BE888296A

BE888296A - Nouveau substrat synthetique pour le titrage d'une activite enzymatique

Info

Publication number: BE888296A
Application number: BE0/204385A
Authority: BE
Original assignee: Toyo Jozo Kk
Priority date: 1980-04-07
Filing date: 1981-04-06
Publication date: 1981-07-31
Also published as: JPS592278B2; JPS56144097A

Description


  : Nouveau substrat synthétique pour le titrage d'une activité enzymatique La présente invention concerne des composés du type amiae qui répondent à la formule de structure générale suivante ;

  

 <EMI ID=1.1> 


  
 <EMI ID=2.1> 

  
 <EMI ID=3.1> 

  
groupe résidu de D-amino acide ou un sel de celui-ci, ainsi qu'un procédé de titrage de la leucine aminopeptidase pour la mise en oeuvre duquel on utilise au moins un des composés précités.

  
 <EMI ID=4.1> 

  
hydrolase (cytosol), EC 3. 4. 11.1., appelée dans la suite du présent mémoire LAP, antérieurement la L-

  
 <EMI ID=5.1> 

  
dans n'importe quels tissus comme aussi dans le sérum et l'on sait que son taux s'accroît dans des conditions pathologiques. On a recours au titrage de la LAP pour l'établissement de diagnostics cliniques dans diverses maladies et l'observation au moment du pronostics.

  
L'analyse en chimie clinique de la LAP se définit en unités G-R (Goldbarg Rutenburg). Une unité G-R égale 2,72 x une unité de LAP internationale (mU/ml). ^Cancer. il$ 283 (195827. 

  
 <EMI ID=6.1> 

  
 <EMI ID=7.1> 

  
butaire d'inconvénients. Les procédés de titrage classiques sont la colorimétrie du composé du type amine

  
 <EMI ID=8.1> 

  
synthèse constitué de L-leucine et du composé du type amine. Lorsqu'un substrat de synthèse, comme le L-leucine-

  
 <EMI ID=9.1> 

  
d'onde de la couleur jaune de la p-nitroaniline formée par l'action enzymatique est chevauchée au moment du titrage colorimétrique et, au surplus, la composition du sérum, en particulier les pigments du type bilirubine, affectent la colorimétrie. Au surplus, lorsque l'on

  
 <EMI ID=10.1> 

  
la couleur formée est colorimétriquement mesurée" par exemple, par la copulation de la &#65533;-naphtylamine formée avec le 5-nitro-2-amino-méthoxybenzène diazotate; la copulation de la 0-naphtylamine diazotée par du nitrate

  
 <EMI ID=11.1> 

  
condensation de la &#65533;-naphtylamine avec le p-diméthylaminobenzaldéhyde ou le p-diméthylaminobenzaldéhyde ou le pdiméthylamino cinnamaldéhyde.

  
Ces procédés de titrage colorimétriques comportent un certain nombre de désavantages, comme un processus

  
de réaction complexe et la nécessité d'un fonctionnement strict. Au surplus, la P-naphtylamine formée est extrêmement toxique et a une activité carcinogène sur la vessie. 

  
Un autre procédé de titrage enzymatique de l'activité de la LAP réside dans l'utilisation du L-leucinamide comme substrat pour la LAP et dans l'incubation de l'ammoniac formé avec de l'a-cétoglutarate, de la

  
 <EMI ID=12.1> 

  
mation en acide glutamique, puis dans la mesure spectrophotométrique du NADH2 oxydé. Lorsque l'on utilise la L-leucyl-L-alanine comme substrat, la L-alamine libérée

  
 <EMI ID=13.1> 

  
la transaminase glutanique-pyruvique pour former de l'acide pyruvique qui est converti en acide lactique par la lactate déhydrogénase, où le NADH2 consomé est soumis à un titrage spectrophotométrique. On connaît également un autre procédé de titrage de la L-leucine déhydrogénase. La L-leucine libérée à partir de la

  
 <EMI ID=14.1> 

  
métriquement titré (brevet japonais mis à la disposition du public N[deg.] 54-119 290). Au surplus, on utilise le L-leucinamide comme substrat et la L-leucine formée est incubée avec de la L-amino acide oxydase pour libérer le peroxyde d'hydrogène que l'on soumet ensuite à un

  
 <EMI ID=15.1> 

  
Ces procédés de titrage enzysatiques de la technique antérieure comportent un grand nombre d'inconvénients. Par exemple, le système de réaction enzymatique est compliqué et le pigment du type bilirubine ou le sérum émulsionné affecte le titrage colorimétrique. Dans le procédé de titrage qui a recours à la L-amino acide oxydase, le L-amino acide dans le sang inhibe le titrage de la L-leucine libérée par la LAP, au surplus, la quantité de L-amino acide dans le sang n'est pas constante, ce qui entraine des inconvénients de titrage.

  
La demanderesse a découvert à présent que la LAP hydrolysait les substrats synthétisés à partir d'une <EMI ID=16.1>  comme la benzylamine, la tyramine ou la butylamine, ou

  
un D-amino acide, comme la D-méthionine ou la D-leucine, et la L-leucine ou L-alanine, pour libérer avec de bons rendements une méthyalamine substituée, comme la thyramine ou un D-amino acide. La méthylamine substituée libérée ou un D-amino acide est oxydé par l'oxydase correspondante et on mesure l'oxygène consommé ou le peroxyde

  
 <EMI ID=17.1> 

  
La présente invention concerne par conséquent de nouveaux composés du type amide servant de substrat synthétique, qui répondent à la formule (I)

  

 <EMI ID=18.1> 


  
 <EMI ID=19.1> 

  
cédemment indiquées.

  
Une forme de réalisation d'un substrat synthétique selon l'invention est un composé du type amide de la formule (I) que l'on synthéthise à partir de L-leucine ou de L-alanine et d'une méthylamine substituée ou d'un  <EMI ID=20.1> 

  
e

  
 <EMI ID=21.1> 

  
présente un groupe méthylamino substitué de la formule (II)

  

 <EMI ID=22.1> 


  
 <EMI ID=23.1> 

  
R2 représente un reste de D-amino acide de la formule (III)

  

 <EMI ID=24.1> 


  
dans laquelle l'un des symboles R4 et R5 représente un groupe carboxyle, cependant que l'autre de ces symboles représente un reste organique et C représente un atome de carbone D-asymétrique. A titre d'exemples du groupe organique R3, on peut citer les radicaux méthyle, éthyle,  n-propyle, isopropyle, n-butyle, amyle, p-hydroxybenzyle, 

  
 <EMI ID=25.1> 

  
peut citer ceux où l'un des symboles R4 et R5 représente un groupe carboxyle, cependant que l'autre de ces symboles représente un groupe méthylthioéthyle, isobutyle, méthyle ou phényle. Comme exemples de la méthylamine

  
 <EMI ID=26.1> 

  
ses qui suivent : éthylamine, n-propylamine, n-butyl- 

  
 <EMI ID=27.1> 

  
amine, 3,4-dihydroxyphényléthylamine, histamine, tryptamine, benzylamine, D-méthionine, D-leucine, D-alanine ou D-phénylglycine. 

