BG104435A

BG104435A - Комбинация от инхибитор на алдозоредуктаза и инхибитор на гликоген фосфорилаза

Info

Publication number: BG104435A
Application number: BG104435A
Authority: BG
Inventors: Banavara L. Mylary; Denis J. Hoover; Bernard Hulin; Judith L. Treadway
Original assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1997-11-21
Filing date: 2000-05-15
Publication date: 2001-01-31
Also published as: ZA9810636B; UY25258A1; KR20010032304A; KR100661214B1; CA2310069A1; EP1032424B9; EP1032424B1; JP2002504478A; NO20002164L; KR20010032300A; ES2161548T3; GR3037071T3; TR200001451T2; EA002365B1; CN1279617A; HRP20000327A2; EP1032424A1; OA11379A; IL135713A0; EA200000433A1

Description

КОМБИНАЦИЯ ОТ ИНХИБИТОР НА АЛДОЗО РЕДУКТАЗА И ИНХИБИТОР НА ГЛИКОГЕН ФОСФОРИЛАЗА Област на приложение

Настоящото изобретение се отнася до фармацевтична комбинация от инхибитор на алдозо редуктаза и инхибитор на гликоген фосфорилаза, до комплект съставен от такива комбинации и използване на такива комбинации за лечение на диабети, хипергликемия, хиперхолестеролемиа, хипертензия, хиперинсулинемия, хиперлипидемия, атеросклероза и исхемия на тъканта при млекопитаещи.

Предшестващо състояние на техниката

Независимо от ранното откриване и следващото широко използване при лечение на диабети и следващото откриване и използване на сулфонилуреа (напр. Chlorpropamide™ (Pfizer), Tolbutamide™ (Upjohn), Acetohexamide™ (E.l.Lilly), TolazamideTM (Upjohn), биганиди (напр. Phenformin™ (Ciba Geigy), Metformin™ (G.D.Searle)), инхибитори алфа-гликозидаза (напр. Precose™ (Bayer) и инсулин сенсибилизатори (напр. Rezulin™ (Parke Davis)) като орални хипогликемични средства, има непрекъсната необходимост от лечение на диабети. При използване на инсулин, необходим при около 10% от пациентите диабетици, при които синтетичните хипогликемични средства не са ефективни (диабет тип I, инсулинозависим диабет мелитус), изисква много голям брой дневни дози обикновено като се инжектират от самите болни.Определянето на личната доза инсулин изисква често определяне на захарта в

урината или кръвта. Прилагането на по-голяма доза инсулин причинява хипогликемия с въздействие, което се разпростира от умерена анормалност в кръвта до кома, или дори смърт. Лечението на неинсулинозависим диабет мелитус (диабет тип II NIDDM) обикновено се състои в комбинация от диета, упражнения, орални средства например сулфонилуреа и при по тежки случаи - инсулин. Обаче клинично наличните хипогликемични средства могат да имат странични въздействия, които ограничават тяхното използване. Във всеки случай, когато едно от тези средства може да се окаже неефикасно в отделен случай, друго средство може да е успешно. Ясна е очевидната непрекъсната потребност от хипогликидни средства, които могат да имат по-незначителни странични въздействия или да заместват други неуспешни такива.

Инхибиторите на алдозо редуктаза съставляват клас от съединения, които стават широко известни с използването им при превантивни и лечебни режими, нарастващо при усложнения на диабети като диабетна невропатия и нефропатия. Такива съединения са добре известни на специалистите в тази област и се идентифицират лесно чрез стандартни биологични тестове.

Например съединението зополрестат, 1-фталазиноцетна киселина, 3,4-дихидро-4-оксо-3-{[ 5-(трифлуорометил)-2бензотиазолил]метил]-,е известно напрмер от обикновено поосочвания патент на САЩ 4,939,140 на Ларсен и др. (описанието на който е дадено тук за справка) заедно с определи брой съединения отнасящи се към него, които се използват като инхибитори на алдозо редуктаза. Зополрестат има следния формула

о и като инхибитор на алдозо редуктаза е подходящ при лечение на гореспоменатите усложнения, произтичащи от диабети мелитус.

Някои инхибитори на алдозо редуктаза се считат полезни за намаляване на липидни нива при млекопитаещи. Виж например патент на САЩ 4,492,706 (опсанието на който е посочено тук за справка) на Kallai-sanfacon и ЕР 0 310 931 А2 (Ethyl Corporation).

Обикновено посочвания патент на САЩ 5,064,830 (описанието на който е посочен тук за справка) на Going описва използването на някои оксофталазинил оцетни киселини, включително зополрестат, за понижаване нивата на пикочната киселина в кръвта.

Обикновено посочваната заявка за патент на САЩ N_o08/059,688 описва използването на някои инхибитори на алдозо редуктаза, включително зополрестат, за намаляване нивата на кръвен липид при хора. В описанието се посочва, че е налице терапевтичен ефект при лечението на заболявания, причинени от повишени нива на триглицериди в кръвта, тези болести включват кардиоваскуларни смущения като тромбоза, атеросклероза, инфаркт на миокарда и ангина пекторис.

В Съединените щати и Западна Европа се счита, че артеросклерозата, заболяване на артериите, води до причиняване на смърт. Патологичната последица, водеща до атеросклероза и запушване на сърцето е добре познато. Най-ранният етап на тази последица е образуването на „мастни образувания“ в сънната артерия, коронарната и церебрална артерии и в аортата. Тези поражения са жълти на цвят, дължащо се на наличието на липидни отлагания намиращи се главно в стомашно-мускулните клетки и в макрофагите на най-вътрешния слой на артериите и аортата. Освен това се приема, че по-голяма част от холестерола .намиращ се в мастните образувания на свой ред води до увеличаване на нарастването на „фибро-плака“, което представлява натрупани найвътрешни стомашно-мускулни клетки, запълнени с липид и заобоколени от извън-клетъчен липид, колаген, еластин и протеогликани. Клетките плюс междуклетъчният материал образуват влакнообразна плака, която покрива по-дълбоките отложения на клетъчни остатъци и по-големия излишък от клетъчен липид. Липидът е основен свободен и естерифициран холестерол. Влакнестата плака се образува бавно и е вероятно след известно време да се калцира и некротизира, като напредва до „сложно увреждане“, което се изразява като артериално запушване и с тенденция към съдова тромбоза и артериален мускулен спазъм, което характеризира напреднала атеросклероза.

Епидемиологичните показатели установяват със сигурност хеперлипидемията като първичен рисков фактор причиняващ кардиоваскуларно заболяване (CVD) дължащо се на атеросклероза. През последните години водещите медици отново наблегнаха на понижаване нивата на плазмения холестерол, по-специално липопротеинен холестерол с ниска плътност, като съществен етап за предотвратяване на CVD. Горните граници за „нормални“ сега се приемат за значително по-ниски, отколкото възприетите преди. В резултат на това голяма част от населението на Запад сега се счита, че е в състояние на особено голям риск. Такива независими рискови фактори включват глюкозна нетолерантност, ляво вентрикулна хипертрофия, хипертензия на съществата от мъжки пол. Кардиоваскуларните заболявания са особено преобладаващи сред диабетици, поне отчасти поради наличието на множество независими рискови фактори сред тази част от хората. Следователно успешното лечение на хиперлипидемия на цялото население, и по-специално на лицата диабетици, е от изключителна важност за медицината.

Хипертензията (или високото кръвно налягане) е състояние, което се проявява сред хората като вторичен симптом на различни други заболявания като ренална атеростеноза, феохромоцитома иди ендокринни смущения. Обаче хипертензията е също показателна за много пациенти, при които агента причинител или смущението е неизвестно. Тъй като „същинска“ хипертензия често пъти е свързана с разстройства като диабети на затлъстяване и хипертриглицеридемия, то връзката между тези разстройства не е изяснена. Освен това много пациенти проявяват симптомите на високо кръвно налягане при пълно отсъствие на каквито и да са други признаци на болест или смущение.

Известно е, че хипертензията може пряко да доведе до сърдечен разрив и удар (мозъчен кръвоизлив). Тези състояния могат ф да причинят смърт на пациента в кратко време. Хипертензията може също да допринесе за развитието на атеросклероза и коронарно заболяване. Тези състояния постепенно отслабват пациента и могат до доведат до смърт в по-дълъг период от време.

Точната причина за същинската хипертензия е неизвестна, макар че се счита, че за появата на заболяването допринасят множество фактори. Сред тези фактори са стрес, неконтролирани емоции, нерегулярно отделяне на хормон (ринин, ангиотензин, алдостеронна система), излишък на сол и вода причинено от лошо функциониране на бъбреците, надабеляване на стените и ф хипертрофия на васкулатурата, което води до свиване на кръвоносните съдове, както и генетични фактори.

Лечението на същинската хипертензия е било предприето като се вземат под внимание горепосочените фактори. Така като средства против хипертензията са създадени и пуснати в употреба голяма поредица от бета-блокери, вазоконстриктори, инхибитори ангиотензин превръщащи ензими и други подобни. Лекуваната на хипертензията като се използват тези съединения е доказало полезността за предотратяване на бързопротичащи смъртни случаи като сърдечен удар, бъбречна недостатъчност и мозъчен кръвоизлив. Обаче развитието на атеросклерозата или сърдечно заболяване, дължащи се на хипертензия остава проблем продължително време. Това предполага, че въпреки че високото налягане е понижено, то основната причина за същинската хипертензия не подлежи на това лечение.

Хипертензията е свързвана с повишени нива на инсулин в кръвта, състояние известно като хиперинсулинемия. Инсулинът, хормон пептид, чийто първоначални действия са да подпомага оползотворяването на глюкозата, синтезирането на протеин и образуването и натрупването на неутрални липиди, също между другите неща съдейства за подпомагане нарастването на васкуларната клетка и увеличаване задържането на натрия в бъбрека. Тези последни функции могат да бъдат осъществявани без да влияе на нивата на глюкозата и са известни като причинители на хипертензия. Растежът на периферната васкулатура например може да причини свиване на периферните капиляри; докато задъържането на натрия увеличава обема на кръвта. Така, намаляването на нивата на инсулин при хиперинсулинемиците може да предотврати анормалния васкуларен растеж и реналното задържане на натрия, причинени от високи нива на инсулин и по този начин да облекчат хипертензията.

Парциалната хипертрофия е значителен рисков фактор за причиняване на бърза смърт, инфаркт на миокарда и конгестивно поражение на сърцето. Тези кардиални случаи се дължат поне частично на нарасналата чуствителност на увреждане на миокарда след исхемия и реперфузия, които могат да се проявят при амбулаторни болни и при пред- и след- оперативни престои. Има неопровержима медицинска необходимост за предотвратяване или минимизиране на неблагоприятните преди- и след оперативни миокардни изходи , особено на пред- и след- оперативните инфаркти на миокарда. Както кардиохирургията, така и не- кардио хирургията са свързани със съществени рискове за инфаркт на миокарда или смърт. Около 7 милиона пациенти, които не са подлагани на сърдечна операция се считат рискови за инцидентна смърт преди или след операция, както и за сериозни сърдечни усложнения, достигащи 20-25% за някои случаи. Допълнително, за 400,000 пациенти на които годишно е направена бай-пасна хирургическа операция, се установява, че пред- и след- оперативния инфаркт на миокарда възлиза на 5% и смърт 1-2%. Обикновено не се провежда проучване за терапията с лекарства в тази област, която намалява уврежданията на сърдечната тъкан от пред и след- оперативна миокардна исхемия или усилва устойчивостта на сърцето при исхемични състояния. Такова лечение се предвижда като животоспасяващо и намалява хоспитализацията, подобрява качеството на живота и намалява общите разходи за грижите за

здравето на високо-рисковите пациенти.

Произвеждането на инсулин от черния дроб е важна цел на терапията NIDDM. Черният дроб е главен регулатор на нивата на глюкозна плазма в след абсорбативния (ускорен) етап и скоростта на произвеждане на гликоза от черния дроб при NIDDM пациентите е значително повишено в сравнение с обикновените индивиди. Подобно при състояние на след етапа на приемане (хранене), където черният дроб има относително по-малка роля при доставянето на общото количество плазмена глюкоза, произвеждането на чернодробна глюкоза е анормално високо при NIDDM пациентите.

Гликогенолизис е важна цел за прекъсване произвеждането на чернодробна глюкоза. Черният дроб произвежда глюкоза чрез гликогенолизис (разлагане на глюкозния полимерен гликоген) и глюконеогенезис (синтезиране на глюкоза от 2- и 3-въглеродни предшественици). Няколко източника на данни показват, че гликогенолизис може да има голям принос за добиването на чернодробна глюкоза при NIDDM. Първо при хора с нормална постабсорбтивност до 75% от произвежданата чернодробна глюкоза

се счита, че е резултат от гликогенолизис. Второ, пациентите със заболявания на чернодробно гликогенно натрупване, включително Hers-заболяване (недостатъчност на гликоген фосфорилаза), проявяват епизодично хипогликемия. Тези наблюдения показват, че гликогенолизис може да бъде важен начин за произвеждане на чернодробна глюкоза.

Гликогенолизис се катализира в черния дроб, мускула и мозъка чрез специфични тъканни изоформи на ензим гликоген фосфорилаза. Този ензим разцепва макромолекулата на гликогена и отделя глюкоза-1-фосфат и нова по-къса макромолекула на гликоген. До сега е известено два типа инхибитори на гликоген фосфорилаза: глюкоза и аналози на глюкозата[ Martin, J.L. и др.

Biochemestry 1991,30,10101] и кофеин и други пуринови аналози [Kasvinsky, P.J. и др. Biol. Chem. 1978, 253,3343-3351 и 9102-9106]. Тези съединения и инхибиторите на гликоген фосфорилаза в голяма степен, са били посочвани като приложими за лечение на NIDDM чрез намаляване произвеждането на чернодробна глюкоза и понижаване на гликемията. [ Blindell, и др. Diabetologia 1992, 35 Suppl.2,569-576 и Martin и др. Biochemistry 1991, 30,10101].

Механизмът(механизмите) отговорен за увреждания на миокарда, наблюдавано след исхемия и реперфузия не са напълно изяснени. Съобщено е [M.F.Allard, и др. Am. J. Physiol. 267, Н66-Н74, 1994], че „предварителното исхемично намаляване на гликоген...е свързано с подобрено след исхемично ляво вентрикуларно функционално възстановяване в хипертрофирани сърца на плъхове“.

Така, въпреки че има разнообразни терапии за хипергликемия, хиперхолестеролемия, хипертензия, хиперинсулинемия, хиперлипидемия, атеросклероза и исхемия, то има непрекъснато нужда и непрекъснато изследване в тази област на техниката за алтернативни лечения.

Техническа същност на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до фармацевтични състави съдържащи инхибитори на алдозо редуктаза и инхибитори на гликоген фосфорилаза и до използването на такива състави за лечение при резистентно на инсулин състояние, включително диабети при млекопитаещи (например хора - мъже или жени) или до

използване на такива състави за намаляване увреждания на тъканта (например по същество предотвратяване увреждането на тъканта, включително предпазване на тъканта) произтичащо от исхемия.

Комбинациите включват терапевтично ефективни количества от инхибитор на алдозо редуктаза и инхибитор на гликоген фосфорилаза.

Предпочитаното количество от инхибитор на алдозо редуктаза е около 0.1 мг/кг до около 20 мг/кг и предпочитаното количество от инхибитор на гликоген фосфорилаза е около 0.1 мг/кг до около 15 мг/кг.

Особено предпочатан инхибитор на алдозо редуктаза е 1-фталазиноцетна киселина, 3,4-дихидро-4-оксо-3[[5трифлуорометил)-2- бензотиазолил]; метил]-.

Предпочитани инхибитори на гликоген фосфорилаза включват

съединения с формула I

формула I и фармацевтично приемливи соли и изходните им съединения, в която пунктираната линия (-) е по избор връзка;

A e -C(H)=, -C((Ci -С₄)алкил= или -С(халоген)=, когато пунктирната линия (-) е връзка, или А е мвтилен или -СН^-С^алкил-, когато пунктирната линия (-) не е връзка;

R_h R₁₀ или Rn са веки независимо един от друг Н, халоген, 4-, 6- или 7-нитро, циано група, (Ci - С₄)алкил, (Cj -С₄)алкокси, флуорометил, дифлуорометил или трифлуорометил;

R₂eH;

R₃ е Н или (Ci -С₅)алкил;

R₄eH, метил, етил, η-пропил, хидрокси(С1-С₃)алкил, (Ci-С₃)алкокси (Ci -С₃) алкил, фенил(С1-С₄)алкил, фенилхидрокси^ С₄)алкил, фенил(С1 -С₄)алкокси(С1 -С₄)алкил, тиен- 2- или -3-ha(Ci С₄)алкил или фур-2-или -3-ha(Ci -С₄)алкил, където споменатите R₄пръстени са моно-, ди- или три-заместени всеки независимо един от друг на въглерод с водород, халоген, (Ci -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, трифлуорметил, хидрокси, амино или циано група; или

R₄ е пирид-2-, -3- или -4-ha(Ci -С₄)алкил, тиазол-2-, --4- или -5ил(С1 -С₄)алкил, имидазол-1-, -2-, -4- или -5-ил(С_гС₄)алкил, пирол-2-или -3-ha(Ci-С₄)алкил, оксазол-2-, -4- или-5-ил(С1 -С₄)алкил, пиразол-3-,-4или -5-ha(Ci -С₄)алкил, изоксазол-3-, -4- или -5-HA(Ci -С₄)алкил, изотиазол-3-, -4- или -5-ил(С, -С₄)алкил, пиридаЗин-3- или -4-ha(Ci С₄)алкил, пиримидин-2-, -4-,-5- или -6-ha(Ci -С₄)алкил, пиразин-2- или -

3-ил (Ci -С₄)алкил или 1,3,5- триазин-2-ил(С1 -С₄)алкил, където споменатите преди R₄ хетеропръстени са по избор моно- или дизаместени всеки независимо един от друг с халоген, трифлуорметил, (Ci-С₄)алкил, (Ci-С₄)алкокси, амино или хидрокси група и споменатите моно- или дву-заместени са свързани с въглерод;

R₅ е Н, хидрокси група, флуоро, (Ci -С₅)алкил, (Ci -С₅)алкокси, (Ci -С₆)алканоил, амино (Ci -С₄)алкокси, моно-N- или ди-Ν,Ν- (Ci С₄)алкиламино(С1 -С₄)алкокси, карбокси^ -С₄)алкокси, (Ci С₅)алкокси-карбонил(С1 -С₄)алкокси, бензилоксикарбонил^С₄)алкокси, или карбонилокси, където споменатият карбонилокси е въглерод-въъглерод свързан с фенил, тиазолил, имидазолил, 1Ниндолил, фурил, пиролил, оксазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил или 1,3,5триазинил, и където споменатите преди това R₅ пръстени са по избор моно-заместени с халоген, (Ci -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, хидрокси, аминогрупа или трифлуорометил и споменатите моно-заместени са свързани с въглерод;

R₇ е Н, флуоро или (С₄ -С₅)алкил; или

R₅ и R₇ могат да бъдат взети заедно като оксо;

R_e е карбокси, (Ci-С₈)алкоксикарбонил, C(O)NR₈Rg или C(O)R₁₂, където

R_B е Н, (Ci -С₃)алкил, хидрокси или (Ci -С₃)алкокси; и R₉ е Н, (Ci -С₈)алкил, хидрокси, (Ci -С₈)алкокси, метиленперфлуориниран(С₁ -С₈)алкил, фенил, пиридил, тиенил, фурил, пиролил, пиролидинил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, пиразолинил, пиразолидинил, изоксазолил, изотиазолил, пиранил, пиперидинил, морфолинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, пиперазинил или 1,3,5- триазинил, където споменатите преди R_eпръстени са звързани въглерод-азот; или

R₃ е моно-, ди- или-тризаместен (Ci -С₅)алкил, където споменатите заместители са всеки независимо един от друг Н, хидрокси, амино група, моно-N- или fln-N,N-(Ci -С₅)алкиламино; или Rg е моно- или ди-заместен (Ci _С₅) алкил където споменатите заместители са всеки независимо един от друг фенил, пиридил, фурил, пиролил, пиролидинил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, пиразолинил, пиразолидинил, изоксазолил, изотиазолил, пиранил, пиридинил, пиперидинил, морфолинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, пиперазинил, или 1,3,5-триазинил, където неароматните азот-съдържащи R₉ пръстени са по избор моно-заместени на азот с (Ci -С_в)алкил, бензил, бензоил или (Ci С₈)алкоксикарбонил и където R₉ пръстените са по избор моно12 заместени на въглерод с халоген, (Ci -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, хидрокси, амино група, или моно- N- и ди- Ν,N(Ci -С₅)алкиламино при условие, че не е включен четвъртичен азот и че няма връзки азоткислород, азот-азот или азот-халоген;

В₁₂епиперазин-1-ил, 4-(Ci-С₄)алкилпиперазин-1-ил, 4формилпиперазин-1-ил, морфолино, тиоморфолино, 1оксотиоморфолино, 1,1-диоксо-тиоморфолино, тиазолидин-3-ил, 1оксо-тиазолидин-3-ил, 1,1-диоксо-тиазолидин-З-ил, 2-(CiС₆)алкоксикарбонилпиролидин-1-ил, оксазолидин-3-ил, или 2(R)хидроксиметилпиролидин-1-ил; или

R₁₂ е 3- и/или 4-моно или ди-заместен оксазетидин-2-ил,

2-, 4-, и/или 5-моно или ди-заместен оксазолидин-3-ил, 2-, 4-, и/или 5моно или ди-заместен тиазолидин-3-ил, 2-, 4-, и/или 5-моно или дизаместен 1-оксотиазолидин-З-ил, 2-, 4-, и/или 5-моно или дизаместен 1,1-диоксотиазолидин-З-ил, 3-и/или 4-, моно- или дизаместен пиролидин-1-ил, 3-, 4-и/или 5-, моно-, ди-или тризаместен пиперидин-1-ил,3-, 4-, и/или 5-моно, ди-, или тризаместен пиперазин-1ил, 3-заместен азетидин-1-ил, 4- и/или 5-, моно- или ди-заместен 1,2оксазинан-2-ил, 3-и/или 4-моно- или ди-заместен пиразолидин-1-ил,

4- и/или 5-, моно- или ди-заместен изоксазолидин-2-ил, 4-и/или 5-, моно- и/или ди-заместнен изотиазолидин-2-ил, където Ri₂заместителите са всеки независимо един от друг Н, халоген, (Ci -С₅)алкил, хидрокси, амино група, моно-N- или fln-N,N-(Ci С₅)алкиламино, формил, оксо, хидроксиимино, (Ci -С₅)алкокси, карбокси, карбомоил, moho-N-или fln-N,N-(Ci-С₄)алкилкарбамоил, (Ci -С₄)алкоксиимино, (Ci -С₄)алкоксиметокси, (Ci С₆)алкоксикарбонил, карбокси(С1 -С₅)алкил или хидрокси (Ci С₅)алкил;

с уговорка че или R₄ е Н, метил, етил или η-пропил, R₅ е ОН;

с уговорка, че ако R_s и R₇ са Н, тогава R₄ не е Н, метил, етил, ппропил, хидрокси^! -С₃)алкил или (С₁ -С₃)алкокси(С₁ -С₃)алкил и R_e е C(O)NR₈R₉, C(O)R₁₂ или (C_t -С₄)алкоксикарбонил.

Първата група предпочитани съединения с Формула I съдържа тези съединения, в които

Rie5-H, 5-халоген, 5-метил или 5-циано;

R₁₀ иИц са всеки независимо един от друг Н или халоген; Ае-С(Н)=;

R₂ и R₃ са Н;

R₄ е фенил(С₁ -С^алкил, където споменатите фенилни групи са моно-, ди- или три-заместени всеки независимо една от друга с Н или халоген или моно- или ди-заместени всяка независимо една от друга с Н, халоген, (C_t -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, трифлуорометил, хидрокси, амино или циано група; или

R₄ е тиен-2 или -3-ha(Ci -С^алкил, пирид-2-, -3- или -4-ил(С1 С^алкил, тиазол-2-, -4- или -5-ha(Ci -С^алкил, имидазол-1, -2-, -4- или S-HAfCi -Сг)алкил, фур-2- или -3-ha(Ci -С^алкил, пирол-2- или -3-ил(С1 С^алкил, оксазол-2-,-4- или -5-ил-(С·, -С^алкил, пиразол-3-, -4- или -5ил(С1 -Сг)алкил, изоксазол-3-, -4- или -5-ил(С₁ -С^алкил, където споменатите преди R₄ хетеро пръстени са по избор моно- или дизаместени всеки независимо един от друг с халоген, трифлуорометил, (Ci -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, амино или хидрокси и споменатите моно- или ди-заместители са свързани на въглерод;

R₅ е хидрокси;

R_e е C(O)NR₃Rg или C(O)Ri₂; и

R₇eH.

В горната първа група предпочитани съединения с формула I е първа група особено предпочитани съединения, където въглеродният атом а има (S) стереохимизъм;

въглеродният атом Ь има (R) стереохимизъм;

R₄ е фенил(С₁ -С^алкил, тиен-2-ил-(С! -С^алкил, тиен-З-ил-^ С^алкил, фур-2-ил-(С,-С^алкил или фур-3-ил-(С₁ -С^алкил, където споменатите пръстени са моно- или дву-заместени всеки независимо един от друг с Н или флуор;

ReeC(O)NReR_e;

R₈ е (С₁ -С₃)алкил, хидроокси или (С₄ -С₃)алкокси; и

R₉ е Н, (Ci -С₈)алкил, хидрокси, хидрокси (Ci -С₆)алкил, (Ci С₈)алкокси, пиридил, морфолинил, пиперазинил, пиролидинил, пиперидинил, имидазолил или тиазолил или (Ci -С₄)алкил монозаместен с пиридил, морфолинил, пиперазинил, пиролидинил, пиперидинил, имидазолил или тиазолил.

В горната първа група на особено предпочитани съединения са специално предпочитаните съединения

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKCwдиметилкарбамоил-метил)-2-фенил-етил]-амид,

5,6-дихлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина {(1S)-[ (R)хидрокси-(метокси-метил-карбамоил)-метил]-2-фенил-етил -амид,

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина {(1S)-{(R)-xnflpoKcn(метокси-метил-карбамоил)-метил]-2-фенил-етил} -амид,

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина((13)-{(Р)-хидрокси[ (2-хидрокси-етил)-метил-карбамоил]-метил} -2-фенил-етил)-амид,

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина {(1S)-[(R)-xkmpoKcn(метил-пиридин-2-ил-карбамоил)-метил]-2-фенил-етил} -амид или

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина ((1S)-{(R)-xnflpoKcn[метил-(2-пиридин-2-ил-етил)-карбамоил]-метил}-2-фенил-етил)-амид.

В горната първа група особено предпочитани съединения са съединенията, в които:

a. Ri е 5-хлоро; RioHRn саН;

R₄ е бензил;

R₈ е метил; и . Г.' .

B

1⁵

R₉ е метил;

b. Ri е 5-хлоро;

Rn e H;

R₁₀ е б-хлоро;

R₄ е бензил;

R₈ е метил; и R₉ е метокси;

c. Ri е 5-хлоро;

R₁₀MRncaH;

R₄e бензил;

R₈ е метил; и R_g е метокси;

d. Ri е 5-хлоро;

Rio и Rii са H;

R₄ е бензил;

Rs е метил; и

R₉ е 2-(хидрокси)етил;

e. Ri е 5-хлоро;

Rio e Rii са H;

R₄ е бензил;

R₈ е метил; и Rg e пиридин-2-ил; и

f. RiO 5-хлоро;

R_w и Rii са H;

R₄ е бензил;

R₈ е метил; и Rg е 2-(пиридин-ил)етил.

В горната първа група особено предпочитани съединения с формула I е втора група специално предпочитани съединенията, в които:

въглеродният атом а има (S) стереохимизъм;

въглеродният атом b има (R) стереохимизъм;

R₄ е фенил(С₁ -С^алкил, тиен^-ил-^ -С^алкил, тиен-З-ил-^ Сг)алкил, фур-г-ил-^ -С^алкил или фур-3-ил-(С! -С^алкил, където споменатите пръстени са моно- или ди- заместени всеки независимо един от друг с Н или флуор.

