environ 7,0.

Ingrédient Quantité

55 Saccharose 25 g

Mélasse noire 36 g

Liqueur de macération de maïs 6 g

Extrait de malt 10 g

K2HP04 2 g «o Hydrolysat enzymatique de caséine* 10 g

Eau du robinet 1100 ml

(pH initial 6,5-6,7)

65 * N-Z-Case, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J., U.S.A.

On fait incuber le milieu végétatif inoculé à 25 °C pendant 48 heures, à 250 tours par minute, sur un agitateur de type ro

13

646 701

tatif. Après 24 heures, on homogénéise le milieu pendant une minute à faible vitesse dans un mélangeur (de type Waring), puis on le fait incuber à nouveau pendant les 24 heures restantes. Ou bien, on peut faire incuber le milieu végétatif inoculé pendant 48 heures puis l'homogénéiser pendant 15 secondes à faible vitesse.

Ce milieu végétatif incubé peut être utilisé pour inoculer un milieu de culture de fermentation en flacon agité ou pour inoculer un milieu végétatif de second stade. On peut également le conserver pour une utilisation ultérieure, en maintenant la culture dans la phase vapeur de l'azote liquide. On prépare la culture pour cette conservation dans de nombreuses petites ampoules, comme suit:

On mélange les cultures végétatives volume/volume avec une solution de suspension ayant la composition suivante:

Ingrédient Glycérol Lactose Eau désionisée

Quantité 20 ml 10 g q.s.p. 100 ml

Milieu IV Ingrédient ZnS04.7H20 Peptone de viande soluble*

Farine de soja Dextrine de tapioca** Mélasse noire Hydrolysat enzymatique de caséine***

Na2HP04 MgS04.7H20 FeS04.7H20 Huile de coton Antimoussant* ** * Eau du robinet

Quantité 0,00455 g/1

30,5 15,5 2,0 10,5

8,5 4,5 5,5 0,1 40,0 1,0 1000,0

g/1 g/1 g/1 g/1

g/1 g/1 g/1 g/1 ml ml ml

(pH initial 6,8-7,0)

* Peptone, Amber Laboratories, Juneau Wisconsin, U.S.A.

** Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur, Illinois, U.S.A. *** N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J. U.S.A.

**** P2000, Dow Corning, Midland, Michigan, U.S.A.

Milieu V Ingrédient Glucose Amidon 5 Peptone de viande soluble* Mélasse noire CaC03 MgS04.7H20 Hydrolysat enzymatique io de caséine** Antimoussant* **

Eau du robinet

Quantité

2,5 1,0 1,0 1,0 0,2

% % % % %

0,05%

0,4 %

0,02%

q.s.p. volume

On répartit les suspensions préparées dans de petits tubes stériles à bouchon vissé (4 ml par tube). On conserve ces tubes dans la phase vapeur de l'azote liquide.

On peut utiliser une suspension conservée ainsi préparée pour inoculer des cultures inclinées ou des milieux d'ensemencement liquides. On fait incuber les cultures inclinées à 25 °C à la lumière pendant 7 jours.

B. Fermentation en réservoir

Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml de la culture végétative de premier stade incubé pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif de second stade ayant la même composition que celui du milieu végétatif. Le milieu de second stade est incubé dans un flacon Erlen-meyer à large ouverture de deux litres, à 25 °C pendant 24 heures, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.

Le milieu de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit ci-dessus, est utilisé pour inoculer 100 litres d'un milieu de production stérile choisi parmi l'un des suivants:

* O.M. Peptone 15 ** N-Z-Amine A

*** Antifoam «A», Dow Corning On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 1651 à une température de 25 °C pendant 7 jours. On aère le milieu de fermentation avec 20 de l'air stérile, en maintenant le niveau d'oxygène dissous supérieur à environ 50% de la saturation en air.

C. Milieu végétatif de troisième stade Si l'on effectue la fermentation dans des réservoirs plus 25 grands que ceux utilisés pour la fermentation par 100 litres, il est recommandé d'utiliser une culture végétative de troisième stade pour ensemencer le réservoir plus grand. Un milieu végétatif de troisième stade préféré a la composition suivante:

30 Ingrédient Saccharose Mélasse noire Liqueur de macération de maïs 35 Hydrolysat enzymatique de caséine*

Extrait de malt k2hpo4

Eau du robinet

40

Quantité 25 g 25 g

6g

10 g 10 g 2g 1000 ml

(pH initial 6,1)

* N-Z-Case

Préparation 3 45 Séparation du mélange antibiotique A-42355

On agite soigneusement le bouillon de fermentation entier (4127 litres), obtenu par le procédé décrit dans l'Exemple 1 en utilisant le milieu de production II, avec 4280 litres de méthanol pendant une heure, puis on filtre, en utilisant un adjuvant so de filtration (Hyflo Supercel, une terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.). On ajuste le pH du filtrat à 4,0 par addition d'HCl 5 N. On extrait le filtrat acidifié deux fois avec des volumes égaux de chloroforme. On réunit les extraits chloroformiques et on les concentre sous vide jusqu'à un vo-55 lume de 20 litres. On ajoute ce concentré à 200 litres d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355. On sépare le précipité par filtration et l'on obtient 2775 g du mélange A-42355 sous forme d'une poudre blanc gris.

60 Séparation et identification des facteurs de A-30912 Préparation 4

Séparation du facteur A de A-30912 On dissout 1 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 7 ml d'un mé-65 lange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit dans une colonne en verre de 3,7 cm de diamètre intérieur et de 35 cm de longueur [Colonne de Chromatographie CLFPCE* (Chromatographie liquide sous

646701

14

faible pression de caractéristiques élevées) Michel-Miller, Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ 08360] garnie de résine à phase inverse de gel de silice LP-1/C18 (10-20 microns), qui a été préparée comme décrit dans la Préparation 10, par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie dans le système 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, à l'aide du mode opératoire de garnissage en suspension décrit dans la Préparation 11. Une pompe F.M.I. avec une conception de piston sans vannes (débit maximal 19,5 ml/minute) est utilisée pour déplacer le solvant dans la colonne à un débit de 9 ml/minute à 7 bars, des fractions étant recueillies toutes les minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Super-ior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6).

Préparation 5

Séparation du facteur B de A-30912 On sépare le mélange A-42355 comme décrit dans la Préparation 3, mais on Chromatographie les extraits chlorofor-miques concentrés (2851) sur une colonne de gel de silice (1501 de gel de silice Grâce, qualité 62) à un débit de 21/minu-te. On lave la colonne avec 200 litres de choroforme, on l'élue avec 500 litres d'acétonitrile, puis on l'élue continuellement avec un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau à un débit de 1 1/minute. On recueille des fractions ayant un volume de 200 litres et on les analyse séparément pour déterminer leur activité biologique. L'analyse biologique est effectuée par une analyse sur disque de papier sur plaque de gélose, ensemencée par Candida albicans. On réunit les fractions 77 à 103 (1365 litres) et on les concentre sous vide. La solution concentrée (4,5 litres) contient un précipité qu'on enlève par filtration et l'on obtient 119 g de mélange A-42355 enrichi en facteur B. On concentre le filtrat à siccité. On redissout le résidu obtenu dans un volume approprié de méthanol. On ajoute la solution méthanolique à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le complexe antibiotique contenant le facteur B. On sépare également ce précipité par filtration et on le sèche, et l'on obtient 24 g supplémentaires de mélange A-42355 enrichi de facteur B sous forme d'une poudre grise.

Le mélange A-42355 enrichi en facteur B ainsi obtenu (1,0 g) est dissous dans 8 ml d'un mélange de 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (Colonne Michel-Miller de 3,7 cm de diamètre intérieur x 33 cm) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne est garnie d'une résine à phase inversée de gel de silice LP-1/ C18 (10-20 microns) préparée comme décrit dans la Préparation 10, à l'aide du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, comme décrit dans la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 10 ml/minute à environ 7 bars, en utilisant une pompe FMI à piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme dans la Préparation 15. On réunit les fractions 102-110 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on la lyophilise, ce qui donne 22 mg du facteur B de A-30912.

