JPS6019499A - ペプチダ−ゼ活性の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ１）　発明の背景 技術分野 本発明はペプチダーゼ活性の測定法に関する。

具体的には、末端がＬ−グルタミン酸てあ゛るペプチド
に作用してＬ−グルタミン酸を遊離するペプチダーゼの
活性の測定法に関する。

本発明の測定法の対象となるペプチダーゼの最も典型的
な例としてはロイシンアミノペプチダーゼ（以下ｒＬＡ
ＰＪと略すこともある。）か挙げられる。

ＬＡＰは広くヒトその他の哺乳動物の臓器に分布してお
り、血清中にも存在する。この血清中のＬＡＰ活性は肝
機能障害、肝胆道疾患、糖尿病、転移性肝癌、膵頭部癌
なとと高い相関性を示し、これらの病気の診断および予
後の観察に有効であることが知られている。

また、醤油または味噌の醸造過程ｌこおいてもｌ７ＡＰ
の作用が遊離アミノ酸、特にＬ−グルタミン酸の生成に
重要な役割を果していることが知られており、ＬＡＰ活
性の測定はこれらの醸造食品の生産管理においても重要
である。

従来技術 従来、ＬＡＰ活性の一般的測定法としては、基質トシて
Ｌ−ロイ／ルーｐ−ニトロアニリドを用いて、生成する
ｐ−二トロアニリンの黄色を比色定量する方法あるいは
基質としてＬ−ロインルーβ−ナフチルアミドを用いて
、生成するβ−ナフチルアミンをｐ−ツメチルアミノベ
ンズアルデヒドなとて比色定量する方法か一般的である
。しかし、前者の方法ではｐ−ニトロアニリンの黄色の
比色定量にビリルビン系色素なとの血清成分の影響かみ
られ、誤差の原因となっている。また、後者の方法は、
反応過程が複雑であることから、厳密な操作を必要とす
るたけてはなく、基質であるＬ−ロインルーβ−ナフチ
ルアミドおよび標準物質として使用されるβ−ナフチル
アミンの発癌性が問題となっている。さらに、これらの
し−ロインルアリルアミドを基質とする方法によって測
定されるＬＡＰ活性はロイシルアリルアミダーゼ活性と
称されるべきものであり、Ｎ末端がロイノンであるペプ
チドを加水分解する真のＬＡＰ活性を正確に反映するか
は疑問である。したがって真のＬＡＰ活性を測定するた
めの基質としては天然界にも存在するペプチドの使用が
望まれていた。

ペプチドを基質とするＬＡＰの測定法としては次の方法
が知られている。■Ｌ−ロイシルグリノンを基質とする
方法（特公昭５６−２０８４０）。

すなわち、ＬＡＰの作用によって生成するし一ロイソン
にＬ−ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、この反応
にともなって生成する還元型ニコチンアミドアデニン゛
ジヌクレオチド（Ｎ　、Ａ　Ｄ　Ｈ２）に由来する８４
０ｎｍの吸光度の増加を測定する方法。■基質としてＬ
−ロイツルールーアラニンを用い、ＬＡＰの作用Ｉこよ
って生成したし一アラニンをグルタミン酸−ピルピン酸
・トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）と乳酸デヒドロゲナー
ゼの共役系に導く方法（四基り甥、聾、５５５〜５６４
（１９６，８年）　）。■基質としてＬ−ロイツルーＬ
−７ラニン、Ｌ−ロイシル−し−ロイノンナトのペプチ
ドを用い、ＬＡＰの作用によって生成したＬ−ロイシン
またはＬ−アラー二ンに対応するデヒドロゲーゼまたは
オキシダーゼを作用させ、最終的にホルマザン発色法等
によって測定する方法（特開昭５７−９Ｌ１９９）。■
基質としてＬ−ロインルーＤ−メチオニンなどのＬ−口
イシル−Ｄ−アミノ酸を用い、ＬＡＰの作用Ｉこよって
生成したＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼを作
用させ、反応によって消費される酸素または生成される
過酸化水素の量を測定する方法（特開昭５６−１４４０
９７　）。