  
Des formes de réalisation de ladite amine substituée sont un composé constitué de L-leucine et d'une méthylamine substituée, comme le L-leucine-benzylamine, le L-leucine-p-hydroxyphenyléthylamide et le L-leucinen-butylamide, un composé constitué de L-leucine et d'un D-amino acide, tel que la L-leucyl-D-méthionine et la L-leucyl-D-leucine, ou un composé constitué de L-alanine et d'une méthylamine substituée, comme le L-alanine-phydroxyphényléthylamide. Ces amines substituées peuvent s'utiliser sous forme de sels solubles, comme les chlorhydrates, bromhydrates, phosphates, formiates, acétates, propionates ou oxalates.

  
On peut produire un composé du type amide conforme

  
à la présente invention par une synthèse peptidique classique, comme la protection et l'enlèvement des groupes protecteurs et une réaction de condensation.

  
A titre d'exemples de groupes protecteurs pour un

  
 <EMI ID=28.1> 

  
L-alanine et la L-leucine, de la formule (IV)

  

 <EMI ID=29.1> 


  
 <EMI ID=30.1> 

  
on peut citer des radicaux protecteurs classiques, comme les radicaux t-butoxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, o-nitrophenylthio ou nitro-benzyloxycarbonyle. Le groupe carboxyle peut être transformé en une forme activée, comme un azide d'acide, un anhydride mixte, un acidimidazolide ou un ester activé, par exemple l'ester cyanométhylique, l'este p-nitrophénylique, l'ester 2,4-dinitrophénylique, l'ester

  
 <EMI ID=31.1> 

  
le réactif de Woodward. Ces formes activées du L-amino acide sont mises en réaction sur le composé du type méthylamine substituée ou le D-amino acide, par mise en oeuvre d'une réaction de condensation, comme le procédé au carbodiimide, le procédé à l'ester activé ou le procédé à l'anhydride d'acide. La réaction se réalise dans un solvant inerte, tel que le diméthylformamide, le diméthylacétamide, le sulfoxyde de diméthyle et le tétrahydrofuranne, avec un rapport équimolaire du composé, à une température qui fluctue de -30[deg.]C à la température ambiante, sous agitation. La réaction peut être terminée en l'espace de 5 à 50 heures. Le groupe protecteur peut ensuite être enlevé.

   Le groupe t-butoxycarbonyle peut être enlevé à l'aide d'acide trifluoracétique et le groupe benzyloxycarbonyle est enlevé par réduction catalytique à l'aida de palladium sur carbone. Le produit peut être purifié par extraction, lavage, chromatographie ou cristallisation. Le produit ainsi obtenu est transformé en son sel, par exemple, un sel inorganique, comme le chlorhydrate, bromhydrate ou phosphate ou un sel d'acide organique, comme un formiate, acétate, propionate ou oxalate.

   L'oxydase correspondant à la méthylamine substituée et au D-amino acide libéré par l'action de la LAP sur le support de synthèse susmentionné conforme à la présente invention, est au moins une enzyme qui hydrolyse cette méthylamine substituée ou le D-amino acide comme substrat, de manière à consommer de l'oxygène et à libérer du peroxyde d'hydrogène au cours d'une réaction enzymatique. Comme exemples de l'enzyme convenant à la méthylamine substituée, on peut citer une amine oxydase, comme la mono amine oxydase, la diamine oxydase ou la polyamine oxydase et une enzyme pour le D-amino acide est la D-amino acide oxydase. L'invention ne se limite pas à ces oxydases, cependant, la mono amine oxydase est une enzyme obtenue à partir de sérum porcin ou bovin et d'Aspergillus niger; la tyramine oxydase

  
est une enzyme de Sarcina lutea IAM 1099 (Biochem.

  
 <EMI ID=32.1> 

  
 <EMI ID=33.1> 

  
est une enzyme de tissus animaux ou de Trigonopsis variavillis.

  
On peut utiliser ces oxydases sous une forme immobilisée. L'enzyme immobilisée peut être assemblée dans un appareil d'analyse automatique et s'utilise eu combinaison avec une électrode à oxygène ou une électrode à peroxyde d'hydrogène. La forme immobilisée comporte des avantages tels que la réduction de la quantité nécessaire d'enzymes de valeur est coûteuse. On peut utiliser un palpeur de l'enzyme immobilisée de l'électrode à enzyme et des électrodes susmentionnées pour la mesure rapide et multiple avec divers réactifs. Le palpeur peut également être avantageusement utilisé dans des échantillons colorés pour le titrage de l'activité de la LAP.

  
On peut préparer l'enzyme immobilisée par mise en oeuvre de techniques d'immobilisation connues, par exemple la prise avec de l'acrylamide, la réticulation avec des

  
 <EMI ID=34.1> 

  
du collagène et de la fibroïne ou une liaison convalente avec ces composés, l'adsorption ou la liaison co-valente avec un polymère organique poreux ou la prise avec un photoresist. Ces enzymes immobilisées sont transformées en membranes, formes fibreuses, pastilles ou tubes convenant à des électrodes à enzymes.

  
La forme de réalisation du titrage de l'activité

  
de la LAP est indiquée ci-dessous. Une concentration aliquote de la solution de substrat synthétique est incubée avec l'échantillon de titrage de la LAP, comme

  
 <EMI ID=35.1> 

  
La durée de l'incubation n'est pas limitée et est, de préférence, une durée nécessaire à la libération d'amine substituée ou de D-amino acide à partir du substrat synthétique par la LAP. La méthylamine substituée ou le D-amino acide ainsi libéré est oxydé par l'oxydase correspondante de manière à consommer de l'oxygène ou

  
à libérer du peroxyde d'hydrogène. La réaction se met en oeuvre eu ajoutant la solution d'oxydase correspondante ou en mettant le mélange réactionnel en contact

  
 <EMI ID=36.1> 

  
de cette manière ou le peroxyde d'hydrogène ainsi li-

  
 <EMI ID=37.1> 

  
ou une électrode à peroxyde d'hydrogène. Ce titrage 3e réalise de manière avantageuse par la combinaison de l'électrode à enzyme de l'enzyme immobilisée et de l'électrode. Le rendament est enregistré ou montré bous forme de modification électrique pour convertir l'activité de la LAP. On mesure classiquement la quantité du peroxyde d'hydrogène par un réactif de coloration constitué de 4-amino antipyrine, de phénol et de peroxydase

  
ou d'un réactif luminescent, comme le luminol.

  
La forme de réalisation du système de titrage d'activité de la LAP est un système de détection de réaction comprenant l'injection d'un réactif de mesure 

  
de l'activité de la LAP, d'une solution de substrat et 

  
de tampon dans un récipient de réaction à LAP dans le-  quel on libère la méthylamine substituée ou le D-amino  acide à partir du substrat synthétique, on oxyde la méthylamine substituée formée ou le D-amino acide formé  par l'oxydase correspondante et on détecte la quantité  d'oxygène ou de peroxyde d'hydrogène.