Préparation 6

Isolement du facteur D de A-30912 On réunit et on Chromatographie sur une colonne de gel de silice (Grâce, qualité 62) les extraits chloroformiques concentrés de deux essais de fermentation (38001 et 40071) obtenus par le procédé décrit dans la Préparation 3. On lave la colonne avec du chloroforme puis on élue avec de l'acétonitrile et un mélange 98:2 d'acétonitrile et d'eau. On recueille des fractions ayant un volume d'environ 2001 et on les soumet à une analyse biologique sur disque de papier sur gélose ensemencée avec Candida albicans. On réunit les fractions actives (8501) et on les concentre sous vide. On ajoute la solution 5 concentrée (0,71) à 10 volumes d'éther diéthylique pour faire précipiter le mélange A-42355 enrichi en facteur D. On enlève ce précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 32 g de mélange A-42355 enrichi en facteur D sous forme d'une poudre grise.

io On dissout le mélange A-42355 enrichi en facteur D ainsi obtenu (1,0 g) dans 5 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile. On filtre cette solution et on l'introduit sur une colonne de gel de silice (colonne Michel-Miller, 3,7 cm de diamètre intérieur x 30 cm) par l'intermédiaire 15 d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. La colonne a été garnie de résine à phase inversée de gel de silice LP-1/C18 (10-20 microns) préparée comme décrit dans la Préparation 10. Le garnissage a été effectué dans un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, selon le mode opératoire de gar-2c nissage de la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 3,1 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes. On recueille une fraction toutes les 2 minutes. L'élution de l'antibiotique est contrôlée à 280 nm comme décrit dans la Prépa-25 ration 4. On réunit les fractions 96-108 et on les concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout cette huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 89 mg du facteur D de A-30912.

30 Préparation 7

Séparation du facteur H de A-30912 On dissout 5,0 g du mélange antibiotique A-42355, préparé comme décrit dans les Préparations 2 et 3, dans 35 ml du mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile, on filtre la 35 solution résultante et on l'introduit sur ime colonne de verre de 3,7 cm de diamètre intérieur x 42 cm (colonne Michel-Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système de vannes. La colonne est garnie de résine à phase inversée de gel de silice LP-1/Ci8 (10-20 microns) (Préparation 10) dans ■»o un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme décrit dans la Préparation 11. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 13 ml/minute à environ 8,3 bars, en utilisant une pompe FMI à conception de piston sans vannes, et l'on recueille une fraction toutes les deux minutes. On contrô-« le l'élution de l'antibiotique à 280 nm comme décrit dans la Préparation 19, paragraphe C. On réunit les fractions 112— 132 avec les fractions 106-117 d'une seconde purification similaire. Les fractions réunies sont concentrées sous vide jusqu'à une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-50 butanol et on lyophilise pour obtenir 173 mg du facteur H brut de A-30912.

On dissout le facteur H brut de A-30912 (150 mg) dans 8 ml d'un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile; on filtre la solution résultante et on la réintroduit sur une co-55 lonne de verre de 2,0 cm de diamètre intérieur x 32 cm, comme décrit ci-dessus. Le solvant se déplace dans la colonne à un débit de 8 ml/minute à environ 5,5 bars, et on recueille une fraction toutes les 3 minutes. On contrôle l'élution de l'antibiotique à 280 nm. On réunit les fractions 17 et 18 et on les 60 concentre sous vide pour obtenir une huile. On dissout l'huile dans un petit volume de t-butanol et on lyophilise pour obtenir 29 mg du facteur H de A-30912.

Identification des facteurs de A-30912 65 Les différents facteurs de A-30912 peuvent être identifiés par Chromatographie sur couche mince (CCM). Les Rf des facteurs A à G de A-30912, en utilisant la CCM sur gel de silice (Merck, Darmstadt), un système solvant 7:3 de benzène et

15

646 701

de méthanol et un bioautographe par Candida albicans sont indiqués dans le Tableau VII.

Tableau VII

Facteur de

A-30912

A

B

C

D

E

F

G

Rf

0,35

0,45

0,54

0,59

0,27

0,18

0,13

Les Rr approximatifs des facteurs A, B, C, D et H de A-30912 dans différents systèmes solvants, en utilisant une CCM sur gel de silice (plaques de gel de silice n° 60 de Merck Darmstadt, 20 x 20 cm) et un bioautographe par Candida albicans, sont donnés dans le Tableau VIII.

Tableau VIII

Facteur de A-30912

Rf-Systèmes solvants

a b

c d

Facteur A

0,28

0,14

0,28

0,43

Facteur B

0,39

0,21

0,42

0,47

Facteur C

0,46

0,31

0,51

0,58

Facteur D

0,50

0,38

0,57

0,61

Facteur H

0,42

0,27

0,36

0,53

Systèmes solvants a: acétate d'éthyle:méthanol (3:2)

b: acétate d'éthyle:méthanol (7:3)

c: acétonitrile:eau (95:5)

d: acétate d'éthyle:éthanol:acide acétique (40:60:0,25) On peut également identifier les facteurs A, B, D et H de A-30912, par Chromatographie liquide sous faible pression de caractérisitques élevées (CLPFCE) analytique, dans les conditions suivantes:

Colonne Garnissage

Solvant

Volume de l'échantillon

Dimension de l'échantillon

Température de la colonne

Débit

Pression

Détecteur

Pompe Injection verre, 0,8 x 15,0 cm

Nucleosil 10-C]8 (Machery Nagel and Company); garni en utilisant le mode opératoire de garnissage en suspension de la Préparation 11

Mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile

8 ni

8ng ambiante 1,8 ml/minute environ 14 bars

UV à 222 nm (ISCO Model 1800 Variable Wavelength UV-visible Absorbance Monitor)

LDC Duplex Minipump injection sur boucle

Les durées de rétention approximatives pour les facteurs A, B, D et H de A-30912 dans ces conditions sont résumées dans le Tableau IX.

Tableau IX

Facteur de A-30912 Temps de rétention (s) A 792 B 870 H 990

D 1 140

Préparation 8

Préparation de l'antibiotique S31794/F-1 On produit l'antibiotique S31794/F-1 par culture en immersion à?Acrophialophora limonispora NRRL 8095, en agi-s tant, remuant et/ou aérant à pH 3-8, de préférence 5-7, et à 15-30 °C, de préférence à 18-27 °C, pendant 48 à 360 heures, de préférence pendant 120 à 288 heures.

On isole l'antibiotique S31794/F-1 par traitement du bouillon de culture (90 L) avec un mélange 4:1 (90 L) d'acéta-îo te d'éthyle et d'isopropanol et en homogénéisant pendant 30 minutes à la température ambiante. On sépare la phase organique et on l'évaporé sous vide à environ 40 °C. On Chromatographie le résidu ainsi obtenu sur environ dix fois sa quantité de gel de silice, en utilisant des mélanges de chloroforme et 15 de méthanol (95:5 à 60:40). On réunit les fractions qui ont une activité antifongique et on les Chromatographie sur 100 fois leur quantité de «Sephadex LH-20» avec du méthanol. Les fractions provenant de la colonne de Sephadex et qui ont une activité antifongique sont réunies et rechromatographiées sur 20100 fois leur quantité de gel de silice (0,05-0,2 mm) avec un système solvant 71:25:4 de chloroforme, de méthanol et d'eau. Les fractions éluées qui ont une activité antifongique sont réunies et évaporées sous vide pour obtenir l'antibiotique brut S31794/F-1. On dissout ce produit dans de petites quan-25 tités de méthanol et on le précipite avec de l'éther diéthylique pour obtenir S31794/F-1 sous forme d'une poudre amorphe blanche, p.f. 178-180 °C (décomposition) après séchage sous vide poussé à 25-30 "C. La cristallisation dans dix fois son volume de mélange 80:12:8 d'acétate d'éthyle, de méthanol et 30 d'eau donne S31794/F-1 cristallisé, p.f. 181-183 °C avec décomposition après séchage sous vide poussé à 20 °C.

Préparation 9

Séparation de l'antibiotique S31794/F-1 35 On introduit l'antibiotique S31794/F-l brut, obtenu comme décrit dans la Préparation 8 après Chromatographie sur Sephadex, sur une colonne de gel de silice (colonne Michel-Miller) par l'intermédiaire d'une boucle à l'aide d'un système à vannes. On utilise le mode opératoire de garnissage en sus-40 pension décrit dans la Préparation 11. On déplace le solvant dans la colonne en utilisant une pompe FMI avec une conception de piston sans vannes. On contrôle l'élution de l'antibiotique en utilisant un appareil de contrôle UV à 280 nm comme dans la Préparation 22. On réunit les fractions ayant une 45 activité antifongique et on les concentre sous vide pour obtenir l'antibiotique S31794/F-1.