Rq е C(O)R₁₂; и

R₁₂ е морфолино, 4-(С₁-С₄)алкилпиперазин-1-ил, 3-заместен азетидин-1-ил, 3-и/или 4-, моно-или ди-заместен пиролидин-1-ил, 4и/или 5-моно или ди-заместен изоксазолидин-2-ил, 4-и/или 5-, моноили ди-заместен 1,2-оксазинан-2-ил, където споменатите заместители са всеки независимо един от друг Н, халоген, хидрокси, амино група, моно-N- или λη-Ν,Ν-^ -С₆)алкиламино, оксо, хидроксиимино или алкокси.

От горната първа група особено предпочитани съединения са специално предпочитаните съединения,:

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ (1S)-6eH3HA-(2R)хидрокси-3-(4-метил-пиперазин-1-ил)-3-оксо-пропил]-амид хидрохлорид,

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ (1S)-6eH3m-(2R)хидрокси-3-(3-хидрокси-аЗетидин-1-ил)-3-оксо-пропил]-амид,

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина ((1S)-6oh3ma-(2R)хидрокси-3-изоксазолидин-2-ил-3-оксо-пропил)-амид,

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина ((1S)-6eH3kv\-(2R)хидрокси-3-[ 1,2]оксазинан-2-ил-3-оксо-пропил)-амид,

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ (1S)-6eH3HA-(2R)хидрокси-3-((33)-хидрокси-пиролидин-1 -ил)-3-оксо-пропил]- амид,

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбосилна киселина [ (1в)-бензил-3((33,48)-дихидрокси-пиролидин-1-ил)-(2Б)-хидрокси-3-оксо-пропил]амид,

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (18)-бензил-3((ЗП,48)-дихидрокси-пиролидин-1-ил)-(2П)-хидрокси-3-оксо-пропил]амид или

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина((1 S)-бензил-(2R)хидрокси-3-морфолин-4-ил-3-оксо-пропил)-амид.

В горната втора група особено предпочитани съединения са съединенията, в които

a. Ri е 5-хлоро;

R₁₀ и Rn са Н;

R₄ е бензил; и

R₁₂ е 4-метилпиперазин-1 -ил;

b. R₁ е 5-хлоро;

R₁₀ и R-и са Н;

R₄ е бензил; и

R₁₂e З-хидроксиазетидин-1-ил;

c. Ri е 5-хлоро;

R₁₀ и Rn са Н;

R₄ е бензил; и

R₁₂ е изоксазолидин-2-ил;

d. Ri е 5-хлоро;

R₁₀ и Rn са Н;

R₄ е бензил; и

R₁₂ е (1,2)-оксазинан-2-ил;

e. Ri е 5-хлоро;

R₁₀n R_n са Η;

R₄ е бензил; и

R₁₂ е 3(8)-хидроксипиролидин-1-ил;

f. Ri е 5-хлоро;

саН;

R₄ е бензил; и

R₁₂ е (38,48)-дихидроксипиролидин-1-ил;

g. Ri е 5-хлоро;

RioHRn са Η;

R₄ е бензил; и

R₁₂ е (ЗР,48)-дихидроксипиролидин; и

h. R, е 5-хлоро;

Rio и RucaH;

R₄ е бензил; и R₁₂ е морфолино.

Втората група от предпочитани съединения с формула I включва тези съединения, в които

Ri е Н, халоген, метил или циано група;

R₁₀ и Rii са всеки независимо един от друг Н или халоген; Ае-С(Н)=;

R₂ и R₃ са Н;

R₄ е фенил(С₁ -С^алкил където споменатите фенилни групи са моно-, ди- или три-заместени всяка независимо една от друга с Н или халоген или моно или ди-заместени всяка независимо една от друга с Н, халоген, (Ci -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкоски, трифлуорометил, хидрокси, амино или циано група; или

R₄e тиен-2- или -3-ha(Ci -С^алкил, пирид-2-, -3- или -4-ил (Ci -С^алкил, тиазол-2-, -4- или -5-ha(Ci -С^алкил, имидазол-1-, -2-, -4или 5-ил(С_гСг)алкил, фур-2- или -3-HA(Ci -С^алкил, пирол-2- или-3ha(Ci -С^алкил, оксазол-2-, -4- или -б-ил^ -С^алкил, пиразол-3-, -4или -5-HA(Ci -С^алкил, изоксазол -3-, -4- или -5-HA(Ci -С^алкил, в които гореспоменатите R₄ хетеропръстени са по избор моно- или дизаместени всеки независимо един от друг с халоген, трифлуорометил, (Ci -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, амино или хидрокси група и споменатите моно- или ди-заместители са свързани към въглерод;

R_s е хидрокси;

R_e е карбокси или (Ci -С_в)алкоксикарбонил; и

R₇ е Н, флуор или (Ci -С_в)алкил.

Във втората група предпочитани съединения с формула I има група особено предпочитани съединения, в които въглеродният атом а е със (S) стереохимизъм; въглеродният атом b е с (R) стереохимизъм;

R₄ е фенш^С, -С^алкил, тиен-^-ил-^ -С^алкил, тиен-З-ил (Ci -С₂)алкил, фур-2-ил(С! -С^алкил или фур-3-ил-(С₁ -С^алкил, в които споменатите пръстени са моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг с Н или флуор.

Ri_OnRii саН;

R_eeKap6oKcn; и

R₇eH.

Предпочитано съединение сред непосредствено предшестващата група е съединението, в което:

Ri е5-хлоро;

R₁₀ и Rii са Н; и

R₄ е бензил.

Трета група предпочитани съединения с формула I включва тези съединения, в който

Ri е Н, халоген, метил или циано група.

R₁₀ и Rii всеки независимо един от друг са Н или халоген.

Ае-С(Н)=;

R₂nR₃caH;|

R₄ е фенил(С1 -С^алкил, в който споменатите фенилни групи са моно-, ди- или три-заместени всяка независимо една от друга с Н или!

халоген или моно- или ди-заместени всяка независимо една от друга[ с Н, халоген, (Ci -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, трифлуорметил,| хидрокси, амино или циано група; илиί

R₄ е тиен-2- или -3-HA(Ci -С^алкил, пирид-2-, -3- или -4-ηλ(0ι Сг)алкил, тиазол-2-,-4- или-5-ил(С1 -С^алкил, имидазол-1-,-2-, -4- или 5-ил(С₁ -Сг)алкил, фур-2- или -3-ηλ(0ι -С^алкил, пирол-2- или -3-ηλ(0ι 20

С^алкил, оксазол-2-,-4- или -5-ил(С! -С^алкил, пиразол-3-,-4- или-5ΠΛ(Οί -С₂)алкил, изоксазол-3-, -4- или -б-ил^ -С^алкил, в които споменатите преди R₄ хетероцикли са по избор моно- или дизаместени всеки независимо един от друг с халоген, трифлуорметил, (С! -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, амино или хидрокси група и споменатите моно- или ди-заместители са свързани с въглерод;

R₅ е флуоро, (Ci -С₄)алкил, (С₄ -С₅)алкокси, аминоСС, С₄)алкокси, моно-N- или fln-N,N-(Ct -С₄)алкиламино(С₁ -С₄)алкокси, карбоксил (С^ -С₄)алкокси, (Ci -(^алкокси-карбонил^ -С₄)алкокси, бензилоксикарбонил(С₁ -С₄)алкокси;

R₇ е водород, флуоро или (С₁ -С₈)алкил.

Четвърта група предпочитани съединения с формула I включва тези съединения, в които

Ri е Н, халоген, метил или циано група;

R₁₀ и R_n са всеки независимо един от друг Н или халоген;

Ае-С(Н)=;

R₂ и R₃ са водород

R₄ е фенил(С₁ -С^алкил, в който фенилните групи са моно-, диили три-заместени всяка независимо една от друга с Н или халоген ф или моно- или ди-заместени всяка независимо една от друга с Н, халоген, (Ct -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, трифлуорметил, хидрокси, амино или циано група; или

R₄ е тиен-2- или -3-ил(С! -С^алкил, пирид-2-,-3- или -4-ил(С! С₂)алкил, тиазол-2-, -4- или -5-ил(С₁ -С^алкил, имидазол-1-,-2-,-4- или б-ил^ -С^алкил, фур-2-или-3-ил(С₁ -С^алкил, пирол-2- или -З-ил^ С^алкил, оксазол-2-, -4- или -5-ил(С, -С^алкил, пиразол-3-,-4- или -5ил^ -С₂)алкил, изоксазол-3-,-4- или -б-ил^ -С^алкил, в които споменатите преди R₄ хетеропръстени са по избор моно или дизаместени всеки независимо един от друг с халоген, трифлуорметил,

(С₁ -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, амино или хидрокси и споменатите моно- или ди-заместители са свързани с въглерод;

Rs е флуоро, (Ci -С₄)алкил, (С₁ -С₅)алкокси, амино^, С₄)алкокси, моно-N- или ah-N,N-(Ci -С₄)алкиламино(С!-С₄)алкокси, карбокси (С₁ -С₄)алкокси, (С^-С^алкокси-карбонил^-С^алкокси, бензилоксикарбонил^! -С₄)алкокси;

Re е C(O)NReR_e или C(O)R₁₂; и

R₇ е Н, флуоро или (Ci -С₆)алкил.

Предпочитаните инхибиторй^ликоген фосфорилаза включват съединения с формула IA

Формула IA и фармацевтично приемливи соли и техни предварителни лекарства, където пунктираната линия (- - -) е по избор връзка;

А е -С(Н)=, -C((Ct -С₄)алкил=, -С(халоген)=или -N=, когато пунктирната линия (- - -) е връзка, или А е метилен или -СН((С, С₄)алкил)-, когато пунктираната линия (- - -) не е връзка;

Ri, R₁₀ и Rii всеки независимо един от друг са Н, халоген, циано група, 4-, 6-, или 7-нитро, (Ci -С₄)алкил, (Ci - С₄) алкокси, флуорометил дифлуорометил или трифлуорометил;

R₂eH;

R₃ е Н или (Ci -С₅)алкил;

R₄ е Н, метил, етил, η-пропил, хидрокси(С, -С₃)алкил(С1 С₃)алкокси(С!-С₃)алкил, фенил(С! -С₄)алкил, фенилхидрокси^-С^ алкил, (фенил)((С1 -С₄)алкокси)(С! -С₄)алкил, тиен-2- или -3-ha(Ci С₄)алкил или фур-2-или -3-ил(С! -С₄)алкил, в които сповменатите R₄ пръстени са моно, ди- или три-заместени всеки независимо един от друг на въглерод с Н, халоген, (С₁ -С₄)алкил, (С₁-С₄)алкокси, трифлуорометил, хидрокси, амино, циано или 4,5-дихидро-Шимидазол-2-ил; или

R₄ е пирид-2-, -3- или ~4-ил(С1 -С₄)алкил, тиазол-2-, -4- или -5ил(С·! -С₄)алкил, имидазол -2-, -4- или -5-ηλ(0·ι -С₄)алкил, пирол-2-или-

3-ил(С1-С₄)алкил, оксазол-2-, -4- или -5-ил(С1 -С₄)алкил, пиразол-3-, -4или -5-ил(С₁ -С₄)алкил, изоксазол -3-, -4- или -5-ha(Ci -С₄)алкил, изотиазол-3-, -4- или -5-ил(С₁ -С₄)алкил, пиридазин -3- или 4-ил(С₁ С₄)алкил, пиримидин -2-, -4-, -5- или -6- ил(С₁-С₄)алкил, пиразин -2- или О -3-ил(С! -С₄)алкил, 1,3,5-триазин-2-ил(С₁ -С₄)алкил или индол-2-(С1 -

С₄)алкил, в които споменатите преди R₄ хетеропръстени са по избор моно-или ди-заместени всеки независимо един от друг с халоген, трифлуорометил, (Ci -С₄)алкил, (С₄ -С₄)алкокси, амино, хидрокси или циано група и споменатите заместители са свързани с въглерод; или

R₄ е Ris-карбонилоксиметил, в който споменатият R_1s е фенил, тиазолил, имидазолил, 1Н-индолил, фурил, пиролил, оксазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, пиридил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил или 1,3,5-триазинил, в които споменатите ф преди R₁₅ пръстени са по избор моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг с халоген, амино, хидрокси група, (Ci ] С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси или трифлуорометил и споменатите моно или ди-заместители са свързани с въглерод;

I R₅eH;

| Re е карбокси, (Ci -С₈)алкоксикарбонил, бензилоксикарбонил, ϊ C(O)NRgRg или C(O)Ri₂.

в които i

j R₈ е Н, (Ci -С₆)алкил, цикло(С₃ -С_б)алкил, цикло(С₃ -С_в)алкил(С1 j С₅)алкил, хидрокси група или (Ci -С₈)алкокси; и '1

R₉e Н, цикло(С₃ -С₈)алкил, цикло (С₃ -С₈)алкил(С| -С₅)алкил, цикло (С₄ -С₇)алкенил, цикло (С₃ -С₇)алкил(С! -С₅)алкокси, цикло (С₃ С₇)алкокси, хидрокси, метилен-перфлуориниран(С₁ -С₈)алкил, фенил или хетероциклено съединение, в което споменатият хетеропръстен е пиридил, фурил, пиролил, пиролидинил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, пиразолинил, пиразолидинил, изоксазолил, изотиазолил, пиранил, пиридинил, пиперидинил, морфолинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, пиперазинил, 1,3,5-триазинил, бензотиазолил, бензооксазолил, бензимидазолил, тиохроманил или тетрахидробензотиазолил, в които хетероциклените пръстени са свързани въглерод-азот; или

R₉ е (Ci -С₆)алкил, или (Ci -С₈)алкокси, в които споменатите (Ci С₈)алкил или (Ci -С₈)алкокси са по избор монозаместени с цикло(С₄ С₇)алкен-1-ил, фенил, тиенил, пиридил, фурил, пиролил, пиролидинил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, пиразолинил, пиразолидинил, изоксазолил, изотиазолил, пиранил, пиперидинил, морфолинил, тиоморфолинил, 1-оксотиоморфолинил, 1,1диоксотиоморфолинил, пиридазинил,пиримидинил, пиразинил, пиперазинил, 1,3,5-триазинил или индолил и в които споменатият (Ci -С_в)алкил или (Ci -С₈)алкокси са по избор допълнително всеки независимо един от друг моно- или ди-заместени с халоген, хидрокси, (Ci -С₅)алкокси, амино, моно-N- или AH-N,N-(Ci С₅)алкиламино, циано, карбокси, или (Ci -С₄)алкоксикарбонил; и в които R₉ пръстените са по избор моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг на въглерод с халоген, (Ci - С₄)алкил, (Ci - С₄) алкокси, хидрокси, хидрокси^ -С₄)алкил, амино (Ci С₄)алкил, моно-N- или fln-N,N-(Ci -С₄)алкиламино(С1 -С₄)алкил, (Ci C₄)aAKOKcn(Ci -С₄)алкил, амино, моно-N- или ah-N,N-(Ci С₄)алкиламино, циано, карбокси, (Ci -С₅)алкоксикарбонил, карбамоил, формил или трифлуорометил и споменатите R₉пръъстени могат допълнително по избор да бъдат моно- или ди заместени всеки независимо един от друг с (С₁ -С₅)алкил или халоген;

с уговорката, че в никой R_g хетеропръстен не е включен четвъртичен азот;

R₁₂ е морфолино, тиоморфолино, 1-оксотиоморфолино, 1,1диоксотиоморфолино, тиазолидин-3-ил, 1-оксотиазолидин-З-ил, 1,1диоксотиазолидин-3-ил, пиролидин-1-ил, пиперидин-1-ил, пиперазинил-1-ил, пиперазин-4-ил, азетидин-1-ил, 1,2-оксазинан-2-ил, пиразолидин-1-ил, изоксазолидин-2-ил, изотиазолидин-2-ил, 1,2оксазетидин-2-ил, оксазолидин-3-ил, 3,4-дихидроиЗокуинолин-2-ил,

1.3- дихидроизоиндол-2-ил, 3,4-дихидро-2Н-куинол-1-ил, 2,3-дихидробензо[1,4]оксазин-4-ил, 2,3-дихидро-бензо[1,4]тиазин-4-ил, 3,4дихидро-2Н-куиноксалин-1-ил, 3,4-дихидро-бензо[с][1,2]оксазин-1-ил,

1.4- дихидро-бензо[0][ 1,2]оксазин-3-ил, 3,4-дихидро-бензо[ е][ 1,2] оксазин-2-ил, ЗН-бензо[0]изоксазол-2-ил, ЗН-бензо[с]изоксазол-1-ил или азепан-1-ил, където споменатите R_1Z пръстени са по избор моно-, ди- или три-заместени всеки независимо един от друг с халоген, (Ci -С₅) алкил, (Ci -С₅)алкокси, хидрокси, амино група, моно-N- или ди-Ν,Ν(Ст -С₅)алкиламино, формил, карбокси, карбамоил, моно-N- или диМ.ЩСгС^алкилкарбамоил, (Ci-С₆)алкокси(С1-С₃)алкокси, (CiС₅)алкоксикарбонил, бензилоксикарбонил, (С₍ -С₅) алкоксикарбонил (Ci -С₅)алкил, -С₄)алкоксикарбониламино, карбокси (Ci -С₅)алкил, карбамоил(С1 -С₅)алкил, моно-N- или fln-N,N-(Ci -С₅) алкилкарбамоил (Ci -С₅)алкил, хидрокси^ -С₅)алкил, (Ci -С₄)алкокси (Ci -С₄)алкил, амино (Ci -С₄)алкил, моно-N- или fln-N,N-(Ci -С^алкиламино^ С₄)алкил, оксо, хидроксиимино или (Ci -С₆)алкоксиимино и в които не повече от два заместители са избрани от оксо, хидроксиимино или (Ci -С₆)алкоксиимино и оксо, хидроксиимино или (Ci -С₆) алкоксиимино са неароматен въглерод; и

където споменатите R₁₂ пръстени са по избор допълнително моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг с (Ci -С₅) алкил или халоген;

при предварителното условие, че когато R_ee (Ci -С₅) алкоксикарбонил или бензилоксикарбонил, тогава Ri е 5-халоген, 5(Ci -С₄)алкил или 5-циано и R₄ е (фенил) (хидрокси) (Ci -С₄)алкил, (фенил) ((Ci -С₄)алкокси(С1 -С₄)алкил, хидроксиметил или Ar(Ci -Сг) алкил, в които Аг е тиен-2- или -3-ил, фур-2- или -3- ил или фенил, в които споменатия Аг е по избор моно- или ди-заместен всеки независимо един от друг с халоген; с уговорката, че когато R₄ е бензил и R₅ е метил, Ri₂ не е 4-хидрокси-пиперидин-1-ил или когато R₄е бензил и R₅ е метил, R_e не е C(O)N(CH₃)₂;

с уговорката, че когато Ri и R_w и Rn са Н, то R₄ не е имидазол-

4-илметил, 2-фенилетил или 2-хидрокси-2-фенилетил;

с уговорката, че когато и R₈ и R₉ са n-пентил, то Ri е 5-хлоро, 5бромо, 5-циано, 5(Ci -С₅)алкил, 5(Ci -С₅)алкокси или трифлуорометил;

с уговорката, че когато R₁₂ е 3,4-дихидроизокуинол-2-ил, споменатият 3,4-дихидроизокуинол-2-ил не е заместен с карбокси((С1 -С₄)алкил;

с уговорката, че когато Re е Н и R₉ е (Ci -С₈)алкил, R₉ не е заместен с карбокси или (Ci -С₄)алкоксикарбонил на въглерод, който е свързан към азотен атом N в NHR₉; и с уговорката, че когато Re е карбокси и R_1s R₁₀, Rn, и R₅ са всички Н, тогава R₄ не е бензил, Н, (фенил)(хидрокси)метил, метил, етил или п-пропил.

Първата група предпочитани съединения с формула IA включва тези съединения, в които:

Ri е 5-Н, 5-халоген, 5-метил, 5-циано или 5-трифлуорометил; R_w и Rn са всеки независимо един от друг Н или халоген; Ае-С(Н)=;

R₂ hR₃ caH;

R₄ е H,метил, фенил(С₁ -С^алкил, в които споменатите фенилни групи са моно- или ди-заместени всеки независиимо един от друг с Н, халоген, (Ci -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, трифлуорометил, хидрокси, амино или циано група и в които споменатите R₄ групи са по избор допълнително моно-заместени с халоген; или

R₄ е тиен-2- или -3-ha(Ci -С^алкил, пирид-2-,-3- или -4-ил(С1 С^алкил, тиазол-2-,-4- или -б-ил^ -С^алкил, имидазол-2-, -4- или -5ha(Ci -С^алкил, фур-2- или -3-ил(С1 -С^алкил, пирол-2- или -3-ил(С1 С₂)алкил, оксазол-2-,-4-или-5-ha(Ci-Сг)алкил, пиразол-3-,-4-илиС 5-ha(Ci -Сг)алкил, изоксазол -3-, -4- или -5-ил(С1 -С₂)алкил, изотиазол 3-, -4- или -5-ha(Ci -Сг)алкил, пиридазин -3- или -4-ha(Ci -С^алкил, пиримидин -2-, -4-, -5- или -6-ил(С1 -С^алкил, пиразин-2- или -3-ha(Ci С^алкил или 1,3,5-триазин -2-HA(Ci -С^алкил, в които преди споменатите R₄ хетеро пръстени са по избор моно или ди-заместени всеки независимо един от друг с халоген, трифлуорометил, (Ci С^алкил, (Ci -Сг)алкокси, амино или хидрокси група и споменатите моно или ди-заместители са свързани към въглерод;

R₅ е Н; и

Rg е C(O)NR₀R₉ или C(O)Ri₂.

Ф В горната първа група предпочитани съединения с формула IA има първа група на особено предпочитани съединения, в които

R₄ е Н, фенил(С, -С^алкил, тиен-2- или -3-w\(Ci -С^алкил, фур-2или -3-ил(С1 -Сг)алкил, в които споменатите R₄ пръстени са моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг с Н или флуоро;

Re е C(O)Ri₂; и

R₁₂ е морфолино, тиоморфолино, 1-оксотиоморфолино, 1,1диоксотиоморфолино, тиазолидин-3-ил, 1-оксотиазолидин-З-ил, 1,1диоксотиазолидин-3-ил, пиролидин-1-ил, пиперидин-1-ил, пиперазин-1ил, пиперазин-4-ил, азетидин-1-ил, 1,2-оксазинан-2-ил, изоксазолидинШИР

2- ил, изотиазолидин-2-ил, 1,2-оксазетидин-2-ил, оксазолидин-3-ил,

1,3-дихидроизоиндол-2-ил или азепан-1-ил.

в които споменатите R₁₂ пръстени са по избор моно- или дизаместени всеки независимо един от друг с халоген, (Ci -С₅)алкил, (Ci -С₅)алкокси, хидрокси, амино, моно-N- или fln-N,N-(Ci С₅)алкиламино, формил, карбокси, карбамоил, моно-N- или ди-Ν,Ν(Ci -С₅) алкилкарбамоил, (Ci -С_в)алкоксикарбонил, хидрокси^ С₅)алкил, aMHHo(Ci -С₄)алкил, моно-N- или fln-N,N-(Ci С₄)алкиламино(С1 -С₄)алкил, оксо, хидроксиимино или (Ci С₆)алкоксиимино, с уговорката, че само хетеропръстените R₁₂триазолидин-3-ил, пиролидин-1-ил, пиперидин-1-ил, пиперазин-1-ил, пиперазин -4-ил, азетидин-1-ил, 1,2-оксазинан-2-ил, изоксазолидин-2ил или оксазолидин-3-ил са по избор моно или ди-заместени с оксо, хидроксиимино, или (Ci -С₆)алкоксиимино; и в които споменатите R₁₂ пръстени са по избор допълнително моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг с (Ci С_е)алкил.

В горната група особено предпочитани съединения са съединенията

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ (18)-бензил-2-(3хидроксиимино-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид,

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(sic-3,4дихидрокси-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид,

5-хлоро-1 Н-2-карбоксилна киселина [2-((3S, 48)-дихидроксипиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил]-амид,

5-хлоро-1 Н-2-карбоксилна киселина [ (18)-бензил-2-(с13-3,4дихидрокси- пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид,

5-хлоро-1 Н-2-карбоксилна киселина [ 2-(1,1 -диоксо-тиазолидин-

3- ил)- 2-оксо-етил]-амид,

5-хлоро-1Н-2-карбоксилна киселина (2-оксо-2-тиазолидин-3-илетил)-амид,

5-хлоро-1 Н-2-карбоксилна киселина [ (13)-(4-флуоро-бензил)-2(4-хидрокси-пиперидин-1 -ил)- 2-оксо-етил]-амид,

5-хлоро-1 Н-индол2-карбоксилна киселина [ (1S)-6eH3HA-2-((3RS)хидрокси- пиперидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид,

5-хлоро-1 Н-2-карбоксилна киселина[2-оксо-2-((1 RS)-okco-1тиазолидин-3-ил)-етил]-амид,

5-хлоро-1 Н-2-карбоксилна киселина [ (1в)-(2-флуоро-бензил)-2(4-хидрокси-пиперидин-1 -ил)- 2-оксо-етил]-амид,

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ (13)-бензил-2((38,48)-хидрокси- пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил]-амид,

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ (13)-бензил-2-(3хидрокси-азетидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид,

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ (13)-бензил-2-(3хидроксиимино-азетидин-1 -ил)-2-оксо-етил]-амид или

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ (1в)-бензил-2-(3хидроксиимино-пиперидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид.

В горната група особено предпочитани съединения е първа група специално предпочитани съединения, в които

R₄ е Н; и

R₁₂ е тиазолидин-3-ил, 1-оксо-тиазолидин-З-ил, 1,1-диоксотиазолидин-3-ил или оксазолидин-3-ил или споменатите R₁₂заместители по избор моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг с карбокси, (Ci -С₅)алкоксикарбонил, хидрокси^ Сз)алкил, aMHHo(Ci -С₃)алкил, моно-N- или fln-N,N-(Ci С₃)алкиламино(С1 -С₃)алкил или

R12 е моно- или ди-заместен пиридин-1-ил, в който споменатите заместители са всеки независимо един от друг карбокси, (C_t С₅)алкоксикарбонил, (Ci -С₅)алкокси, хидрокси, хидрокси^ С₃)алкил, амино, амино(С1 -С₃)алкил, моно-N-или fln-N,N-(Ci С₃)алкиламино(С1 -С₃)алкил или моно-N- или fln-N,N-(Ci С₄)алкиламино; и пръстените R₁₂ са по избор допълнително всеки независимо един от друг заместени с (Ci -С₅)алкил.

Предпочитани съединения от непосредствено предходната група особено предпочитани съединения са съединенията в които

a. Ri е 5-хлоро;

R_w и Rii са Н; и

Ri₂ е С1з-3,4-дихидоркси-пиролидин -1-ил;

b. Ri е 5-хлоро;

Rio и Rii са Н; и

R₁₂e (Зв,43)-хидрокси-пиролидин-1-ил;

c. Ri е 5-хлоро;

R₁₀ и R_n са Н; и

R₁₂ е 1,1-диоксо-тиазолидин-З-ил;

d. Ri е 5-хлоро;

Rio и Rn са Н; и

R₁₂ е тиазолидин-3-ил; и

e. Ri е 5-хлоро;

Ri_OnRii саН; и

Ri₂ е 1-оксо-тиазолидин-З-ил.