また、ＬＡＰの作用によって生成する反応生成物を酵素
を用いて定量する方法としては上記のほかに次の方法か
知られている。すなわち■基質としてＬ−ロイシンアミ
ドを用い、ＬＡＰの作用ニよって生成するし一ロイシン
にカンコクマムシ毒Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを作用さ
せ、生成する過酸化水素を発色剤を用いて定量する方法
（特開昭５８−６５７８７）。■基質としてＬ−ロイシ
ンアミドを用い、ＬＡＰの作用によって生成するアンモ
ニアとα−ケトグルタル酸をグルタミン酸デヒ肩ロゲナ
ーゼの作用で反応させ、反応にともなうＮＡＤＨ２の減
少を分光学的に測定する方法。

■基質としてＮ−Ｌ−ロインルー置換メチルアミド化合
物またはＮ−Ｌ−アラニン−置換メチルアミド化合物な
どを用い、ＬＡＰの作用によって生成する置換メチルア
ミン化合物に対応する酸化酵素を作用させ、反応によっ
て消費される酸素または生成される過酸化水素の量を測
定する方法（特開昭５６−１４４０９７．特開昭５７−
９５９４９、特開昭５８−５９９　’５２　）。

以上■〜■の酵素を利用する方法は、反応過程が複雑で
、厳密な反応条件および操作を必要とする、使用する酵
素の安定性が低い、基質特異性か低い、または使用する
基質の調製もしくは入手か困難であるなどのいずれかの
欠点を有する方法である。

〔■〕　発明の概要 要旨 本発明は末端がルーグルタミン酸である　ベブチドに作
用してＬ−グルタミン酸を遊離するペプチダーゼの活性
を測定するに際し、前記ペプチドに対して前記ペプチダ
ーゼを作用させ、次いて遊離するＬ−グルタミン酸にＬ
−グルタミン酸オキシダーゼを作用さゼ、反応に伴う酸
素の消費量または過酸化水素、アンモニアもしくはα−
ケトグルタル酸の生成量を検出することを特徴とするペ
プチダーゼ活性の測定法を提供するものである。

効果 ■本発明において使用するペプチダーゼの基質は基本的
には天然界に存在するものであり、測定されたペプチダ
ーゼ活性には真の意味でのペプチダーゼ活性か反映され
る。

■基質は安全な物質であり、かつ入手か容易である。

オ ■Ｌ−クルタミン酸■キンダーゼは他のアミノで生成し
たし一グルタミン酸を本酵素を用いることによって正確
に測定することができる。

■本発明のＬ−グルタミン酸オキシタ′−ゼ１こよる反
応は、臨床検査等にお０て最も広く実Ｒ］（Ｉｓされて
いるオキシダーゼ反応であり、西Ｙ素反応の１ｌｌｌ＋
定も汎用されている方法をそのまま適用できる。

■上記し一グルタミン酸オキシダーゼｉｔ　Ｌ−り用で
生成したＬ−グルタミン酸のみを特異的に屓１１定する
ことができる。

■上記Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ＋ｉ熱安定性、ｐ
）ｌ安定性および保存安定性力）高く、ペプチダーゼ活
性測定用の試薬として使用する際１こもｂｆ−都合であ
る。

■上記し一グルタミン酸オキシタ゛−ゼ（まイ乍Ｍ１ｐ
Ｈ範囲が広く、至適１）Ｈが７〜８．５であり、ｒ４］
性イτｊ近で効率良く作用することから、ＬＡＰなと至
適ｐＨが同様の範囲であるペプチダーゼの反応系とのカ
ップリングが容易である。また、この酵素反応の生成物
である過酸化水素の発色反応なとによる検出も通常中性
（１近で行なわれることからも、」二記し−グルタミン
酸オキシダーセは都合か良い。

したかつて、ペプチダーゼによる酵素反応と上記Ｌ−グ
ルタミン酸オキシダーゼによる酵素反応と過酸化水素を
検出するための反応のうち連続する二反応あるいは全て
の反応を同時に行うことも可能である。