S31794/F-1 a les Rf suivants par Chromatographie sur couche mince de gel de silice (Merck, 0,25 mm):

50 Système solvant Chloroforme:méthanol:eau (71:25:4)

Chloroforme:méthanol:acide acétique concentré (70:29:1) 55 Chloroforme:méthanol (2:1)

Rf 0,17

0,19 0,27

S31794/F-l peut également être détecté par de la vapeur d'iode.

60

Préparation 10

Préparation de la résine à phase inversée de gel de silice/CIS Etape 1: Hydrolyse

On ajoute 1000 g de gel de silice LP-1 (Quantum Corp., 65 maintenant Whatman) à un mélange de 1650 ml d'acide sul-furique concentré et de 1650 ml d'acide nitrique concentré dans un ballon à fond rond de 51 et on agite pour obtenir une suspension appropriée. On chauffe le mélange sur un bain de

646701

16

vapeur pendant une nuit (16 heures) avec un réfrigérant à re- 2. Peser le matériau de garnissage (100 g pour 200 ml de froidissement d'eau fixé sur le ballon. colonne).

On refroidit le mélange dans un bain de glace et on le filtre 3. Ajouter environ 5 volumes de solvant au matériau de soigneusement en utilisant un entonnoir en verre fritté. On la- garnissage; utiliser un mélange de 70-80% de méthanol et de ve le gel de silice avec de l'eau désionisée jusqu'à pH neutre. 5 20-30% d'eau.

Puis, on lave le gel de silice avec 41 d'acétone et on le sèche 4. Bien agiter jusqu'à ce que toutes les particules soient sous vide à 100 °C pendant deux jours. mouillées, laisser reposer pendant une nuit ou plus longtemps pour assurer une imprégnation complète des particules par le Etape 2: Première silylation solvant. Décanter la liqueur surnageante.

Le gel de silice sec de l'Etape 1 est transféré dans un ballon 10 5. Délayer la résine avec suffisamment de solvant pour à fond rond et mis en suspension dans 3,51 de toluène. On remplir la colonne réservoir. Verser rapidement dans le réser-chauffe le ballon au bain de vapeur pendant deux heures pour voir. La colonne doit être préremplie avec le même solvant et chasser toute l'eau résiduelle par distillation azéotrope. On la colonne réservoir doit être partiellement remplie du solvant ajoute 321 ml d'octadécyltrichlorosilane (Aldrich Chemical avant de verser la suspension. L'utilisation de volumes de sus-Company), et on chauffe le mélange réactionnel à reflux pen- 15 pension plus grands peut également donner de bons résultats; dant une nuit (16 heures) avec une lente agitation mécanique cependant, ceci nécessite (a) un réservoir plus grand ou (b) à 60 °C. On prend soin d'éviter que l'agitateur ne soit trop plusieurs remplissages du réservoir pendant l'opération de près de la partie inférieure du ballon, pour éviter un broyage garnissage.

des particules de gel de silice. 6. Fermer le réservoir avec le bouchon de Teflon en-des-

On laisse le mélange refroidir. On recueille le gel de silice 20 sous de la colonne (voir la Figure 1 du brevet des E.U.A. N° silanisé, on le lave avec 31 de toluène et 31 d'acétone, puis on 4131 547, bouchon N° 3); relier à la pompe; et commencer le sèche à l'air pendant une nuit (16-20 heures). On met le gel immédiatement le pompage du solvant dans les dispositifs au de silice séché en suspension dans 3,51 d'un mélange 1:1 d'à- débit maximum si l'on utilise une pompe Ace Cat. No. cétonitrile et d'eau dans un ballon de 51, on agite soigneuse- 13625-25, ou un système de distribution de solvant similaire ment à la température ambiante pendant deux heures, on fil- 25 (20 ml/minute).

tre, on lave avec 31 d'acétone et on sèche à l'air pendant une 7. Continuer jusqu'à ce que la colonne soit complètement nuit. remplie de l'adsorbant. La pression ne doit pas dépasser la to lérance maximale de la colonne pendant cette opération (14 Etape 3: Deuxième silylation bars pour les colonnes importantes et 21 bars pour les colon-

On répète le mode opératoire de la première silylation en 30 nes analytiques). Dans la plupart des cas, des pressions infé-utilisant 200 ml d'octadécyltrichlorosilane. On chauffe la sus- rieures à 14 bars seront suffisantes.

pension à reflux à 60 °C pendant deux heures, tout en agitant 8. Si la pression dépassait les valeurs maximales, réduire le soigneusement. On recueille le produit final par filtration, on débit et la pression diminuera.

lave avec 31 de toluène et 61 de méthanol, puis on le sèche 9. Après remplissage de la colonne par l'adsorbant, arrê-

sous vide à 50 °C pendant une nuit (16-20 heures). 35 ter la pompe; laisser la pression tomber à zéro; débrancher le réservoir; remplacer le réservoir par une pré-colonne; remplir Préparation 11 la pré-colonne de solvant et d'une petite quantité d'adsor-

Mode opératoire de garnissage en suspension pour les colon- bant, et pomper à la pression maximale jusqu'à ce que la co-nes Michel-Miller lonne soit complètement garnie. Pour une information sup-

Renseignementsgénéraux 40 plémentaire, voir le mode opératoire général. Toujours laisser

On utilise ce mode opératoire pour garnir une colonne de la pression descendre lentement après arrêt de la pompe; ceci résine à phase inversée de gel de silice/C18 comme celle prépa- empêchera la formation de toutes craquelures ou canaux pré-rée par le procédé de la Préparation 10. férentiels dans le matériau de garnissage.

En général, une pression inférieure à 14 bars et des débits 10. Supprimer la pression et débrancher soigneusement la compris entre 5 et 40 ml/minute sont nécessaires pour cette « pré-colonne. Avec une petite spatule, enlever quelques milli-technique de garnissage en suspension; ceci dépend du volume mètres (2-4) de garnissage au sommet de la colonne; placer 1 et des dimensions de la colonne. La pression de garnissage ou 2 filtres au sommet de la colonne; appuyer doucement jus-doit être supérieure à la pression utilisée pendant la sépara- qu'au sommet du matériau de garnissage, et placer un bou-tion réelle de 2 à 3,5 bars; ceci assure qu'il ne se produit pas de chon de Teflon au sommet de la colonne jusqu'à confirmation tassement ultérieur de l'adsorbant pendant les séparations. 50 de l'étanchéité. Relier la colonne à la pompe, introduire la pression (généralement moins de 14 bars) et observer par la Une diminution soudaine de la pression peut provoquer paroi de verre au sommet de la colonne si la résine se tasse da-des craquelures ou des canaux dans le matériau de garnissage, vantage. Si le matériau de garnissage doit continuer à se dépo-ce qui réduirait de façon importante l'efficacité de la colonne. ser (ceci peut être le cas avec les colonnes de dimensions im-II est donc important de laisser la pression descendre lente- 55 portantes), un certain espace mort apparaîtra ou bien, il se ment jusqu'à zéro chaque fois que l'on arrête la pompe. formera des canaux préférentiels et l'étape 9 doit être répétée.

Volume approximatif des colonnes (Colonnes en verre de Ace, Catégorie No., non garnies): 5795-04,12 ml; 5795-10, Préparation 12 110 ml; 5795-16,300 ml; 5795-24,635 ml; et 5796-34,34 ml. Préparation de tétrahydro-A-30912A

Le temps nécessaire pour garnir une colonne en verre peut 60 On dissout dans de l'éthanol le facteur A de A-30912. On varier de quelques minutes à quelques heures, selon la dimen- réduit Pt02 dans de l'éthanol absolu pour former Pt que l'on sion de la colonne et l'expérience de l'opérateur. utilise à son tour pour réduire le facteur A de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous pression Etapes: positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3

1. Relier la colonne de verre à une colonne réservoir par 65 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre un accouplement (le volume de la colonne réservoir doit être sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-deux fois celui de la colonne). Placer les deux colonnes verti- butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-calement avec la colonne réservoir au-dessus. 30912A.

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Préparation 13

Préparation de tétrahydro-A-30912B On dissout dans de l'éthanol le facteur B de A-30912. On réduit Pt02 dans de l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire le facteur B de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-30912B.

Préparation 14

Préparation de tétrahydro-A-30912D On dissout dans de l'éthanol le facteur D de A-30912. On réduit Pt02 dans de l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise à son tour pour réduire le facteur D de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-30912D.