В горната група особено предпочитани съединения е втора група специално предпочитани съединения, в които

R₄ е фенилметил, тиен-2- или -З-илметил, в който споменатите пръстени R₄ са по избор моно- или ди-заместени с флуоро; и

R₁₂ е тиазолидин-3-ил, 1-оксо-тиазолидин-З-ил, 1,1-диоксотиазолидин-З-ил или оксазолидин-3-ил или споменати Ri₂заместители по избор моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг с карбокси или (Ci -С₅)алкоксикарбонил, хидрокси(С1 С₃)алкил, амино(С1 -С₃)алкил или моно-N- или fln-N,N-(Ci -С₃) алкиламино(С1 -С₃)алкил или R₁₂ е моно- или ди-заместен азетидин-1-ил, или моно или дизаместен пиролидин-1-ил или моно- или ди-заместен пиперидин-1-ил, в които споменати заместители са всеки независимо един от друг карбокси, (Ci -С₅)алкоксикарбонил, хидрокси(С! -С₃)алкил, амино(С1 -С₃)алкил, моно-N- или fln-N,N-(Ci -С₃)алкиламино(С1-С₃) алкил, хидрокси, (С, С₅)алкокси, амино група, моно-N- или fln-N,N-(Ci -С₅)аЛКИЛаМИНО, ОКСО, ХИДрОКСИИМИНО ИЛИ (СрС^аЛКОКСИИМИНО; и пръстените R₁₂ са по избор допълнително моно- или дизаместени всеки независимо един от друг с (Ci -С₅)алкил.

Предпочитани съедиинения от непосредствено предходната група на особено предпочитани съединения са съединенията, в които

a. Riе5-хлоро;

R_w и Rii са Н;

R₄ е 4-флуоробензил

R₁₂ е 4-хидроксипиперидин-1-ил; и стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

b. Ri е 5-хлоро; R_w и Ri, са Н; R₄ е бензил;

R₁₂e З-хидроксипиперидин-1-ил; и стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

c. Ri е 5-хлоро;

ф Rio и Rii са Н;

R₄ е бензил;

R₁₂ е с(в-3,4-дихидрокси-пиролидин-1-ил; и стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

d. Ri е 5-хлоро;

Rio и Rii са Н;

R₄ е бензил;

Р₁₂еЗ-хидроксиимино-пиролидин-1-ил; и стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

e. Ri е 5-хлоро;

Ri_OnRiiCaH;

R₄ е 2-флуоробензил;

f. Ri е 5-хлоро; R₁₀MR_n саН; R₄ е бензил; и

R₁₂e (Зв,48)-дихидрокси-пиролидин-1-ил; и стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

g. R! е 5-хлоро; RmmRh саН;

О R₄ е бензил;

R₁₂ е З-хидрокси-азетидин-1-ил; и стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

h. Rj е 5-хлоро;

R₁₀ и RncaH;

R₄ е бензил;

R₁₂ е З-хидроксиимино-азетидин-1-ил; и стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

i. R₁ е 5-хлоро;

R₁₀ и R_n са Н;

R₄ е бензил;

R₁₂e 4-хидроксиимино-пиперидин-1-ил; и стереохимизмът на въглерод (а) е (S).

Втора група специално предпочитани съединения в първата група предпочитани съединения са съединенията, в които

R, е водород, фенил^ - С^алкил, тиен-2- или -З-ил^ -С^алкил, фур-2- или -З-ил^ -С^алкил, в които споменатите пръстени R₄ са моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг с водород, или флуор;

Re е C(O)NR₈R₉; и

R₈ е водород, (С, -С₅)алкил, хидрокси или (С₄ -С₄)алкокси; и η

R₉, е водород, цикло(С₄ -С_в)алкил, цикло(С₃ -С₆)алкил (Ci - С₅) алкил метилен-перфлуориран(С₁ -С₃)алкил, пиридил, пиролидинил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиперидинил, бензотиазолил или тиохроманил; или

R₉ е (Ci -С₅)алкил, в който споменатият (Ci -С₅)алкил е по избор заместен с цикло(С₄ -С_в)алкенил, фенил, тиенил, пиридил, пиролидинил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, пиперидинил, морфолинил, тиоморфолинил, 1-оксотиоморфолинил, или 1,1-диоксотиоморфолинил и в който споменатият (Ci -С₅)алкил или (Ci -С₄)алкокси е по избор допълнително всеки независимо един от друг моно- или ди-заместен с халоген, хидрокси, (Ci-C₅)aAKOKcn, амино, моно-N- или fln-N,N-(Ci -С₅)алкиламино, циано, карбокси, или (Ci -С₄)алкоксикарбонил; и в които пръстените Rg са по избор моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг на въглерод с халоген, (Ci - С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, хидрокси, амино, моно-N- или fln-N,N-(Ci -С₄) алкиламино, карбамоил, (Ci -С₅)алкоксикарбонил или карбамоил.

В непосредствено предходната втора група специално предпочитани съединения са съединенията, в които

a. Ri е 5- хлоро;

R₁₀ и Rn са Н;

R₄ е бензил;

Rs е метил; и

Rg е 3(диметиламино)пропил;

b. стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

Ri е 5-хлоро;

R_w и Rn са Н;

R₄ е бензил;

Rg е метил; и

Rg е 3-пиридил;

c. стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

Ri θδ-хлоро; R_w и Rii са Η; R₄ е бензил;

R₈ е метил; и

R₉ е 2-хидроксиетил; и

d. стереохимизмът на въглерод (а) е (8);

Ri е 5-флуоро;

Rio и R11 са Н;

R₄e 4-флуорофенилметил;

R_B е метил; и

R_g е 2-морфолиноетил.

Трета група специално предпочитани съединения в първа група предпочитани съединения са съединенията, в които

R₄ е водород, фенил(С1 -С^алкил, тиен-2- или -3-ηλ(Οι -С^алкил, фур-2- или -3-ил(С1 -С^алкил, в които споменати R₄ пръстени са моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг с водород или флуор.

R₈ е C(O)NR₈R₉; и

Rg е водород, (Ci -С₅)алкил, хидрокси или (Ci -С₄)алкокси; и R₉ е (Ci -С₄)алкокси в който споменатият (С_ч -С₄)алкокси е по избор заместен с цикло(С₄ -С_б)алкенил, фенил, тиенил, пиридил, пиролидинил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, пиперидинил, морфолинил, тиоморфолинил, 1-оксотиоморфолинил или 1,1-диоксотиоморфолинил и в които споменатият (Ci -С₅)алкил или (Ci -С₄)алкокси е по избор допълнително всеки независимо един от друг моно- или ди-заместен с халоген, хидрокси, (С₅ -С₅)алкокси, амино група, моно-N- или λη-Ν,Ν-(Οι -С₅)алкиламино, циано група, карбокси или (Ci -С₄)алкоксикарбонил; и в които пръстените R₈ са по избор моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг на въглерод с халоген, (Ci -С₄)алкил, (Ci -С₄)алкокси, хидрокси, амино, моно-N- или fln-N,N-(Ci С₄)алкиламино, карбамоил, (Ci -С₅)алкоксикарбонил или карбамоил.

В непосрествено предшестващата трета група специално предпочитани съединения са съединенията, в които

a. Ri е 5- хлоро;

Rio и Rii са Н;

R₄ е бензил;

R₈ е метил; и

R₉ е 2-хидроксиетокси;

b. стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

Ri е 5-хлоро;

R₁₀nRiiCaH;

R₄ е 4-флуорофенилметил;

R₈ е метил; и

R₉eMeTOKcn;

c. стереохимизмът на въглерод (а) е (S);

Ri е 5-хлоро;

R₁₀ и Rii са Н;

R₄ е бензил;

R_B е метил; и

R₉ е метокси;

Втора група предпочитани съединения с формула IA са тези съединения, в които

Ri е 5-халоген, 5-метил, 5-циано или трифлуорометил;

R₁₀ и Rii са всеки независимо един от друг водород или халоген; Ае-С(Н)=;

R₂ и R₃ са водород;

R₄ е водород, фенил(С₁ -С^алкил, тиен-2- или -3-w\(Ci -С^алкил, фур-2- или -3-HA(Ci -С₂)алкил, в които споменатите пръстени са моноили ди-заместени всеки независимо един от друг с водород или флуор;

R₅ е водород; и

R_e е (Ci -С₅)алкоксикарбонил.

Трета група предпочитани съединения с формула IA са тези съединения, в които

Ri е 5-халоген, 5-метил, 5-циано група или трифлуорометил;

R₁₀ и R_t1 са всеки независимо един от друг водород или

халоген;

Ае-С(Н)=;

R₂ и R₃ са водород;

R₄ е водород, метил или фенил(С₁ -С^алкил, в които споменатите фенилни групи са моно- или ди-заместени всяка независимо една от друга с водород, халоген, (Ci -С₄)алкил, (Ci С₄)алкокси, трифлуорометил, хидрокси, амино или циано група и в които фенилни групи са допълнително моно- или ди-заместени всяка независимо една от друга с водород или халоген; или

R₄ е тиен-2- или -З-ил^-С^алкил, пирид -2-,-3- или -4-ил(С1 -С₂) алкил, тиазол-2-,-4- или -5-ил(С1 -С^алкил, имидазол-2-, -4- или -5ha(Ci -Сг)алкил, фур-2- или -3-ил(С1 -С^алкил, пирол-2- или -3-ил(Сг Сг)алкил, оксазол-2-, -4- или -б-ил^-С^алкил, пиразол-3-, -4- или-5kw(Ci -С^алкил, изоксазол-3-, -4- или -5-uv\(Ci -С^алкил, иЗотиазол-3-,-

4- или -5-ил(С₁-С₂)алкил, пиридазин-3-или -Д-илСС, -С^алкил, пиримидин -2-,-4-, -5- или -6-ил(С₅ -С^алкил, пиразин -2- или -3-ha(Ci С^алкил, или 1,3,5-триазин-2-ил(С1 -С^алкил, в които споменатите преди хетеропръстени R₄ са по избор моно- или ди-заместени всеки независимо един от друг с халоген, трифлуорометил, (Ci -С₄)алкил, (С i -С₄)алкокси, амино или хидрокси и споменатите моно- и дизаместители са свързани с въглерод;

Rs е водород; и

R_e е карбокси.

В третата група предпочитани съединения е първата група специално предпочитани съединения, в които

R₁₀ и R_n са водород; и

R₄ е водород.

Особено предпочитано в непосредствено предшестващата специална група е съединение, в което

R₅ е хлор.

Друг аспект на настоящото изобретение е метод за лекуване на млекопитаещи, които са в състояние на резистентност към инсулин, състоящ се в това, че на млекопитаещото в състояние на резиистентност към инсулин се дават терапевтично ефективни количества от:

a) първо съединение, като споменатото първо съединение е инхибитор на алдозо редуктаза; и

b) второ съединение, като споменатото второ съединение е инхибитор на гликоген фосфорилаза.

Предпочитани резистентни към инсулин състояния, взети по отделно или като група, включват диабети, хиперинсулинемия, намалена поносимост на глюкоза, хипергликемия и/или хиперлипидемия последваща хранене, диабети Птип, състав променящ тялото, намаляване масата на слабеещо тяло, затлъстяване (по-специално затлъстяване на коремните вътрешности), хипертензия, дислипидемия (напр. нарастване на свободна мастна киселина, триглицерид, VLDL холестерол, и LDL холестерол нива и намаляване нивото на LDL холестерол), атеросклероза, исхемия на тъкънта и кардиоваскуларни заболявалия, затлъстяване, синдром X (също означаван като „Метаболен синдром“), бременност, състояниия на инфекция, уремия, хиперадрогенизъм, хиперкортизолемия или други състояния на излишък на адренокортикален хормон, акромегали, излишък на хормон на растежа, или полициститно заболяване на яйчниците.

Особено предпочитани устойчиви (резистентни) на инсулин състояния, взети по отделно или като група, включват дислипидемия, исхемия на тъканта, затлъстяване, полициститно заболяване на яйчниците, синдром X и хипертензия.

Особено диабетите са по-специално предпочитани.

Предпочитан инхибитор на алдозо редуктаза е 1фталазиноцетна киселина, 3,4-дихидро-4-оксо-3- [[5трифлуорометил)-2-бензотиазолил] метил]- или фармацевтично приемлива негова сол.

Предпочитан инхибитор на гликоген фосфорилаза е

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3m-(2R)хидрокси-3-((33)-хидроксипиролидин-1-ил)-3-оксопропил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бензил-3((33,43)-дихидроксипиролидин-1-ил)-(2П)-хидрокси-3-оксопропил]амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnдиметилкарбамоил-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnметокси -метил-карбамоил)-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1 S)-((R)-xnflpoKcn[ (2-хидрокси-етил) -метил-карбамоил]-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бензил-2-(3хидроксиимино-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(cis-3,4дихидрокси-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-3-((cis)дихидрокси-пиролидин-1-ил)-(2Р)-хидрокси-3-оксопропил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-((33,43)дихидрокси-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-2-(cis-

3,4- дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(1,1-диоксотиазолидин-3-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-(4-флуоробензил)-2-(4-хидрокси-пиридин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина( (1S)-6eH3m-2-((3RS)хидрокси-пиперидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-оксо-2-((1 RS)оксо-тиазолидин-3-ил)-етил]-амид; или

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (18)-бензил-2-(3хидрокси-азетидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид.

Особено предпочитани млекопитаещи са хора-мъж или жена. Друг предпочитан аспект на този метод е в който първото съединение и второто съединение се прилагат по същество едновременно.

Друг аспект на настоящото изобретение е синергитичен фармацевтичен състав за постигане на чувствителност към инсулин при млекопитаещо, който включва

a. известно количество от първото съединение, като това първо съединение е инхибитор на алдозо редуктаза; и

b. известно количество от второто съединение като второто съединение е инхибитор на гликоген фосфорилаза, при който количеството на първото съединение поотделно и количеството на второто съединение поотделно са недостатъчни, за да се постигне ефекта на чуствителност към инсулин ако се прилагат самостоятелно и при което комбинираният ефект от количествата на първото и второто съединение е по-голям, от сумата на ефектите на чуствителност към инсулин, постигнати с индивидуалните количества от първото и второто съединение и фармацевтично приемлив разредител или носител.

Друг аспект на настоящото изобретение е комплект включващ:

а. терапевтично ефективно количество от инхибитор на алдозо редуктаза и фармацевтично приемлив носител в първата единична доза;

b. терапевтично ефективно количество от инхибитор на гликоген фосфорилаза и фармацевтично приемлив носител във втората единична доза; и

c. опаковка съдържаща заедно споменатите първа и втора единична доза.

Още един друг аспект на настоящото изобретение е синергитичен метод за постигане ефект на чуствителност към инсулин при млекопитаещи, които са в инсулин резистентно състояние, като включва прилагане върху такива млекопитаещи

a. известно количество от първото съединение, като първото ф съединение е инхибитор на алдозо редуктаза; и

b. известно количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е инхибитор на гликоген фосфорилаза в който количеството само на първото съединение и количеството само на второто съединение е недостатъчно, за да се постигне ефекта на чуствителност към инсулина и в който кобинираният ефект от количествата на първото и второто съединения е по-голям от сумата на ефектите на чуствителност към, инсулина, постижима с индивидуалните количества от първото и второто съединение.

ф Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до метод за намаляване на увреждането на тъканта в резултат от исхемия или то би могло да бъде причинено от исхемия, включващ прилагането към нуждаещото се млекопитаещо такова лечение с терапевтично ефективно количество от

а. инхибитор на алдозо редуктаза; и i b. инхибитор на гликоген фосфорилаза.

Предпочитани исхемични тъкани, взети индивидуално или като група, в които исхемичната тъкан е кардиална, от мозък, черен дроб, бъбрек, бял дроб, стомах, скелетен мускул, далак, панкреас,

I нерв, гръбначен мозък, тъкан от ретина, васкулатурата, или тъкан от тъннките черва.

Особено предпочитана исхемична тъкан е кардиалната тъкан. За предпочитане комбинацията съгласно настоящото изобретение се прилага профилактично.

Исхемичните увреждания лекувани съгласно настоящото изобретение могат да се прояват при трансплантация на органи.

За предпочитане комбинацията съгласно настоящото изобретение се дава преди сърдечна операция.

Понятието състояние на резистентност към инсулин се отнася до състоянията (инсулин резистентен синдром или състояние) при които чуствителността и/или отзивчивостта към инсулин в органи, тъкани или клетки в тялото на млекопитаещо се намалява в сравнение с нормалното (или чуствително на инсулин) състояние. Резистентността води до множество аномалии в глюкоза, протеин, и липиден метаболизъм, електролитен и йонен дисбаланс, растеж например на органи, тъкани и клетки, което може да се прояви в една или в повече от следващите (но не ограничена до) : хиперинсулинемия, понижена глюкозна толерантност (IGT), хипергликемия и/или хиперлипидема последваща хранене, диабети II тип, изменение състава на тялото, намаляване на масата на тялото от слабеене, затлъстяване (по-специално абдоминално висерално затлъстяване), хипертензия, дислипидемия, (напр. увеличаване на свободна мастна киселина, триглицерид, и нивата на VLDL холестерол и LDL холестерол, намалено ниво на HDL холестерол), атеросклероза, исхемия на тъканта, и кардиоваскуларни заболявалия (Kopelman и Albon, 1997; DeFronzo и Ferrannini, 1991; Reaven, 1991; Malstrom и др. 1997). В резултат на инсулин резистентното състояние е необходимо по-голямо количество инсулин, за да се доближи или достигне същото биологично действие на инсулина в органи, тъкани и клетки в

сравнение с нормалното (или чувствително на инсулин) състояние, което води до увеличена потребност от панкреаса да отделя повече инсулин (влошена хиперинсулинемия) и при най-екстремни обстоятелства панкреасна недостатъчност и недостиг на инсулин, което води до диабетно състояние тип II. Състоянията на резистентност към инсулина могат например да включват затлъстяване, синдром X (също означаван като „Метаболитен синдром“), бременост или състояния на инфекция, уремия, хиперадрогинизъм, хиперкортизолемия или други състояния на излишък на адренокортикален хормон, акромегали или излишък на хормона на ръстеж, полициститни яйчници, могат да бъдат свързани със старческа възраст или специфични етнически групи (Kopelman и Albon, 1997).

Понятието ефект на чувствителност към инсулин се отнася до състояние в които тъканите на пациента са пригодени да имат нормална или повече от нормална биологична чувствителност на определено количество инсулин.

Понятието „редуциране“ (намаляване) има тенденция да включва частична превенция или превенция, която макар и по-голяма отколкото тази, която ще се получи при невземане на лекарство или при вземане на пласебо (привидно вземане), е по-малка от 100% в допълнение на фактическата пълна превенция.

Понятието „увреждане в резултат на[..] исхемия“ както се използва тук се отнася до състояния пряко свързани с намален приток на кръв към тъканта, например дължащо се на съсирек или Запушване на кръвоносните съдове, които подават кръв на съответната тъкан и което води (в скоби) до намаляване на подаването на кислород в та какава тъкан, понижена сила на тъканите, нефункционалност на тъканта и умъртвяване. Алтернативно, когато кръвта протича или пефузията на органа е количествено адекватна, то капацитетът на пренасяне на кислород

от кръвта или перфузията на органа може да бъде понижена напр. в среда с недостиг на кислород, така че подаването на кислород към тъканта е намалено, понижена е силата на тъканта, дисфункция на тъканта, и накрая умиране на тъканта.

Понятието инхибитор на алдозо редуктаза се отнася до съединения, които инхибират биопревръщането на глюкозата до сорбит, катализирано от ензим алдозо редуктаза.

Понятието инхибитор на гликоген фосфорилаза се отнася до всяка субстанция или средства или всяка комбинация от субстанции и/или средства, която намалява, забавя или елиминира ензимното действие на гликоген фосфорилаза. Обичайно известно ензимно действие на гликоген фосфорилаза е разлагането на гликоген чрез катализиране на обратимата реакция на макромолекула гликоген и неорганичен фосфат до глюкоза-1-фосфат и гликогенова макромолекула, коята е един глюкозен остатък помалък от първоначалната макромолекула гликоген (в направление на гликогенолиза).

Понятието „лекуване“, „лекувам“, „лечение“ според употребата му тук включва превантивно (напр. профилактично) и палиативно (успокоително) лечение.

„Фармацевтично приемлив“ означава, че носител, разредител, лекарствена среда и/или солта трябва да бъде съвместима с другите ингредиенти на формата за приложение и да не бъдат вредни за тези, които поемат лекарството.

Изразът „ изходни съединения“ се отнася до съединения, които се предшественици на лекарството, които като се следва предписанието за лечение отделят лекарство in vivo посредством някои химичен или физиологичен процес (напр. изходните съединения, когато са взети къмфизиологично pH или чрез действието на ензим се превръщат в желаната форма на лекарство).

Примерни изходни съединения чрез разцепване отделят съответна свободна киселина.

Алкилен означава наситен въглеводород (с права или разклонена верига) в който водородният атом е отстраанен от всеки краен въглерод. Примери за такива групи (като се разбира че посочената поредица обхваща характерен пример) са метилен, етилен, пропилен, бутилен, пентилен, хексилен, хептилен).

Халоген означава, хлор, бром, йод или флуор.

Алкил означава права верига наситен въглеводород или разклонена верига наситен въглеводород. Примери на такива алкидни групи (като се разбира, че посочената поредица обхваща характерен пример) са метил, етил, пропил, изопропил, бутил, секбутил, третичен бутил, пентил, изопентил, неопентил, третичен пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, З-метилбутил, хексил, изохексил, хептил и октил.

С алкокси е означена права верига наситен въглеводород или разклонен наситен алкил, свързан посредством окси остатък. Примери за такива алкокси групи (като се разбира, че посочената поредица обхваща характерен пример) са метокси, етокси, пропокси, изопропокси, бутокси, изобутокси, третичен бутокси, пентокси, изопентокси, неопетокси, третичен петокси, хексокси, изохексокси, хептокси и октокси.

Съгласно използването тук понятието моно-N- или fln-N,N-(CiС_х)алкил... се отнася за (Ci -CJ остатък взети всеки независимо един от друг, когато е fln-N,N-(Ci -Сх)алкил..(х означава цяло).

Трябва да се разбира, че ако карбоксилен или хетероциклен радикал( остатък) могат да бъдат свързани или по друг начин прикрепени към означения субстрат, чрез различни атоми на пръстена без да се отбелязва специфичната точка на прикрепване, тогава всички възможни точки се имат предвид, било то посредством въглероден атом или например тривалентен азотен атом. Например понятието „пиридил“ означава например 2-,3-, или4-пиридил, понятието „тиенил“ означава например 2-, или 3-тиенил и т.н.

Изразът „фармацевтично-приемлива сол“ означава нетоксични анионни соли, съдържащи аниони такива като, (но не ограничени до) хлорид, бромид, йодид, сулфат, бисулфат, фосфат, ацетат, малеат, фумарат, оксалат, лактат, тартарат, цитрат, гл юконат, метанлсулфонат и 4-тулуол-сулфонат. Изразът също се отнася за нетоксични катионни соли такива като (но не ограничено до) натрий, калий, калций, магнезий, амоняк или протониран бензатин (Ν,Νдибензилетилендиамин), холин, етаноламин, диетаноламин, етилендиамин, мегламин (N-метил-глюкамин), бенетамин (Νбензилфениламин), пиперазин или трометамин (2-амино-2хид роксиметил-1,3-пропанд иол).

Така както се използват тук изразите „реакционно-инертен разтворител“ и „инертен разтворител“ се отнасят до разтворител или смес от разтворители, които не взаимодействат с изходните материали, реагенти, междинните продукти или крайните продукти по начин, който влияе неблагоприятно на добива на желания продукт.

Вмъкнатият негативен или позитивен знак използван тук в терминологията означава, че насочената поляризирана светлина се върти чрез специфичен стереоизомер.

Всеки химик ще оцени, че някои съединения на настоящото изобретение ще съдържат един или повече атоми, които могат да бъдат в особена стереохимична или геометрична конфигурация, което води до образуване на стереоизомери или изомери на конфигурацията. Всички тези изомери и техни смеси се включват в настоящото изобретение. Хидрати и разтворители на съединенията от настоящото изобретение са включени също.

DTT означава дитиотреитол. DMSO означава диметил сулфоксид. EDTA означава етилендиамино тетраоцетна киселина.

Други признаци и предимства ще бъдат видни от описанието и претенциите, които описват настоящото изобретение.

По-долу ще бъде направено детайлно описание на изобретението.

Изобщо съединенията съгласно настоящото изобретение могат да бъдат получени по методи, които включват методите известни в областта на химията, по-специално в светлината на съдържащото се тук описание. Някои методи за получаване на съединенията съгласно настоящото изобретение са предложени като допълнителни признаци на изобретението и са илюстрирани чрез следните схеми на взаимодействие. Други методи могат да бъдат описани в експерименталния раздел.

Всеки инхибитор на алдозо редуктоза може да се използва като съединение (активно средство) на настоящото изобретение. Понятието инхибитор на алдозо редуктаза се отнася до съединения, които инхибират биопревръщането на глюкоза в сорбит, катализирано от ензима алдозо редуктаза. Такова инхибиране се определя лесно от опитен специалист в тази област по стандартни методи (J.Malone, Diabeies, 29:861-864. 1980. „Red Cell Sorbitol ,an Indicator of Diabetic Control“). Различни инхибитори на алдозо редуктаза са описани и посочени по-долу, обаче други инхибитори на алдозо редуктаза са известни на един опитен специалист в тази област. Описанията на патенти на САЩ, изброени по-долу, са включени тук за справка. Така общите химически наименования USAN или друго означение са поставени с скоби, когато се използват, заедно със справка за съответната патентна литература, която описва съединението.

Действието на инхибитора на алдозо редуктаза върху такан може да се определи като се нааправи изпитание на известно количество инхибитор на алдозо редуктаза, което е необходимо за намаляване на тъкан сорбит (т.е. като се инхибира допълнително получаване на сорбит в следствие блокирането на алдозо редуктаза) или понижаване на тъканна фруктоза (чрез инхибиране получаването на сорбит вследствие блокирането на алдозо редуктаза и вследовие на това получаването на фруктоза). Като няма желание да се обвързва с каквато и да е теория или механизъм, счита се че инхибитора на алдозо редуктаза, чрез инхибиране на алдозо редуктаза, намалява или предотвратява исхемичното увреждане, както е описано по-долу.

Следователно, примерите за инхибитори на алдозо редуктаза полезни в съединенията и методите съгласно настоящото изобретение включват:

1.3- (4-бромо-2-флуоробензил)-3,4-дихидро-4-оксо-1фталазиноцетна киселина (ponalrestat, US 4,251,528);

2. N[[ (5-трифлуорометил)-6-метокси-1нафталенил]тиоксометил]-М-метилглицин (tolresrat, US 4,600,724).

3.5-[ (2,Е)-р-метилцинамилиден]-4-оксо-2-тиоксо-3тиазолиденоцетна киселина (epalsresat. US 4.464,382, US 4,791,126, US 4,831,045);

4.3- (4-бромо-2-флуоробензил)-7-хлоро-3,4-дихидро-2,4-диоксо- (2Н)-куинаЗолиноцетна киселина (zenarestat, US 4,734,419 и 4,883,800);

5.2В,4Р-6,7-дихлоро-4-хидрокси-2-метилхроман-4-оцетна киселина (US 4,883,410);

6.2R.4R-6,7-дихлоро-6-флуоро-4-хидрокси-2-метилхроман-4оцетна киселина (US 4,883,410);

7. 3,4-дихидро-2,8-диизопропил-3-оксо-2Н-1,4-бензоксазин-4оцетна киселина (US 4,771,050);

8.3,4-дихидро-3-оксо-4-[ (4,5,7-трифлуоро-2бензотиазолил)метил]-2Н-1,4-бензотиазин-2-оцетна кииселина (SPR210, US 5.252,572);

9.1Ч-[3,5-диметил-4-[ (нитрометил)сулфонил}фенил]-2-метилбензенацетамид (ZD5522, US 5,270,342 и US 5,430,060);

10. (3)-6-флуороспиро[хроман-4-4’имидазолидин]-2,5’-дион (sorbinil, US 4,130,714);

11. с!-2-метил-6-флуоро-спиро(хроман-4’,4’-имидазолидин)-2’,5’дион (US 4,540,704);

12.2-флуоро-спиро(9Н-флуорен-9,4’имидазолидин)2’,5’-дион (US 4,438,272);

13.2.7- ди-флуоро-спиро(9Н-флуорен-9,4’имидазолидин)2’,5’дион (US 4,436,745, US 4,438,272);

14.2.7- ди-флуоро-5-метокси-спиро(9Н-флуорен-9,4’ имидазолидин)2’,5’-дион (US 4,436,745 и US 4,438,272);

15.7- флуоро-спиро(5Н-инденол[ 1,2-b] пиридин-5,3’пиролидин)2,5’-дион (US 4,436,745, US 4,438,272);

16. с!-с13-6’-хлоро-2’,3’-дихидро-2’-метил-спиро-(имидазолидин4,4’-4’-Н-пирано(2,3-Ь)пиридин)-2,5-дион (US 4,980,357);

17. спиро[ имидазолидин-4,5’ (бН)-куиноли^ 2,5-дион-3’-хлоро7,8’-дихидро-7’-метил-(5’-С1з) (US 5,066,659);

18. (23,43)-6-флуоро-2’,5’-диоксоспиро(хроман-4,4’имидазолидин)-2-карбоксиамид (US 5,447,946) и

19.2[(4-бромо-2-флуорофенил)метил]-6флуороспиро[изокуинолин-4(1 Н), 3’-пиролидин]-1,2’,3,5’(2Н)-тетрон

(ARI-509, US 5,037,831).