〔ｍ〕　発明の詳細な説明 ペプチダーゼ 本発明によってその活性の測定が可能なペプチダーゼと
は、後述の末端かＬ−グルタミン酸であるペプチドに作
用してＬ−グルタミン酸を遊離するペプチダーゼをいい
、このようなペプチドに対して基質特異性を有するもの
であれはアミノペプ１）が挙げられる。この他に本発明
の方法が適用可能なペプチダーゼ゛を例示すれば以下の
とおりである。

アミノペプチダーゼ（ミクロソーム）　ＥＣ８，４，１
１，２アスパラギン酸アミノペプチダーゼ　ＥＣ８，４
，１１，７アミノペプチダーゼ（ヒト肝）　ＥＣ８，４
，１１，１４α−グルタミル−グルタミン酸・ジペプチ
ダーゼ　ＥＣ８，４，１８，７β−アスパラチルジペプ
チダーゼ　ＥＣ８，４，１８，１０ジペプチダーゼ　Ｅ
Ｃ８，４，１８，１１セリン　カルボキシペプチダーゼ
　ＥＣ３，４，１６，１カルボキン・ペプチダーゼＡ　
、ＥＣ８，４，１７，１ペプチド ペプチダーゼの基質として使用されるペプチドはＣ末端
またはＮ末端がＬ−グルタミン酸であるもので、前記ペ
プチダーゼの作用によってＬ−グルタミン酸が遊離する
ジペプチド、トリペプチド、その他オリゴペプチドであ
る。

好適なペプチドは測定すべきペプチダーゼの種類によっ
て異なるか、ＬＡＰの場合はＬ−ロインルーし一グルタ
ミン酸が好ましい。その他車発明において使用しうるペ
プチドを例示すれは以下のとおりである。

Ｌ−アラニル−し−グルタミン酸 Ｌ−クルタミルーし一グルタミン酸 ベンジルオキシカルボニル−グリシ□ルーＬ　−グルタ
ミン酸 本発明において使用されるＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼは基本的には下記反応式で示される作用を示し、Ｌ−
グルタミン酸に対する基質特異性、か高く、他のアミノ
酸にはほとんと作用しない酵素であればよい。

Ｌ−グルタミン酸＋０２　十Ｈ２Ｏ−〉α−ケトグルタ
ル酸十ＮＨ３−１−Ｈ２Ｏ２Ｌ−グルタミン瞼オキソダ
ーセの具体例としては、本発明者によって見出された酵
素であり、ストレプトマイセス・エスピー　Ｘ−１１９
−６（３ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｓｐ、Ｘ　−１１９
−６；微工研物より得られる酵素（如王影蛙訓裡、４％
（６）。

１８２３〜１８２８（１９８８）、特願昭５７−１１２
２７１　ｉこの酵素を以下「本酵素」ということもある
。）を例示することかできる。

以下に本酵素の特徴的性質を示す。

本酵素はＬ−グルタミン酸に対する基質特異性か極めて
高く、他のアミノ酸に対しては実質Ｍ、な作用は示さな
い。すなわち、ｐＨ７，４においてはＬ−アスパラギン
酸とＬ−アスパラギンにわすかな活性（Ｌ−グルタミン
酸に対する活性の０６〜０７％）を示すが、Ｌ−グルタ
ミンを含む他のし一アミノ酸およびＤ−アミノ酸には全
く作用しない。また、ｐＨ６，０においてはＬ−アスパ
ラギン酸およびＬ−アスパラギンにｐａｌ　Ｌでも実質
的に活性を示さない。

本酵素の作用１）Ｈ範囲は広＜（ｐＨ５〜１０）、至適
１）ＨはｐＨ７〜８．５である。すなわち、中性付近で
効率よく作用する酵素である。

本酵素は広いｐＨ範囲において安定である。すなわち、
３７°Ｃ１６０分間保持の条件下ではｐＨ５５〜１０．
５の範囲において、４５８Ｃ２１５分間保持の条件下で
はＩ）Ｈ５，５〜９５の範囲において、６０°Ｃ１１５
分間保持の条件下ではｐＨ５，５〜７．５の範囲におい
てそれぞれ安定であった。