Préparation 15

Préparation de tëtrahydro-A-3Q912H On dissout dans de l'éthanol le facteur H de A-30912. On réduit PtOz dans de l'éthanol absolu pour former Pt que l'on utilise ensuite pour réduire le facteur H de A-30912 par voie catalytique, en utilisant une hydrogénation sous pression positive jusqu'à ce que la réaction soit terminée (environ 2 à 3 heures). On filtre le mélange réactionnel et on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans une petite quantité de t-butanol et on le lyophilise pour obtenir tétrahydro-A-30912H.

Exemple 1

A. Désacylation du facteur A de A-30912

On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de culture incliné A et le milieu de production I et en faisant incuber le milieu de production pendant environ 42 heures. On ajoute au milieu de fermentation le facteur A de A-30912 (340 g de substrat brut qui contiennent environ 19,7 g de facteur A de A-30912, dissous dans 1,51 d'éthanol).

On contrôle la désacylation du facteur A de A-30912 par analyse avec Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité vis-à-vis de C. albicans.

B. Séparation du noyau de A-30912A

On filtre le bouillon de fermentation entier (100 litres), obtenu comme décrit dans le paragraphe A et contenant le noyau d'environ 20 g de facteur A de A-30912. On rejette le gâteau mycéliens. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu (environ 93 litres) sur une colonne contenant 4,5 litres de résine HP-20 (polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) à un débit de 200 ml/minute. On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol (85 litres) à un débit de 200-300 ml/ minute.

On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: On prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle, en utilisant un mode opératoire tel que celui décrit dans l'Exemple de Référence 1. On détermine l'activité de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée) vis-à-vis de Candica albicans. Si la partie aliquote non s traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912A. L'éluat contenant le noyau de A-30912A est concentré sous vide jusqu'à un petit volume et lyophilisé pour obtenir environ 97 grammes de noyau brut.

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C. Purification du noyau de A-30912A par Chromatographie liquide en phase inversée

On dissout 25 grammes du noyau de A-30912A brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe B, dans 300 ml d'un îs mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de Pyridine. On Chromatographie cette solution sur une colonne en acier inoxydable de 4 litres (8 cm x 80 cm) garnie de Lich-roprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne 20 fait partie d'une unité chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 rue du Canal 91160 Longjumeau, France). Le colonne fonctionne à une pression de 6,2-6,9 bars, en donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de 25 contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Av., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6). On recueille par minute des fractions ayant un volume d'environ 500 ml.

30 En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912A, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir 2,6 grammes de noyau. La quantité de solvant nécessaire pour achever cette séparation chromatographique varie de 7 à 8 litres.

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D. Caractéristiques du noyau de A-30912A

(a) Formule brute: C34H51NA5

(b) Poids moléculaire: 797,83.

(c) Solide amorphe blanc, soluble dans l'eau, le diméthyl-40 formamide, le diméthylsulfoxyde et le méthanol; insoluble dans le chloroforme, le tolèune et l'éther diéthylique.

(d) Spectre d'absorption infrarouge (Pastille de KBr). Présente des maxima d'absorption à:

3340 large (OH, liaison hydrogène); 2970,2930 et 2890 4S (étirement de CH, groupements CH3, CH2, CH aliphatiques), 1660 et 1624 (plusieurs groupements carbonyle C=O); 1510— 1550; 1430-1450 (déformation «wagging»); 1310-1340; 1230— 1260; 1080; 835,650 large, et 550 large, cm-1.

50 (e) Le titrage électrométrique dans le diméthylformamide aqueux à 66% indique la présence d'un groupement titrable avec un pKa d'environ 7,35 (pH initial 7,32).

(f) Durée de rétention en CLPE (K'): 11,52 minutes dans les conditions suivantes:

55 Colonne:. 4 x 300 mm

Garniture: Gel de silice/C]8

Solvant: Mélange 1:2:97 d'acétate d'ammonium,

d'acétonitrile et d'eau Débit: 3 ml/minute

60 Pression: 172,5 bars

Détecteur: UV à longueur d'onde variable à 230 nm

Sensibilité: 0-0,4 A.U.F.S.

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Exemple 2

On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de l'Exemple 1, mais on utilise comme substrat té-trahydro-A-30912A.

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Exemple 3

On prépare le noyau de A-30912A et on le purifie par le procédé de l'Exemple 1, mais on utilise comme substrat l'aculéacine A.

Exemple 4

A. Désacylation du facteur B de A-30912

On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant eniron 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur B de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

On contrôle la désacylation du facteur B de A-30912 par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candica albicans ou Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit complète comme le montre la disparition de l'activité.

B. Séparation du noyau de A-30912B

On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu dans une colonne contenant de la résine HP 20 (Polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution de la façon suivante: on prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On détermine l'activité vis-à-vis de Candida albicans de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée). Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912B. On concentre l'éluat contenant le noyau de A-30912B sous vide jusqu'à un petit volume et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

C. Purification du noyau de A-30912Bpar Chromatographie liquide en phase inversée

On dissout le noyau de A-30912B brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe B, dans un mélange 96:2:1:1 d'eau, d'acétonitrile, d'acide acétique et de pyridine. On Chromatographie cette solution sur une colonne garnie de Lichroprep RP-18, granulométrie 25-40 microns (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH). La colonne fait partie d'une unité Chromatospac Prep 100 (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal 91160 Longjumeau, France). On fait fonctionner la colonne à une pression de 6,2-6,9 bars, donnant un débit d'environ 60 ml/minute, en utilisant le même solvant. On contrôle la séparation à 280 nm en utilisant un appareil de contrôle UV (ISCO Absorption Monitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) équipé d'une unité optique (ISCO Type 6).

En se basant sur l'absorption à 280 tun, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912B, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912B purifié.

Exemple 6

A. Désacylation du facteur D de A-30912

On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la préparation I, en utilisant le milieu de production s I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation le facteur D de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

On contrôle la désacylation du facteur D de A-30912 par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou 10 Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit terminée comme le montre la disparition de l'activité.

B. Séparation du noyau de A-30912D

15 On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant de la résine HP-20 (Polymère très poreux DIAION, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, 2o Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. On élue ensuite la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mo-2s de opératoire suivant: On prépare deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On détermine l'activité vis-à-vis de Candida albicans de ce produit et de l'autre partie 30 aliquote (non traitée). Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912D. On concentre sous vide jusqu'à un petit volume l'éluat contenant le noyau de A-30912D et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

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C. Purification du noyau de A-30912Dpar Chromatographie liquide en phase inversée

On purifie le noyau de A-30912D brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B, en utilisant le mode opératoire du 40 paragraphe C de l'Exemple 4.

En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de A-30912D, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912D purifié.

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Exemple 7

On prépare le noyau de A-30912D et on le purifie par le procédé de l'Exemple 6 mais on utilise comme substrat tétrahydro-A-309 12D.

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Exemple 5

On prépare le noyau de A-30912B et on le purifie par le procédé de l'Exemple 4 mais on utilise comme substrat tétrahydro-A-30912B.

Exemple 8

A. Désacylation du facteur H de A-30912

On effectue une fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation I, en utilisant le milieu de production 551. Après fait incuber la culture pendant 48 heures, on ajoute au bouillon de fermentation du facteur H de A-30912 dissous dans une petite quantité de méthanol.

On contrôle la désacylation du facteur H de A-30912 par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans ou 60 de Neurospora crassa. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit terminée comme l'indique la disparition de l'activité.

B. Séparation du noyau de A-30912H

65 On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide ainsi obtenu sur une colonne contenant de la résine HP-20 (Polymère très poreux DIAION,

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HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: On prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre l'une des parties aliquotes jusqu'à un petit volume et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de myristoyle. On détermine l'activité de ce produit et de l'autre partie aliquote (non traitée) vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de A-30912H. On concentre sous vide jusqu'à un petit volume l'éluat contenant le noyau de A-30912H et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

C. Purification du noyau de A-30912Hpar Chromatographie liquide en phase inversée

On purifie le noyau de A-30912H brut, obtenu comme décrit dans le paragraphe B, selon le procédé du paragraphe C de l'Exemple 4.

En se basant sur l'absorption à 280 nm, on combine les fractions contenant le noyau de A-30912H, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de A-30912H purifié.

Exemple 9

On prépare le noyau de A-30912H et on le purifie par le procédé de l'Exemple 8, mais on utilise comme substrat té-trahydro-A-30912H.