  
Dans le système réaction-détecteur, la partie de colonne d'enzyme immobilisée peut de préférence être séparée de la partie d'électrode d'oxydase et de détection, ou être construite unitairement sous forme  d'électrode à enzyme ou d'enzyme où l'enzyme immobilisée est attachée au détecteur de l'électrode. Le système de titrage peut être un système à détecteurs-réacteurs multiples dans lequel, par exemple, l'échantillonnage s'effectue à partir de réacteurs à LAP multiples en vue de l'injection dans un récipient de réaction-détecteur, l'opération étant suivie de détections et de lavages.

  
 <EMI ID=38.1> 

  
 <EMI ID=39.1> 

  
ien entendu que, conformément à la présente invention, on peut tout aussi avantageusement utiliser une électrode à peroxyde d'hydrogène.

  
Le procédé de titrage de la LAP conforme à la présente invention est très simple, rapide et comporte un système de titrage reproductible et ce procédé est très intéressant pour le diagnostic clinique.

  
Les abréviations qui figurent dans la suite du présent mémoire ont les significations indiquées.cidessous :

  
Boc : t-butoxycarbonyle

  
 <EMI ID=40.1> 

  
TFA : acide trifluoracétique Z benzyloxycarbonyle Les exemples qui suivent illustrent la présente invention sans pour autant limiter cette dernière.

  
EXEMPLE 1

  
 <EMI ID=41.1> 

  
On a dissous du Boc-Leu-OSu (3,28 g; 10 mM) et de la benzylamine (1,07 g; 10 mM) dans du DMF (30 ml) et on en a ajusté le pH à 7 par addition de NMM, puis on a agité le tout jusqu'au lendemain à la température  ambiante. On a chassé le DMF par distillation et on a

  
 <EMI ID=42.1> 

  
lavé la solution à 3 reprises avec une solution à 5 %

  
p/p de bicarbonate de sodium, 2 fois avec de l'HCl 1N

  
et 2 fois avec de l'eau, on l'a séchée avec du sulfate

  
de sodium, puis on chassé l'acétate d'éthyle par distillation. On a introduit le résidu dans une colonne  de gel de silice (100 g) et on l'a élué avec un mélange 

  
 <EMI ID=43.1> 

  
On a agité le composé en question (1,2 g) dissous dans du TFA (3 ml) pendant 30 minutes. Après l'élimination du TFA par distillation, on a dissous le résidu dans de l'acide acétique 0,1 N. On a introduit la solution dans une colonne de Sephadex LH-20 (97,0 x 3,0 cm) et on l'a fractionnée en fractions de chacune 6,3 ml.

  
On a réuni les fractions N[deg.] 28 - 36 et on les a lyophi-

  
 <EMI ID=44.1> 

  
acétate (900 mg). 

  
Rendement : 32,1 % (acétate)

  
 <EMI ID=45.1> 

  

 <EMI ID=46.1> 


  
Valeur RF : plaque de gel de silice (n-butanol :

  
acide acétique : eau = 3 : 1 : 1), Rf = 0,80

  
 <EMI ID=47.1> 

  
EXEMPLE 2

  
 <EMI ID=48.1> 

  
On a ajouté du D-Met-OH (1,4 g; 10 mM) et du bicarbonate de sodium (1,68 g; 20 mM) à un mélange d'eau
(15 ml) et de DMF (5 ml). On y a ajouté du Boc-LeuOSu (3,28 g, 10 mM) dans du DMF (30 ml) et on a agité le tout jusqu'au lendemain à la température ambiante.

  
 <EMI ID=49.1> 

  
 <EMI ID=50.1> 

  
tout sous vide. On a dissous le résidu dans un mélange d'acétate d'éthyle et de HC1 1N (50 ml - 50 ml). On a lavé la couche à l'acétate d'éthyle avec de l'eau, on

  
l'a séchée par l'addition de sulfate de sodium et on en

  
a chassé l'acétate d'éthyle par distillation. On a introduit le résidu dans une colonne de gel de silice

  
(100 g) et on l'a élué avec un mélange de benzène et d'acétate d'éthyle (1:1), de façon à obtenir du Boc-LeuD-Met-OH (1,6 g). 

  
On a dissous le produit (1,5 g) dans du TFÀ (4 ml)

  
et on l'a agité à la température ambiante pendant 30 minutes Après l'élimination du TFA par distillation, on a dissous le résidu dans de l'acide acétique 0,1 N et on l'a introduit dans une colonne de Sephadex LH- 20 (97,0 x

  
3,0 cm) de façon à le fractionner en fractions de chacune 6,3 ml. On a rassemblé les fractions N[deg.] 28 à 36

  
et on les a lyophilisées de façon à obtenir le -L-leucylD-méthionine acétate (1,3 g) .

  
Rendement .: 40,4 %

  

 <EMI ID=51.1> 


  
Valeur RF : plaque de gel de silice (n-butanol : acide

  
acétique : eau = 3 : 1 : 1), Rf = 0,50

  
 <EMI ID=52.1> 

EXEMPLES

  
 <EMI ID=53.1> 

  
éthylamide

  
On a dissous du Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) et de la tyramine (1,37 g; 10 mM)dans du DMF (30 ml) et on en

  
 <EMI ID=54.1> 

  
tout jusqu'au lendemain à la température ambiante. Après l'élimination du DMF par distillation, on a dissous le résidu dans de l'acétate d'éthyle (50 ml), on l'a lavé

  
à 3 reprises avec une solution à 5 % p/p de bicarbonate de sodium, 2 fois avec de l'HCl 1 N et 2 fois avec de l'eau, puis on a séché la solution par l'addition de sulfate de sodium. Après l'élimination de l'acétate d'éthyle par distillation, on a introduit le résidu dans une colonne de gel de silice (100 g), on l'a élue avec un mélange de benzène et d'acétate d'éthyle (1:1)

  
 <EMI ID=55.1> 

  
 <EMI ID=56.1> 

  
on a agité la solution pendant 30 minutes à la température ambiante et on en a chassé le TFA par distillation. On a introduit le résidu, dissous dans de l'acide acétique, 0,1 N, dans une colonne Sephadex LH-20

  
(97,0 x 3,0 cm) et on a fractionné la solution en fractions de chacune 6,3 ml. On a recueilli les fractions 30 à 38 et on les a lyophilisées de façon à obtenir le L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide acétate
(1,25 g).