本酵素は作用適温の範囲は３０〜６０°Ｃと広く。

作用至適温度は５０°Ｃ付近である。

本酵素の熱安定性は非常に高い。すなわち、ｐＨ５５に
おいては６５°Ｃまで安定であり、８５°Ｃても約５０
％の残存活性を示す。ｐＨ７，ｓにおいては５０°Ｃま
て安定てあり、７５°Ｃても約６０％の残存活性を示す
。ｐＨ９，５においては４５°Ｃまて安定てあり、７０
°Ｃて約５０％の残存活性を示す。

本酵素の活性はパラクロロマーキュリベンゾエイトによ
って約４５％阻害されるか、他の通常の阻害剤によって
は阻害されない。

本酵素の製造法の一例は参考例に詳述する。

−−− 一一〜−−−− 反応 本発明の測定法は基本的には二段階の反応から成る。す
なわち、（１）測定対象のペプチダーゼを末端がＬ−グ
ルタミン酸であるペプチドに作用さゼてＬ−グルタミン
酸を遊離させる反応および（２）上記反応で生成したし
一グルタミン酸に酸素と水の存在下でＬ−グルタミン酸
オキシダーゼを作用させ、過酸化水素、アンモニアおよ
びα−ケトグツ１タル酸を生成させる反応である。

各反応の条件は各酵素が好適に反応するように調節すれ
ばよいが、（１）と（２）の反応条件が同様の範に 囲てあれば反応条件を変更せずに同−反応−て連続して
反応を行うことがてきるのて都合が好５ｙ０たとえば、
測定対象がＬＡＰである場合、ＬＡＰの至適１）Ｈが７
．８〜９．０であることからし一グルタミン酸オキシダ
ーゼの反応条件と適合し、（１）と（２）の反応を同一
反応系中で連続して行うことかできる。

また（１）および（２）の酵素反応は緩衝液などを含む
溶液中で通常行われるが、多層分析フィルムなとを使用
するドライ・システム（化学の領域、３５ｆ４１゜２７
３〜２８０（１，９８１））で反応を行ってもよい。

反応ＩＣ際し、Ｌ−クルタミン酸オキシターセは可溶性
酵素または固定化酵素として使用される。

固定化酵素は包括法（格子型、マイクロカプセル型など
）、担体結合法（共有結合法、イオン結合法、物ｍ１的
吸着なと）、架嬌法なとの一般的方法（「固定化酵素」
、千畑一部編集、昭和５０年３月２０日、■講談社発行
）によって製造することかできる。

たとえは、固定化用の担体としてはセルロース（セロフ
ァン、濾紙ナト）、アセデルセルロース誘導体、各種イ
オン交換セルロース、カラギーナンなとの多糖類：コラ
ーゲン、ゼラチンなとの蛋白質：ポリスチレン、ポリア
ミ／スチレン、光硬化樹脂（エチレン性不飽和基を有す
る親水性光硬化樹脂（特公昭５５−４０．特公昭５５−
２０６７６ンなど）、イオン交換樹脂なとの合成有機高
分子物質、ガラス（多孔性ガラスピーズなど）、シリカ
なとの無機物質を使用することができる。酵素の導入、
官能基の活性化なとの前処理を施して使用される。担体
と酵素の結合は、ジアゾ法、ペグブード法、アルキル化
法、架橋試薬（クルクルアルデヒド、ヘキサメチレンジ
イソンアナートなと）を使用する方法によって行うこと
かできる。また上記のような架橋試薬によって酵素間を
架橋することによって固定化することもてきる。

固定化酵素は膜状、ダル状、粒状、チップ状、粉末状、
マイクロカプセル状、チューブ状、容器状、繊維状、ホ
ロファイバー状なと使用の態様に応した形態に調製され
る。たとえば、膜状に調製して酵素電極として、粒状に
調製し、カラムに充填してリアクター型バイオセンサー
とじ−Ｃ１あるいは発色試薬、ゼラチンなとのバインダ
ーなととともＪζ多層分析フィルムの酵素試薬層として
調製して使用することができる。