Exemple 10

On prépare et on purifie le noyau de A-30912H par le procédé de l'Exemple 8, mais on prépare le facteur H de A-30912 à partir du facteur A de A-30912 selon le mode opératoire suivant:

On dissout 19,6 mg de facteur A de l'antibiotique A-30912 dans 1 ml de diméthylformamide. On ajoute à cette solution du méthanol acide (3% de HCl, 0,06 ml). On agite la solution résultante à la température ambiante pendant une nuit puis on l'évaporé à siccité sous vide. On Chromatographie le résidu obtenu par CLPECE comme décrit dans la Préparation 7, en utilisant du gel de silice à phase inversée (LP-1/ C]8, préparé comme décrit dans la Préparation 10) et un mélange 7:2:1 de méthanol, d'eau et d'acétonitrile comme solvant d'élution et l'on obtient 1,4 mg du facteur H de A-30912 (le composé de formule II où R1 et R4 sont tous deux OH, R2 est l'hydrogène, R3 est un groupement méthoxy et R est un groupement linoléoyle).

Exemple 11

On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H de formule I où R3 est un groupement éthoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II où R3 est un groupement méthoxy et R est un groupement linoléoyle. On prépare le substrat par le mode opératoire utilisé dans l'Exemple 10.

Exemple 12

On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H ayant la formule I où R3 est un groupement n-propoxy, mais on utilise comme substat le composé de formule II où R3 est un groupement n-propoxy e R est un groupement linoléoyle. On prépare le substrat comme décrit dans l'Exemple 10.

Exemple 13

On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de A-30912H ayant la formule I où R3 est un groupement isobutoxy, mais on utilise comme substrat le composé 5 de formule II où R3 est un groupement isobutoxy et R est un groupement linoléoyle.

Exemple 14

On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le io noyau de A-30912H de formule I-où R3 est un groupement n-pentyloxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II où R3 est un groupement n-pentyloxy et R un groupement linoléoyle.

15 Exemple 15

On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H de formule I où R3 est un groupement n-hexyloxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II où R3 est un groupement n-hexyloxy et R un 20 groupement linoléoyle.

Exemple 16

On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H de formule I où R3 est un groupe-25 ment éthoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II où R3 est un groupement éthoxy et R un groupement stéaroyle.

Exemple 17

30 On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H de formule I où R3 est un groupement 2-éthyl-l-butoxy, mais on utilise comme substrat le composé de formule II où R3 est un groupement 2-éthyl-l-butoxy et R un groupement linoléoyle.

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Exemple 18

On prépare et on purifie par le procédé de l'Exemple 8 le noyau de type A-30912H ayant la formule I où R3 est un groupement 3-méthyl-l-butoxy, mais on utilise comme 40 substrat le composé de formule II où R3 est un groupement 3-méthyl-1-butoxy et R un groupement linoléoyle.

Exemple 19 A. Désacylation de l'antibiotique S 31794/F-l 45 On effectue la fermentation de A. utahensis comme décrit dans la Préparation 1, en utilisant le milieu de production I. Après avoir fait incuber la culture pendant environ 48 heures, on ajoute au milieu de fermentation l'antibiotique S 31794/ F-l, dissous dans une petite quantié de méthanol.

so On contrôle la désacylation de S 31794/F-l par analyse sur disque de papier vis-à-vis de Candida albicans. On laisse la fermentation se poursuivre jusqu'à ce que la désacylation soit terminée comme le montre la disparition de l'activité.

55 B. Séparation du noyau de S 31794/F-l

On filtre le bouillon de fermentation entier obtenu comme décrit dans le paragraphe A. On rejette le gâteau mycélien. On fait passer le filtrat limpide obtenu sur une colonne contenant une résine HP-20 (Polymère très poreux DIAION, HP-Series, 60 Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon). On rejette l'effluent ainsi obtenu. Puis on lave la colonne avec jusqu'à huit volumes d'eau désionisée à pH 6,5-7,5 pour enlever le bouillon filtré résiduel. On rejette cette eau de lavage. Puis on élue la colonne avec une solution 7:3 d'eau et de méthanol. 65 On contrôle l'élution en utilisant le mode opératoire suivant: On prélève deux parties aliquotes de chaque fraction éluée. On concentre à un petit volume l'une des parties aliquotes et on la traite par un chlorure d'acide comme le chlorure de

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myristoyle. Ce produit et l'autre partie aliquote non traitée sont analysés pour leur activité vis-à-vis de Candida albicans. Si la partie aliquote non traitée n'a pas d'activité et que la partie aliquote acylée a une activité, la fraction contient le noyau de S-31704/F-1. On concentre sous vide jusqu'à un petit volume l'éluat contenant le noyau de S 31794/F-l et on le lyophilise pour obtenir le noyau brut.

C. Purification du noyau de S 31794/F-l par Chromatographie liquide en phase inversée

On purifie selon le mode opératoire du paragraphe C de l'Exemple 4 le noyau de S 31704/F-l brut obtenu comme décrit dans le paragraphe B ci-dessus.

En se basant sur l'absorption à 280 nm, on réunit les fractions contenant le noyau de S 31794/F-l, on les évapore sous vide et on les lyophilise pour obtenir le noyau de S 31794/F-l purifié.

Préparation d'un premier groupe de dérivés Le mode opératoire suivant illustre la préparation de composés de formule III par la méthode utilisant un «ester actif». Les composés particuliers préparés par ce mode opératoire sont les composés de formule III où R5 est un groupement CH3 (CH2)n-j et R1, R2, R3 et R4 sont tels que définis dans les noyaux correspondants.

Préparation de référence I

Préparation du tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 12,5 g d'acide n-tridécanoïque (Sigma Chemical Co), de 11,5 g de 2,4,5-trichlorophénol et de 12,0 g de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide dans 650 ml de chlorure de méthylène. Puis on filtre le mélange réactionnel et on le sèche sous vide pour obtenir 22 g de tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle. On purifie ce matériau par Chromatographie sur colonne de gel de silice (Woelm) en utilisant du toluène comme éluant. On contrôle les fractions par CCM en utilisant une lumière ultraviolette à courte longueur d'ondes pour la détection. On réunit les fractions contenant le produit purifé et on les concentre sous vide à siccité.

Exemple de référence 1

Acylation du noyau de A-30912A par le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle

On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 6,0 g de tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle et de 4,5 g de noyau de A-30912A dans 600 ml de diméthylfor-mamide (DMF). L'élimination du solvant sous vide laisse un résidu (12 g). On délaie le résidu avec 500 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides résultants avec 500 ml de méthanol. On filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut (5,0 g).

On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme suit:

On injecte un échantillon du produit brut (1 g), dissous dans 5 ml de méthanol, dans une colonne en acier inoxydable de 2,5 x 80 cm garnie de résine LP-1/CI8 (Voir Préparations 10 et 11). On élue la colonne avec un système solvant comprenant un mélange 3:3:3 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 69 à 103,5 bars avec un débit de 11-12 ml/minute en utilisant une pompe duplex LDC (Milton-Roy).On contrôle l'effluent avec un détecteur à ultraviolets (ISCO-UA-5) à 280 nm. On recueille des fractions toutes les deux minutes (21-24 ml). On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les sèche sous vide. On obtient 550 mg de produit. On répète la Chromatographie susmentionnée quatre fois pour obtenir des échantillons purifiés supplémentaires du produit comme suit: 620 mg, 520 mg, 670 mg et 490 mg, soit un poids total de 2,8 g.

En suivant le mode opératoire précédent, on fait réagir 40 g du noyau de A-30912A avec le n-tridécanoate de 2,4,5-s trichlorophényle et l'on obtient 2,6 g du produit cité en titre purifié. On réunit les substances des deux préparations (5,4 g). L'ion masse par SMDC (M+ + Na+): 1016. (Valeur théorique: M+ + Na+ = 1016). La CLPE analytique (C18 Micro Bondapak, Waters Co.) avec comme éluant le système io 2:1:2 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile n'indique qu'un seul pic.

Exemple de référence 2 15 Acylation du noyau de A-30912Bpar le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle

On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5-trichloro-phényle et de 1 mmole de noyau de A-30912B dans 200 ml de 20 DMF. L'élimination du solvant sous vide fournit un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec 300 ml de méthanol et on filtre l'extrait méthanolique qu'on concentre sous vide pour obtenir 25 un produit brut.