  
Rendement : 40,3 % (acétate)

  

 <EMI ID=57.1> 


  
Valeur RF : plaque de gel de silice (n-butanol : acide

  
acétique : eau = 3 : 1 : 1), Rf = 0,75

  
 <EMI ID=58.1> 

  
EXEMPLE 4

  
 <EMI ID=59.1>   <EMI ID=60.1> 

  
 <EMI ID=61.1> 

  
 <EMI ID=62.1> 

  
dans un 'bain de glace. On a ajouté du carbodiimide hydrosoluble (1,83 ml; 1 mM) à cette solution et on a agité le tout jusqu'au lendemain. Après l'élimination

  
 <EMI ID=63.1> 

  
de l'acétate d'éthyle (50 ml), solution que l'on a lavée à 3 reprises avec une solution à 5 % p/p de bicarbonate de sodium, à 2 reprises avec du HC1 1 N et à 2 reprises avec de l'eau, puis on l'a séchée avec du sulfate de sodium et on en a éliminé l'acétate d'éthyle par distillation. On a introduit le résidu dans une colonne de gel de silice (100 g) et on l'a élué avec un mélange de benzène et d'acétate d'éthyle (1:1) de façon à obtenir le Boc-Leu-NH-(CH2)3 (1,4 g).

  
On a dissous le composé (1,2 g) dans du TFA

  
(3 ml), on a agité la solution pendant 30 minutes à la température ambiante, puis on a éliminé le TFA par distillation. On a introduit le résidu, dissous dans de l'acide acétique 0,1N, dans une colonne de Sephadex LH-20 (97,0 x 3,0 cm) et on a fractionné la solution en fractions de 6,3 ml chacune. On a recueilli les

  
 <EMI ID=64.1> 

  
à obtenir le -L-leucine-n-butylamide acétate (800 mg). Rendement : 32,5 % (acétate)

  
 <EMI ID=65.1>  
 <EMI ID=66.1> 
 Valeur RF : plaque de gel de silice (n-butanol : acide

  
 <EMI ID=67.1> 

  
EXEMPLE 5

  
L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide

  
 <EMI ID=68.1> 

  
du HOSu (23,0 g; 0,2 M) dans du THF (300 ml) dans un ballon d'une contenance de 1 1. On a ajouté, goutte

  
à goutte, à -10"C et en l'espace d'environ 10 minutes, une solution de DCC (41,3 g; 0,2 M) dans du THF (200 ml) et on a agité le tout à la température ambiante jusqu'au lendemain. On a filtré la DCU précipitée et on a concentré le filtrat. On a dissous le résidu dans de l'acétate d'éthyle (300 ml), on l'a lavé à l'aide de HCl N, d'une solution de NaCl et d'une petite quantité d'eau et on a séché la solution avec du sulfate de sodium anhydre. Après l'élimination de l'agent dessicant, on a concentré la solution, on y a ajouté du n-hexane de façon à obtenir du Boc-Leu-OSu sous forme d'une poudre incolore pos-

  
 <EMI ID=69.1> 

  
dement : 90 %.

  
On a ajouté du Boc-Leu-OSu (3,28 g; 10 mM) et du DMF (5 ml) à de la tyramine (1,51 g; 11 mM) dissoute dans du DMF (14 ml) et on a agité le tout sous neutralisation par addition de NMM jusqu'au lendemain. On a le DMF par distillation sous vide et on a ajouté de l'acétate d'éthyle (100 ml) au résidu, puis on l'a lavé avec une solution à 5 % p/p de bicarbonate de sodium, une solution de NaCl, du HCl N, une solution de NaCl et une petite quantité d'eau et on a séché la solution avec du sulfate de sodium anhydre. On a séparé l'agent dessicant et on a concentré la solution. On a ajouté du n-hexane au résidu afin d'obtenir la poudre

  
 <EMI ID=70.1> 

  
poudre dans du dioxanne (5 ml), on a ajouté une quantité

  
 <EMI ID=71.1> 

  
 <EMI ID=72.1> 

  
la solution précitée et on a agité le tout pendant

  
2 heures à la température ambiante. On a ensuite éliminé le chlorure d'hydrogène et le dioxanne par distillation sous vide. On a ajouté du n-hexane au résidu huileux,

  
 <EMI ID=73.1> 

  
précipité sous vide de façon à obtenir du L-leucine-phydroxyphényléthylamide.HCl pulvérulent (2,23 g). Rendement : 78,0 % (de Boc-Leu-OSu)

  
 <EMI ID=74.1> 

  

 <EMI ID=75.1> 


  
P.F. : 125 - 130[deg.]C

  
Spectre IR : Fig. 8

  
TLC : plaque de gel de silice (Merck, N[deg.] 5715) révélateur : (n-butanol : pyridine : acide acétique glacial : eau = 15 : 10 : 3 : 12) Rf = 0,70.

  
EXEMPLE 6

  
L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide

  
On a ajouté du chloroformiate d'éthyle (0,94 ml,
10 mM) à du Z-Leu-OH (2,7 g; 10 mM) et de la NMM

  
 <EMI ID=76.1> 

  
on a agité le tout à -15[deg.]C pendant 2 minutes. On a

  
 <EMI ID=77.1> 

  
à la solution précitée et on a agité le tout à la température ambiante jusqu'au lendemain. On a chassé le solvant sous vide, on a ajouté de l'acétate d'éthyle (100 ml) on a lavé le tout avec une solution à 10 % de citrate, une solution aqueuse à 5 % p/p de bicarbonate de sodium et de l'eau et on l'a séchée avec du sulfate de sodium anhydre. Après l'élimination de l'agent dessicant, on a ajouté du n-hexane au résidu huileux. On a recristallisé le précipité dans un mélange d'acétate d'éthyle et n-hexane, de façon à recueillir une poudre blanche du produit (3,0 g, 78 %). On a dissous la poudre dans une solution aqueuse à 50 % v/v d'éthanol (600 ml), on a ajouté du carbone supportant 5 % p/p de palladium
(600 ml) et une solution aqueuse de HCl N (5 ml) et on a introduit de l'hydrogène gazeux sous agitation à la température ambiante.

   Après l'arrêt de la formation d'anhydride carbonique gazeux, on a séparé le catalyseur par filtration et on a concentré le filtrat. 

  
On a séché le produit huileux incolore sous vide de façon à obtenir le L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide.

  
HCl (1,8 g, 62,7 %).

  
EXEMPLE 7

  
L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide

  
On a dissous du Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) et de la tyramine (1,37 g, 10 mM) dans du DMF (30 ml), on en a ajusté le pH à 7 par addition de NMM et on a agita le

  
 <EMI ID=78.1> 

  
l'élimination du DMF, on a dissous le résidu dans de l'acétate d'éthyle (50 ml) et on a lavé la solution à

  
 <EMI ID=79.1> 

  
carbonate de sodium, à 2 reprises avec du HC1 1N, à deux reprises avec de l'eau et on a séché le tout à l'aide de sulfate de sodium. On a éliminé l'acétate

  
 <EMI ID=80.1> 

  
de gel de silice (100 g) puis on l'a élue avec un mélange de benzène et d'acétate d'éthyle (1:1) de façon

  
 <EMI ID=81.1> 

  
dissous le composé (1,4 g) dans de l'acide trifluoracétique (5 ml), on a agité la solution pendant 30 minutes à la température ambiante et on en a chassé l'acide trifluoracétique. On a dissous le résidu dans de l'acide acétique 0,1 N et on a introduit la solution dans une colonne de Sephadex LH-20 (97,0 x 3,0 cm) pour

  
 <EMI ID=82.1> 

  
recueilli les fractions N[deg.] 30 à 38 et on les a lyophilisées de façon à obtenir le L-leucine-p-hydroxyphényl-éthyl-amide

  
 <EMI ID=83.1> 

  
Rf = 0,757.