Други дозо редуктаза включват съединения, които имат формула I

CHaCOR¹ или фармацевтично приемлива нейна сол, в която Z е О или S (1)

Ri е хидрокси или група, която е в състояние да бъде отстранена in vivo, за да се получи съединение с формула I, в която Ri е ОН; и

X и Y са едни и същи или различни и са избрани от водород, трифлуорометил, флуор и хлор.

Предпочитана подгрупа от горната група инхибитори на алдозо редуктаза включва съединенията с номер 1,2,3,4,5,6,9,10 и 17 и следните съединения с формула I:

20.3.4- дихидро-3-(5-флуоробензотиазол-2-илметил)-4оксофталазин-1-ил-оцетна киселина [ R¹=хидрокси;Х=F; Y=Н;

21.3- (5,7-дифлуоробензотиазол-2-илметил)-3,4-дихидро-4оксофталазин-1-ил-оцетна киселина [R¹=xnflpoKcn;X=F; Y=H;

22.3- (5-хлоробензотиазол-2-илметил)-3,4-дихидро-4оксофналазин-1-илоцетна киселина [R¹=хидрокси; X=Y=H];

23.3- (5,7-дихлоробензотиазол-2-илметил)-3,4-дихидро-4оксофталазин-1-илоцетна киселина [R¹=хидрокси; X=Y=CI];

24.3.4- дихидро-4-оксо-3-(5-трифлуорометилбензоксазол-2илметил)фталазин-1 -илоцетна киселина [R¹=xnflpoKcn;X=CF₃; Y=H);

25. 3,4-дихидро-3-(5-флуоробензоксазол-2-илметил)-4оксофталазин-1-ил-оцетна киселина [ R¹=хидрокси;Х= F; Y=Н];

26.3- (5,7-дифлуоробензоксазол-2-илметил)-3,4-дихидро-4оксофталазин-1-илоцетна киселина [ R¹=хидрокси; Х=Y=F];

27. 3-(5-хлоробензоксазол-2-илметил)-3,4-дихидро-4оксофталазин-1-илоцетна киселина [ R¹=хидрокси; Х=CI;Y=Н];

28. 3-(5,7-дихлоробензоксазол-2-илметил)-3,4-дихидро-4оксофталазин-1-илоцетна киселина[R¹=хидрокси; X=Y=CI]; и

29. зополрестат, 1-фталазиноцетна киселина, 3,4-дихидро-4оксо-3-{[ (5-(трифлуорометил)-2-бензотиазолил]метил]-[ R¹=хидрокси; Х=трифлуорметил; Y=H],

В съединения 20-23 и 29 Ze S. В съединения 24-28 Z е О.

йММиММ·····

От горната подгрупа съединенията 20-29 са повече предпочитани, а 29 е специално предпочитано.

Съединенията инхибитори на алдозо редуктаза съгласно настоящото изобретение са лесно достъпни или могат лесно да бъдат синтезирани от опитен специалист в тази област на техниката, като използва конвенционални методи за органичен синтез, особено от гледна точка на изложеното в подходящи патентни описания.

Всеки инхибитор на гликоген фосфорилаза може да се използва като второ съединение в настоящото изобретение. Понятието инхибитор на гликоген фосфорилаза се отнася до всяка субстанция или агент или всяка комбинация от субстанции и/или агенти, който намаляват, забавят или отстраняват ензимното действие на гликоген фосфорилаза. Известното ензимно действие на гликоген фосфорилаза е разграждане на гликоген чрез катализа на обратима реакция на гликогенова макромолекула и неорганичен фосфат до глюкоза-1-фосфат и гликогенова макромолекула, която е с 1 глюкозил-остатък по-къса от оригиналната гликогенова макромолекула (в посока на гликогенолис). Такива действия се определят лесно от опитен специалист в тази област съобразно стандартни опити (напр. като описаните по-нататък). Множество от тези съединения са включени в следващите публикувани РСТ заявки за патент: РСТ публикувана заявка WO 96/39384 и WO 96/39385. Обаче други инхибитори на гликоген фосфорилаза са известни на опитните специалисти в тази област на техниката.

Изобщо съединенията с формула I и формула II могат да бъдат получени по методи, които включват известните в тази област на техниката методи, по-специално в светлината на съдържащото се тук описание. Някои методи за получаване на съединения от формула I и формула IA са предложени като допълнителни признаци на настоящото изобретение и са илюстрирани със следните реакционни схеми.

СХЕМА I

водна он*

Rio R11

WO 99/26659

PCT/IB98/0I752

СХЕМА II

COOEt

1. (ROCOfe, основа

2.Условия на редукция

R-ю R-и

WO 99/26659

PCT/IB98/01752

СХЕМА III

* ___________________________WQ99/26659

CXEMAIV

XXIII

XXIV

R12H RfiRgNH

^PT\ N I R₃ OH

XXV b^CONR₈R₉;C(O)R₁₂

OH XXVI b^CONR₈Rg;C(O)R₁₂

PCT/IB98/01752

WO 99/26659

СХЕМА V

*

WO 99/26659

PCT/IB98/01752

СХЕМЕ VI

Ртх NH

COOH

1. PhCHO, |Редуциране

2. NaCNBH3/R₃CHO **

З.Отходящи H₂. Pd/C

XLIV

Основа R₃-X

N

COOH

Re

XLV

Rs

Re

III

WO 99/26659

PCT/IB98/0I752

СХЕМА VII

PCT/IB98/01752

WO 99/26659

CXEMAVIII

LXIII

LXVI

PCT/IB98/01752

WO 99/26659

CX E MA IX

^R3

LXVIII

Et₂NSF₃

-------►

LXIX

CXEMAX

LXIV

LXX1II

Съгласно реакционната Схема I, съединенията с формула I, в които R,, R₂, R₃, R_4j R₅, R_e и R₇ съглсно дадените по-горе определения могат да бъдат получени по всеки от двата главни метода. При първия метод желаното съединение с формула I може да бъде получено като подходящия индол-2-карбоксилна киселина или индолин-2-карбоксилна киселина с формула I се купелува с подходящ амин (т.е. ацилиране на амин) с формула III. Според втория метод желаното съединение с формула I може да бъде получено като се купелува подходящо съединение от формула IV (т.е. съединение от формула I, в което R_e е карбокси) с подходящ алкохол с формула R₈R₉NH или амин или алкохол с формула R₁₂H, в който R₈R₉ и Rt₂ са съгласно дадените по-горе определения (т.е. ацилиране на амин или алкохол).

Обикновено съединение от формула II се купелува със съединение с формула III, (или съединение с формула IV се купелува с подходящ амин (напр. R₁₂ или R₈ R₉NH)) или алкохол в присъствието на подходящо купелуващо вещество. Подходящото купелуващо вещество е такова вещество, което превръща карбоксилната киселина в специфичен реактив, който образува съответно амидна или естерна връзка при взаимодействие с амин или алкохол .

Купелуващото вещество може да бъде реагент, който причинява кондензиране по метод пот, когато са смесени заедно с карбоксилна киселина и амин или алкохол. Ако трябва киселина да бъде кондензирана с алкохол, то е за предпочитане да се използва голям излишък алкохол като разтворител в реакцията, със или без 1.0 до 1.5 еквивалента добавен диметиламинопиридин. Примери на купелуващи реагенти са 1-(3-диметиламинопропил)-3етилкарбодиимид хидрохлорид-хидроксибензотриазол (DEC/HBT), карбонилдиимидазол, дициклохексилкарбодиимид/ хидроксибензотриазол (НВТ), 2-етокси-1-етоксикарбонил-1,260 дихидрокуинолин (EEDQ), карбомилдиимидазол/НВТ, и диетилфосфорилцианид. Купелуването се извършва в инертен разтворител, за предпочитане апротонен разтворител при температура около-20°С до около 50°С в продължение на около 1 до около 48 часа. Примерните разтворители включват ацетонитрил, дихлорметан, диметилформамид и хлороформ.

Купелуващо вещество може да бъде също това вещество, което превръща карбоксилната киселина до активиран междинно, съединение, което е изолирано и/ или образувано в първия етап и дава възможност за реагиране с амин или алкохол във втория етап. Примери за такива купелуващи вещества и активирани междинни продукти са тионил хлорид или оксалил хлорид за получаване на солна киселина, флуорид на циануровата киселина за образуване на флуороводородна киселина или алкил хлороформат такъв като изобутил или изопропенил хлороформат (с третична азотна база) за образуване на смесен анхидрид на карбоксилната киселина. Ако купелуващото вещество е оксалил хлорид, то благоприятно е да се използва малко количество диметилформамид като съразтворител с друг разтворител (такъв като дихлорметан) да катализира получаването на солна киселина. Използването на тези купелуващи вещества и подходящо избиране на разтворители и температури е известно на опитни специалисти в тази област на техниката или може лесно да бъде определено от литературата. Тези и други примерни условия, подходящи за купелуване на карбоксилни киселини са описани в Houben-Weyl, Vol XV, част II, E.Wunsch, Ed., G. Theime Verlag, 1974, Stuttgart и M. Bodansky, Princples of Peptide Syntesis, Springer-Verlag Berlin 1984 и The Peptides. Analysis, Sinthesis and Biology (ed. E. Gross and J. Meienhofer), томове 1-5 (Academic Press NY 1979-1983).

Съединенията c формула IV, в които Ri R_w, Ru, A, R₂, R₃, R₄, R₅и R₇ са съгласно определенията дадени по-горе, могат да бъдат получени от съответния естер от формула V (напр. съединения с Формула I, в които Re е (С₁-С₅)алкоксикарбонил или бензилоксикарбонил) чрез хидролиза с алкалдействащи вещества във вид на воден разтвор при температура от около -20° С до около 100° С, обикновено при около 20° С в продължение на около 30 минути до около 24 часа.

По избор съединения с формула IV се получават чрез активиране на индол карбоксилна киселина с Формула II със средство за купелуване (както е описано по- горе), при което се получава активиран междинно съединение (като например солна киселина, флуороводородна киселина или смесени хидроксиди), което след това реагира със съединение с формула III, в която R₃, R₄, R₅ и R₇ са съгласно даденото по-горе определение и R_e е карбокси, в подходящ разтворител в присъствието на подходяща основа. Подходящите разтворители вклюючват вода или метанол или тяхна смес, заедно със съразтворител като например дихлорометан, тетрахидрофуран или диоксан. Подходящите основнодействащи съединения включват натриев, калиев или литиев хидроксиди, натриев или калиев бикарбонат, натриев или калиев карбонат, или калиев карбонат заедно с тетрабутил амониев бромид (1 еквивалент) в достатъчно количество, за да се консумира киселината освободена от реакцията (обикновено това количество е достатъчно за да поддържа pH на реакцията по-голямо от 8). Основ нодействащото може да бъде добавено нарастващо заедно с активирано междинно вещество, за да осъществява точен контрол на pH на реакцията. Реакцията обикновено се провежда при температура между -20°С и 50°С. Процедурите по изолиране се определят от специалистите в тази област на техниката, за да се отстранят онечистванията, но обикновено се състоят в отстраняване на водно-смесими съразтворители чрез изпаряване, екстракция на онечистванията при високо pH с органичен разтворител, подаване на киселинно средство за понижаване на pH (1-2) и филтриране или екстракция на желания продукт с подходящ разтворител като например етилацетат или дихлорметан.

Съединение с формула V може да бъде получено чрез купелуване на подходящо съединение с формула III, в която R_ee алкоксикарбонил и подходящо съединение с формула II при прилагане на операция аналогична на тази описана по-горе (например операция А).

По избор съединения с формула I, които съдържат серни атоми в сулфидно или в състояние на сулфонно окисляване, могат да бъдат получени от съответни съединения с формула I, които съдържат серен атом в неокислен вид като се подлагат на обработване с подходящо окисляващо вещество като например с тхлоропероксибензоена киселина в дихлорметан при температура около 0°С до около 25°С в продължение на около 1 до около 48 часа и като се използва от около 1 до около 1.3 еквивалента за превръщане чрез окисляване до сулфоокис и по-голям от 2 еквивалента за превръщане чрез окисляване до сулфон.

По избор съединенията с формула I, които са моно- или диалкилирани на R₅ аминоалкокси могат да бъдат получени от съответно съединение с формула I, където R₅ е аминоалкокси, чрез моноалкилиране или ди-алкилиране на R₅ амин, За да се получи желаното съединение с формула I. Такова моно- или диалкилиране може да се проведе чрез обработване на R₅ аминоалкокси съединение с 1 еквивалент от подходящо карбонилно съединение (За моноалкилиране) или по-голям от 2 еквивалента от подходящо карбонилно съединение (за диалкилиране) и подходящо редуциращо средство в подходящ разтворител. Подходящи условия на редуциране включват натриев цианоборо хидрид или натриев борохидрид в метанол или етанол, или водород/хидрогениращ катализитор (такъв като паладий върху въглерод) в полярен

разтворител като например вода, метанол или етанол при около 0°С до около 60°С в продължение на 1 до 48 часа.

По избор съединения с формула I, в които R₅ е алканоилокси (RCOO-), се получават чрез О-ацилиране на подходящо съединение с Формула I със солна киселина или производно на друга активирана киселина в присъствието, ако е необходимо, на подходяща основа (напр. основа на третичен амин като триалкиламин или пиридин), за предпочитане в апротонен разтворител като например тетрахидрофуран или дихлорометан при температура около 0°С до около 50°С в продължение на околоО.бдо около 48 часа.

По избор съединения с формула I, в която R₅ и R₇ и двата са приети като оксо, се получават чрез окисляване на съответно съединение с формула I, например в която R₅ е хидрокси и R₇ е водород, с подходящо окисляващо средство. Примерите на оксиляващи средства включват реагента Dess-Martin в дихлорометан, карбодиимид и диметилсулфоксид и катализатор киселина (Pfitzner-Moffatt режим или негови модификации, като например използване на водо-разтворим карбодиимид) или Swernтип реакции (напр. оксалилхлорид/ОМвО/триетиламин). Съединенията с формула I, с друга чуствителна на окисляване функционалност могат да ползват подходящо блокиране и деблокиране на такава функционалност.

Например в реакционна схема I някои съединения с формула I съдържат функционалност на първичен амин, вторичен амин или на карбоксилна киселина в частта на молекула, дефинирана с R₅ или R₆която може да пречи на очаквана реакция на купелуване на реакционна схема I ако междинното съединение с формула III или R₁₂H или R₈R₉NH амини са ляво незащитени. Следователно функционалността на първичен или вторичен амин може да бъде защитена, където тя е налице в R₅ или R₆ остатъци на междинното съединение с формула III или амин (R₈R₉NH или R₁₂H) чрез подходяща блокираща група по време на реакцията на купелуване по реакционна схема I. Продуктът от такава реакция на купелуване е съединението с формула I, съдържащо блокираща група. Тази блокираща група се отстранява в следващия етап, за да се получи съединението с формула I. Подходящи блокиращи групи за блокиране на амин и карбоксилна киселина включват тези блокиращи групи обичайно използвани при синтеза на пептид (такъв като N-t-бутоксикарбонил, N-карбобензилокси и 9флуоренилметиленоксикарбонил за амини и нисш алкил или бензилови естери за карбоксилни киселини), които не са химически активни при условията на купелуване описани по-горе (и непосредствено предшестващите тук примери като операция А) и могат да бъдат отстранени без химична промяна на друга функционалност в съединението с формула I.

Изходните индол-2-карбоксилни киселини и индолин-2карбоксилни киселини, използвани в реакционната схема I, когато не се намират на пазара или са неизвестни от предшестващото сътояние на науката (то е широко публикувано), се осигуряват посредством обичайните методи за синтезиране. Например съгласно реакционна схема II индоловият естер с формула VII може да бъде получен от съединение с формула VI (в която Q е избрано за да се постигне желанато А както е определено по-горе) чрез синтезата за индол Fischer (виж The Fischer Indol Sinthesis Robinson. B. (Wiley, New York,1982)), последвано от осапуниране на получения индолов естер с формула VII, за да се добие съответната киселина с формула VII. Изходният арил хидразон може да бъде получен чрез кондензирация на лесно достъпния хидразин с подходящо карбонилно производно или чрез реакцията Japp-Klingeman (виж Organic Reactions, Phillips. R. R. 1959,10,143).

По избор индол 2-карбоксилна киселина с формула VIIIА може да бъда получена чрез кондензиране на орто метил нитро съединение с формула IX с оксалатен естер, за да се добие индолов естер с формула X, последвано от редуциране на нитро -групата и последваща хидролиза.

Този три-етапен метод е известен като Reissert indol; syntehesis (Reissert, Chemische Berichte 1897,30,1030). Условията за постигане на тази последователност и референциите към тях са описани в литературата (Kermack, и др. J.Chem. Soc. 1921,1602; Cannon и др. J. Med. Chem 1981,24,238; Julian и др. в Heterocyclic Compounds, том 3 (Wiley, New York, 1962, R.C. Elderfield ed.) стр.18). Пример за специфично изпълнение в тази последователност е Пример 10А-10С - тук.

3-халоген-5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилни киселини могат да бъдат получени чрез халогениране на 5-хлоро-1 Н-индол 2карбоксилни киселини.

По избор (към реакционна схема II) заместени индолини с формула XIV мгат да бъдат получени чрез редуциране на съответните индоли от формула XV със редуциращо средство като например магнезий в метанол при температура от около 25°С до около 65°С в продължение на от около 1 час до около 48 часа (реакционна схема

III).

Индолин карбоксилните киселини с формула XVI се получават чрез осапунване на съответния естер с формула XVII (реакционна схема III). Съединението с формула XVII се получава чрез редуциране на съответния индол естер с формула VII с редуциращо средство като например магнезий в метанол, както е по-горе описано за превръщане на съединението с формула XV до съединение от формула XIV.

В следващите параграфи се описва как се получават различни амини, които се използват в горните реакционни схеми.

Съгласно реакционна схема IV съединенията с формула XXII (амини с формула III от реакционна схема I в които R₅ е OH, R₇ е водород и R_e е естер) или съединения с формула XXVI (R_e е C(O)NR₈R₉ или C(O)R_1Z) се получават като се излезе от N-защитен (означаван с Р_т)алдехид с формула XX. Алдехидът с формула XX или натриевия бисулфитен адукт на алдехид от формула XX се обработват с калиев или натриев цианид във воден разтвор със съразтворител като например диоксан или етилов ацетат при температура около 0°С до около 50°С, за да се получи цианохидрин с формула XXI. Цианохидрин по формула XXI се обработва с алкохол (например^ -С₆)алкохол като например метанол) и катализатор силна киселина като солна киселина при температура около 0°С до около 50°С, последвано ако е необходимо от добавяне на вода. Тогава се отстраняват блокиращите групи (Р_т) ако все още са налице, като се приложи подходящ метод за деблокиране и се получава съединение с формула XXII. Например ако N- блокиращата група Р_т с формула XX е третичен-бутоксикарбонил (t-Boc), съединението с формула XXII се получава направо от съединението с формула XXI и ако е необходимо се добавя вода. Съединението с формула XXII може да бъде блокирано на азот с подходяща блокираща група за да се получи съединение с формула XXIII, последвано от хидролиза на естера с водни разтвори на алкалнодействащи вещества при температура около 0°С до около 50° С в в инертен разтворител, което води до съответна хидрокси киселина с формула XXIV. Съединението с формула XXIV е купелувано ( аналогичено на метода на купелуване описан в реакционна схема I) с подходящ R₈R₉NH или HR₁₂ амин за образуването на съединение с формула XXV, на което след това е деблокирано и се получава съединение с формула XXV (например съединение с формула III, в която R₅ е OH, R₇ е водород и R_s е C(O)R₁₂или C(O)NR₈R₉. Пример на превръщане на цианохидрин с формула

XXI в съответния метилов естер с формула XXII с отстраняване t-блок блокираща група е предложено в РСТ публикувана WO/9325574, пример 1а. Други примери в които цианохидрин се превръща в нисши алкилови естери с формула XXIII могат да бъдат намерени в патент на САЩ N_o 4,814,342 и публикация ЕРО 0438233.

Някои съединения с формула I са стереоизомитрни благодарение на стереохимичната конфигурация на въглеродите означени а и Ь. Специалистът в тази област може да получи междинните съединения с формула XXII и XXVI с желан стереохимизъм по феакционна схема IV. Например алдехид с формула XX се среща или в енатиомерна форма (стереохимизъм на а) чрез операции съгласно литературни източници описани накратко по-долу (виж реакционна схема V). Цианохидринът с формула XXI може да бъде получен от съединенито с формула XX като се подложи на обработка с натриев или калиев цианид както е описано по-горе като се поддържа стереохимизъм на въглерод а, което води до смес на стереоизомери на въглерод Ь.

Опитен специалист в тази област може на този етап да използва кристализация за отделяне на изомери или пречистване на един изомер.

Например получаването на съединение с формула XXI, в която Р_т е Вос, R₃ е водород, R₄ е бензил и стереохимизма на въглероди е а иде съответно(З) и (R), като използва този начин заедно с пречистване и прекристализиране е описано в Biochemisry 1992,31, 8125-8141.

По избор отделянето на изомер може да се извърши чрез хроматография или чрез начини на прекристализиране след като съединение с формула XXI (смес от изомери) се превръща в съединение с формула XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI, V, IV или I по метод и/или последователност описани тук. Междинните съединения с формула XXI със специфичен стереохимизъм на въглероди а и Ьсе

i

превръщат в междинни съединения с формула XXII със задържане на този стереохимизъм чрез обработка с алкохол и катализатор силна киселина, последвано от добавяне на вода ако е необходимо, както е описано по-горе.

По избор желан изомер на съединението с формула XXI може също да бъде получен като се из лезе от междинното съединение с формула XXI и посредством хроматографско разделяне на диастереометричните производни (например с триметилсилил хлорид (TMS) или t-бутилдиметилсилил хлорид (TBDMS), за да се получат О-TMS или О-TBDMS производни). Силил производно на междинно съединение с формула XXI, което има еднаква стереоизомерна форма на въглероди аи be превърнато със запазване стереохимизма в междинно съединение с формула XXII (ако силил групата не е етстранена в този етап тя се отстранява след това по подходящ начин, като например обработване с тетрабутиламониев флуорид в тетрахидрофуран), по метода описан по-горе за превръщане на съединението с формула XXI в съедиинението с формула XXII.

Съгласно реакционна схема V алдехидите с формула XX (изходен материал за реакционна схема IV) се получават от съответните амино киселини с формула XXX. Амино киселината с формула XXX е блокирана на азот с блокираща група (Р_т) (такава като Вос). Блокираното съединение се естерифицира с алкохол и се превръща в естер, за предпочитане метилов или етилов естер на съединението с формула XXXI. Това може да се извърши чрез обработване на съединение с формула XXX с метлов или етилов йодид в присъствието на подходящо алкалнодействащо съединение (напр. К₂СО₃) в полярен разтворител като диметилформамид. Съединението с формула XXXI се редуцира например с диизобутилалуминиев хидрид в хексан или толуол, или тяхна смес, при температура около -78° С до около -50° С, последвано от охлаждане с метанол при -78°С, както е описано в J. Med. Chem. 1985, 28,1779-1790 до образуване на алдехид с формула XX. По избор (не е описано в Реакционна схема V) аналогично Nметоксиметиламиди отговарящи на съеднение с формула XXXI, в което алкохолният заместител в естера е заместен с N(OMe)Me се образуват от съединение с формула XXX, N,0диметилхидроксиламин и подходящ купелуващ агент (напр. 1-(3диметиламинопропил)3-етилкарбодиимид хидрохлорид (DEC). Полученото съединение се редуцира например с литиево-алуминиев хидрид в инертен разтворител като етер или тетрахидрофуран при температура около 0°С до около 25°С и се получава алдехид с формула XX. Този дву-етапен метод е главно за превръщане на Nблокирани а-аминокиселини до алдехд с формула XX (Fehrentz и Castro, Syntesis 1983, 676-678).

По избор алдехидите с формула XX могат да бъдат получени чрез окисляване на блокирани аминоалкохоли с формула XXXIII например с пиридин-ЗО₃ при температура около -10°С до около 40°С в нертен разтворител, за предпочитане дметлсулфоксид. Блокирани аминоалкохоли с формула XXXIII ако не се намират на пазара могат да бъдат получени чрез блокиране на аминоалкохоли с формула XXXII. Аминоалкохолите с формула XXXII се получават чрез редукция на аминокиселни с формула XXX. Тази редукция е придружена от третиране на съединенията с формула XXX с литиево алуминиев хидрид съгласно метода, опсан от Dickman и др. Organic Syntheses; Wiley: New York, 1990; Collect, том VII, стр. 530, или със сярна киселина-натриев борхидрид по метода на Abiko and Masamune, Tetrahedron Lett. 1992 333, 5517-5518 или c натриев борхидрид -йод съгласно метода на МсКеппоп и Meyers, J. Org. Chem. 1993,58,35683571, които също инфирмират за други подходящи методи за превръщане на аминокиселини с формула XXX до амно алкохоли с формула XXXII.

Съгласно реакцонна схема VI съединенията с формула XXX използвани в реакционна схема V могат да бъда получени по следния начин. Аминокиселините с формула XLI могат да бъдат получени чрез N-алкилиране на блокирани (Р_т) амино киселини с формула XL чрез обработване с подходяща основа и алкилиращо средство. Специфични методи за такова алкилиране са описани от Benoiton, CCan.J.Chem. 1977,55, 906-910, and Hansen, J. Org. Chem. 1985,50 945-950. Например когато R₃ е метил, натриев хидрид и метилйодид се използват. Деблокирането на съединение с формула XLI води до получаване на желаното съединение с формула XXX.

По избор амино киселина с формула XLII може да бъде Nалкилирана чрез три-степенно последователно провеждане на редуктивно бензилиране (например с бензалдехид, Pd/С-катализно хидрогениране, за да се получи моно-И-бензил производно и редукционно аминиране с подходящо ацилово съединение (например с формалдехид и натриев цианоборохидрид за вкарване на R₃ като метил), за да се получи N-бензил, N-R₃-3aMecTeHa амино киселина. N-бензил блокиращата група се отстранява по подходящ начин (например чрез хидрогениране с подходящ катализатор, за да се добие съединение с формула XXX. Специфичните условия за тази три-етапен метод за алкилиране са описани от Reinhold и др. J. Med. Chem. 1968,11, 258-260.

Непосредствено предшестващата оброботка може де се използва също за включвяне на остатък R₃ в междинното съединение с формула XLIV за получаване на междинно съединение с формула XLV (което е междинно съединение с формула III, в която R₇ е ОН). Непосредствено предшестващото обработване може да се използва също за вкючване на остотък R₃ в м еждинно съединение с формула Illa (което е междинното съединение с формула III, в която R₃ е водород).