On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme suit:

On injecte un échantillon du produit brut (1 g) dissous dans 5 ml de méthanol, dans une colonne en acier inoxydable 30 de 2,5 x 80 cm garnie de résine LP-1/C18 (Voir Préparations 10 et 11). On élue la colonne avec un système solvant consistant en un mélange 3:3:4 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On effectue l'élution à une pression de 69-103,5 bars avec un débit de 11-12 ml par minute en utilisant une pompe duplex 35 LDC (Milton-Roy). On contrôle l'effluent avec un détecteur UV (ISCO-UA 5) à 280 nm. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les sèche sous vide pour obtenir le produit cité en titre. On analyse le produit purifié par CCM en utilisant des plaques C18 à phase inversée (Whatman KC18) et 40 un système solvant consistant en un mélange 1:2:2 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. Après développement, on observe les plaques sous la lumière UV pour détecter le produit.

45 Exemple de référence 3

Acylation du noyau de A-30912D avec le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle

On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5-trichloro-50 phényle et de 1 mmole de noyau de A-30912D dans 200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec 300 ml de méthanol, on filtre 55 l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut. On purifie le produit brut par CLPE à phase inversée comme décrit dans l'Exemple de référence 2.

Exemple de référence 4 60 Acylation du noyau de A-30912Hpar le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle

On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle et de 1 mmole de noyau de A-30912H dans 200 ml de 65 DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides restants avec 300 ml de méthanol, on filtre

21

646 701

l'extrait et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut.

On purifie le produit brut par CLPE en phase inversée comme décrit dans l'Exemple de référence 2.

Exemple de référence 5

On prépare le composé de formule III où R3 est un groupement n-propoxy et R5 est un groupement CH3-(CH2)n-, selon le mode opératoire de l'Exemple de référence 4, mais en utilisant comme substance de départ le composé de formule I où R3 est un groupement n-propoxy (préparé par le procédé de l'Exemple 12).

Exemple de référence 6

Acylation du noyau de S 31794/F-l par le n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle

On agite à la température ambiante pendant 16 heures une solution de 3,3 mmoles de n-tridécanoate de 2,4,5-trichlorophényle et de 1 mmole de noyau de S 31794/F-1 dans 200 ml de DMF. L'élimination du solvant sous vide donne un résidu. On délaie le résidu avec 300 ml de chlorure de méthylène pendant 45 minutes, et on filtre le mélange. On rejette le filtrat. On extrait les solides résultants avec 300 ml de méthanol, on filtre l'extrait méthanolique et on le concentre sous vide pour obtenir un produit brut.

On purifie le produit brut par CLPE en phase inversée comme décrit dans l'Exemple de référence 2.

Préparation d'un second groupe de dérivés Le mode opératoire suivant qui donne la préparation des composés de formule III où R5 est CH3(CH2)i0CONH-

/*—*\

^ • -, illustre le procédé de préparation d'un se-

cond groupe de composés de formule III.

Préparation de référence 2

Préparation de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminoben-zoïque

On ajoute goutte à goutte 8,74 g (40 mmoles) de chlorure de n-dodécanoyle à une solution de 5,5 g (40 mmoles) d'acide p-aminobenzoïque dissous dans 100 ml de pyridine. On agite le mélange pendant 3 heures et on le verse dans 3 litres d'eau. On filtre le précipité qui se forme et on le sèche sous vide et l'on obtient 11,01 g d'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminoben-zoïque.

Préparation de référence 3

Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide N- ( n-dodécanoyl) -p-aminobenzoïque

On dissout dans 250 ml de chlorure de méthylène 11,01 g (34,5 mmoles) d'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoïque, 7,5 g (38 mmoles) de 2,4,5-trichlorophénol et 6,94 g (34,5 mmoles) de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 3 heures et demi, puis on le filtre. On évapore le filtrat sous vide pour obtenir un résidu qu'on cristallise dans un mélange acétonitrile/eau et l'on obtient 12,84 g de l'ester 2,4,5-trichlorophényle de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoïque.

Exemple de référence 7

Acylation du noyau de A-30912A

On dissout 8,16 g (10,2 mmoles) de noyau de A-30912A et 4,72 g (10,2 mmoles) de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoïque dans 100 ml de DMF. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave duex fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité «Prep LC/System 500» (Waters asso-5 ciates, Inc.) en utilisant une colonne Prep Pak-500/C]8 (Waters Associates, Inc.,) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM en utilisant des plaques de gel de silice io et un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile comme système solvant. On réunit les fractions -contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoylé du noyau de A-30912A(3,5 g).

15

Exemple de référence 8

Acylation du noyau de A-30912B On dissout dans 100 ml de diméthylformamide (10,2 mmoles) du noyau de A-30912B et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5-20 trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-amino-benzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 25 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité «Prep LC/System 500» unit (Waters Associates, Inc.), en utilisant une colonne Prep Pak-500/C18 (Water Associates, Inc.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volu-30 me d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme systeme solvant un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le 35 dérivé N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoyle du noyau de A-30912B.

Exemple de référence 9

Acylation du noyau de A-30912D 40 On dissout dans 100 ml de diméthylformamide (10,2 mmoles) du noyau de A-30912D et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-amino-benzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obte-« nir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité «Prep LC/System 500» unit (Waters Associates, Inc.), en utilisant une colonne Prep Pak-500/C18 so (Water associâtes, Inc.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme système solvant un mélange 25:65:10 en volume 55 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzyle du noyau de A-30912D.

«o Exemple de référence 10

Acylation du noyau de A-30912H On dissout dans 100 ml de diméthylformamide, 10,2 mmoles du noyau de A-30912H et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5-trichlorophénilique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-aminoben-65 zoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans

646701 22

50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité «Prep LC/System 500» unit (Waters Associates, Inc.), en utilisant une colonne Prep Pak-500/C18 (Water Associates, Inc.), comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme système solvant un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le io dérivé N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoylé du noyau de A-30912H.

Exemple de référence 11

On prépare le composé de formule III où R3 est un grou- 15

S* %

pement isobutoxy et R5 est CH3(CH2)io CONH-«v •-,

selon le mode opératoire de l'Exemple de référence 9, mais en 20 utilisant comme substance de départ le composé de formule I où R3 est un groupement isobutoxy (préparé par le procédé de l'Exemple 13).

Exemple de référence 12 25

Acylation du noyau de S 31794/F-l On dissout dans 100 ml de diméthylformamide 10,2 mmoles du noyau de S 31794/F-l et 10,2 mmoles d'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide N-(n-dodécanoyl)-p-ami-nobenzoïque. On agite la solution à la température ambiante 30 pendant 15 heures. On chasse le solvant sous vide pour obtenir un résidu qu'on lave deux fois avec de l'éther diéthylique. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 50 ml de méthanol et on le purifie par CLPE en phase inversée à l'aide d'une unité «Prep LC/System 500» unit (Waters 35 Associates, Inc.) comme phase fixe. On élue la colonne de façon isocratique avec un mélange de 25:65:10 en volume d'eau, de méthanol et d'acétonitrile à 34,5 bars. On analyse les fractions par CCM sur plaques de gel de silice et en utilisant comme système solvant un mélange 25:65:10 en volume d'eau, de 40 méthanol et d'acétonitrile. On réunit les fractions contenant le produit désiré et on les lyophilise pour obtenir le dérivé N-(n-dodécanoyl)-p-aminobenzoyle du noyau de S 31794/F-l.

Préparation d'un troisième groupe de dérivés 45

Le mode opératoire suivant qui donne la préparation des composés de formule III où R5 est CH3(CH2)70-*^ (^)

\ /

illustre le procédé de préparation d'un troisième groupe de composés de formule III.