  
EXEMPLE 8

  
 <EMI ID=84.1> 

  
On a dissous du Boc-Ala-OH (37,8 g; 0,2 M) et du HOSu (23,0 g; 0,2 M) dans du THF (300 ml) dans un

  
 <EMI ID=85.1> 

  
goutte, à -10"C, en l'espace d'environ 10 minutes, une solution de DCC (41,3 g; 0,2 M) dans du THF (200 ml)

  
et on a agité le tout à la température ambiante jusqu'au lendemain. On a séparé la DCU précipitée et on a concentré le filtrat. On a dissous le résidu dans de l'acétate d'éthyle (300 ml), on l'a lavé à l'aide de HCl N, d'une

  
 <EMI ID=86.1> 

  
a séché la solution à l'aide de sulfate de sodium anhydre. Après l'élimination de l'agent dessicant, on

  
a concentré la solution et on y a ajouté du N-hexane de façon à obtenir le produit sous forme de poudre incolore

  
 <EMI ID=87.1> 

  
On a ajouté du Boc-Ala-OSu (2,86 g; 10 mM) et du

  
 <EMI ID=88.1> 

  
dans du DMF (20 ml) et on a agité la solution jusqu'au lendemain, sous neutralisation par l'addition de NMM. 

  
On a chassé le DMF par distillation sous vide et on a ajouté de l'acétate d'éthyle au résidu, puis on a lavé le tout avec une solution à 5 % p/p de bicarbonate de sodium, une solution de NaCl, du HC1 N, une solution

  
de NaCl et une petite quantité d'eau et on l'a séché avec du sulfate de sodium anhydre. On a séparé l'agent dessicant et on a concentré la solution. On a ajouté du n-hexane au résidu huileux de manière à obtenir une poudre (2,55 g).

  
 <EMI ID=89.1> 

  
 <EMI ID=90.1> 

  
à 5[deg.]C, puis on a agité le tout à la température ambiante pendant 2 heures. On a chassé le chlorure d'hydrogène et le dioxanne par distillation sous vide. On a ajouté

  
 <EMI ID=91.1> 

  
le précipité. On a séché le précipité sous vide de

  
 <EMI ID=92.1> 

  
éthyl-amide.

  
HCl (1,81 g)

  
Rendement : 74,0 % (de Boc-Ala-OSu)

  

 <EMI ID=93.1> 


  
P.F. : 105 - 110[deg.]C

  
Spectre IR : Fig. 9 TLC : plaque de gel de silice (Merck, N[deg.] 5725)

  
révélateur (n-butanol : pyridine : acide acétique

  
glacial = 15 : 10 : 3 : 12) Rf = 0,64.

  
EXEMPLE 9

  
L-alanine-p-hydroxyphényléthylamide

  
 <EMI ID=94.1> 

  
à du Z-Ala-OH (2,2 g; 10 mM) et de la NMM (1,0 g;

  
 <EMI ID=95.1> 

  
pendant 2 minutes. On y a ajouté de la tyramine (1,4 g,
10 mM) dans du DMF (20 ml) et on a agité l'ensemble à la température ambiante jusqu'au lendemain. On a chassé le tétrahydrofuranne par distillation et on a ajouté de l'acétate d'éthyle (100 ml). On a lavé la solution avec une solution aqueuse à 10 % p/p de citrate de sodium, une solution aqueuse à 5 % p/p de bicarbonate de sodium et une faible quantité d'eau et on a séché le tout avec du sulfate de sodium anhydre. Après l'élimination de l'agent dessicant, on a ajouté du n-hexane au résidu huileux obtenu à partir de la solution concentrée. On a recristallisé le précipité dans un mélange d'acétate d'éthyle et n-hexane, de manière à obtenir une poudre blanche. On a dissous la poudre dans une solution aqueuse à 50 96 d'éthanol (600 ml), on a ajouté du carbone supportant 5 % de palladium (600 mg) et du

  
 <EMI ID=96.1> 

  
sous agitation à la température ambiante. Après l'arrêt de la formation de l'anhydride carbonique, on a séparé le catalyseur et on a concentré le filtrat et on l'a

  
 <EMI ID=97.1> 

  
EXEMPLE 10

  
Titrage de l'activité de la LAP en utilisant du -L-

  
 <EMI ID=98.1> 

  
dans un récipient de réaction pourvu d'une électrode

  
 <EMI ID=99.1> 

  
 <EMI ID=100.1> 

  
(Boehringer G.m.b.H.) et on a incubé le tout à 37[deg.]C pendant 15 minutes sous agitation. On a ajouté de l'amine

  
 <EMI ID=101.1> 

  
tout pendant 1 minute à 37[deg.]C. On a oxydé la benzylamine formée par la LAP et on a mesuré la quantité d'oxygène consommée par une électrode à oxygène sous forme d'une variation du courant électrique.

  
Les résultats apparaissent sur la figure 1 où la variation du courant électrique (en ordonnées) est portée en graphique par rapport à la proportion de l'activité de la LAP (en abscisses). L'activité de la LAP peut être déterminée par la mesure de la variation du courant électrique.

  
EXEMPLE 11

  
Titrage de l'activité de la LAP en utilisant du L-leucinep-hydroxyphényléthylamide et de la tyramine oxydase

  
La solution de substrat et l'enzyme dont il a été question à l'exemple 10 ont été remplacés par une solution dans un tampon au phosphate 0,1 M (pH 7,0; 1 ml)

  
 <EMI ID=102.1> 

  
 <EMI ID=103.1> 

  
50 fil), et on a mis le procédé en oeuvre de la même manière que celle décrite à l'exemple 10 en vue du titrage de l'activité de la LAP. Les résultats obtenus apparaissent sur la figure 2 où la variation du courant apparaît en ordonnées et l'activité de la LAP apparaît en abscisses.

  
EXEMPLE 12

  
Titrage de l'activité de la LAP en utilisant de la -Lleucyl-D-méthionine et de la D-amino acide oxydase

  
On a remplacé la solution de substrat et d'enzyme mise en oeuvre à l'exemple 10 par une solution dans un tampon au phosphate 0,1 M (pH 7,0; 1 ml) de -L-leucylD-méthionine (50 mM) et de D-amino acide oxydase (11,5

  
 <EMI ID=104.1> 

  
en oeuvre de la même manière que celle décrite à l'exemple 10 pour le titrage de l'activité de la LAP.  Les résultats obtenus apparaissent sur la figure 3 où la variation du courant apparaît en ordonnées et l'activité de la LAP apparaît en abscisses. 

  
EXEMPLE 13

  
Titrage de l'activité de la LAP en utilisant du la L-leucine-n-butylamide et de l'amine oxydase La figure 4 illustre un schéma du système de titrage de l'activité de la LAP.