検出 本発明によるペプチダーゼ活性の測定は、前記二段階の
反応にともなう酸素の消費量、または過酸化水素、アン
モニアもしくはα−ケＩ・クルタル酸の生成量を検出す
ることによって行われる。なお、検出法はレート法でも
エンドポイント法でもよい。

（１）酸素消費量 酸素の消費量の検出は、通常ワールブルク検圧法（生化
学実験講座５．酵素研究？Ｌ（１）、第３５〜４１頁、
＠東京化学同人、１９ｊ５年８月２０日発行）または酸
素電極法（電極法による酸素測定。

支 萩原−二編、■講談社、１９７７年１．１月２０日発行
）によって行われる。

酸素電極としては、たとえば、カソードとして白金電極
、アノードとして鉛電極を具備し、水酸化カリウム溶液
を内部液とし、白金カッ〜ド表面１こ酸素透過性のテフ
ロン膜が装着されたクラ〜り型酸素電極を使用すること
ができる。

酸素電極は酵素電極としても使用することができる。た
とえば、Ｌ−クルタミン酸オキシダーゼの固定化酵素も
しくは半透性膜て覆われた可溶性酵素をクラーク型電舞
の電極膜に密着して装芒した電極装着型酵素電極として
使用することかでき、固定化酵素を充填したカラムなど
によるリアクターと分離して装着された酸素電極とから
成るリアクター型酵素電極としても使用することができ
る（「化学の領域、増刊１３４号、バイオマテリアルサ
イエンス第１集Ｊ　ｐｐ、　６９〜７９．１９８２年４
月２０日、■南江堂発行；「化学工業」１９８２年６月
号、１）り、４９１〜４９６　；　「イオン電極と酵素
電極」、鈴木周−編、ｐｐ、６５〜１０６．１９８１年
１１月１日、■講談社発行；「化学の領域」第８６巻、
第５号、ｐｐ、ａ４ｓ〜８４９、（１９ｇ２））。

（２）過酸化水素生成量 過酸化水素の生成■の検出は、電気化学的方法、分光学
的方法、化学発光法、けい先決など公知の方法（特公昭
５６−８２９１９など）によって行うことができる。

電気化学的方法としては過酸化水素電極を用いる方法か
一般的であるが、過酸化水素とヨウ素イオンを反応させ
、ヨウ素イオンの活量減少をヨウ素イオン電極で測定す
る方法によっても過酸化水素を検出することかできる。

過酸化水素電極としては、たとえば白金電極を使用した
クラーク型−過酸化水素電極を使用することができる。

また、酸素電極と同様の酵素電極として使用することも
てきる。

分光学的方法としては■パーオキシダーゼ法、■カタラ
ーゼ法、■Ｔｉ１ＩＶ）／　４−　（２−ピリジルアゾ
）レゾルンノール系、Ｖ（Ｖｌ／ｌ／キン−ル・オレノ
ン系なとを使用する化学的方法（以上、有機合成化学′
ヒｔ’７）’、’　６５９〜６６６（１９８１）参照）
、■グルタチオン７・グルタチオンパーオキシダーゼ■
のパーオキシダーゼ法は、被酸化性発色剤をパーオキシ
ダ５−セも°しくは同様の活性を示す物質の存在下に過
酸化水素と反応させ、反応生成物である色素を吸光度測
定によって定量する方法である。パーオキシダーゼとし
ては通常、西洋わ−さひ（ホースラデインユ）由来の酵
素か使用される。

発色剤としては、たとえばＯ−ジアニノジン、４−メト
キノ−１−ナフトールもしくは２，２′−アンノービス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−ス兎ホン酸）なと
の単独；４−アミノアンチピリンとフェノール、ｐ−ク
ロロフェノール、２．４゜６−ドリブロモフエノールな
とのフェノール系化合物との組合せ、４−アミノアンチ
ピリンとＮ。

Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリンなど
のアニリン系化合物との組合せ；４−アミノアンチピリ
ンとＮ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジンなどのトルイジ
ン系化合物との組合せ：よたは３−メチル−２−ヘンゾ
チアゾリノンヒドラノ゛ンとＮ、Ｎ−ジメチルアニリン
との組合せなとを使用することができる。

なお、パーオキシダーゼ法による発色反応は中性付近の
ｐＨて行われる場合か多い。たとえ・は、４−アミノア
ンチピリン／フェノール系の場合、発色反応はｐＨ７，
５で行われる。したかつて、Ｌ−グルタミン酸オキシダ
ーゼによる反応は通常中性刊近で行われることから、発
色反応に際してｐＨを変更することなく、同一反応系中
で連続して反応を行うこともてきる。さらに、Ｌ　Ａ　
Ｉ）を対象とする場合、ＬＡＰによる酵素反応も同じｐ
Ｈ範囲で行うことか可能である。すなわぢ、ＬＡＰによ
る酵素反応、Ｌ−グルタミン酸オキシダーセによる酵素
反応および発色反応の三反応を同一反応系中で連続して
行うことかできる。

■のカタラー七法としては過酸化水素をカタラーゼの存
在下にアルコール（メタノールなと）と反応させ、生成
するアルデヒド（ホルムアルデヒドなと）を発色系に導
き、生成色素を吸光度測定するか、あるいはアルデヒド
をアルデヒドデヒドロゲナーゼを利用して定量する方法
なとを採用することができる。ホルムアルデヒドを発色
させる方法としては、アンモニアと反応させる方法また
は酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、赤血塩（フェリンア
ン化カリウム）など）の存在下でヒドラゾン（４−アミ
ノ−８−ヒドラジノ−５−メルカプ）−１，２，４−ト
リアゾールなと）と反応させる方法を用いることができ
る（特公昭５６−１９２３８）。

化学発光法としては、過酸化水素を赤血塩の存在下でル
ミノールと反応させ、化学発光量をツメトンカウンター
によって測定する方法（特開昭５８−４７４８４）が好
適である。同様の方法て赤血塩の代りにパーオキシダー
ゼを使用してもよく　（特開昭５７−７１３９９．特開
昭５７−７１４００）、ルミノールの代りにイソルミノ
ール、ピロガロールを使用してもよい。

けい先決としては、ホモバニリン酸をパーオキシダーゼ
の存在下、過酸化水素と反応させてけい光強度を測定す
る方法か挙げられる。発けい光試薬としてはｐ−ヒドロ
キシフェニル酢酸またはジシ アセチルフルオレス調ン（特開昭５５−４８６５６）な
どを用いてもよい。

（３）　アンモニア生成量 アンモニアはミクロケルプール法、ネ、スラー法、イン
ドフェノール法、ニンヒドリン法、フエノサアラニン法
なとの方法によって分析できる。また、カチオン選択性
電極によってアンモニウムイオ。ンを分析する方法また
は疎水性のガス透過性膜を装着したガラス電極からなる
アンモニアカス電極によってアンモニアガスとして分析
する方法なと、電気化学的分析法によって分析してもよ
い。さらに、これらの電極とＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼを組合せた酵素電極によってアンモニアを検出して
もよい。

（４）ａ−ケトグルタル酸生成量 α−ケトクルタル酸は、３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾン（ＭＢ”ｌ’ｌｌ）と反応させて生成
物の吸光度を測定する方法、２．４−ジニトロフェニル
ヒドラジンと反応させ、生成物の吸光度を測定する方法
、０−フェニレンジアミンと反応させて生成物の吸光度
を測定する方法、その他公知の方法を使用することかで
きる。

〔１■〕　実施例 以下、本発明による測定法の一例を示す実施例およびＬ
−グルタミン酸オキシダーゼの製造法をない。実施例お
よび参考例において酵素単位（Ｕｎ　ｉ　ｔ）は「Ｕ」
と表記するものとする。

実施例１ （１１試薬の調製 ■基質溶液 り一ロイシル−し一グルタミン酸２５ｒｎｇを５肩ｔの
０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（１）Ｈ，８，５）に溶解し
た。