⁷¹

Амино киселините използвани в схемите тук (например XL, XLII) ако не са налични на пазара или няма информация в литературата, могат да бъдат получени по различни методи известни на спецалистите от тази област на технката. Например може се се използва синтез Strecker или негови варианти. Съгласно това, алдехид (R₄CHO), натриев или калиев цианид и амониев хлорид взаимодействат и се получава съответен аминонитрил. Аминонитрилът се хидролизира с минерална киселина, за да се получи желаната амино киселина с формула XLII R₄C(NH2)COOH. По избор може да се използва метода Bucherer-Berg, при който хидантоин се получава чрез нагряване на алдехид (R₄CHO) с амониев карбонат или калиев цианид последвано от хидролиза (например с бариев хидроксид в кипящ диоксан) с киселина или основа до получаване на желаната амино киселина с формула XLII R₄C(NH₂)COOH.

Други методи за синтезиране на α-амино киселини са посочени в литературата, което би позволило на един специалист в тази област на техниката да получи желаното междинно съединение с формула XLII R₄C(NH₂)COOH , необходимо за синтезиране на съединенията с формула I.

Подходящи методи за синтезиране или разцепване на съединенията с формула XLII могат да се намерят в списание от Duthaler (Tetrahedron 1994, 50,1539-1650) или Williams (R. М. Williams, Синтезиране на оптично активни амино киселини. Pergamon: Oxford, U.K. 1989).

Специфичен метод за синтезиране на междинно съединение с формула XLII в някоя енантиомерна форма от съответн R₄X(X=CI, Br или I) междинно съединения е метода на Pirrung и Krishnamurthy (J.Org. Chem. 1993,58, 947-958) или чрез MeTOfld на O’Donnell др. (J. Am. Chem. Soc. 1989,111, 2353-2355). Необходимите R₄X междинни съеднения се получават лесно по множество методи познати на опитните химици от тази област на техниката. Например тези съединения, когато R₄X е АгСН₂Х могат да бъдат получени чрез пълно халогетиране на съединението АгСН₃ или чрез образуване на арен Ar-Η и превръщане на алкохола в бромид.

Друг специфичен метод за синтезиране на междинни съединения с формула XLII в някоя енантиомерна форма е този на Corey и Link (J.Am. Chem. Soc. 1992,114, 1906-1908). Така междинното съединение с формула R₄COOCCI₃ се редуцира енантиоспецифично до междинно съединение R₄CH(OH)CCI₃, което след обработка с азид и основа се превръща в междинно съединение R₄CH(N₃)COOH, което се редуцира с каталитично хидрогениране до желаното съединение с формула XLII. Необходиимият трихлорметил кетон R₄COCCI₃ се получава чрез взаимодействиие на алдехид R₄CHO с анион трихлорометид, последвано от окисляване (Gallina и Giordano, Synthesis 1989, 466-468).

Междинните амини с формула III (използвани в Реакционна схема I), в която R₅ и R₇ са водород, могат да бъдат получени съгласно Реакционна схема VII. Амино киселина (подходящо блокиран (Р_т) с формула L се активира чрез превръщане в солна киселина, флуороводородна киселина или смесен анхидрид (напр. чрез изобутилов хлороформат и триетиламин в инертен разтворител като например тетрахидрофуран или диоксан при около 0°С до около -40°С) и активиранато междинно съединение обработено с диазометан, за да се получи диазокетон с формула LI. Диазокетонът с формула LI се обработва с алкохол R(OH) (например (С_гС₆)алканол като метанол), и подходящ катализатор като например нагряване, сребърен окис или сребърен бензоат, за да се получи естер с формула LII. Естерът с формула LII е деблокиран за да се получи съединение с формула IIIA (чрез преподреждане Wolff). По избор естерът с формула LII се хидролизира, например с основи, и се

ТЗ се купелува с подходящ амин R₁₂H или HNR₈R₉ до получаване на съединение с формула IIIB, както е описано преди това.

Съобразно с реакционна схема VIII, междинните амини с формула III, в която R₅ е кислород - свързан заместител(например алкокси) (използван в Реакционна схема I) могат да бъдат получени по следния начин. Съединение с формула LXI се алкилира на кислород чрез обработване с подходящо алкилиращо средство (напр. алкилйодид, алкилбромид, алкилхлорид или алкилтозилат) и достатъчно алкалнодействащо вещество, за да се получи алкоксид (натриев или калиев хидрид) в подходящ полярен апротонен разтворител (напр. диметилформамид или тетрахидрофуран) при температура около 0°С до около 150°С като се получава съединение с формула LXII. Съединението с формула LXII се деблокира за да се образува желания междинен амин.

Междинните амини с формула III, в които R₅ е (Ci - С₆) алкоксикарбонилалкокси (използван в реакционна схема I) могат да бъдат получени по следния начин. Съединение с формула LXI се алкилира с халоген-алканоат естер до образуване на съединение с формула LXIII, което след това се деблокира, за да се получи желания амин. Съответната киселина може да бъде получена чрез хидролиза на естер като се използва воден разтвор на алкалнодействащо вещество при подходящ разтворител. Тези амини с формула III, в които R₆ съдържа естер и R₅ съдържа карбокси могат да бъдат получени от амин с формула LXIII (както е получена по-горе в този раздел), в която R₅ съдържа функционалната група на карбоксилната киселина блокирана като t-бутилов естер като се обработва с безводна киселина, за да се получи съответната киселина на R₅ без да се хидролизира естера на R₆ позиция. Съединенията с формула LXVI (междинни амини с формула III, в която R₅ е блокиран аминоалкокси) могат да бъдат получени от съединението с формула LXI. Съединението с формула LXI се алкилира с халоген-алкано-

нитрил до получаване на съединение с формула LXIV. Съединението с формула LXIV се редуцира до първичен амин чрез обработване с водород и подходящ катализатор (напр. родий- въглерод) в присъствието на амоняк за предпочитане полярен, протонен разтворител като например вода, метанол или етанол, за да се получи първичен амин с формула LXV. Съединението с формула LXV е блокирано на азот с блокираща група (Р_Т1), която е ортогонална по отношение на другата блокираща група (Р_т), след което следва деблокиране на блокиращата група Р_т, до получаване на желаното съединение с формула III. Блокираното съединение с формула III се купелува с подходящо съединение с формула II и полученото блокирано съединение с формула I се деблокира.

Съединенията с формула LXII и формула LXIV, в които η е 2, за предпочитане се получават чрез обработване на съеднениие с формула LXI с излишък на акрилат естер или акрилонитрил, съответно, в присъствието на подходяща основа като например калиев или натрие хидроксид, в подходящ разтворител, за предпочитане полярен протонен разтворител.

Съобразно с реакционна схема IX съединенията с формула LXVII и формула LXIX (съединения с формула III, в които R₅ е F или R₅ и R₇ са и двата F) могат да бъдат получени от съединение с формула LXI. Съединение с формула LXI се обработва с подходящо средство за флуориране като например диетиламиносерен трифлуорид в инертен разтворител като например апротонен разтворител, за предпочитане дихлорометан, за да се получи съединение с формула LXVII. Съединението с формула LXVII се деблокира по подходящ начин.

Съединението с формула LXI се окислява до съединение с формула LXVIII като се използва режимът описан по-горе за получаване на съединения с формула I, в които R₅ и R₇ заедно образуват оксо. Съединението с формула LXVIII се обезфлуорява при подходящи условия (например диетиламиносерен трифлуорид в дихлорометан).

Съобразно с реакционна схема X съединениото с формула 1_ХХ или съединение с формула LXIV, в които R₇ е алкил (напр. съединение с формула III, в която R₇ е алкил) се получават от съединение с формула LXX (също виж реакционна схема V за аналогично получаване на амин). Съединението с формула LXX се обработва с органометален реагент R₇M и полученият вторичен алкохол се окислява, както в предшестващия раздел, до получаване на съединение с формула LXXI. Съединението с формула LXXI посредством цианохидрин с формула LXXII се превръща в съединение с формула LXXIII като се използват същите условия, които са използвани за превръщане на съединение с формула XXI в съединение с формула XXII в реакционна схема IV.

По избор съединението с формула LXXII се превръща в съединение с формула LXIV, както е описано за превръщането на междинно циано-съединение в амид в реакционна схема V.

Съединение с формула R₈NH₂ или R₉NH₂ се моноалкилира с карбонилно съединение съответващо на R₈ или R₉ при подходящи условия за редукционно аминиране до амин с формула R₈R₉. За да не се допусне диалкилиране, може да се предпочете блокиране на амините (R₈NH₂ или R₉NH₂) с подходяща блокираща група Р_т, за да се получи R₈ (Pt)NH или R₉(P_t)NH например чрез взаимодействие с бензалдехид и редуциращо средство. Блокираните амини са моноалкилирани с карбонилно съединение, отговарящо съответно на R₉ или R₈ при подходящи условия на редукционно аминиране до получаване на R₈R₉N(P_T). Блокиращата група (Р_т) се отстранява (например чрез пълно каталитично хидрогениране когато Р_т е бензил), за да се получи съединение с формула R₈R₉NH. За специалистите в тази област подходящите условия за редукционно получаване на амини са познати от литературата. Тези условия получаване на амини са познати от литературата. Тези условия включват тези съобщени от Borch et al. (J. Am. Chem. Soc. 1971,28972904) и тези съобщени от Emerson (Organic Reactions, Wiley, New York, 1948 (14), 174), Hutchins stall. (Org. Prep. Proced. Int. 1979 (11),20, и Lane et all. (Syntesis 1975,135). Условията за получаване на амини чрез редукция, благоприятстващи N-моноалкилирането, включват тези съобщени от Morales et al. (Synthetic Communications 1984,12131220) и Verardo etal. (Syntesis 1992,121-125). Амините R₈NH₂ или R₉NH₂ могат също да бъдат моноалкилирани съответно с RgX или RaX, в които X е хлорид, бромид, тозилат или мезилат. По избор междинните съединения с формула R₈ (P_T)NH или R₉(P_T)NH могат да бъдат алкилирани с RgX или RaX и да се отстрани блокиращата група, за да се получи съединение с формула R₈R₉NH.

Могат да бъдат използвани допълнителни методи за получаване на амини с формула R₈R₉NH, в които R₈-NH или R₉-NH са свързани кислород-азот. Така лесно намиращото се съединение с формула (Ci -С^алкоксикарбонил-ИНОН или NH₂CONHOH се алкилират на азот и кислород чрез обработване с основа и излишък от подходящо алкилиращо средство (R-X), за да се получи съответно (Ci -С₄) алкоксикарбонил-М(Н)ОР, което след това се хидролизира до получаване на съединение с формула R₈R₉NH (в което R₈=R₉=R). Подходящите условия, основа и алкилиращо средство включват тези, описани от Goel and Krolls (Org.Prep. Proced. Int. 1987,19, 75-78) и Major and Fleck (J.Am. Chem. Soc. 1928,50,1479).По избор амин c формула NH₂COH(OH) може да бъде последователно алкилиран, първоначално на кислород и да се получи NH₂CONH(OR’), след това на азот и да се получи NH₂CON(R”)(OR’), посредством последователно обработване с алкилиращи средства R’X и R”X, съответно, в присъствието на подходяща основа. Подходящата основа и алкилиращите средства включват тези, описани от Kreutzkamp and Messinger (Chem. Ber. 100,3463-3465 (1967) and

Danen et al. (J. Am. Chem. Soc. 1973,95,5716-5724). При хидролиза на тези производни на алкилирана хидроксиуреа се получават амини R’ONH₂ и RON HR”, които съответстват на известни амини с формула R₈R₉NH . Специалистите от тази област на техниката могат да пригодят операциите описани в този раздел за други алкилиращи средства R, R’, и R’’-Х, за да се получат други амини с формула R₈R₉NH, в която R₈-N или R₉-N са кислород-азот свързани. Uno et al. (synLett 1991,559-560) описват ВЕ₃-каталитично добавяне на органометалния реагент R-Li към О-алкил охсим с формула R’CH=NOR”, за да се получат съединения с формула R’RCH-NH( OR”). Този начин може също да се използва, за да се получат съединения с формула R₈R₉NH, в която единият от R₈-NH или R₉-NH са свързани кислород-азот.

Изходните съединения, от които се получават лекарствените съедения съгласно настоящото изобретение и в които карбоксилна група в карбоксилна киселина с Формула I е заместена от естер могат да бъдат получени чрез свързване на карбоксилна киселина с подходящ алкил халид в присъствието на основно действащо съединение като например калиев карбонат в инертен разтворител като диметилформамид при температура около 0°С до 100°С в продължение на около 1 до около 24 часа. По избор киселината се свързва с подходящ алкохол като разтворител в присъствие на катализно количество киселина като например концентрирана сярна киселина при температура от около 20°С до 120°С, за предпочитане температура на кипене, в продължение на около 1 час до около 24 часа. Друг метод е взаимодействие на киселина със стехиометрично количество алкохол в присъствието на катализно количество киселина в инертен разтворител като например тетрахидрофуран със съпътстващо отстраняване на водата, проведено по физичен начин (напр. Dean-Stark уловител) или по химичен начин (например молекулярни сита).

Изходните съединения, от които се получават лекарствените съединения съгласно настоящото изобретение, в които алкохолната функция е произлязла като етер, могат да бъдат получени като се свързва алкохол с подходящо количество алкил бромид или йодид в присъствие на на алкалнодействащо вещество като например калиев карбонат в инертен разтворител като например диметилформамид при температура около 0°С до 100°С в продължение на около 1 час до около 24 часа. Алканоиламинометилови етери могат да бъдат получени при взаимодействието на алкохол с бис(алканоиламино)метан в присъствие на катализно количество киселина в инертен разтворител като например тетрахидрофуран, съгласно метода описан в патент на САЩ 4,997,984. По избор тези съединения могат да бъдат получени по методите описани от Hoffman et al. в J.Org.Chem. 1994,59,3530.

Диалкилфосфатните естери могат да бъдат получени чрез взаимодействие на алкохола с диалкил хлорофосфат в присъствие на алкалнодействащо вещество в инертен разтворител като тетрахидрофуран. Дихидроген фосфатите могат да бъдат получени чрез взаимодействие на алкохол с диарил или дибензил хлорофосфат, както е описано по-горе, последвано от хидролиза или хидрогениране в присъствие съответно на катализатор благороден метал.

Гликозиди се получават чрез взаимодействие на алкохол и въглеводород в инертен разтворител като например толуол в присъствие на киселина. Обикновено водата, образувана при реакцията се отстранява както е описано по-горе. Друг начин е взаимодействието на алкохол с подходящо блокиран гликозил халид в присъствието на основа, последвано от деблокиране.

М-(1-хидроксиалкил)амиди, Ь1-(1-хидрокси-1-( алкоксикарбонил) метил) амиди са съединения, в които R₂ е бил заместен с С(ОН)С(О)ОУ, могат да бъдат получени чрез взаимодействие на

Ί9 първичен амид или индол с подходящ алдехид при алкални или неутрални условия (напр. натриев етоксид в етанол) при температури между 25 и 70°С. N-алкоксиметил индоли или М-1-(алкокси)алкил индоли могат да бъдат получени чрез взаимодействие на Nнезаместения индол с необходимия алкил халид в присъствие на основа в инертен разтворител. 1-(М,М-диалкиламинометил)индол, 1(1-(М,М-диалкиламино)етил)индол и Ν,Ν-диалкиламинометил амиди (напр. R₃=CH₂N(CH₃)₂) могат да бъдат получени като изходно N-H съединение взаимодейства с подходящ алдехид и амин в разтворител алкохол при 25 до 70°С.

Циклични изходни съединения за съединенията с приложение като лекарство (напр. изходни съединения съгласно изобретението, в които R₂ и R₃ са обикновен въглерод) могат да бъдат получени чрез взаимодействие на основно съединение (лекарство) с алдехид или кетон или негов диметил ацетал в инертен разтворител в

присъствието на катализно количество киселина с едновременно отстраняване на вода или метанол. По избор тези съединения могат да бъдат получени чрез взаимодействие на амино алкохол или хидрокси амид с гем-дибромо алкан в присъствие на алкалнодействащо съединение (напр. калиев карбонат) в инертен разтворител (напр. диметилформамид).

Съединенията с формула IA могат да бъдат получени съгласно описанието дадено по-долу.

Номерата на схемите и номерата на формулите посочени след края на настоящото изречение се отнасят до номера на схеми и номера на формули, които се срещат след настоящото изречение на текста (т.е. те не трябва да се смесват с изложеното до тук).

WO 99Z26659

РСТЛВ98ЛН752

СХЕМА XI

j s

il j

WO 99/26659

PCT/IB98/01752

CXEMAXII

COOEt

R10 Rn

COOEt COOH

“ю R11 R10 Rn

Режим на хидролиза

Rio Rn

WO 99/26659

PCT/IB98/01752

C_x Е M A XIII

Rio R11 R10 R11

wo 99/26659

PCT/IB98/01752

C-XEMAXIV

XVIII

COOH

R₃

CONRgRg;C(O)Ri2

XXV

R12H RsRgNH

CONR_eR₉;C(O)Ri2 lllb

WO 99/26659

PCT/IB98/0I752

CXEMAXV

COOR

XXXII естерифициране,^/

COOH

XXX

^R3

XXXIII

WO 99/26659

РСТЛВ98/01752

CXEMAXVI

основа, R_rx

XL

XLII

COOH

Illa

I.PhCHO, редукц.

2. Ь1аС1ЧВНз/ подходящо карбонилно съединение

3. изходящи н₂. Pd/C

COOH

XXX

Съгласно Реакционна схема XI съединенията с формула IA, в която R_1s R₁₀, Rn, A, R₂, R_3> R₄, R₅, и R_e са съгласно дадените по-горе определения, могат да бъдат получени по двата главни методи. При първия метод желаното съединение с формула IA може да бъде получено като подходящо съединение индол-2-карбоксилна киселина, индолин-2-карбоксилна киселина или бензимидазол-2карбоксилна киселина с формула II се купелува с подходящ амин (напр. ацилиращ амин) с формула III. При втория метод желаното съединение с формула IA може да бъде получено като подходящо съединение с формула IV (напр. съединение с формула IA в която R₆ е карбокси) се купелува с подходящ алкохол или амин с формула R₈R₉NH или R₁₂H, в които R₈, R₉ и R₁₂ са съгласно дадените по-горе определения (т.е. ацилиращ амин или алкохол). Първият метод (купелуване на съединения с формула II със съединения с формула III е обикновено предпочитан, когато R₄ не е водород и R₅ е водород.

Обикновено съединения с формула II се свързват със съединения с формула III (или съединение с формула IV се свързва с подходящ амин (напр. R₁₂H или R₈R₉NH)) или алкохол в присъствието на подходящо купелуващо средство. Подходящото купелуващо средство е такова , което превръща карбоксилна киселина в реактивна разновидност, която образува амидна или естерна връзка при взаимодействие съответно с амин или алкохол.

Средството за купелуване може да бъде реагент, който да причинява тази кондензация в един пот метод, когато са смесени заедно с карбоксилна киселина и амин или алкохол. Ако киселината трябва се се кондензирана с алкохол за предпочитане е да се използва голям излишък на алкохол в качеството на реагиращ разтворител с добавянето на 1.0 или 1.5 еквивалента диметиламинопиридин. Примери на купелуващи реагенти са 1-(3диметиламинопропил)-3-етилкарбодиимид хидрохлоридхидроксибензотриазол (DEC/HBT), карбонилдиимидазол, дициклохексилкарбодиимид/хидроксибензотриазол (НВТ), 2-етокси1 -етоксикарбонил-1,2-дихидрокуинолин (EEDQ), карбонилдиимидазол/НВТ, пропан фосфонов анхидрид (пропанфосфонов кисел анхидрид, РРА) и диетилфосфорилцианид. Купелуването се извършва в инертен разтворител, за предпочитане в апротонен разтворител при температура около -20°С до около 50°С в продължение на около 1 до около 48 часа при оптимално присъствие на основа на третичен амин като например триетиламин. Примерните разтворители включват ацетонитрил, дихлорометан, етил ацетат, диметилформамид и хлороформ или техни смеси.

Средството за купелуване може да бъде също такова средство, което превръща карбоксилната киселина в активирано междинно съединение, което е отделено и/или образувано в първия етап и има възможност във втория етап да реагира с амин или алкохол. Примери за такива средства за купелуване и активирани междинни съединения са тионил хлорид или оксалил хлорид за образуване на солна киселина, флуорид на цианурова киселина за получаване на флуороводородна киселина или алкил хлороформат като например изобутил или изопропенил хлороформат (с основа на третичен амин) за получаване на смесен анхидрид на карбоксилната киселина. Ако средството за купелуване е оксалил хлорид, благоприятно е да се използва малко количество диметилформамид като съразтворител с друг разтворител (като например дихлорометан), за да катализира образуването на солна киселина. Солната киселина може да бъда купелувана чрез смесване на подходящо междинно съединение с формула III в подходящ разтворител заедно с подходяща основа. Подходящи комбинации на разтворител/основа е например дихлорметан, диметилформамид или ацетонитрил или техни смеси в присъствието на основа на третичен амин например триетиламин. Други подходящи комбинации разтворител/основа включват вода или (Ci -С₅)алкохол или тяхна смес заедно със

съразтворител като например дихлорметан, тетрахидрофуран или диоксан и основнодействащо съединение като натриев или калиев карбонат, натриев, калиев или литиев хидроксид или натриев бикарбонат в достатъчно количество, за да се изразходи киселината, освободена при реакцията. Използване на фазовотрансферен катализатор (обикновено 1 до 10 мол.%) като например четвъртичен амониев халид (например тетрабутиламониев бромид или метил триоктиламониев хлорид) е за предпочитане когато се използва само частично смесим съразтворител (например дихлорометан-вода или дихлорометан-метанол). Използването на тези средства за купелуване и подходящ подбор на разтворители и температури са известни на специалистите в тази област или може лесно да се ползва от литературата. Тези и други примерни условия използвани за купелуване на корбоксилни киселини са описани в Houben-Weyl, Vol.XV, part.ll, Е. Wunsch, Ed. G. Theime Verlag, 1974, Stuttgard, и M. Bodansky, Principles of Peptide Syntesis, Springer-Verlag Berlin 1984, и The Peptides. Analysis, Synthesis and Biology (ed. E. Gross and J. Meienhofer), vols 1-5 (Academic Press NY 1979-1983).

Съединенията c формула IV, в които Ri, R₁₀, Rn, A, R₂, R₃, R₄ и R₅, са съгласно дадените по-горе определения могат да бъдат получени от съответните естери с формула V (т.е. съединения с формула IA, в която R₆ е (Ci -С₅) алкоксикарбонил или бензилоксикарбонил) чрез хидролиза с водно основнодействащо вещество при температура около -20°С до около 100°С, обикновено 20°С, в продължение на около 30 минути до около 24 часа.

По избор съединенията с формула IV се получават чрез активиране на индол карбоксилна киселина с формула II със средство за купелуване (както е описано по-горе), което води до активирано междинно съединение (като например солна киселина, флуороводородна киселина или смесен анхидрид), които след това реагират със съединение с формула III, в която R₃, R₄ и R₅ са

MiMM мм съгласно дадените по-горе определения и R_e е карбокси, в подходящ разтворител в присъствието на подходяща основа. Подходящи разтворители включват вода или метанол или тяхна смес, заедно със съразтворител като например дихлорметан, тетрахидрофуран или диоксан. Подходящи вещества с основен характер включват натриев, калиев или литиев хидроксиди, натриев или калиев бикарбонат, натриев или калиев карбонат, или калиев карбонат заедно с тетрабутил амониев бромид (1 еквивалент) в достатъчно количество, за да изразходват киселината освободена при реакцията (обикновено количество достатъчно за поддържане pH на реакцията над 8). Съединение, с основен характер може да бъде добавяно в нарастващи количества с активираното междинно съединение, за да се извършва точен контрол на pH на реакцията. Реакцията се провежда главно между -20°С и 50°С. Начина на изолиране се определя от специалист в тази област на науката за да се отстранят онечистванията, но обикновено представлява отстраняване на водосмесими съразтворители чрез изпаряване, екстракция на онечистванията при високо pH с органичен разтворител, подкиселяване до ниско pH (1-2) и филтруване или извличане на желания продукт с подходящ разтворител като етилов ацетат или дихлорметан.

Съединението с формула V може да бъде получено чрез купелуване на подходящо съединение с формула III, в която R₆ е алкоксикарбонил и подходящо съединение с формула II в аналогичен начин, както е описан по-горе.

По избор съединенията с формула IA, които съдържат серни атоми в състояние на сулфоксид или в сулфоново окислено състояние, могат да бъдат получени от съответните съединения с формула IA, които имат серен атом в неокислено състояние, чрез обработване с подходящо средство за окисляване, като например

m- хлоропероксибензоена киселина в дихлорметан при температура около 0°С до около 25°С в продължение на около 1 до около 48 часа, като се изплзва около 1 до около 1.3 еквивалента за превръщане до сулфид окислено състояние и повече от 2 еквивалента за превръщане до сулфон окислено състояние.

Например в реакционна схема XI някои съединения с формула IA съдържат функционалност на първичен амин, вторичен амин или на карбоксилна киселина в част от молекулата определена от R₆, който може да се намеси с възможна реакция на купелуване от реакционна схема XI, ако междинното съединение с формула III или R₁₂H или ^w RgRgNH амин е ляво неблокиран. Следователно функционалността на първичния амин, вторичния амин и карбоксилната киселина може да бъде блокирана, където тя е налице в R₆ остатъците на междинното съединение R₈R₉NH или R₁₂H амин с формула III чрез подходяща блокираща група по време на реакцията на купелуване в реакционна схема XI. Продуктът от такава реакция на купелуване в такъв случай е съединение с формула IA, съдържащо блокираща група. В следващия етап тази блокираща група се отстранява и се получава съединение с формула IA. Подходящите блокиращи групи за блокиране на амин и карбоксилна киселинна включват тези блокиращи групи, които обикновено се използват при синтез на пептид, като например М4-бутоксикарбонил,М-карбобензокси и 9флуоренилметиленокси кар бонил за амини и нисш алкил или бензилестери за карбоксилни киселини), които не са химически активни при условията на купелуване, описани по-горе и могат да бъдат отстранени без химическа промяна на друга функционалност в съединението с формула IA.

Изходните индол-2-карбоксилни киселини и индолин-2карбоксилни киселини, използвани в реакционна схема XI, когато те не се намират на пазара или не са известни в нивото на техниката (при многообхватни публикации), са достъпни чрез обикновените методи на синтезиране. Например съгласно реакционна схема XII индоловият естер с формула VII (в която А не е азот) може да бъде получен от съединение с формула VI (в която Q е избрано така, че да се получи желаното А съгласно определението по-горе, с изключение за N) чрез Fischer индол-синтез (виж The Fischer Indole Syntesis Robinson, B. (Wiley, New York, 1982)), последвано от осапунване на получавания индолов естер с формула VII, за да се получи съответната киселина с формула VIII. Изходният арил хидразон може да бъде получен чрез кондензиране на лесно достъпния хидразин с подходящо карбонилно производно или чрез реакцията JappKingeman (виж Organic Reactions. Phillips, R.R. 1959,10,143).

По избор индол 2-карбоксилна киселина с формула VIIIA може да бъде получена чрез кондензиране на орто метил нитро съединение с формула IX с оксалатов естер и да се получи индол естер с формула X, последвано от редуциране на нитро групата и след това хидорлиза.

Този три-етапен метод е известен като Reissert indole syntesis (Reissert, Chemische Berichte 1897,30,1030). Режимите за извършване на тази последователност и обесненията към тях са описани в литературата (Kermack, etal., J. Chem. Soc. 1921,119,1602; Cannon et al., J. Med. Chem. 1981, 24,238; Julian, et al. in Hetero cyclic Compounds, vol 3 (Wiley, New York, 1962, R.C. Eldrfield ed.) p.18).

3-халоген-5-хлоро-1 Н-индол-2- карбоксилни киселини могат също да бъдат получени чрез халогениране на 5-хлоро-1 Н -индол-2карбоксилни киселини.

Съгласно реакционна схема XIII междинните бензимидазол-2карбоксилни киселини от формула XI могат да бъдат получени чрез кондензиране на орто-диамино съединение с формула XIII с гликолова киселина, последвано от окисляване на получения бензамидазол-2-метанол с формула XII (Bistrzycki, A. and Przeworski, G. Ber. 1912.45,3483). По избор (към реакционна схема XII) заместените индолини с формула XIV могат да бъдат получени чрез редукция на съответните индоли с формула XV с редуциращо средство като например магнезий в метанол при температура около 25°С до около 65°С в продължение на около 1 до около 48 часа (Реакционна схема III).