  
L'échantillon pour le titrage de l'activité de la

  
 <EMI ID=105.1> 

  
d'échantillon (1) et la solution de substrat (2) sont introduits dans le récipient réacteur à LAP (3). L'échantillon est introduit en utilisant une micropipette ou un auto-échantillonneur et la solution de substrat

  
est introduite par l'intermédiaire d'une pompe (4) à volume constant. Après incubation, on transfère le mélange de réaction dans une colonne d'enzyme immobilisée

  
(5) où l'on introduit simultanément la solution de tampon dans le récipient à tampon (6) par l'intermédiaire de

  
la pompe à volume constant (7).

  
On a transféré la solution qui a passé à travers

  
la colonne d'enzyme immobilisée dans une cellule à écoulement pourvue d'une électrode (8), comme une électrode à oxygène ou une électrode à peroxyde d'hydrogène

  
en vue de mesurer l'oxygène consommé ou le peroxyde d'hydrogène libéré sous l'effet de l'activité enzymatique.  On a maintenu une température constante dans le récipient 

  
à température constante (10). La variation électrique décelée par l'électrode fut enregistrée dans l'enregistreur (12), un appareil de mesure digital (13) ou un enregistreur digital (14) par l'intermédiaire de l'amplificateur (11).

  
Dans le schéma d'assemblage représenté sur la figure 4, on a utilisé les éléments qui suivent :
solution du substrat : dans tampon au phosphate 0,1 M
(pH 7,0) de L-leucine-n-butylamide (50 mM) ;

  
échantillon de titrage de titrage de l'activité de la LAP : solution de LAP de concentrations diverses
(50 U/ml, 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml et 250 U/ml ;

  
colonne d'enzyme immobilisée : 2,8 x 30 mm contenant
100 mg d'amine oxydase immobilisée (15 I/g de véhicule) liée de manière convalente à de l'amine oxydable et un polymère poreux (véhicule : polyacrilonitrile, réactif de réticulation : glutaraldéhyde, brevet britannique N[deg.]2015 001) et cellule d'écoulement

  
cellule d'écoulement : volume interne 0,1 ml, pourvue d'une électrode à oxygène.

  
 <EMI ID=106.1> 

  
 <EMI ID=107.1> 

  
à 37[deg.]C pendant 15 minutes. On a fait s'écouler un tampon au phosphate 0,1 M (pH 7,0) au débit de 1 ml/mn dans la colonne d'enzyme immobilisée, à partir du récipient à tampon. Après que la détection de la quantité d'oxygène

  
 <EMI ID=108.1> 

  
dans la cellule à écoulement, on a transférer le mélange d'incubation (10 ml) dans la colonne d'enzyme immobilisée. On a oxydé la n-butylamine formée par la LAP par de l'enzyme immobilisée et on a mesuré la quantité consommée d'oxygène dissous au cours de la réaction enzymatique par l'intermédiaire d'une électrode à oxygène dont était équipée la cellule à écoulement, sous forme de variation du courant électrique que l'on a enregistrée à l'aide d'un amplificateur.

  
Les résultats obtenus apparaissent sur la figure 5 dont l'axe des ordonnées représente la variation de courant et l'axe des abscisses représente l'activité de la LAP. On voit qu'on a obtenu de bons résultats et que

  
le procédé est avantageux pour l'analyse automatique.

  
EXEMPLE 14

  
Titrage d'activité de la LAP en utilisant de la -L-leucylD-méthionine et de la D-amino acide oxydase

  
On a introduit un échantillon de LAP (50 U/ml,

  
 <EMI ID=109.1> 

  
 <EMI ID=110.1> 

  
de -L-leucyl-D-méthionine (50 mM), et on a incubé le tout à 37[deg.]C pendant 15 minutes. On a mesuré l'activité de la LAP à l'aide du système représenté sur la figure 6. On voit sur la figure 6 que la notation de référence 15 indique un injecteur de mélange d'incubation de LAP,

  
que la notation de référence 16 indique un récipient à tampon au phosphate 0,1 M, que la notation de référence
17 indique une pompe à volume constant qui transfère le tampon au débit de 1 ml/mn et que la notation de référence 18 indique une cellule à écoulement. La cellule

  
à écoulement est constituée d'un réacteur-détecteur pourvue d'une électrode à oxygène 20 équipée d'une membrane à enzyme immobilisée de D-amino acide oxydase 19
(véhicule : membrane de polyacrylonitrile contenant des groupes amino, réactif de réticulation : glutaraldéhyde, brevet britannique N[deg.] 215 001) (30 U/g de véhicule, diamètre 5 mm, 0,8 mg, activité de D-amino acide oxydase 2,4 mU). On a enregistré la variation du courant électrique par l'intermédiaire d'une électrode à oxygène dans l'enregistreur 22 par l'intermédiaire de l'amplificateur 21. La notation de référence 23 indique un collecteur de sortie.

  
Dans l'appareil représenté ci-dessus, le tampon

  
au phosphate 0,1 M (pH 7,0; coula à raison de 1 ml/mn et après la stabilisation de l'oxygène dissous, on a injecté le mélange d'incubation de LAP susmentionné

  
(10 fil) par l'intermédiaire de l'injecteur. On a oxydé la D-méthionine libérée sous l'effet de la LAP par

  
 <EMI ID=111.1> 

  
de manière à consommer l'oxygène dissous que l'on a décelé par l'intermédiaire de l'électrode à oxygène et on a enregistré la variation du courant électrique.

  
Les résultats obtenus apparaissent sur la figure 7 où l'axe des ordonnées représente la variation de courant et l'axe des abscisses représente l'activité de la LAP. On voit que l'on a obtenu de bons résultats et que le procédé et les produits conformes à l'invention conviennent parfaitement à un système de titrage automati que. 

  
Au surplus, on a continuellement titré l'activité de la LAP, 100 fois, en utilisant des échantillons de titrage d'activité de la LAP (100 U/ml et 200 U/ml).

  
Après les titrages respectifs, la quantité d'oxygène dissoute a immédiatement (1 minute après la fin de la détection) montré la valeur stable originale et chaque essai effectué au bout de la centième fois a révélé les bons résultats et la reproductibilité.

  
EXEMPLE 15

  
Spécificité vis-à-vis du substrat sur divers substrats

  
 <EMI ID=112.1> 

  
On a utilisé les substrats synthétiques sui suivent :
L-leucinamide (50 mM), L-leucine-p-nitroanilide (50 mM), L-leucine-p-naphtylamide (solution saturée), L-leucine&#65533;

  
 <EMI ID=113.1> 

  
amide (50 mM).