■ＬＡ、Ｐ標準溶液 ＬＡＰ　（ノグ了社製、ブタ腎臓由来、２２０Ｕ／肩ｔ
）を０．１　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）で
稀釈して２５〜５００　ｙｎＵ／ｍｌの酵素溶液を調製
した。

■発色試薬 フェノール４０り、４−アミノアンチピリン４０ｍｇお
よびパーオキソダーゼ（東洋紡績■製、西洋ワサヒ由来
、ｌ　ＯＯＵ／ｍｇ）　６　ｍｇを０．２　Ｍりん酸カ
リウム緩衝液（１）Ｈ７，４人８０ＰＩｔに溶解した。

■Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ 部分精製し一グルタミン酸オキシターゼ（１２Ｕ／ｍｙ
’）　５　ｍｔｔを５０　ｍｌ　ｔ７）　０．１　Ｍり
ん酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解した（約１．２　（Ｊ
／Ｍｌ）。

（２）操作法 試験管に基質溶液０．１　ｍｌを取り、２５〜５００７
７１Ｕ／ゴに調製したＬＡＩ’標阜溶岐阜溶液０　ｍｌ
を加え、３７°Ｃ、１５分間インキュベートした後、２
５％１、　ＩＪクロロ酢酸２０／ｌｌを加えて反応を停
止させた。反応停止液にＩＭりん酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７、４）　０．２　ｍｌ　、　Ｌ−グルタミン酸オキ
シターセ０．１　ｍｌおよび発色試薬０．５　ｍｌを加
え、３７°Ｃ２２０分間好気的に振盪しながらインキュ
ベートした。Ｗ検を対即として５００１ｍにおける吸光
度を測定し、第１図に示す検量線を作成した。

実施例２ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ２ＵおよびＬ−ロイツル
ーＬ−クツにタミン酸１０μｍｏｌを含む０１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（＋）Ｈ８，５）１ｍ／を３０°Ｃの恒温
水が循環しているポーラログラフ方式の酵素電極のキュ
ベツトへ密封し、２０ｔｔ（ＪのＩ−Ａ　Ｐ　４ｆｉ準
溶液（１２，５〜Ｉ　ＣＩ　ＯｍＵ／２０ｐｌ　インジ
ェクション）を注入して酸素消費速度を測定し、第２図
に示す検量線を作成した。

実施例３ （１１醤ｉ＋ｂ！サスペンションの調製醤油麹１０ｇに
５０　ｍｌの０．１Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，
０）を加え、５分間ホモジナイザーでホモジナイズした
後、同緩衝液を加えて総量を２００肩ｔとした。

（２）　操作法 Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ２ＵおよびＬ−ロイシル
−し−グルタミン酸１０７ｚｍｏ＋　を含む０１Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）　１胛ｌを３０°Ｃの恒
温水が循環しているクラーク型酸素電極のキュベツトに
密封し、５０ｔｔ（ｌの醤油麹ガスペンションを注入し
て酸素消費速度を測定したところ、醤油麹のロイシンア
ミノペプチダ−（ｆ活性は１．２６０／９　麹と算出さ
れた。

参考例 ５００　ｍｌ容三角フラスコにフスマ２０ｇおよび水１
６Ｍ／を入れ、１２０°Ｃ１３０分間加圧滅菌して調製
したフスマ培地にストレプトマイセス・エスピー　Ｘ−
１１９−６（微工研菌第６５６０ｑ）を植菌し、２８°
Ｃ１７１日間培養して種菌を調製しノこ。

５１容三角フラスコ２５本にそれぞれフスマ２００ＬＪ
および水１６０７７／を入れ、１２０’Ｃ，３０分間加
圧滅菌した後、前記の種菌を無菌的に接種し、２８°Ｃ
て２１月間培養後、温度を２０°Ｃに下けてさらに２週
間培養した。