Индол карбоксилни киселини с формула XVI се получават чрез осапунване на съответен естер с формула XVII (реакционна схема XIII). Естерът с формула XVII се получава чрез редуциране на съответен индолов естер с формула VII със редуциращо средство като например магнезий в метанол, както е описано по-горе за превръщането на съединение с формула XV в съединение с формула XIV.

В следващата част се описват начини за получаване на различни амини, които се използват в горните реакционни схеми.

Съгласно реакционна схема XIV алфа-амино киселина с формула XXIII може да бъде блокирана на азот с подходяща блокираща група (Р_т) (например t-Boc), за да се образува съединение с формула XXIV. Специалистът в тази област може лесно да избере подходяща блокираща група и метод за включването й. Например две познати блокиращи групи са t-Boc (включена чрез обработване на амино киселина с ди-t- бутилдикарбонат за предпочитане в протонен подходящ разтворител или смес на разтворите при високо pH) и CBZ (включена чрез обработване на амино киселина в бензилхлороформат в подходящ, за предпочитане протонен разтворител или смес на разтворител и основа). Съединение сформула XXIV се купелува (при операции аналогични на метода на купелуване описан в реакционна схема XI) с подходящ R₈R₉NH или HR₁₂ амин за получаване на съединение с формула XXV, което след като се деблокира се получава съединение с формула IIlb (т.е. съединение с формула III в която R_e е C(O)R₁₂ или C(O)NR₈R₉). Ако блокиращата група е t-Boc, чрез обработване на съединение с

формула XXV с киселина в подходящ, за предпочитане апротонен разтворител. Киселиннодействащите съединения за деблокиране включват HCI, MeSO₃H или трифлуорооцетна киселина.

Съгласно реакционна схема XV съединение с формула XXXI (N-блокиран амин с формула III, в който R_e е (C_t -С₀)алкоксикарбонил или бензилоксикарбонил) може да бъде получено от съответната неблокирана амино киселина с формула XXX чрез N-блокиране (като се получава блокирана амино киселина с формула XXXIII) последвано от естерифициране. Например съединение с формула XXXIII може да бъде естерифицирано с подходящ алкохол и катализатор киселина като например солна киселина или тионил хлорид, или в случай на третичен-бутанол чрез обработване на амино киселина с изобутилен и катализатор киселина като например концентрирана сярна киселина или чрез обработване с алкил халид (например метил йодид) и основнодействащо съединение (напр. калиев карбонат). По избор естерифицирането може да се извърщи преди блокирането.

Съгласно реакционна схема XVI съединенията с формула XXX, в която R₃ не е водород, използвани в реакционна схема V могат да бъдат получени по следния начин. Амино киселини с формула XLI могат да бъдат получени чрез N-алкилиране на блокирани (Р_т) амино киселини с формула XL чрез обработване с подходящо основнодействащо съединение и средство за алкилиране. Специфични операции за това алкилиране са описани от Benoiton, Can. J. Chem. 1977,55, 906-910 и Hansen, J.Chem. 1985,50,945-950. Например когато R₃ е метил и Р_те Вос се използват натриева основа и метил йодид в тетрахидрофуран. При деблокиране на съединението с формула XLI се получава желаното съединение с формула XXX.

По избор амино киселина с формула XLII може да бъде алкинирана чрез три етапно последователно провеждане на редукционно бензилиране (например с бензиладехид, Pd/Cкатализно хидрогениране), за да се получи производно на moho-N- бензил и редуктивно аминиране с подходящо карбонилно съединение (като например с формалдехид и натриев цианоборохидрид за включване на R₃ като метил) и води до Nбензил, N-R₃-3aMecTeHa амино киселина. N-бензил блокиращата група е отстранена по подходящ начин (например чрез хидрогениране с подходящ катализатор), за да се получи съединение с формула XXX. За този три етапен метод за алкилиране са описани от Reinhold etal., J.Med. Chem. 1968,11,258-260.

Получаването, описано непосредствено преди това което може също да бъде използвано за включване на R₃ остатък в междинно съединение с формула Illa (което е междинно съединение с формула III в което R₃ е водород).

Амино киселините използвани в схемите тук (напр. XL, XLII) ако не се намират на пазара или не са съобщени в литературата, могат да бъдат получени чрез различни методи известни на специалистите от тази област. Например могат да се използват синтеза Strecker или негови изменения. Съобразно с това алдехид (R₄CHO), натриев или калиев цианид и амонииев хлорид реагират до получаване на съответен аминонитрил. Аминонитрилът се хидролизира с минерална киселина до получаване на желаната R₄C(NH₂)COOH амино киселина (формула XLII). По избор може да се използва метода Bucherer-Berg по който хидантоин се получава чрез нагряване на алдехид (R₄CHO) с амониев карбонат и калиев цианид, последвано от хидролиза (например с бариев хидроксид в кипящ диоксан) с киселина или основа и до получаване на желаната амино киселина R^NH^COOH (формула XLII).

Други методи за синтезиране на α-амино киселини са също описани в литературата, които могат да позволят на специалистите в тази област да получат желаното междинно съединение R₄C(NH₂)COOH (формула XLII), необходимо за синтезиране на съединения с формула IA.

Подходящи методи за синтезиране и/или разделяне на съединения с формула XLII се намират в списания от Dirthaler (Tetrahedron 1994, 50,1539-1650), или от Williams (R.M. Williams, Synthesis of optically active amino acids. Pergamon: Oxford, U.K. 1989).

Специфичен метод за синтезиране не междинно съединение с формула XLII във всеки енантиомерен вид от съответното междинно съединение R₄X (X=CI, Вг, или I) е методиката на Pirrung и Krishnamurthy (J. Org. Chem. 1993,58,957-958) или методиката на O’Donnell et.al. (J. Am. Chem. Soc. 1989,111, 2353-2355). Необходимите междинни съединения R₄X се получават лесно чрез много методи познати на специалистите в тази област. Например тези съединения, когато R₄X е АгСН₃ могат да бъдат получени чрез пълно халогениране на съединението АгСН₃ или чрез обработване с фомалин на арен Ar-Η и превръщане на алкохол в бромид.

Друг специфичен метод за синтезиране на междинни съединения с формула XLII във всеки енантиомерен вид е този на Corey и Link (J.Am. Chem. Soc. 1992,114,1906-1908). Така, междинно съединение с формула R₄COOCI₃ се редуцира специфично енантиомерно до междинно съединение R₄CH(OH)CCI₃, което се подлага на обработване с азид и основнодействащо съединение до получаване на междинно съединение R₄CH(N₃)COOH, което се редуцира чрез катализно хидрогениране до желаното съединение с формула XLII. Желаният трихлорометил кетон R₄COOCI₃ се получава чрез взаимодействие на алдехид R₄CHO с анион на трихлорометид, последвано от окисляване (Gallina and Giordano, Synthesis 1989,466468).

Съединение c формула R₈NH₂ или R₉NH₂ се моноалкилира с карбонилно съединение съответно до R₈ или R₉ при подходящи условия на редукционно аминиране, за да се получи R₈R₉NH амин. За да се избегне диалкилиране, може да е за предпочитане да се блокират амините R₈NH₂ или R₉NH₂ с подходяща блокираща група

Р_т, за да се получи R₈ (P_T)NH или R₉(P_T) NH, например като взаимодейства с бензалдехид и редуциращо средство. Блокиращите амини се моноалкилират с карбонилно съединение отговарящи съответно на R_s или Re при подходящи условия за редукционно аминиране, за да се получи R₈R₉N(P_T). Блокиращата група (Р_т) се отстранява (например чрез пълно каталитично хидрогениране когато Р_т е бензил), за да се получи съединение с формула R₈R₉NH. За специалистите в тази област са познати от литературата подходящи условия за редукционно аминиране (вкарване на аминогрупа). Тези условия включват и съобщените от Borch et al. (J. Am. Chem. Soc. 1971,2897-2904) и тези публикувани от Emerson (Organic Reactions, Wiley ; New York, 1948 (14), 174), Hutchins et al. (Org. Prep. Proced. Int. 1979 (11), 20, and Lane etal. (Synthesis 1975,135). Режими на редукционно вкарване на аминогрупа благоприятни за Nмоноалкилиране включваат тези съобщени от Morales, et al. (Synthetic Communications 1984,1213-1220) and Verardo et al. (Synthesis 1992, 121-125). R₈NH₂ или R₉NH₂ амините могат също да бъдат моноалкилирани с ReX или съответно RgX, където X е хлорид, бромид, тозилат или мезилат. По избор междинно съединение с формула Re (Ρτ)ΝΗ или R₉(P_t) NH може да бъде алкилирано с RgX или ReX и блокиращата група да бъде отстранена, за да се получи съединение с формула R₈R₉NH.

Могат да бъдат използвани и други методи за получаване на амини с формула R₈R₉NH, в които R_e-NH или R₉-NH са свързани кислород-азот. Така лесно достъпно съединение с формула (Ci -С₄)алкоксикарбонил-ИНОН или NH₂CONHOH се диалкилират на азот и кислород чрез обработване с основнодействащо съединение и излишък на подходящо алкилиращо средство (R-Х) до получаване съответно (Ci -C₄)aAKOKCHKap6oHHA-N(R)OR, което след това се хидролизира за да се получи съединение с формула R₈R₉NH (в която R₈= Ρθ= R). Подходящ режим, основнодействащо средство и

алкилиращо средство включват тези описани от Goel and Krolls (Org. Prep. Proced. Int. 1978,19, 75-78) и Major and Fleck (J.Am. Chem. Soc. 1928,50,1479). По избор N-хидроксикарбамид (NH₂CONH(OH)) може последователно да бъде алкилиран, първо на кислород за да се получи NH₂CONH(OR’), след това на азот за да се получи NH₂CON(R”)(OR’), чрез последователно обработване с алкилиращи средства R’X и R”X, съответно, в прсъствието на подходящо съединение с основен характер. Подходящи такива и алкилиращи средства включват тези описани от Kreutzkamp and Messinger (Chem. Ber. 100,3463-3465 (1967) и Danen et al. (J. Am. Chem. Soc. 1973,95, 5716-5724). Хидролизата на тези алкилирани хидроксикарбамидни производни води до получаване на RONH₂ или RONHR” амини, които отговарят на известните амини с формула R₈R₉NH. Химиците специалисти в тази област на техниката могат да адаптират описаните тук методики за други алкилиращи средства R, R’ и R’’-Х за получаване на други амини с формула R₈R₉NH, в която R₈-N или R₉-N са кислород-азот свързани. Uno et al. (SynLett 1991,559-560) описва ВР₃-катализпрана добавка към органометален реагент R-Li до Оалкил оксим с формула R’CH=N-OR” за получаване на съединения с формула R’RCH-NH(OR”). Този начин може да се използва също за получаване на съединения с формула R₈R₉NH, в която R₈-NH или R₉NH са кислород-азот свързани.

Изходните съединения за лекарствата съгласно настоящото изобретение, където карбоксилната група в карбоксилната киселина с формула IA е заместена с естер, могат да бъдат получени като се свързва карбоксилна киселна с подходящ алкил халид в присъствието например на калиев карбонат в инертен разтворител като диметилформамид при температура около 0 до около 100°С в продължение на около 1 до около 24 часа. По избор киселината може да се свърже с подходящ алкохол като разтворител в присътвие на каталитичноно количество киселина като

например концентрирана сярна киселина при температура около 20 до 120°С, за предпочитане тепмература на кипене, в продължение от около 1 час до около 24 часа. Друг метод е взаимодействието на киселина със стехеометрично количество алкохол в присъствието на катализно количество киселина в инертен разтворител като тетрахидрофуран, с едновременно отстраняване на водата, което се извършва по физичен (напр. Dean-Stark уловител) или химичен начин (например молекулярни сита).

Изходните съединения за лекарствата съгласно настоящото изобретение, където алкохолната функция се придобива от етер, може да се получи като се свързва алкохол с подходящ алкилбромид или йодид в присъствието на основнодействащо като например калиев карбонат в инертен разтворител като например диметилформамид при температура около 0 до около 100°С в продължение на около 1 час до около 24 часа. Алканоиламинометилови етери могат да се получат при взаимодействие на алкохол с бис-(алканоиламино)метан в присъствието на катализно количество киселина в инертен разтворител като напрмер тетрахдрофуран, съгласно метода описан в патент на САЩ 4 997,984. По избор тези съединения могат да бъдат получени по методите описани от Hoffman et al. в J. Org. Chem. 1994, 59,3530.

Диалкилфосфатните естери могат да бъдат получени като алкохол взаимодейства с диалкил флорофофат в присъствие на оснвонодействащо вещество в инертен разтворител като например тетрахидрофуран. Двукиселите фосфати могат да бъдат получени като алкохол взаимодейства с диарил или дибензил хлорофосфат както е описано по-горе, последвано от хидролиза или хидрогениране съответно в присъствието на катализатор благороден метал.

Гликозиди се получават като алкохол взаимодейства с въглеводород в инертен разтворител като например толуол в присъствието на киселина. Обикновено образуваната при реакцията вода се отстранява при образуването й, както е описано по-горе. Алтернатива методика е взаимодействието на алкохол с подходящ блокиран гликозил халид в присъствието на основнодействащо, последвано от деблокиране.

N-(1 -хидроксиалкил)амиди, N-(1 -хидрокси-1 (алкоксикарбонил)метил)амиди или съедининия, в които R₂ е бил заместен от C(OH)C(O)OY могат да бъдат получени като основен амид или индол взаимодейства с подходящ алдехид при неутрални или основни условия (напр. натриев етоксид в етанол) при температура между 25 и 70°С. N-алкоксиметил индоли или N-1(алкокси)алкил индоли могат да бъдат получени като N-незаместен ндол взаимодейства с необходимия алкил халид в присъствието на основнодействащо веещество в инертен разтворител. 1-(N,Nдиалкиламинометил) индол, 1-(1-(М,М-диалкиламино)етил)индол и Ν,Νдиалкиламинометил амиди (напр. R₃=CH₂N(CH₃)₂) могат да бъдат получени като основно N-Н съединение взаимодейства с подходящ алдехид и амин в разтвор алкохол при 25 до 70°С.

Изходните съединения за лекарство съгласно настоящото изобретение, където R₂ и R₃ са обикновено въглерод могат да бъдат получени като основното съединение (лекарствено) взаимодейства с бензалдехид или кетон или негов диметил ацетал в инертен разтворител в присъствието на каталитично количество киселина при едновременно отделяне на вода или метанол.

Изходните материали и реагенти за гореописаните реакционни схеми (напр. амиди, заместени индол карбоксилни киселини, заместени индолин карбоксилни киселини, амино киселини), макар че получаването на по-голяма част от тях е описано по-горе, се намират лесно и могат да бъдат лесно синтезирани от специалист в

100 тази област като използват традиционни методи за органичен синтез. Например много от междинните съединения използвани тук за получаване на съединения с формула I и IA се отнасят до или произлизат от амино киселини, срещани в природата, за които има голям научен интерес и търговска потребност, и следователно много такива междинни съединения се намират на пазара или са посочени в лиитературата или пък лесно се получават от други обикновено налични субстанции по методи, които са посочени в литературата.

Някои методи за получаване подходящи за получаването на съединенията описани тук (напр.съединения с Формула I, съединения с формула IA) могат Да изискват блокиране на слабата функционалност. Необходимостта от такова блокиране ще зависи много от естеството на слабата функционалност и режима на методите за получаване. Необходимостта от такова блокиране се определя лесно от специалиста в тази област. Използването на такива блокиращи/деблокиращи методи също е във възможностите на специалиста в тази област. За общото описание на блокиращи групи и тяхното използване виж T.W.Green, Protective Groups in Organic Syntesis. Jokn Wiley&Sons, New York, 1991.

Някои от съединенията съгласно настоящото изобретение имат асиметрични въглеродни атоми и следователно са енантиомери или диастереомери. Диастереомерните смеси могат да бъдат разделени на техните индивидуални диастереомери на базата физични и химически различия по известни методи per se. например чрез.хроматография и/или фракционна кристализация. Енантиомерите могат да бъдат разделени чрез превръщане на енантиомерната смес в диастереомерна смес чрез взаимодействие с подходящо оптично активно съединение (напр. алкохол), като се разделят диастереомерите и превръщане (напр. като се хидролизира) отделните диастереомери в съответните чисти енантиомери. Всички такива изомери включително диастереомери,

101 енантиомери и техните смеси се считат за част от настоящото изобретение. Също някои от съединенията съгласно настоящото изобретение са атропиомери (напр. заместен биарил) и се считат за част от настоящото изобретение.

Много от съединенията съгласно настоящото изобретение са киселиннодействащи и те образуват сол с фармацевтично приемлив катион. Някои от съединенията съгласно настоящото изобретение са основнодействащи и образуват сол с фармацевтично приемлив анион. Всички тези ссоли са в обхвата на настояящото изобретение и те могат да бъдат получени по конвенционални методи. Например те могат да бъдат получени просто като контактуват с киселини и основни вещества, обикновено в стехеометрично отношение, както във водна, неводна или частично водна среда, както е подходящо. Солите се извличат чрез филтроване, утаяване с неразтворители, последвано от филтроване, чрез изпаряване на разтворителя или в случай на водни разтвори чрез лиофилизиране, както е подходящо.

Освен това, когато съединенията съгласно изобретението образуват хидрати или солвати, то те също са в обхвата на настоящото изобретение.

Полезността на комбинациите съгласно настоящото изобретение като медицински средства за лечение на болести, така както е детайлизирано тук за млекопитаещи (напр. хора) е показано чрез действието на съединенията съгласно изобретението при конвенционални опити in vitro и in vivo, описани по-долу. Тези опити предоставят средства за сравняване активността на съединенията съгласно настоящото изобретение с активността на други познати съединения. Резултатите от тези сравнения са полезни за определяне нивото на дозите на млекопитаещи, включително хора, за лечение на такива заболя вания.

102

Анализи на инхибитор на алдозо редуктаза

Активността на инхибитор на алдозо редуктазата може да се определи от количеството инхибитор на алдозо редуктаза, което е необходимо за снижаване сорбита в тъканта и така понижаване на тъканната фруктоза, съгласно следващите опити.

Мъжки плъхове Sprague-Dawley се заразяват с диабет чрез инжектиране на стрептозисин по 55 мг/кг i.v. при pH 4.5 в цитратен буфер. Те се хранят колкото желаят при контролирани условия на престояване (в помещение), температура и осветление. След 5 седмици като диабетици, плъховете се анестизират със свръх доза пентобарбитал, тогава лесно се отделят тъкани и се анализират за сорбит и фруктоза.

Нивата на сорбит се определят съгласно метода на Donald М. Eades et al., „Rapid Analysis of Sorbitol, Galactitol, mannitol and Myoinositol Mixtures From Biological Sources“, Journal of Chromatography, 490.1-8, (1989).

Фруктозатав тъкан на плъх се определя ензимно като се използва модификация на метода на Amewama (Methods in Enzymoldgv. 89:20-29,1982), при който ферицианида се заменя с резазурин,оцветител който е редуциран до високо флуоресцентен резоруфин. Количеството на резоруфин флуоресценция е в стехеометрично съотношение с количеството фруктоза, оксидирана чрез фруктозо дехидрогеназа. Опитът съдържа 0.1 мл екстрат от нерв неутрализиран 6% перхлорна киселина с краен обем 1.5 мл. Следва престой в продължение на 60 минути при постоянна стайна температура в затворен съд, флуоресцентната проба се определя във флуоресцентен спектрохотометър Perkin-Emler 650-40 при възбуждане=560 nm, излъчване =580 nm с прорези 5мм всеки един. Концентрациите на фруктоза се изчисляват чрез сравнение със серии познати образци фруктоза.

Анализи на инхибитор на гликоген фозфорилаза

По посочената по-долу методика могат да бъдат получени три различни пречистени изомери на гликоген фосфорилаза (GP), в които гликоген фосфорилазата е в активирано „а“ състояние (означена като гликоген фосфорилаза а, или съкратено GPa) и отнасяща се тук за гликоген фосфорилаза от човешки черен дроб (HLGPa), гликоген фосфорилаза от човешки мускул (HMGPa) и гликоген фосфорилаза от човешки мозък (HBGPa).

Извличане и ферментация

HLGP и HMGP cDNAs се извличат от плазмид рКК233-2 (Pharmacia Biotheh. Inc., Piscataway, New Jersey) в E.coli щам XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, СА). Щамът се инокулира в LB среда (съставена от 10 г триптон, 5 г екстракт от дрожди, 5 г NaCI и 1 мл NaOH на литър) плюс 100 мг/л ампицилин, 100 мг/л пиридоксин и 600 мг/л MnCI₂ и израства при 37°С до клетъчна плътност OD₅₅₀ =1.0 В този момент клетките се възбуждат с 1мМ изопропил-1-тио-р-0галактозид (IPTG). Три часа след възбуждането клетките се събират чрез центрофугиране и клетъчните пелети се държат замразени при -70°С колкото е необходимо за пречистването.

HBGP cDNA може да бъде извличен по няколко метода, например по метода описан от Crerar, et al. (J. Biol. Chem. 270:1374813756). Методът описан от Crerar, et al. (J. Biol. Chem. 270:1374813756) за извличане на HBGP се състои в следното: HBGP cDNA може да бъда извлечен от плазмид рТАСТАС в Е СоН щам 25А6. Щамът се инокулира в LB среда (съставена от 10 г триптон, 5 г естракт от дрожди, 5г NaCI и 1 мл 1N NaOH на литър) плюс 50 мг/л ампицилин и израства в продължение на една нощ, след това се ресуспендира в свежа LB среда плюс 50 мг/л ампицилин и се реинокулира в увеличен 40 пъти обем от LB среда съдържаща 250 μΜ изопропил-1-тио-р-0-галактозит (IPTG), 0.5 мМ пиридоксин и 3 мМ MgCI₂ и расте при 22°С в продължение на 48-50 часа. Тогава

104

клетките могат да бъдат събрани чрез центрофугиране и получените клетъчни пелети от центрофугирането се държат замразени при 70°С колкото е необходимо за пречистването.

HLGP cDNA са извлечени от плазмид pBlueBaclll (Invitrogen Corp., San Diego, СА), който се разделят с BaculoGold Linear Viral DNA(Pharmingen, San Diego, СА) в Sf9 клетки. Рекомбинираният вирус последователно се пречиства. За получаване на протеин клетките Sf9, увеличили ръста си в свободна от серум среда, се инфектират чрез многократно инжектиране 0.5 и на клетъчна плътност 2x10® клетки/мл. След израстване в продължение на 72 часа при 27°С клетките се центрофугират и добитите клетки се държат замразени при -70°С колкото е необходимо за пречистване. Purification of Glycigen Phosphorylase expressed in E coli.

Описаните по-горе E coli клетки се суспендират отново в 25 тМ β-глицерофосфат (pH 7.0) с 0.2 mM DTT, 1 тМ MgCI₂, плюс следващите инхибитори на протеаза:

0.7 мг/мл

Пепстатин А

0.5 мг/мл

Левкопептин

0.2 тМ

0.5 тМ фенилметилсулфонил флуорид (PMSF) и EDTA

разтворени чрез повторно третиране с 200мг/мл лизозим и 3 мг/мл DNAa3a, последвано от обработка с ултразвук 5 пъти по 1.5 минути в лед като се използва Ултразвуков клетъчен деструктор Branson Model 450 (Branson Sonic Power Co., Danbury CT). Тогава E coli клетките лизати се пречистват чрез цинтрофугиране при 35,000 хд в продължение на 1 час, последвано от филтроване през филтър 0.45 микрона. GP в разтворимата фракция на лизатите (изчислени че са по-малко от 1% от общия протеин) се пречистват чрез непрекъснато наблюдение на ензимната активност (както е описано в Gpa Activity Аззау раздела, по-долу) чрез серия хроматографски операции, дадени детайлно по-долу.

105

Хроматография на Имобилизиран метален афинитет (IMAC) Тази операция се основава на метода на Luong et al. (Luong et al. Journal of Chromatog raphy (1992) 564,77-84.). 500 мл от филтрованата разтворима фракция на клетки лизати (получени от приблизително 160-250 г от първоначално добитите клетки) се поставят в 130 мл колона на IMAC Chelating-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, New Jersy), която е заредена c 500 мл CuCI₂ и 25 mM β-глицерофосфат, 250 mM NaCI и 1mM имидазол и буфериране при pH 7. Колоната се промива с буфер докато А₂₈₀ се върне към основно. Тогава пробата се отмива от колоната със същия буфер, съдържащ 100тМ имидазол, за да се премахне връзката GP и другите протеинови връзки. Фракциите съдържащи GP активност обединяват (приблизително 600 мл) и след това се добавят етилендиаминотетраоцетна киселина (EDTA), DLдитиотриитол (DTT), фенилметилсулфонил флуорид (PMSF), левкопептин и пепстатин А, за да се получи концентрация съответно 0.3 mM, 0.2 тМ, 0.2 тМ, 0.5 мг/мл, и 0.7 мг/мл. Заредената GP се обезсолва над колона Sephadex G-35 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), буферирана c 25 mM буфер Tri-HCL (pH 7.3), 3mM DTT (Buffer А), за да се отстрани имидазола и се запазва в лед до втори етап на хроматография.

5’-АМР-Сефароза хроматография

Обезсолената обединена GP проба (приблизително бООмл) след това се смесва със 70 мл 5’-АМР Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, New Jersy), която се буферира c буфер A (виж по-горе). Сместа се разбърква внимателно в продължение на един час при 22°С, след това се поставя в колоната и се промива с буфер А, докато А₂₈₀ стане основно. GP и другите протеини се отмиват от колоната с 25 mM Tris-HCI, 0.2 тМ DTT и 10 тМ аденозин 5’-монофосфат (АМР) при pH 7.3 (буфер В). Фракциите съдържащи GP се обединяват за следващо идентифициране чрез определяне на

106 ензимната активност (описано по-долу) и чрез ясно визуализиране на М_г приблизително 97 kdal GP протеинова ивица с натриев додецил сулфат полиакриламид гел електрофореза (SDS-PAGE), последвано от оцветяване със сребро (2D-silver Stain If „Daiichi Kit, Daiichi Pure Chemicals Co., LTD, Tokyo, Japan) и след това обединяване. Обединената GP е подложена на диализа в 25 тМ β-глицерофосфат, 0.2 mM DTT, 0.3 тМ EDTA, 200 тМ NaCI, pH 7.0 буфер (Buffer С) и се

съхранява в лед до използване.

Преди да се използва GP ензим същият се превръща от неактивен вид, както е извлечен в Е соН щам XL-1 Blue (означаван Gpb) (Stragene Cloning Systems, La Jolla, California), в активен вид (означаван Gpa) по методика описана по-долу в раздел А Активиране HaGP.

Пречистване на гликоген фосфорилаза извлечена в клетки Sf9 Клетките Sf9 получени при центрофугиране, както е описано по-горе, се превръщат отново в суспензия в 24 тМ β-глицерофосфат (pH 7.0) с 0.2 mM DTT, 1 тМ MgCI₂ ,плюс следните протеаза инхибитори:

0.7 мг/мл Пепстатин А

0.5 мг/мл Левкопептин

0.2 тМ фенилметилсулфонил флуорид (PMSF) и

0.5 mM EDTA разтворени чрез повторна обработка с 3 мг/мл DNAa3a, последвано от обработка с ултразвук 3 пъти по 1 минута в лед като се използва Ултразвуков клетъчен деструктор Branson Model 450 (Branson Sonic Power Co., Danbury CT). Тогава Sf9 клетъчни лизати се пречистват чрез цинтрофугиране при 35,000 х g в продължение на един час, последвано от филтроване през филтър 0.45 микрона. GP в разтворимата фракция на лизатите (изчислени че са по-малко от 1.5% от общия протеин) се пречистват чрез контролиране на ензимната активност (както е описано в Определяне активността на

107

СяР_раздела по-долу) чрез серия хроматографски операции, дадени детайлно по-долу.