50

Préparation de référence 4

Préparation de l'acide p-(n-octyloxy)benzoïque On ajoute une solution de 19,2 g (150 mmoles) d'acide p- ss hydroxybenzoïque dans 120 ml d'hydroxyde de sodium aqueux à 10% à 480 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) préalablement chauffés à 80 °C. On ajoute goutte à goutte à la solution 28,95 g (150 mmoles) de bromure de n-octyle. On agite le mélange réactionnel pendant 4 heures à la températu- 60 re ambiante, après quoi on le verse dans 1200 ml d'eau glacée. On ajoute 30 ml d'acide chlorhydrique concentré et on laisse le mélange reposer jusqu'à ce que la précipitation soit terminée. On recueille le précipité, on le sèche et on le cristallise dans un mélange acétonitrile/eau, p.f. 97-99 °C. 65

Analyse pour C15H2203:

Calculée: C, 71,97; H, 8,86 Trouvée: C, 71,72; H, 9,10

Préparation de référence 5

Préparation de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p- ( n-octyloxy ) benzoïque

On dissout dans 200 ml de chlorure de méthylène 6,18 g (24,7 mmoles) d'acide p-(n-octyloxy)benzoïque, 5,39 g (27,2 mmoles) de 2,4,5-trichlorophénol et 4,94 g (24,7 mmoles) de N,N'-dicycIohexylcarbodiimide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 18 heures puis on le filtre. On évapore le filtrat pour obtenir une huile, qu'on cristallise dans un mélange d'acétonitrile et d'eau pour obtenir l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzoïque. Analyse RMN: 8 4,02 (2H, t, J=3 Hz), 5 7,0 (1H, d, J=4 Hz), 7,23 (s, 1H), 7,3 (s, 1H), 8,08 (d, 1H, J=4 Hz).

Exemple de référence 13

Acylation du noyau de A-30912A On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 14,2 g (17,8 mmoles) de noyau de A-30912A et 15,32 g (35,7 mmoles) d'ester 2,4,5-trichlorophénylique d'acide p-(n-octyloxy)-benzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les produits de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité «Prep LC/System 500» en utilisant du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants de 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM sur gel de silice (Merck) en utilisant comme système solvant un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912A et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912A;

Rendement: 7,13 g; M+ + 23:1052 (par SMDC).

Exemple de référence 14

Acylation du noyau de A-30912B On dissout dans 150 ml de DMF 17,8 mmoles de noyau de A-30912B et 35,7 mmoles d'ester 2,4,5-trichlorophénylique d'acide p-(n-octyloxy)benzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité «Prep LC/ System 500» et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne par étapes avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912B et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)ben-zoylé du noyau de A-30912B.

Exemple de référence 15

Acylation du noyau de A-30912D On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles de noyau de A-30912D et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité «Prep LC/System 500» et du gel de silice comme phase fixe.

23

646 701

On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912D et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912D.

Exemple de référence 16

Acylation du noyau de A-30912H On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles de noyau de A-30912H et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité «Prep LC/System 500» et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de A-30912H et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912H.

Exemple de référence 17

On prépare le composé de formule III où R3 est un grou-

/*—*\

pement n-hexyloxy et R5 est CH3(CH2)70- -, en

•m»

utilisant le mode opératoire de l'Exemple de référence 16,

mais en utilisant comme substance de départ le composé de formule I où R3 est un groupement n-hexyloxy (préparé par le procédé de l'Exemple 15).

Exemple de référence 18

Acylation du noyau de S 31794IF-1 On dissout dans 150 ml de diméthylformamide 17,8 mmoles de noyau de S 31794/F-l et 35,7 mmoles de l'ester 2,4,5-trichlorophénylique de l'acide p-(n-octyloxy)benzoïque. On agite la solution à la température ambiante pendant 16-20 heures. On chasse le solvant sous vide et on lave le résidu deux fois avec de l'éther diéthylique et deux fois avec du chlorure de méthylène. On rejette les liquides de lavage. On dissout le résidu lavé dans 80 ml d'un mélange 1:3 d'acétate d'éthyle et de méthanol et on le purifie par CLPE en utilisant une unité «Prep LC/System 500» et du gel de silice comme phase fixe. On élue la colonne progressivement avec des systèmes solvants 1:4 à 2:3 de méthanol et d'acétate d'éthyle. On analyse les fractions par CCM en utilisant du gel de silice (Merck) et un mélange 3:2 en volume d'acétate d'éthyle et de méthanol comme système solvant. On réunit les fractions exemptes de noyau de S 31794/F-l et on les lyophilise pour obtenir le dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de S 31794/F-l.

Exemple de référence 19

L'activité antifongique des composés de fomule III peut être démontrée in vitro par des essais de diffusion de disques et des essais de dilution sur gélose et in vivo par des essais clas-5 siques sur des souris qui montrent l'efficacité vis-à-vis d'une infection fongique systémique. Les résultats des essais antifongiques des composés types de formule III sont donnés dans les Tableaux IV à VIII.

Les Tableaux IV et V donnent les résultats de l'essai in vi-10 tro des composés des Exemples de référence 1, 7 et 13 par des procédés de diffusion de disques sur plaques de gélose. L'activité dans le Tableau IV est mesurée par la dimension (diamètre en mm) de la zone d'inhibition du microorganisme observé que produit le composé d'essai. Dans le Tableau V, l'activi-15 té est mesurée par la concentration inhibitrice minimale (CIM) de la substance (mg/disque) nécessaire pour inhiber la croissance de l'organisme d'essai. Le Tableau VI donne les résultats de l'essai in vitro du dérivé p-(n-octyloxy)benzoylé du noyau de A-30912A contre cinq souches de Candida albicans 2o par le procédé de dilution sur gélose. Dans le Tableau VI, l'activité est mesurée par la CIM de la substance (mg/ml) nécessaire pour inhiber l'organisme d'essai.

Les résultats d'essais in vivo pour déterminer l'efficacité des dérivés vis-à-vis d'une infection provoquée par Candida 25 albicans A-26 chez des souris sont donnés dans le Tableau VII. Dans ces essais, l'activité est mesurée par la DE50 (c'est-à-dire la dose en mg/kg nécessaire pour guérir 50% des animaux d'essai). Quand on n'obtient pas de DE50, l'activité est indiquée par la plus faible dose à laquelle on observe un effet 30 antifongique significatif. Dans ces essais, on infecte par voie intraveineuse avec Candida albicans A-26 des groupes de souris albinos mâles (exemptes de pathogènes particuliers) pesant 18 à 20 grammes. On traite les animaux par rayons x 24 heures avant l'infection à environ 50 roentgens par minute pen-35 dant 8 minutes (dose totale de 400) pour réduire les réactions immunologiques à l'organisme infectieux. A 0,4 et 24 heures après l'infection, on donne à chaque groupe de souris des doses progressives par voie sous-cutanée du composé d'essai sous forme d'une suspension dans 33% de polyéthylène glycol 40 (PEG) dans de l'eau. On note le jour de la mort de chaque animal. Une comparaison statistique par l'essai «t» de Student du jour moyen de la mort est effectuée entre chaque groupe d'animaux infectés-traités à une dose particulière et un groupe de 10 animaux infectés-non traités pour déterminer si le traite-45 ment prolonge de façon significative la durée de survie.

Le Tableau VIII donne les résultats de l'essai des composés des Exemples de référence 1,7 et 13 pour déterminer leur absorption après administration par voie orale. Dans ces essais, on gave des souris avec une dose de 416 mg/kg de com-50 posé d'essai en suspension dans un mélange de 33% de PEG 400 et d'eau. A des intervalles de temps, on prélève des échantillons de sang du sinus orbital et on détermine leur activité antibiotique comme suit: on place un disque de 7 nom contenant 20 ml de sang entier sur de la gélose ensemencée avec As-55 pergillus montevidensis A 35137. Après 40 heures d'incubation à 30 °C, on compare les zones d'inhibition des échantillons de sang à un témoin obtenu à partir du composé d'essau, et on calcule la quantité du composé dans l'échantillon de sang.

646701

24

Tableau Vili

Dérivés du noyau de A-30912A

Taux dans le sang après administration orale chez les souris

Exemple de Composés de formule III Taux dans le sang* (mg/ml)

référence R5 =

N°

1 CH3(CH2)ir 0,10

7 CH3(CH2)l0CONH-»^ y*- 0,83

13 CH3(CH2)70-.^ )•- 23,

* Quatre heures après administration par gavage du composé d'essai à une dose de 416 mg/kg sous forme d'une suspension du composé dans 33% de PEG 400 dans l'eau. Composé déterminé par analyse biologique vis-à-vis d'Aspergillus montevidensis A-35137.