  
On a introduit une solution et tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0, 10 ni) contenant de la LAP (300 U/ml) dans une solution au tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0,

  
50 fil) du substrat susmentionné et on l'a incubée à 37[deg.]C pendant 15 minutes. On a également utilisé de l'amino peptidase (20 U/ml, 10 (il, Boehringer G.m.b.H.) dans les mêmes conditions. On a mesuré la L-leucine libérée par la LAP et l'aminopeptidase par un système à schéma d'écoulement tel que représenté sur la figure 4 décrite à l'exemple 13 (on a utilisé de la L-amino acide oxydase au lieu d'amine oxydase). On a fait s'écouler du tampon  <EMI ID=114.1> 

  
termédiaire d'une pompe à volume constant et après que

  
 <EMI ID=115.1> 

  
 <EMI ID=116.1> 

  
tion susmentionné (10 \il) . On a utilisé une colonne de fibres de L-amino acide oxydase immobilisée (28 U:gvéhicule, 100 mg, 2,8 x 30 mm). On a décelé l'oxygène consommé correspondant à la formation de L-leucine par la L-amino acide oxydase par l'intermédiaire de l'électrode à oxygène prévue dans la cellule à écoulement, signal que l'on a amplifié en une variation de courant électrique de manière à titrer l'activité de la LAP et de l'aminopeptidase sur divers substrats. Les résultats apparaissent dans le tableau I.

  
 <EMI ID=117.1> 

  

 <EMI ID=118.1> 


  
Ainsi que le Tableau I le représente, le Lleucinamide, le N-L-leucyl-p-nitroanilide et le -Lleucine-p-naphtyl-amide antérieurement connus, furent hydroylsés, non seulement par la LAP, mais également par l'aminopeptidase et, par conséquent, ces substrats sont moins avantageux pour le titrage de l'activité de la LAP dans du sérum, en raison du fait que le

  
 <EMI ID=119.1> 

  
et le L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide conformes à la présente invention furent hydrolysés par la LAP ou

  
 <EMI ID=120.1> 

  
substrats sont avantageux pour le titrage de la LAP sphérique.

  
EXEMPLE 16

  
Titrage d'activité de la LAP en utilisant du L-leucinep-hydroxyphényléthylamide et l'amine oxydase

  
On a préparé la solution de substrat (50 mM) en dissolvant le chlorhydrate de L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide dans un tampon au phosphate 0,1 M (pH7,0). On a préparé la solution (I) suivante :

  

 <EMI ID=121.1> 


  
On a préparé la solution de composition de réaction
(il) (0,45 ml) par l'addition d'amine oxydase (5 U/ml, Miles Lab., 50 &#65533;1) à la solution susmentionnée (I) (0,4ml). 

  
A la solution de composition de réaction (II)
(0,45 ml) on a ajouté du sérum* de rat normal, du sérum** de rat à maladie du parenchyme hépatique et du sérum*** de rat à cholestase extra-hépatique, dans

  
 <EMI ID=122.1> 

  
à une incubation à 37[deg.]C pendant 30 minutes et à une mesure spectrophotométrique à 480 nm.

  
 <EMI ID=123.1> 

  
** 50 % de tétrachlorure de carbone dans de l'huile d'olive - (V/V) (1 ml/kg/jour) que l'on a injecté par la voie sous-cutanée à 2 reprises par semaine pendant

  
4 semaines dans le dos de rats Wister mâles, pesant environ 250 g. On a recueilli le sérum 48 heures après l'administration finale.

  
*** Rats Wister mâles, pesant environ 250 g que l'on

  
 <EMI ID=124.1> 

  
conduit biliaire. On a recueilli le sérum 48 heures après la ligature.

  
On a traité du sérum à activité de LAP connue
(Seraclea N, 122 unités G-R, Nihon Shoji Co.) de la même manière que celle décrite ci-dessus et on a calculé l'activité de la LAP. Les résultats obtenus apparaissent dans le Tableau II.

  
A des fins de comparaison avec le procédé de titrage susmentionné, on a appliqué le procédé de titrage de l'activité de la LAP antérieurement connu aux mêmes échantillons de sérum. Les résultats apparaissent également dans le Tableau II. 

TABLEAU II

  

 <EMI ID=125.1> 


  
Ainsi que le tableau le représente, le L-leucinep-hydroxyphényléthylamide conforme à la présente invention peut s'utiliser comme substrat avantageux pour l'établissement d'un diagnostic d'une maladie du parenchyme hépatique.

  
EXEMPLE 17

  
Titrage de l'activité de la LAP en utilisant du L-alaninep-hydroxyphényléthylamide et de l'amine oxydase

  
On a dissous du chlorhydrate de L-alanine-p-hydroxyphényléthylamide tel qu'obtenu à l'exemple 8 dans un tampon au phosphate 0,1 M (pH 7,0) de façon à préparer une solution de substrat (50 mM). On a utilisé cette solution de substrat (0,025 ml) au lieu de la solution

  
de substrat décrite à l'exemple 16 et on a préparé la solution (I) et la solution de composition de réaction
(II) de la même manière que celle décrite à l'exemple 16.

  
On a titré l'activité de la LAP de la même manière que celle décrite à l'exemple 16. Les résultats apparaissent dans le tableau 3. 

TABLEAU III

  

 <EMI ID=126.1> 


  
Ainsi que le montre le tableau, le L-alanine-p-

  
 <EMI ID=127.1> 

  
est un substrat synthétique très avantageux pour le diagnostique de la cholestase extrahépatique.

  
EXEMPLE 18

  

 <EMI ID=128.1> 


  
 <EMI ID=129.1> 

  
sérum de titrage de LAP standard, test LAPC Wako (procédé au substrat de L-leucine-p-diéthylaminoanilide),

  
 <EMI ID=130.1> 

  
 <EMI ID=131.1>  

  
On a ajouté de l'éthanol (2,5 ml) dans le but d'arrêter la réaction. On a séparé la substance déposée et on a soumis la solution surnageante à une mesure colorimétrique à 480 nm. La courbe standard obtenue est repré-

  
 <EMI ID=132.1> 

  
néaire entre l'activité de la LAP et l'absorption à 180 nm.

  
L'axe des ordonnées sur cette figure 10 représente l'absorption à 480 nm, cependant que son axe des abscisses représente les unités G-R. On peut se servir du procédé comme méthode de titrage quantitatif de Inactivité de

  
la LAP sérique et comme trousse de titrage. On a titré l'activité de la LAP sérique de patients humains à l'aide de la courbe standard susmentionnée. Le coefficient de corrélation y = 0,984 (échantillon n = 241) et l'équation

  
de régression Y = 1,024x - 2,898, ont révélé de bons résultats. La courbe de corrélation est celle représentée sur la figure 11 où les unités G-R obtenues par l'intermédiaire du procédé suivant l'invention figurent en ordonnées, tandis que les unités G-R obtenues avec le procédé à trousse Wako figurent en abscisses.

  
Brève explication des dessins Figure 1 : titrage de la LAP par électrode à oxygène en utilisant le L-leucine-benzylamide et l'amine oxydase. Figure 2 : titrage de la LAP par une électrode à oxygène en utilisant le L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide et la tyramine oxydase. Figure 3 : titrage de la LAP par une électrode à oxygène en utilisant la L-leucyl-D-méthionine et la D-amino acide oxydase. Figure 4 : schéma du système de titrage de l'activité de la LAP.