Хроматография на имобилизиран метален афинитет (IMAC) Хроматографията на имобилизиран метален афинитет се извършва съгласно описанието в горния раздел. Обединената обезсолена GP се съхранява в лед до следваща обработка. Активиране на GP

Преди провеждане на следващата хроматография, фракцията неактивиран ензим, както е извлечена в клетки SF9 (означена Gpb), се превръща в активна форма (означена Gpa) чрез следната методика, по-долу описана в Section (A) Activation of GP, Анион обменна хроматография

Като се следва активирането на IMAC пречистен Gpb до GPa чрез реакция с имобилизирана фосфорилаза киназа, обединените фракции Gpa се подлагат на диализа в срещу 25 тМ Tris-HCI, pH 7.5, съдържащ 0.5 тМ DTT, 0.2 тМ EDTA, 1.0 тМ фенилметилсулфонил флуорид (PMSF), 1.0 мг/мл левкопептин и 1.0 мг/мл пепстатин А. Тогава пробата се поставя в Анион обменна хроматографска колона monoQ (Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, New Jersey). Колоната се измива c буфер, докато А₂₈₀ се върне към основно. Тогава пробата се отмива от колоната с линеен градиент 0-0.25 М NaCI, за да се отстрани GP връзката и другите протеинови връзки. Фракциите съдържащи GP се отмиват с 0.1 до 0.2 М NaCI, както е описано, като чрез непрекъснато наблюдение се открива достигането от елюантът пик на абсорбиране на протеин при А_2в0. GP протеинът се идентифицира като се визуализира ясно протеинова ивица М_г приблизително 97 Kdal чрез електрофореза с натриев додецил сулфат полиакриламиден гел (SDS-PAGE), последвано от сребърно оцветяване (2D-silver Stain II „Daiichi Kit“, Daiichi Pure Chemicals Co., LTD.,Tokyo, Japan) и след това се обедининяват. Обединениян протеин GP се подлага на диализа в 25 mM N,N-bis[2-

108 хидроксиетил]-2-аменоетансулфонова киселина, 1.0 mM DTT, 0.5 тМ EDTA, 5 тМ NaCI, pH 6.8 буфер и се съхранява в лед до използването му.

Определяне ензимната активност на GP

А)Активиране на GP: Превръщане на GPb в GPa. Преди да се определи ензимната активност на GP, ензимът се превръща от неактивна форма както е извлечен в Е.соНщам XL-1 Blue (означаван Gpb)(Stragene Cloning Systems, La Jolla, California), в активна форма (означена Gpa) чрез фосфорилизиране на GP като се използва фосфорилаза киназа както следва. Фракцията неактивен ® ензим, както е извлечен в Sf9 клетки (означен Gpb), се превръща също в активна форма (означена Gpa) като се следва следната методика.

Взаимодействие на GP с имобилизирана Фосфорилаза киназа фосфорилаза киназа (Sigma Chemical Company, St. Luis, MO) ce имобилизира на Affi-Gei 10 (BioRad Corp., Melvile, NY) съгласно указанията на производителя. Накратко ензимът фосфорилаза киназа (10 мг) се инкубира с промити зрънца Affi-Gel (1мл) в 2.5 мл от 100mM HEPES и 80 тМ СаС1₂ при pH 7.4 в продължение на 4 часа при 4°С. Тогава зрънцата Affi-Gel се промиват веднъж със същия ф буфер преди блокирането с 50 mM HEPES и 1М глицин метилов естер при pH 8.0 в продължение на 1 час при стайна температура.

Блокиращият буфер се отстранява и се замества с 50mM HEPES (pH 7.4), 1 тМ β-меркаптоетанол и 0.2% NaN₃ за съхраняване. Преди да се използва за превръщане на Gpb в Gpa, зрънцата от имобилизирана Affi-Gel фосфорилаза киназа се буферират чрез промиване в буфер използван за постигане на киназа реакцията, състоящ се от 25 тМ β-глицерофосфат, 0,3 mM DTT и 0.3 тМ EDTA при pH 7.8 (буфер на киназа опит).

Частично пречистена неактивна Gpb, получена от горната 5’АМР- Sepharose хроматография (от Е coll) или сместта на Gpa и Gpb

109 получена по-горе от IMAC (от клетки Sf9), се разрежда 1:10 с буфер за изследване на киназа, след това смесен с гореспоменатия ензим фосфорилаза киназа, имобилизиран на зрънца на Affi-Gel. Добавя се NaATP до 5 тМ и MgCI₂ до 6 тМ. Получената смес се разбърква внимателно при 25°С в продължение на 30 до 60 минути. Пробата се отделя от зрънцата и процента на активиране на Gpb до Gpa се преценява чрез определяне активността (действието) на GP ензим в присъствие на и в отсъствие на 3.3. тМ АМР. Тогава процента на общата активност на GP ензим, дължаща се на активността на Gpa ензим (AMP-независим), се изчислява по следния начин:

HLGP активност - АМР % общо HLGPa=----------------------------------HLGP активност + АМР

По избор, превръщането на Gpb в Gpa може да бъда наблюдавано чрез изоелектрично фокусиране, основаващо се на изместване на електрофорезната подвижност, която се забелязва при превръщането на GPb в GPa. Пробите GP се анализират чрез изоелектрично фокусиране (IEF) като се използва Pharmacia PlastGel System (Pharmacia Biotech. Inc. Piscataway, New Jersey) като се използва предварително формован гел (pl range 4-6.5) и препоръчания от производителя метод. Тогава разтворените отново GPa и GPb ивици се показват ясно на гела чрез сребърно оцветяване (2D-silver Stain II „Daiichi Kit“, Daiichi Pure Chemicals Co., LTD., Tokyo, Japan). Идентифицирането на GPa и GPb се извършва чрез сравнение на образци от GP производен от Е co//и GPb, които се поставят успоредно на същите зрънра гел като експериментални проби.

В. Определяне активността на GPa

Описаните тук активности на съединенията инхибитори гликоген фосфорилаза съгласно настоящото изобретение по отношение болести/състояния лечение/превенция, могат да бъдат

110 непряко определени като се оцени влиянието на съединенията съгласно настоящото изобретение по отношение активността на активираната форма гликоген фосфорилаза (GPa) по един от двата метода: активността на гликоген фосфорилазата се измерва в права посока като се наблюдава получаването на глюкоза-1-фосфат от гликоген или чрез проследяяване на обратната реакция като се измерва синтеза на гликоген от глюкоза-1-фосфат чрез отделяне на неорганичен фосфат. Всички реакции могат да се проведат по три в електроден 96- позиционен микротитър и промяната на абсорбцията, дължаща се на образуване на продукт от реакцията, се измерва с дължина на вълната, описана подробно по-долу в MCC/340 MKII Elisa Reader (Lab Systems, Finland), свързан към Titertech Microplate Stacker (ION Biomedical Co., Huntsville, Alabama).

За измерване на активността на GPa ензим в пряка посока получаването на глюкоза-1-фосфат от гликоген се контролира чрез мултиензимен съчетан общ метод на Pesce et al. [ Pesce, M.A., Bodourian, S.H., Harris,R.C. и Nicholson, J.F. (1977) Clinical Chemisry 23,1711-1717], променен по следния начин: 1 до 10 мг Gpa, 10 части фосфоглюкомутаза и 15 части глюкоза-6-фосфат дехидрогеназа (Boehringer Mannheim Biochemicais, Indianapolis, IN) се разреждат до 1 мл в Буфер А (описан след това). Буфер А е с pH 7.2 и се състои от 50mM HERES, 100 тМ KCI, 2.5 тМ етиленгликолтетраоцетна киселина (EGTA), 2.5 mM MgCI₂, 3.5 тМ КН₂РО₄ и 0.5 тМ дитиотриитол. 20 рл от този материал се добавят към 80 рл Буфер А, съдържащ 0.47 мг/мл гликоген, 9.4 тМ глюкоза, 0.63 тМ оксидирана форма на никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADP⁺). Съединенията за изследване се добавят като 5 рл разтвор в 14% диметилсулфоксид (OMSO) преди добавянето на ензими. Базовата скорост на активност на Gpa ензима в отсъствие на инхибитори се определя чрез добавяне на 5 рл от 14% DMSO и напълно инхибираната скорост на активност на ензим Gpa е получена като се

Ill добавя 20 μΛ от 50 mM на субстаанцията с положителен контролен тест, кофеин. При стайна температура реакциата се последва от измерване на превръщането на оксидиран N A DP⁺ в редуциран NADP⁺ при 340nm.

За определяне активността на Gpa ензим в обратната посока, превръщането на глюкоза-1-фосфат в гликоген плюс неорганичен фосфат се измерва по главния метод описан от Engers et. al. [ Engers,

H.D., Shechosky, S. и Madsen, N.B. (1970) Can. J. Biochem. 48,746-754] изменен по следния начин: 1 до 100 pr GPa се разрежда до 100 мл в Буфер В (описан след това тук). Буфер В е с pH 7.2 и се състои от 50 mM HERES, 100 mM KCI, 2.5 mM EGTA, 2.5 mM MgCI₂ иО.5тМ дитиотриитол. 20 рл от този материал се добавят към 80 рл от Буфер В с 1.25 мг/мл гликоген, 9.4 mM глюкоза и 0.63 тМ глюкоза-1-фосфат. Съединенията за изследване се добавят като 5 мл разтвор в 14% DMSO преди добавянето на ензим. Базовата скорост на действието на GPa ензим в отсъствие на добавени инхибитори се определя като се добавят 5 мл от 14% DMSO и напълно инхибираната скорост на действие на GPa ензим се получава като се добави 20 рл от 50 mM кофеин. Сместа се държи при постоянна стайна температура в продължение на 1 час и неорганичният фосфат, отделен от глюкоза-1фосфат, се измерва като се използва общия метод на Lanzetta et al. [Lanzetta, P.A., Alvarez, L.J., Reinach, P.S и Candia, O.A. (1979) Anal Biochem. 100,95-97], променен по следния начин: 100 рл от 10 мг/мл амониев молибдат, 0.38 мг/мл малахитово зелено в 1N HCIce добавят към 100 мл от ензимната смес. След престояване 20 минути при постоянна стайна температура се измерва оптичната плътност (екстинцията) при 620 nm.

Горнияте опити проведени с поредица от концентрации на изследваното съединение дава възможност да се определи стойността 1С₅₀ (концентрация на изследваното съединение

112 необходима за достигане на 50% инхибиране) за инхибиране in vitro действието на GPa ензим посредством тестваното съединение. Определяне на показателите на резистентност към инсулин Комбинациите съгласно настоящото изобретение се адаптират лесно за клинично приложение като хипогликемични средства. Хипогликемичната активност на комбинациите съгласно настоящото изобретение се определя от количеството изследвано съединение, което намалява нивата на глюкоза по отношение на лекарствен разтвор без изследвано съединение в мъжка ob/ob мишка. Опитът позволява също да се определи приблизителната минимална ефективна доза (MED) за намаляване in vivo на концентрацията на плазмена глюкоза в такава мишка на тези изследвани съединения.

Тъй като концентрацията на глюкоза в кръвта е тясно свързана с развитието на диабетични смущения, тези съединения благодарение на хипогликемичното си действие предотвратяват, спират и/или водят до регресия на диабетичните смущения.

Мъжки ob/ob мишки C57BL/6J на възраст пет до осем седмици (получени от Jackson Laboratory, Bar harbor, ME) се Затварят по 5 бр. в клетка като се прилагат стандартни грижи за животно. След едноседмичен период на аклиматизиране животните се претеглят и преди третиране се взема от ретро-орбиталния им синус по 25 микролитра кръв. Пробата от кръв незабавно се разрежда 1:5 с разтвор, съдържащ 0.025% натриев хепарин и се съхранява в лед за метаболен анализ. Животните се разпределят на групи за третиране така, че всяка група да бъде с подобна средна стойност на концентрация на плазмена глюкоза. След като се определят групите, всеки ден в продължение на четири дни на животните се дава орално дневна доза лечебен разтвор, съдържащ едно от: 1) 0.25% тегл/об. метил целулоза във вода без регулиране на pH; или 2) 0.1% Pluronic® Р105 Bloc copolymer Surfactant (BASF Corporation, Parsippany, NJ) в 0.1% физиологичен разтвор без регулиране на pH. На петия ден

113 животните се претеглят отново и им се дават орални дози с изследваното съединение или само с течния компонент. Всички лекарства се дават в течен компонент, състоящ се от 1).0.25% тегл./об. метил целулоза във вода без регулиране на pH или 2) 10 % DMSO/O.1%. Pluronic® P105(BASF Corporation, Parsippany, NJ) в 0.1% физиологичен разтвор без регулиране на pH. Тогава след три часа се взема кръв от животните от ретро-орбиталния синус за определяне нивата на кръвния метаболит. Прясно взетите проби се центрофугират в продължение на две минути при 10,000 х g при стайна температура. Леката фракция се анилизират за глюкоза, например чрез Abbott VP™ (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX) и VP Super System® Autoanalyser (Abbott Laboratories, Irving, TX) или Abbott Spectrum CCX™ Autoanalyser (Aboott Laboratories, Irving, TX) като се използва А-Gent™ Glucose-UV Test reagent system (Aboott Laboratories, Irving, TX) (изменение на метода на Richterich and Dauwalder, Schweizerische Medizinische Wochenschrift, 101,860 (1971)) (метод хексокеназа) като се използва 100 мг/дл еталон. Тогава плазмената глюкоза се изчислява по уравнението: Плазмена глюкоза (мг/дл)=резултата на пробата х 8.14, в която 8.14 е показател на разреждане, пригоден за плазмен хаматокрит (приемаме, че хематокрита е 44%).

Животните, които поемат дози с течен компонент подържат по същество непроменени хипергликемични нива на глюкоза (напр. по-голямо или равно на 250 мг/дл), животните третирани с изследваните съединения с подходящи дози имат значително понижени стойности на глюкозата. Хипогликемичното действие на изследваните съединения се определя чрез статистически анализ (t-тест без съпостъвяне) на средната концентрация на плазмена глюкоза между групата с тествано съединение и групата третирана с течен компонент на 5-я ден. Горното изследване, проведено с поредица дози на изследваните съединения, дава възможност да се

114 определи приблизителната стойност на минималната ефективна доза (MED) за in vivo намалено количество на глюкоза в плазмата.

Съединенията съгласно настоящото изобретение се адаптират лесно за клинично приложение като средства за реверсия на хиперинсулинемия, средства за намаляване на триглицерид и хипохолестеролни средства. Тази активност може да бъде определена от количеството изследвано съединение, което намалява нивата на триглицериди или холестерол по отношение на контролата течен компонент без изследваното съединение в мъжка ob/ob мишка.

Тъй като концентрацията на холестерол в кръвта е тясно свързано с развитието на кардиоваскуларни, церебрално васкуларни или периферно васкуларни смущения, комбинациите съгласно настоящото изобретение, благодаарение на тяхното хипохолестеролно действие предотвратяват, спират и/или предизвикват регресия на атеросклероза.

Тъй като концентрацията на инсулин в кръвта е свързано с подпомагане растежа на васкуларната клетка и увеличаване реналното задържане на натрия (в допълнение към другите въздействия, напр. подпомагане използването на глюкоза) и тези функции са познати причини за хипертензия, комбинациите съгласно настоящото изобретение, благодарение на тяхното хипоинсулинно действие, предотвратяват, спират или предизвикват регресия на хипертензията.

Тъй като концентрацията на триглицериди и свободни мастни киселини в кръвта оказва влияние на общите нива на липиди в кръвта, комбинациите съгласно настоящото изобретение, благодарение на тяхното действие да намаляват триглицеридите и свободните мастни киселини, предотвратяват, спират и/или предизвикват регресия на хиперлипидемия.

115

Свободните мастни киселини оказват влияние на общото ниво на липиди в кръвта и независимо от това имат негативна връзка с чуствителността към инсулин в различни физиологични и паталогични състояния.

Мъжка ob/ob мишка C57BL/6J на възраст пет до осем седмици (получена от Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) се затварят по пет в клетка като се прилагат стандартните практически грижи и поемат стандартна за гризачи храна по желание. След едноседмичен период на аклиматизация, животните се претеглят и преди каквото и да е третиране им се взема по 20 микролитра кръв от ретро-орбиталния синус. Пробата от кръв незабавно се разрежда 1:5 с физиологичен разтвор, съдържащ 0.025% натриев хепарин и се държи в лед за определяне на плазмената глюкоза. Животните биват разпределени на групи за третиране така, че всяка група има сходна средна концентрация на плазмена глюкоза. Изследваното лекарство се дава чрез орално хранене с тръба по около 0.02% до 2.0% разтвор (тегловен/обемен-тегл./об.)) в: 1). 10% DMSO/0.1 Pluronic® Р105 Bloc copolymer Surfactant (BASF Corporation, Parsippany.NJ) в 0.1% физиологичен разтвор без регулиране на pH или 2) 0.25% тегл/об. метилцелулоза във вода без регулиране на pH. Еднократна дневна доза (s.i.d) или двукратната дневна доза (b.i.d) се поддържа от 1 до 15 дни. Контролната мишка получава 10% DMSO/0.1 Pluronic®P105 в 0.1% физиологичен разтвор без регулиране на pH или 0.25% тегл./об. метилцелулоза във вода без регулиране на pH.

Три часа след като е дадена последната доза животните са пожертвани чрез обезглавяване и кръвта от артерията се събира в 0.5 мл сепараторни тръбички за серум, които съдържат 3.6 мг смес на натриев флуорид и калиев оксалат в тегловно съотношение 1:1. Прясно взетите проби се центрофугират при стайна температура в продължение на 2 минути при 10,000 х g и горният плаващ слой на

116 серума се отстранява и разрежда 1:1 обем/обем с 1Т111/м1 разтвор на апротин в 0.1 физиологичен разтвор без регулиране на pH.

Пробите от разреден серум се съхраняват след това при -80°С до провеждане на анализи. Размразени, разредени проби от серум се анализират за определяне нивата на инсулин, триглицериди, свободни мастни киселини и холестерол. Концентрацията на инсулин в серума се определя като се използват Equate® RIA INSULIN комплекти (метод на двойно антитяло; както е описан подробно от производителя), които се продават от Binax, South Portland, ME. Вътрешният коефицент на отклонение е < 10%. Триглицеридите на серума се определят като се използва Abbott VP™ и VP Super System® Autoanalyser (Aboott Laboratories, Irving, TX) или Abbott Spectrum CCX™ (Aboott Laboratories, Irving, TX) като се използва система А-Gent™ Ttiglicerides Test reagent (Aboott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, TX) (метод на липазно-свързан ензим; модификация на метода на Sampson, et al., Clinical Chemisty 21,1983 (1975)). Нивата общия холестерол в серума се определят като се използва Abbott VP™ и VP Super System® Autoanalyser (Aboott Laboratories, Irving, TX) или Abbott Spectrum CCX™ (Aboott Laboratories, Irving, TX) и система А-Gent™ Cholesterol Test reagent system (метод нахолестеролно естераза-свързан ензим; модификация на метода на Allain, et al. Clinical Chemisty 20,470 (1974) като се използват еталони от 100 и 300 мг/мл. Концентрацията на свободниамастна киселина в серума се определя като се използва комплект апаратура на Amano International Enzyme Co., Inc. пригоден за използване с Abbott VP™ и VP Super System® Autoanalyser (Aboott Laboratories, Irving, TX) или Abbott Spectrum CCX™ (Aboott Laboratories, Irving, TX). Тогава нивата на инсулин, триглицериди, свободни мастни киселини и общ холестерол в серума се изчисляват посредсвом уравненията:

Серумен инсулин (мг/мл) = стойността за пробата х2

117

Серумни триглицериди(мг/мл)= стойността за пробата х2

Общо холестерол в серума (мг/мл)= стойността за пробата х2 Свободни мастни кисел, в серума (μΕς/1_)= стойността за пробата х2 в които 2 е коефицент на разреждане.

Животните на които са давани дози от течен компонент поддържат непроменени, високи нива на инсулин в серума (напр. 275 μυ/мр), триглицериди в серума (напр. 235 мг/дл), свободни мастни киселини в серума (напр. 1500 μΕκβ./мл) и общо хорестерол в серума (напр. 190 мг/мл), докато животните третирани със съединенията съгласно настоящото изобретение обикновено показват понижени нива на инсулин, триглицериди, свободни мастни киселини и общо хорестерол в серума. Серумното действие на съединенията съгласно настоящото изобретение да понижават инсулина, триглицеридите, свободните мастни киселини и общия холестерол се определя чрез статистически анализ (t-тест без съпоставяне) на средната концентрация на инсулин, триглицериди, свободни мастни киселини и общ холестерол на групата на групата третирана със съединение сравнени с групата третирана с течен компонент.

Действието за осигуряване на предпазване от исхемия (напр. увреждане на сърдечна тъкан) на съединенията съгласно настоящото изобретение може да бъде демонстрирано in vitro съгласно описанието от Butweil et al., Am. J. Physiol., 264, H1884H1889,1993 and Allard et al., Am. J. Physio. 1994,267, H66-H74. Опитите са проведени като изо обемно изолирани проби от сърце на плъх, по същество както е описано в горепосочената статия. Обикновени мъжки плъхове Sprague-Dawley, мъжки плъхове SpragueDawley лекувани от сърдечна хипертрофия с операция чрез свързване на аортата, акутни диабетни мъжки BB/W плъхове или не диабетни BB/W възрастни плъхове предвидени за контрол предвирително се третират с хепарин (1000 u, i.p.), последвано от пентобарбитал(65 мг/мл i.p.). След това се прави дълбока анестезия,

118 която се установява с липсата на рефлекс за хранене, сърцето се изрязва бързо и се поставя в леден физиологичен разтвор. Извършва се перфузия на сърцето обратно през аортата в продължение на 2 минути. Сърдечният пулс и вентрикуларното налягане на сърце на плъх се определят като се използва балон от латекс в лявата камера свързана чрез тръба за високо налягане към източник на налягане. В сърцето се впръсква перфузат разтвор съставен (в тМ) от NaC1118, KCI 4.7, CaC11.2, MgCI₂1.2, NaHCO₃ 25, глюкоза 11. Апарата за перфузия е температурно-регулиран добре с подгряващи бани, използвани за перфузата и за водния кожух около тръбопроводите за перфузата, за да се поддържа температура на сърцето 37°С. Окисляването на перфузата се обезпечава чрез педиатричен окислител с кухи тръбички (Capiax, Terumo Corp., Tokyo, Japan) непосредствено близо до сърцето. Сърцата са подложени на перфузен разтвор ±изпитвано съединение в продължение на 10 минути или повече, последвано от 20 минути глобална исхемия и 60 минути реперфузия при липса на изследваното съединение. Биенето на сърцето за контрола и на сърцата третирани със съединение се сравняват в периода след исхемията. Лявото вентрикуларно налягане на контролното и сърцата, третирани със съединението, се сравняват в периода след исхемията. В края на опита сърцата също се подложени на перфузия и оцветяване, за да се определи частта на инфарктната площ по отношение площта на риска (% IA/AAR), както е описано по-долу.

Терапевтичното действие на съединенията съгласно настоящото изобретение за предпазване от увреждане на сърдечната тъкан, иначе получаващо се от исхемичен инсулт, може също да бъде демонстрирано in vivo съгласно редовете представени от Liu etal., Circulation, Vol. 84, No 1, (July 1991), както специално е описано тук. Опитите in vivo изследват кардиопротекцията на изследваното съединение по отношение на контролна група, на

119 която се дава физиологичен разтвор. Както е известно от предшестващото състояние на техниката, видно е, че кратки периоди на исхемия на миокарда последвана от коронарна артериална перфузия предпазва сърцето от последваща тежка исхемия на миокарда (Murry eta!., Circulation 74:1124-1136,1986). Кардиопротекцията, изразена като намаляване на инфаркта на миокарда, може да бъде индуцирана фармакологично като се подава интравенозно агонисти на аденозин рецептор на цели, анестезирани зайци, изследвани като in sito опитни животни на предварително кондициониране на исхемия на миокарда (Liu et al. Circulation 84,350-356,1991). Опитът in vivo изследва дали съединенията могат фармакологично да възбудят кардиопротекция т.е намалена големина на инфаркта на миокарда, когато съединението се дава парентерално на невредими анестезирани зайци. Ефекивостта на съединенията съгласно настоящото изобретение може да бъде сравнена с предварително кондициониране на исхемия като се използва агонист А1 аденозин, №-1-(фенил-2А-изопропил) аденозин (PIA), които са сочени като фарамкологично индуциращи кардиопротекция на невредими анестезирани зайци, изследвани in sito (Liu et al., (Liu et al. Circulation 84,350-356,1991). Точната методика е описана по-долу. Хирургия: Новозеландски бели мъжки зайци (3-4 кг) се анестезират с натриев пентобарбитал (30 мг/кг, i.v.). Прави се трахеотомия чрез коремен срез по средната линия и зайците се вентилират със 100% кислород като се използва нагнетателен вентилатор. Поставят се катетри в лявата юголарна вена За подаване на лекарството и в лявата сънна артерия за измерване налягането на кръвта. Тогава сърцето се показва през лявата част на гръдния кош и тогава се поставя примка (00 коприна) около издаденото разклонение на лявата коронарна артерия. Исхемия се причинява като се издърпва примката опъната и като се затяга на място. Освобождаването на

120 примката дава възможност в засегнатата площ да бъде направена реперфузия. Исхемията на миокарда е видна от цианозата в дадено място; реперфузията е видна от реактивиранатахиперемия. Протокол: Когато налягането и ритъма на сърцето на плъх се стабилизира в продължение поне на 30 минути, започва опита. Исхемично предварително кондициониране се индуцира чрез двукратно притискане на коронарната артерия в продължение на 5 минути, последвано от реперфузия в продължение на 10 минути. Фармакологично предварително кондициониране се индуцира чрез двукратно впръскване на изследваното съединение например около 5 минути и се оставя така 10 минути преди да се извършва допълнителна интервенция или като се прелива аденозин агонист, ΡΙΑ (0.25 мг/кг). След исхемично предварително кондициониране, фармакологично предварително кондициониране или без кондициониране (некондициониран, контрол с течен компонент), артерията се запушва в продължение на 30 минути и се извършва реперфузия в продължение на два часа, за да се причини инфаркт на миокарда. Изследваното съединение и ΡΙΑ се разтварят в ъв физиологичен разтвор или друга подходяща течност и се прилагат съответно по 1 до 5 мг/кг.

Оцветяване (Liu et al. Citculation 84:350-356, 1991): В края на втория час след проведената реперфузия сърцата се отстраняват бързо, окачват се на апаратурата Langendorff и в продължение на една минута се запълват с нормален физиологичен разтвор като са подгрети до температурата на тялото (38°С). Тогава коприненият конец, използван като примка се завързва здраво, за да запуши отново артерията и 0.5% суспензия от флуоросцентни частички (1-10 микрона) Duke Scientific Corp. (Palo Alto, СА) се вкарва с перфузата, за да оцвети всичко от миокарда с изключение на рисковата площ (неоцветената камера). Тогава сърцата се замразяват бързо и се съхраняват в продължение на една нощ при -20°С. На следващия ден

121 сърцата се нарязват на 2 мм резени и се оцветяват с 1% трифенил тетразол хлорид (ТТС). Тъй като ТТС реагира с живата тъкан, това оцветяване разграничава живата тъкан (червено оцветена) от мъртвата (неоцветена инфарктна тъкан). Инфарктната площ (неоцветена) и рисковата площ (без флуоресцентни частички) се изчисляват за всеки резен от лявата камера като се използва предварително калиброван анализатор по образ. За стадартизиране на исхемичните увреждания съобразно различията на рисковите площи между сърцата, данните се изразяват като съотношение на инфарктната площ към площта на риск (% IA/AAR). Всички данни са изразени като Средно ±SEM и се сравняват статистически като се използва единичния фактор ANOVA или t-теста без съпоставяне. Значимостта се счита за р<0.05.

Изобретението може да бъде изследвано за полезността му да намалява или предотвратява исхемични увреждания на не-сърдечни тъкани, например мозък или черен дроб, като се използват методиките дадени в научната литература. Съединенията съгласно настоящото изобретение могат да бъдат прилагани по предпочитан начин и течен компонент и при предпочитано време на прилагане, както преди исхемичната проява, по време на изхемичната проява, след исхемичната проява (периода на реперфузия- ако е включена) или по време на всеки от долупосочените опитни етапи.