得られた培養物を３’１．５ｅの水に１時間浸漬した後
、濾過し、さらにけいそう士を通過させて粗酵素成約３
４１を得た。この粗酵素液に硫酸アンモニウムを５０％
飽和まて加え、生成した沈澱を遠沈採取して００２Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ５，５）８、９１　ニ溶解し、５７°Ｃ
て３０分間ＩＪＩＩ熱シタ。この熱処理した酵素液を５
°Ｃ以下に冷却後、２倍量の予め冷却したエタノールを
加え、生成した沈澱を遠沈採取して０．０２　Ｍりん酸
緩衝ｉ１ケ（１）１１７．４）２ｅに溶解し、同一緩衝
液で一夜透析した。透析中に生成した沈澱を遠沈除去し
、」二清液を同−ｉ衝液で平衝化したＤＥＡＥ　（ジエ
チルアミノエチル）−セルロースカラム（３，５ｘ５０
ｃｘ）に通し、吸着した酵素を食塩０３５Ｍを含む同一
緩衝液を用いて溶出したう溶出さ４１だ活性区分を集め
、００５Ｍの食塩を含む００５Ｍ酢酸緩衝液（ｐ１１５
５）で−夜透析した。この透析内液を同一緩衝液で平衝
化したＤＥＡＥ−セファロース０Ｌ−６Ｂ（ファルマン
ア・ファインケミカルダン−１製）ツノラム（２ＸｌＯ
α）に通し、吸着した酵素を食塩０．０５〜０７５Ｍの
リニアグラジェット法で溶出した。溶出された活性区分
を集め、透析濃縮後、セファデックスＧ−２００（ファ
ルマノア・ファインケミカルズ社製）カラム（２，５Ｘ
１２０Ｌ：Ｔｎ）を用いてゲル濾過を行い、活性区分を
集めて濃縮後、００２Ｍりん酸カリウム緩衝液（＋）８
７．４）で透析した。この透析内液を遠沈し、」二清液
を精密濾過した後、凍結乾燥してＬ　グルタミン酸オキ
シダーゼの精製標品（比活性５５．ＩＵ／ｆｆ１ｇ蛋白
。

収率１８．４％）８　ｏｍｙを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるＬＡＰの検量線を示す。 第２図は実施例２におけるＬＡＰの検量線を示す。 特許出願人　（６７７）ヤマサ醤浦株式会社ｄ呪硬？ 乞 手続補正書（自発１ 特許庁長官　志　賃　学　殿 １　事件の表示 昭和５８年特許願第１２５６６６シシ ２　発明の名称 ペプチターゼ活性の測定法 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　（郵便番号　２８８１ 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１電話　０４７９
（２２）００９５ ４　補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ２）明細書第２１頁第１行目の１オキツタ〜ゼ」の後に
［（本酵素）Ｉを加入する。 ３）　明細書第２５頁第２行目の「Ｌ−クルタミン酸オ
キ／ターセ（」と「１２」との間に１一本酵素：Ｊを加
入する。 ４）明細書第２５頁第１７行目の１オキシタ−セ」の後
に「（本酵素〕」を加入する。 ５）明細書箱２５頁末行に「酵素」とあるのを１酸素」
と訂正する。 ６）明細書第２８頁第４行目および第１０行１」に１−
平衡化ＪとあるのをそれぞれＦ平衡化Ｊ、ｙノ正する。 ７）明細書第２９頁第１行目の「キンダーゼ」の後に［
（本酵素］」を加入する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）末端かＬ−グル多ミン酸である　ペプチドに作用し
   てＬ−グルタミン酸を遊離するペプチダーゼの活性を測
   定するに際し、前記ペプチドに対して前記ペプチダーゼ
   を作用させ、次いて遊離するＬ−グルタミン酸にＬ〜ク
   ルタミン酸オキ／ダーゼを作用させ、反応に伴う酸素の
   清貧ｍまたは過酸化水素、アンモニアもしくはａ−ケト
   グルタル酸の生成量を検出することを特徴とするペプチ
   ダーゼ活性の測定法。 ２）ペプチダーゼがロイシンアミノペプチダーゼである
   特許請求の範囲第１項記載のペプチダーゼ活性の測定法
   。 ３）ペプチドかＬ−口イシル−Ｌ−グルタミン酸である
   特許請求の範囲第１または２項記載のペプチダーゼ活性
   の測定法。