Tableau VII

Dérivés du noyau de A-30912A

Activité thérapeutique vis-à-vis de Candida albicans chez les souris

Exemple de Composés de Formule III Programme DE50 (mg/kg) Dose active la plus référence R5 = de

N° dose*

1 CH3(CH2)„- B

7 CH3(CH2)10CONH-V y»- A

13 CH3(CH2)70-< X«- A 13 10

•z:»' 22,2 > 12,5

♦Programmes de dose: A = 40,20,15 et 10 mg/kg; B = 80,40,20 et 10 mg/kg. Les doses sont administrées 0,4 et 24 heures après l'injection sous forme d'une suspension du composé d'essai dans 30% de PEG dans l'eau. Nombre de souris recevant les composés d'essai pour chaque dose: 6 souris par groupe. Nombre de souris dans le groupe témoin (non traité): 10 souris. ** Mesurée par augmentation de la durée de survie des animaux traités par rapport aux témoins, calculée par la méthode de L.J. Reed et H. Muench, Amer. J. Hygiene, 27,493-497 (1938).

faible

(mg/kg)

34

20

15

10

15

> 5

Tableau VI

Activité in vitro du dérivé du noyau de A-30912A où R5 = %

CH3(CH2)70- • • - vis-à-vis de souches de Candida albicans

CIM (jig/ml)

A26 SBH16 SBH31 SBH28 SBH29

0,312 0,312 0,312 0,312 0,312

25

Tableau V

Dérivés du noyau de A-30912A

Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose

646701

Exemple de référence

N°

Composés de Formule III

R5 =

CIM (mg/disque)*

Candida albicans

A-26

>0,302(0,312)*

Trichophyton mentagrophytes # 6

1

CH3(CH2)u-

0,625

0,039

7

CH3(CH2)10CONH-

<f~>-

0,625

>0,039

1,25

0,678

13

CH3(CH2)7(M^

"V

0,156

* Les composés sont en suspension dans une solution de borate de sodium 0,01M, pH 7,5. Les composés sont essayés à 20 mg/disque au niveau supérieur et à des doubles dilutions jusqu'à ce qu'on atteigne les points finals. Incubation : 24 heures à 30 °C.

** vis-à-vis de 5 isolats

Tableau IV

Dérivés du noyau de A-30912A

Activité antifongique par l'essai de diffusion de disque sur plaque de gélose

Composés de Formule III

Zone d'inhibition (mm)a

Exemple de

Saccharomyces

Neurospora

Trichophyton

Candida référence

R5 —

pastorianus crassa mentagrophytes albicans

N°

X-52

846

A-23

A-26

1

CH3(CH2)„-

21

32

60*

30

7

CH3(CH2)10CONH-</ \-

21

33*

55*

23

17

35*

56*

19

13

CH3(CH2)70-<f V-

18

23*

—

28

* Zone d'inhibition mesurable distincte avec nouvelle croissance de l'organisme autour du disque.

a Les composés sont testés sous forme de suspensions méthanoliques à une concentration de 1 mg/ml en plongeant un disque de 7 mm dans la suspension et en le plaçant sur la surface de la gélose.

Incubation: 24-48 heures à 25-37 °C.

C

1 feuille dessins

Claims (18)

1. 646701

   2

   REVENDICATIONS 1. Noyau peptidique cyclique de formule:

   dans laquelle R1 est H ou OH et; quand R1 est H, R2 est H et sé en ce que, dans la formule I, R1 et R4 sont tous deux OH, R3 et R4 sont tous deux H ou tous deux OH, et quand R1 est R2 est H et R3 est un groupement alkyloxy en Q à C6. OH, R2 est H, R3 est OH ou un groupement alkyloxy en Q à 7. Noyau de A-30912H selon la revendication 6, caractéri-

   O 30 sé en ce que R3 est un groupement éthoxy, n-propoxy, iso-

   11 propoxy, n-butoxy, isobutoxy, t-butoxy, n-pentyloxy, n-hex-

   C6 et R4 est OH, ou bien R2 est -C -NH2 et R3 et R4 sont tous yloxy, 2-éthyI-1 -butoxy ou 3-méthyl-1 -butoxy.

   deux OH, et ses sels d'addition d'acides. 8. Noyau de S 31704/F-l selon la revendication 1, caracté-
2. 2. Noyau de A-30912A selon la revendication 1, caractéri- risé en ce que, dans la formule I, R1, R3 et R4 sont tous deux sé en ce que R1, R3 et R4 sont OH et R2 est H. 35 q
3. 3. Noyau de A-30912B selon la revendication 1, caractéri- 11

   sé en ce que, dans la formule I, R1 et R2 sont tous deux H et R3 OH et R3 est -C -NH2.

   et R4 sont tous deux OH. 9. Noyaux selon l'une des revendications 2 à 8 sous forme
4. 4. Noyau de A-30912D selon la revendication 1, caractéri- de leurs sels d'addition d'acides.

   sé en ce que, dans la formule I, R1, R2, R3 et R4 sont tous H. 40 10. Procédé de préparation d'un noyau peptidique cycli-
5. 5. Noyau de A-30912H selon la revendication 1, caractéri- que de formule I selon la revendication 1 et de ses sels d'addi-sé en ce que, dans la formule I, R1 et R4 sont tous deux OH, tion d'acides, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en con-R2 est H et R3 est ch3o-. tact dans un milieu aqueux un antibiotique peptidique cycli-
6. 6. Noyau de A-30912H selon la revendication 1, caractéri- que de formule

   45

   3

   646 701

   dans laquelle R1 est H ou OH et, quand R1 est H, R2 est H et R3 et R4 sont tous deux H ou tous deux OH et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle, et quand R1 est OH, R2 est H et R4 est OH, R3 est OH et R est un groupement stéaroyle, linoléoyle ou palmitoyle, ou bien R3 est un groupement alkyloxy en C) à C6 et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle,

   O

   II

   et quand R1, R3 et R4 sont OH et R2 est-C-NH2, R est un groupement myristoyle, avec une. enzyme de désacylation produite par un microorganisme de la famille des Actinopla-naceae.
7. 11. Procédé selon la revendication 10 pour préparer le noyau de A-30912A, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre les antibiotiques de formule II où R1, R3 et R4 sont OH, R2 est H et R est un groupement linoléoyle, stéaroyle ou palmitoyle, en contact avec une enzyme de désacylation produite par un microorganisme de la famille des Actinoplanaceae.
8. 12. Procédé selon la revendication 10 pour préparer le noyau de A-30912B, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'antibiotique de formule II où R1 et R2 sont tous deux H et R3 et R4 sont tous deux OH et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle, en contact avec une enzyme de désacylation produite par un microorganisme de la famille des Actinoplanaceae.
9. 13. Procédé selon la revendication 10 pour préparer le noyau de A-30912D, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'antibiotique de formule II où R', R2, R3 et R4 sont H et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle, en contact avec une enzyme de désacylation produite par un microorganisme de la famille des Actinoplanaceae.
10. 14. Procédé selon la revendication 10 pour préparer le noyau de A-30912H, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'antibiotique de formule II où R1 et R4 sont OH, R2 est H, R3 est CH30 et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle, en contact avec une enzyme de désacylation produite par un microorganisme de la famille des Actinoplanaceae.
11. 15. Procédé selon la revendication 10 pour préparer un noyau de A-30912H, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'antibiotique de formule II où R1 et R4 sont OH, R2 est H, R3 est un groupement alkyloxy en C2 à C6 et R est un groupement stéaroyle ou linoléoyle, en contact avec une enzyme de désacylation produite par un microorganisme de la famille des Actinoplanaceae.
12. 16. Procédé selon la revendication 10 pour préparer le

    5 noyau de S 31794/F-l, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre l'antibiotique de formule II dans laquelle R1, R3 et R4 sont

    O

    II

    OH, R2 est -C-NH2 et R est un groupement myristoyle, en io contact avec une enzyme de désacylation produite par le microorganisme de la famille des Actinoplanaceae.
13. 17. Procédé selon l'une des revendications 10 à 16, caractérisé en ce que le microorganisme de la famille des Actinoplanaceae est un membre du genre Actinoplanes.

    i5 18. Procédé selon l'une des revendications 10 à 17, caractérisé en ce que le microorganisme est Actinoplanes utahensis.
14. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le microorganisme est A. utahensis NRRL 12052.
15. 20. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce

    20 que le microorganisme est Streptosporangium roseum var. hol-landensis NRRL 12064.
16. 21. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le microorganisme est Actinoplanes missouriensis NRRL 12053.

    25 22. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le microorganisme est Actinoplanes sp. NRRL 12065.
17. 23. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le microorganisme est Actinoplanes sp. NRRL 8122.

    30 24. Procédé selon l'une des revendications 10 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape de séparation du noyau peptidique cyclique ou d'un de ses sels, à partir du milieu de fermentation.
18. 25. Procédé selon l'une des revendications 10 à 24, carac-

    35 térisé en ce qu'il comprend l'étape de purification du noyau peptidique cyclique, ou d'un de ses sels.