  
1. Injecteur d'échantillon de titrage de la

LAP.

  
2. Solution de substrat.

  
3. Réacteur à LAP.

  
4. Pompe à volume constant.

  
5. Colonne d'enzyme immobilisée.

  
6. Récipient à tampon.

  
7. Pompe à volume constant

  
8. Electrode.

  
9. Cellule à écoulement.

  
10. Boite à température constante.

  
11. Amplificateur.

  
12. Enregistreur.

  
13. Appareil de mesure digitale.

  
14. Enregistreur digital.

  
 <EMI ID=133.1>  à oxygène à l'aide du système représenté sur la figure 4 et de L-leucyl-n-butylamide et d' amire oxydase. Figure 6 : équipement de titrage de la LAP.

  
15. Injecteur pour le mélange de titrage de

  
la LAP.

  
 <EMI ID=134.1> 

  
17. Pompe à volume constant. 

  
18. Cellule à écoulement.

  
19. Membrane à enzyme immobilisée.

Claims

20. Electrode à oxygène.

21. Amplificateur.

22. Enregistreur.

23. Tubulure de sortie.

Figure 7 : titrage de la LAP en utilisant une électrode à enzyme pourvue d'une enzyme immobilisée

et d'une électrode à oxygène, en se servant

de -L-leucine-D-méthionine et de D-aminoacide oxydase.

Figure 8 : spectre IR du L-leucine-p-hydroxyphényléthylutni dia Figure 9 : spectre IR du L-alanine-p-hydroxyphényléthylamide. <EMI ID=135.1>

L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide.

Figure 11 : courbe de corrélation obtenue en utilisant le L-leucine-p-hydroxyphényléthylamide et

un échantillon du commerce.

REVENDICATIONS

1. Amide répondant à la formule de structure géné- <EMI ID=136.1>

<EMI ID=137.1>

<EMI ID=138.1>

et R2 représente un groupe méthylamino substitué ou un

groupe résidu de D-amino acide ou un sel d'un tel groupe. 2. Amide (I) ou sel de ce dernier suivant la revendication 1, caractérisé en ce que R1 représente un radical isobutyle.

<EMI ID=139.1>

<EMI ID=140.1>

un groupe méthyle.

<EMI ID=141.1>

<EMI ID=142.1>

un groupe méthylamino de la formule (II) qui suit

<EMI ID=143.1>

<EMI ID=144.1>

5. Amide (I) ou un sel de ce dernier suivant la

<EMI ID=145.1>

un groupe méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-

<EMI ID=146.1>

5-imidazole méthyle, 3-imidazole méthyle ou phényle.

6. Amide (I) ou un sel de celui-ci suivant la reven-

<EMI ID=147.1>

de D-amino-acide de la formule (III) qui suit

<EMI ID=148.1>

<EMI ID=149.1>

groupe carboxyle, cependant que l'autre de ces symboles représente un radical organique et le symbole C représente un atome de carbone D-asymétrique. 7. Amide ou un sel de celui-ci suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'un des symboles R4 et

<EMI ID=150.1>

de ces symboles représente un groupe méthylthioéthyle,

<EMI ID=151.1>

de carbone D-asymétrique.

8. Procédé de titrage de la leucine aminopeptidase, caractérisé en ce que l'on fait réagir un substrat du type amide ou sel de celui-ci de la formule

<EMI ID=152.1>

<EMI ID=153.1>

présente un groupe méthylamino substitué ou un reste de D-amino acide, sur un échantillon de titrage de la leucine aminopeptidase, on incube le produit de la réaction de la méthylamine substituée ou du D-amino acide sur l'oxydase correspondante et on mesure l'oxygène consommé ou le peroxyde d'hydrogène libéré.

9. Procédé de titrage suivant la revendication 8, caractérisé en ce que R.. représente un groupe isobutyle.

10. Procédé de titrage suivant la revendication 8,

<EMI ID=154.1>

11. Procédé de titrage suivant la revendication 8, caractérisé en ce que R2 représente un groupe méthylamino substitué de la formule

<EMI ID=155.1>

dans laquelle R3 représente un groupe organique. 12. Procédé de titrage suivant la revendication 11, caractérisé en ce que R3 dans le groupe (II) représente un radical méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, nbutyle, amyle, p-hydroxybenzyle, 3,4-dihydroxybenzyle,

<EMI ID=156.1>

13. Procédé de titrage suivant la revendication 8,

<EMI ID=157.1>

est un reste de D-amino acide de la formule

<EMI ID=158.1>

dans laquelle l'un des symboles R4 et R5 représente un groupe carboxyle, cependant que l'autre de ces symboles représente un groupe organique et C représente un atome de carbone D-asymétrique.

14. Procédé de titrage suivant la revendication 13,

<EMI ID=159.1>

reste de D-amino acide représente un groupe carboxyle, cependant que l'autre de ces symboles représente un

<EMI ID=160.1>

<EMI ID=161.1>

15. Procédé de titrage suivant l'une quelconque des revendications 8, 9, 10, 11, 12, 13 et 14, caractérisé en ce que l'oxydase est une enzyme immobilisée.

16. Procédé de titrage suivant l'une quelconque des revendications 8, 9, 10, 11, 12, 13 et 14, caractérisé en ce qu'on effectue le titrage par l'intermédiaire d'une électrode à oxygène ou d'une électrode à peroxyde d'hydrogène ou d'une électrode à enzyme de ces dernières. <EMI ID=162.1>

cations 8, 9, 10,11, 12, 13 et 14, caractérisé en ce que l'on mesure le peroxyde d'hydrogène à l'aide d'un réactif de coloration ou d'un réactif luminescent. Le soussigné n'ignore pas qu'aucun document joint au dossier d'un brevet d'invention ne peut être de nature à apporter, soit à la description, soit aux dessins, des modifications de fond, et déclare que le contenu de la présente note n'apporte pas de telles modifications et n'a d'autre objet que de signaler une

ou plusieurs erreurs matérielles.

Il reconnaît que le contenu de la présente note ne peut avoir pour effet de rendre valable totalement ou partiellement la demande de brevet (le brevet) sous rubrique, si celle-ci (celui-ci) ne l'était pas en tout ou en partie en vertu de la législation actuellement en vigueur.

Il autorise l'administration à joindre cette note au dossier du brevet et à en délivrer photocopie. Le soussigné n'ignore pas qu'aucun document joint au dossier d'un brevet d'invention ne peut être de nature à apporter, soit à la description, soit aux dessins, des modifications de fond, et déclare que le contenu de la présente note n'apporte pas de telles modifications et n'a d'autre objet que de signaler une

ou plusieurs erreurs matérielles.

Il reconnaît que le contenu de la présente note ne peut avoir pour effet de rendre valable totalement ou partiellement la demande de brevet (le brevet) sous rubrique, si celle-ci (celui-ci) ne l'était pas en tout ou en partie en vertu de la législation actuellement en vigueur.

Il autorise l'administration à joindre cette note au dossier du brevet et à en délivrer photocopie.