Полезността на изобретението За намаляване на исхемичните увреждания на мозъка може да бъде показана например при млекопитаещи като се използва метода на Park et al. (Ann. Neurol. 1988; 24:543-551). Накратко, съгласно методиката на Park et al., възрастни мъжки плъхове Sprague Dawley се анестизират отначало с 2% халотан и след това чрез механично вентилиране със смес азотен окис-кислород (70%:30%), съдържаща 1% халотан. Тогава се прави трахеотомия. Подаваното количество от вентилатора се регулира да поддържа налягането на азотен окис в артерията

MH··

122 сърцата се нарязват на 2 мм резени и се оцветяват с 1% трифенил тетразол хлорид (ТТС). Тъй като ТТС реагира с живата тъкан, това оцветяване разграничава живата тъкан (червено оцветена) от мъртвата (неоцветена инфарктна тъкан). Инфарктната площ (неоцветена) и рисковата площ (без флуоресцентни частички) се изчисляват за всеки резен от лявата камера като се използва предварително калиброван анализатор по образ. За стадартизиране на исхемичните увреждания съобразно различията на рисковите площи между сърцата, данните се изразяват като съотношение на инфарктната площ към площта на риск (% IA/AAR). Всички данни са изразени като Средно ±SEM и се сравняват статистически като се използва единичния фактор ANOVA или t-теста без съпоставяне. Значимостта се счита за р<0.05.

Полезността на изобретението за намаляване на исхемичните увреждания на мозъка може да бъде показана например при млекопитаещи като се използва метода на Park et al. (Ann. Neurol. 1988; 24: 543-551). Накратко, съгласно методиката на Park et al., възрастни мъжки плъхове Sprague Dawley се анестизират отначало с 2% халотан и след това чрез механично вентилиране със смес азотен окис-кислород (70%: 30%), съдържаща 1% халотан. Тогава се прави трахеотомия. Подаваното количество от вентилатора се регулира да поддържа налягането на азотен окис в артерията

123 приблизително на 35 мм Hg и адекватно артериално насищане с кислород (РаО₂>90 мм Hg). Температурата на тялото може да бъде непрекъснато наблюдавана с ректален термометър и ако е необходимо животните могат да бъдат поддържани с нормална температура чрез външно затопляне. След това животните се подлагат на субтемпорална краниектомия така, че главната артерия от артарията на лявото полукълбо (МСА) да бъда изложена под оперативния микроскоп, тогава артерията се запушва чрез микробиполярна коагулация, за да предизвика голямо исхемично увреждане в мозъчната кора и основната ганглиа. 3 часа след МСА запушване, плъховете са дълбоко анестизирани с 2% халотан и се извършва торакотомия, за да се влее хепаринизиран физиологичен разтвор в лявата камера. Елюентът се събира през разрез на лявото предверие (атриум). Отмиването с физиологичен разтвор се последва от приблизително 200 мл 40% формалдехид, ледена оцетна киселина и абсолютен разтвор на метанол (FAM; 1:1:8,об/об/об), тогава животните се обезглавяват и сърцето се държи във фиксатор в продъължение на 24 часа. Тогава мозъкът се изважда, прави се дисекция, обработва се, опакова се в парафин и се секционира (приблизително 100 сечения на един мозък). Тогава сеченията се оцветяват с хематоксилин-еозин или с комбинация от крезил виолетово и Luxol fast blue и се изследва с лъчев микроскоп, за да се определи размера на исхемичното увреждане като се използва анализатор с образ (например Quantimet 720). Исхемичните обеми или площи се изразяват в абсолютни единици (мм³, и мм²) и като процент от общата изследвана част. Ефктивността на съединенията и методите съгласно настоящото изобретение да намаляват исхемичните увреждания на мозъка, причинени от МСА запушване, е изразена на база намаляването на площта или обема на относителните или абсолютни исхимични увреждания на мозъчните

124 разрези на плъховете от групата на третираните, сравнено с мозъчните разрези на плъхове от групата на псевдо-третираните. Други методи, които могат да се използват по избор, за да се покаже полезността на настоящото изобретение за намаляване исхемичните увреждания на мозъка, включват тези методи, които са описани от Nakayama, et al. in Neurology 1988; 38:1667-1673, Memezawa, et al. in Stroke 1992; 23: 552-559, Folbergrova, et al. in Proc. NatLAcad. Sci. 1995; 92:5057-5059. and Gotti, et al. in Brain Res. 1990; 522: 290-307.

Полезността на съединенията и методите съгласно настоящото изобретение за намаляване исхемичното увреждане на черния дроб може да бъда показано например при млекопитаещи като се използва метода на Уокоуата, et al. (Am. J. Physiol. 1990; 258: G564-G570). Накратко при методиката на Уокоуата, et al, възрастни мъжки плъхове Sprague Dawley държани на режим на хранене се анестизират с натриев петобарбитал (40 мг/кг i.p.), след това животните се трахеотомизират и механично се вентилират със стаен въздух. Черният дроб се отстранява и се поставя в условията на стайна среда и поддържана постояна температура (37°С), тогава се прави перфузия през порталната вена при постоянно налягане 15 см воден стълб с модифициран Krebs-Henseleit буфер без хемоглобин (в тМ: 118 NaCI, 4.7 KCI, 27 NaHCO₃), 2.5 CaCI, 1.2 MgSO₄,1.2 KH₂PO₄, 0.05 EDTA и 11 mM глюкоза, плюс 300U хепарин. pH на перфузата се поддържа 7.4 като буфера се обгазява с 95% О₂ - 5% СО₂. Всеки черен дроб се перфузира със скорост на потока 20 мл/мин при еднократен цикъл в продължение на 30 мин., отмиване и период на равновесие (предисхемичен период), последвано от 2 часа период на глобална исхемия и след това 2 часа на реперфузия при условия идентични на предисхемичния период. Аликватна част (20 мл) перхузат се събира през предисхемичния период, непосредствено след исхемичия период на запушване и на всеки 30 ми. в

125 продължение на 2 часа по време на реперфузия. Пробите перфузат се анализират за наличие на хепатоклетъчни ензими като например аспартат амино-трансфераза (AST), аланин амино-трансфераза (ALT) и лактат дехидрогеназа (LDH), което се счита за количествено изразяване на степента на увреждане на исхемичната тъкан а черния дроб по време на процедурата. Активността на AST, ALT и LDT в перфузата може да се определи по няколко метода, например чрез рефлектометричен метод като се използва автоматичен анализатор Kodak Ektachem 500, съобщен от Nakano et al. (Hepatology 1955; 22: 539-545). Действието на съставите и методите съгласно настоящото изобретение за намаляване на исхемичните увреждания на черния дроб, предизвикани от запушване е посочено, че се базира на намаляване отделянето на хепатоклетъчни ензими непосредствено след периода на запушване и/или в периода на постисхемична-реперфузия в перфузираните черни дробове от плъховете от групата подложена на третиране в сравнение с реперфузираните черни дробове от плъхове от контролната група на псевдо-третиране.

Други методи и характеристики, които по избор могат да бъдат използвани за показване полезността на съставите и методите съгласно настоящото изобретение за намаляване на исхемичното увреждане на черния дроб включват тези методи, описани от Nakano etal. (Hepatology 1955; 22: 539-545).

Прилагането на съединения съгласно настоящото изобретение може да става посредством всеки метод, който доставя съединение съгласно настоящото изобретение с предпочитане на желаната тъкан (напр.тъкани на черния дроб и/или сърцето). Тези методи включват орални начини, в края на дванадесетопръстника и др. Обикновено съединенията съгласно настоящото изобретение се дават единично (напр. веднъж на ден) или на множество дози.

126

Комбинациите съгласно настоящото изобретение са полезни за намаляване или минимизиране на увреждания причинени пряко на някоя тъкан, която може да е чуствителна на исхемично/реперфузно увреждане, (напр. сърце, мозък, бял дроб, бъбрек, черен дроб, черво, скелетен мускул, ретина) в резултат на исхемичен случай (напр. ихфаркт на миокарда). Следователно активните съединения се използват полезно профилактично за предотвратяване т.е. (очаквано или профилактично) да притъпи или да възспре увреждане на тъкан (напр. миокардна тъкан) при пациенти, които са пред риск от исхемия (напр. исхемия на миокарда).

Обикновено съединенията съгласно настоящото изобретение се дават орално, но може да се използва и парентерално даване (напр. интравенозно, мускулно, подкожно или в гръбначния мозък), например когато оралното даване е неподходящо за дадена цел или когато пациентът не е в състояние да поеме лекарството. Локалното подаване също може да се посочи, например когато пациентът страда от стомашо-чревни разстройства или когато съгласно очакванията на лекаря е най-добре да се приложи по повърхността

на определената тъкан или орган.

Двете отделни съединения съгласно настоящото изобретение могат да бъдат давани съвместно едновременно или последователно във всяка последователност или като единичен фармацевтичен състав, включващ инхибитор на алдозо редуктаза както е описано по-горе или инхибитор на гликоген фосфорилаза, както е описано погоре във фармацевтимо приемлив носител.

Във всеки един случай, разбира се, количеството и времето на подаване на съединенията ще зависи от лекувания субект, от сериозността на бедствието, от начина на даване, от преценката на лекуващия лекар. Така, тъй като пациентите се различават един от друг, показаните по-долу дози са само указателни и лекарят може определя дозата на съединенията ,за до постигне лечението (напр.

127 намаляване активността на глюкозата, количеството инсулин), което лекарят счита като подходящо за пациена. Съобразно желаната степент на лечение, лекарят може да се съобразява с различни фактори като възрастта на пациента, наличието на предишни заболявания, както и наличните към момента на други заболавания (напр. кардиоваскуларна болест).

Така например, при един начин на даване на съединение съгласно настоящото изобретение може да бъде приложено точно преди сърдечна хирургична операция (напр. в последните 24 часа до операцията) когато има риск от исхемия на миокарда. При алтернативен примерен начин, съедиенията могат да бъдат дадени след хирургичната операция на сърцето (например 24 часа след операцията), когато има риск за исхемия на миокарда. Съединенията съгласно изобретението могат за бъдат давани по хроничен дневен режим.

Обикновено определено количество от съединението съгласно изобретението се използва, така че да бъде достатъчно да се постигне подходящ ефект на чуствителност към инсулин.

Алтернативно положение, количество на комбинация съгласно настоящото изобретение се използва така, че да е достатъчно за постигане на нормално биологично действие на инсулин при „нормална концентрация“, което ще стане видно от поддържане на еугликимия, нормална гликемия и нормална липидемия (напр. триглицериди, холестерол, свободни мастни киселини) в допълнение към нармално налягане и нормален глюкозен толеранс.

Използва се определено количество от комбинацията, което е ефективно за предпазване от исхемия.

Определено количество инхибитор на алдозо редуктаза съгласно изобретението се използва ефективно за действието на изобретението например като намаляване активността на

128 триглицеридите и холестерола и реверсия нахиперинсулинемия. Обикновено ефективна доза на инхибитори на алдозо редуктаза съгласно изобретението е в интервала от около 0.1 мг/кг/дневно до 100 мг/кг/дневно в една или разделени дози, за предпочитане 0.1 мг/кг/дневно до 20 мг/кг/дневно на единична или разделени дози.

Изобщо ефективната доза за въздействие на настоящото изобретение, например действието на понижаване на глюкозата в кръвта, триглицериди, свободи мастни киселии и холестерол, както и реверсивното хиперинсулинемично действие на съединение инхибитор на гликоген фосфорилаза, е дозата в интервала от 0.005 W до 50 мг/кг/дневно, за предпочитане 0.01 до 25 мг/кг/дневно и особено за предпочитане 0.1 до 15 мг/кг/дневно.

Съединенията съгласно настоящото изобретение обикновено се дават под формата на фармацевтични състави, съдържащи поне едно от съединенията съгласно настоящото изобретение заедно с фармацевтично приемлив течен компонент или разредител. Така съединенията съгласно настоящото изобретение могат да се дават по отделно или заедно за всяка една традиционна орална, парентерална, ректална или трансдермална доза.

При орално даване фармакологичният състав може да има ф формата на разтвор, суспензия, таблетки, хапчета, капсули, прахове и др. подообни. Таблетките, съдържащи различни инертни пълнители | като натриев цитрат, калциев карбонат и калциев фосфат, се

I

I използват заедно с различнии средства за дезинтегриране като

I

I нишесте и за предпочитане нишесте от патато или тапиока и някои

I силиктни комплекси, заедно с свързващи средства като ! пиливинилпиролидон, захароза, желатин и акация. Освен това за | целите на таблетиране често са много полезни смазващи средства

I като магнезиев стеарат, натриев лаурил сулфат и талк. Твърди j състави от подобен тип се използват също като пълнители при меки и j твърдо-запълнени желатинови капсули; предпочитаните материал в

|) ί|

129 тази връзка също включват лактоза и млечна захар, както и високомолекулярни полиетилен гликоли. Когато за орално поемане се приготвят водни суспензии или сиропи, съединенията съгласно настоящото изобретение могат да се комбинират с различни подслаждащи средства, оцветяващи средства, емулгиращи средства и/или суспендиращи средства, както и разредители като вода, етанол, пропилен гликол, глицерин и различни подобни комбинации от тях.

За целите на парентерално прилагате могат да се използват разтвори в масло от сусам, масло от фъстъци или воден пропилен гликол, както и стерилни водни разтвори на съответни водоразтворими соли. Такива водни разтвори могат да бъдат подходящо буферирани ако е необходимо, и течни разредители, които първо се превръщат в изотонни с достатъчно физиологичен разтвор или глюкоза. Тези разтвори са особено подходящи за целите на интравенозно, мускулно, подкожо и интраперитонеално инжектиране. В тази връзка, използваната стерилна водна среда винаги се получава по стандартни начини, които са добре познати на специалистите от тази бласт.

За целите на трансдермално (например локално) приложение се приготвят, стерилен разредител, водни или частично водни разтвори (обиковено с концентрация около 0.1% до 5%), които иначе приличат на посоченните по-горе парентерални разтвори.

Методи за приготвяне на различни състави с известно количество активен ингредиент са познати, или ще станат видни в светлината на разкритото тук за тези, които са специалисти в тази област. Като премерни методи за приготвяне а фармацевтични състави виж Remington’s Pharmaceutical Sciences. Маси Publiching Company, Easter, Pa., 115th Edition (1975).

Фармацевтичните състави съгласно настоящото изобретение могат да съдържат 0.1% -95% съединение(я) съгласно настоящото

130 изобретение, за предпочитане 1%-70%. Във всеки случай, съединението или формата за приложение ще съдържат съединение(я) съгласно изобретението в количество ефективно за излекуване на болест/състояние на лекуваното лице.

Тъй като настоящото изобретение има аспект, който се отнася до лечение например на състояние на резистентност към инсулин като се третира с комбинация от активни ингериенти, които могат да бъдат давани по отделно, изобретението се отнася също до комбиниране на отделни фармацевтични състави като комплект. Комплектът съдържа два отделни фармацевтични състава: инхибитор на алдозо редуктаза и ихибитор на гликоген фосфорилаза, както са описани по-горе. Комплектът съдържа опаковка, съдържаща отделните състави, такава като градуирана бутилка, градуиран опаковка от фолио. Обикновео комплектът съдържа указания за приложение на отделните компоненти. Комплектът е особено удобен, когато отделите компоенти се прилагат за предпочитане по различни начини на дозиране (напр. орално и паретерално), прилагат се на различни иннтервали на дозата, или когато титруването на отделите компоненти е поискано от лекуващия лекар.

Пример за такъв комплект е така нареченият блистер пакет. Блистер пакетите са добре позннати в индустрията за пакетиране и се използват широко за пакетиране на фармацевтични единични форми на дози (таблетки, капсули, и др. подобни). Блистер пакетите обикновено се състоят от листове от относително твърд материал, покрит със слой за предпочитане от прозрачен пластмасов материал. При процеса на пакетиране в пластичното фолио се образува вдлъбнатини. Вдлъбнатините имат размера и формата на таблетки или капсули за опаковане. След това таблетките или капсулите се поставят във вдлъбнатините и листовете от отоситело твърд материал се залепват към пласмасовото фолио откъм тази страна на фолиото, която е обратна на посоката в която са

132 течно-кристално средство за прочитане на глас или напомнящ аудисигнал, който например прочита датата, на която е била взета последната дневна доза и/или напомня кога трябва да бъде взета следващата доза.

Съединенията съгласно настоящото изобретение могат самостоятелно или в комбинация между всяко от тях или други съединения обикновено ще бъдат давани в подходяща форма за приложение. Следните примерни форми за приложение са само илюстриращи и не ограничават обхвата на настоящото изобретение.

В следващите по-долу форми за приложение „активен ингредиент“ означава съединение (я) съгласно настоящото изобретение, а това може да се отнася до ихибитор на алдозо редуктаза, инхибитор на гликоген фосфорилаза или комбинация от двете.

Форма за приложение 1: Желатинови капсули

Желатиновите капсули се получават като се използва следното:

Ингредиент	Количество (мг/капсула)
АктИг вен ингредиент	0.25-100
Нишесте NF	0-650
Течлив прах от нишесте	0-50
Силиконов флуид 350 сантистокса	0-15
форми за приложение във вид на таблетки се приготвят като се
използват следните ингредиенти:
Форма за приложение 2: таблетки
Ингредиент	Количество мг/таблетка
Активен ингредиент	0.25-100
Целулоза, микрокристална	200-650

133

Силиконов диоксид, опушен 60-650

Стеаринова киселина 5-15

Компонентите се смесват и пресоват, за да се образуват таблетки.

По избор, таблетки, всяка съдържаща 0.25-100 мг активни ингредиенти се приготвят по следния начин:

Форма на приложение 3: таблетки

Ингредиент	Количество мг/таблетка
Активен ингредиент	0.25-100
Нишесте	45
Целулоза, микрокристална	35
Поливинилпиролидон (10% разтвор във	вода) 4
Натриева карбоксиметил целулоза	4.5
Магнезиев стеарат	0.5
Талк	1

Активните ингредиенти, нишестето и целулозата се пресяват през сито N_o 45 меш US и се смесват старателно. Разтворът на поливинилпиролидон се смесва с получените прахове и тогава сместа преминава през сито N_o 14 меш US. Гранулиите получени по този начин се сушат при 50-60°С и преминават през сито N_o18 меш. Натриевоа карбоксиметил целулоза, нишесте, магнезиевият стеарат и талк предварително минават през сито N_o60 и тогава се добавят към гранулите и след смесване се пресоват на машина за таблетиране и се получават таблетки.

Суспензии, всяка съдържаща 0.25-100 мг активен ингериент на доза от 5 мл могат да бъдат приготвени по следния начин:

133

Силиконов диоксид, опушен 60-650

Стеаринова киселина 5-15

Форма на приложение 3: таблетки

134

Форма на приложение 4; суспензии

ингредиент	количество (мг/5мл)
Активени ингредиент Na карбоксиметил целулоза Сироп Разтвор на бензоена киселина Ароматизатор Багрило Пречистена вода до	0.25-100 мг 50 мг 1.25 г 0.10 мл по желание, по желание. 5мл

Активните ингердиенти преминават през сито N_O45 меш US и се смесват с Na карбоксилметил целулоза и сироп и образуват гладка паста. Разтвор на бензоената киселина, ароматизаторът и оцветителят се разреждат с определено количество вода и се добавят с разбъркване. Тогава се добавя достатъчно вода до постигане на желания обем.

Приготвя се аерозолен разтвор, съдържащ следните ингредиенти:

Форма за приложение 5: аерозол

Ингредиент количество (% тегл.)

Активен ингредиент Етанол Пропелант 22 (хлородихлорометан)

0.25 25.75 70

Активният ингредиент се смесва с етанол и към сместа се добавя към част от пропелант 22, охлажда се до 30°С и се пренася в пълнещо уствойство. Тогава необходимите количества се подават в кутия от неръждаема стомана и се разреждат с оставащият

135 пропелант. Тогава към кутията се поставят затварящи приспособления.

Супозитории се приготвят по следния начин:

Форма за приложение 6: супозитории

Ингредиент	Количество (мг/супоз.)
Активен ингредиент	250
Наситени мастни кис. глицериди	2,000

Активният ингредиент преминава през сито N_o 60 меш US и се суспендира в глицериди на наситени мастни кисели, които предварително се стапят като се използва минималната необходима топлина. Тогава сместа се излива във форма за супозитор с номинален капацитет 2 г и се оставя да се охлади.

Интравенозна форма за приложение се приготвя по следния начин:

форма за приложение 7: интравенозен разтвор

Ингредиент	количество
Активен ингредиент	20 мг
Изотонен физиологогич. разтвор	1,000 мл

Разтворът от горните ингредиенти са прилага интервенозно на пациента с дебит (скорост) 1 мл на минута

Горният активен ингредиент може също да бъде комбинация от вещества.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1 .Фармацевтичен състав съдържащ терапевтично активно количество от:

a. инхибитор на алдозо редуктаза;

b. инхибитор на гликоген фосфорилаза; и

c. фармацевтичен носител.
2. фармацевтичен състав съгласно претенция 1, в който инхибиторът на алдозо редуктаза е 1-фталазиноцетна киселина 3,4дихидро-4-оксо-3-[[5-флуорометил)-2-бензотиазолил]метил]- или тяхна фармацевтично приемлива сол.
3. фармацевтичен състав съгласно претенция 2, в който инхибиторът на гликоген фосфорилаза е

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3iM-(2R)хидрокси-3-((33)-хидроксипиролидин-1-ил)-3-оксопропил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бензил-3((38,43)-дихидроксипиролидин-1-ил)-(2П)-хидрокси-3-оксопропил]амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnдиметилкарбамоил-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnметокси -метил-карбамоил)-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcn[ (2-хидрокси-етил) -метил-карбамоил]-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (18)-бензил-2-(3хидроксиимино-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(cis-3,4дихидрокси-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

137

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-((33,45)дихидрокси -пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-3-((cis)дихидроксипиролидин-1-ил)-(2Р)-хидрокси-3-оксопропил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-2-(cis-

3,4- дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(1,1-диоксотиазолидин-3-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-(4-флуоробензил)-2-(4-хидрокси-пиперидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-2-((3RS)хидрокси-пиперидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-оксо-2-((1 RS)оксо-тиазолидин-3-ил)-етил]-амид; или

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бензил-2-(3хидрокси-азетидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид.
4. фармацевтичен състав съгласно претенция 3, в който количеството инхибитор на алдозо редуктаза е от около 0.1 мг/кг до около 20 мг/кг.
5. фармацевтичен състав съгласно претенция 4, в който количеството инхибитор на гликоген фосфорилаза е от около 0.1 мг/кг до около 15 мг/кг.
6. Метод за лечение на млекопитаещо, който е в състояние на резистентност към инсулин, характеризиращ се с това,че на млекопитаещото се дава терапевтично активно количество от

a. Инхибитор на алдозо редуктаза; и

b. инхибитор на гликоген фосфорилаза.
7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че състоянието на резистентност към инсулин е диабети, хиперинсулинемия, увреден толеранс към глюкоза, хипергликемия и/или хиперлипидема,, диабет тип II, изменен състав на тялото,

138 намаляване масата на тялото от отслабване, затлъстяване, хипертензия, дислипидемия, атеросклероза, исхемия на тъканта, кардиоваскуларни смущения, затлъстяване, синдром X, бременност, състояние на инфекция, уремия, хиперадрогенизъм, хиперкортизолемия или други състояния на излишък на адренокортикален ензим, акромегалия, излишък на хормона на растежа или полициститни увреждания на яйчниците.
8. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това,че състоянието на резистентност е диабет.
9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че инхибиторът на алдозо редуктаза е 1-фталазиноцетна киселина,

3,4-дихидро-4-оксо-3-{[ 5-трифлуорометил)-2-бензотиазолил] метил]или фармацевтично приемлива тяхна сол.
10. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това че инхибиторът на гликоген фосфорилаза е

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-(2R)хидрокси-3-((Зв)-хидроксипиролидин-1-ил)-3-оксопропил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бензил-3((33,43)-дихидроксипиролидин-1 -ил)-(2Р)-хидрокси-3-оксопропил] амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnдиметилкарбамоил-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnметокси -метил-карбамоил)-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcn[ (2-хидрокси-етил) -метил-карбамоил]-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бензил-2-(3хидроксиимино-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(cis-3,4дихидрокси-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

139

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-((3S,4S)дихидрокси-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3kv\-2-(cis)-

3,4- дихидрокси-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]- амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ 2-(1,1 -диоксотиазолидин-3-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3iM-3-(cis)дихидрокси-пиролидин-1-ил)-(2В)-хидрокси-3- оксопропил]- амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-(4-флуоробензил)-2-(4-хидрокси-пиперидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-2-((3RS)хидрокси-пиперидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-оксо-2-((1 RS)оксо-тиазолидин-3-ил)-етил]-амид; или

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бенЗил-2-(3хидрокси-азетидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид.
11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това,че количеството инхибитор на алдозо редуктоза е около 0.1 мг/кг до около 20 мг/кг и количество инхибир на гликоген фосфорилаза е от около 0.1 мг/кг до около 15 мг/кг.
12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че млекопитаещото е мъж или жена.
13. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че състоянието на резистентност към инсулин е затлъстяване.
14. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че състоянието на резистентност към инсулин е полицисти тно заболяване на яйчниците.
15. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че състоянието на резистентност към инсулин е синдром X.
16. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че състоянието на резистентност към инсулин е хипертензия.

140
17. Комплект съдържащ:

a. терапевтично ефективно количество инхибитор на алдозо редуктаза и фармацевтично приемлив носител в първа форма на единична доза;

b. терапевтично ефективно количество инхибитор на гликоген фосфорилаза и фармацевтично приемлив носител във втора форма на единична доза;

c. опаковъчно средство за поемане на споменатите първа и втора форми на доза.
18. Комплект съгласно претенция 17, в който инхибиторът алдозо редуктаза е 1-фталазиноцетна киселина, 3,4-дихидро-4-оксо3-[[5-трифлуорометил)-2-бензотиазолиил]метил- или фармацевтично приемлива тяхна сол.
19. Комплект съгласно претенция 18, при който инхибиторът на гликоген фосфорилаза е

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-(2R)хидрокси-3-((38)-хидроксипиролидин-1-ил)-3-оксопропил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (18)-бензил-3((38,48)-дихидроксипиролидин-1 -ил)-(2Р)-хидрокси-3-оксопропил] амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnдиметилкарбамоил-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnметокси -метил-карбамоил)-метил)-2-фенил-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcn[ (2-хидрокси-етил) -метил-карбамоил]-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (18)-бензил-2-(3хидроксиимино-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(cis-3,4дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

141

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна KnceAHHa[2-((3S,4S)дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксидна киселина[ (1S)-6eH3MA-2-(cis-

3,4- дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(1,1-диоксотиазолидин-3-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-3-(cisдихидроксипиролидин-1 -ил)-(2В)-хидрокси-3-оксопропил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (18)-(4-флуоробензил)-2-(4-хидрокси-пиперидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-2-((3RS)хидрокси-пиперидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-оксо-2-((1 RS)оксо-тиазолидин-3-ил)-етил]-амид; или

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1в)-бензил-2-(3хидрокси-азетидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид.
20. Комплект съгласно претенция 19, в който количеството инхибитор алдозо редуктаза е от окол 0.1 мг/кг до около 20 мг/кг.
21. Комплект съгласно претенция 20, в който количеството инхибитор на гликоген фосфорилаза е от около 0.1 мг/кг до около 15 мг/кг.
22. Фармакологичен състав за постигане на на ефект на чуствителност към инсулин при млекопитаещо, включващ

a. определено количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е инхибитор на алдозо редуктаза; и

b. определено количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е инфибитор на гликоген фосфорилаза в който количеството само на първото съединение или количеството на второто съединение самостоятелно е недостатъчно да се постигне ефект на чуствителност към инсулин и в който

142 комбинирания ефект от количествата на първото и второто съединения е по-голям от сумата на ефектите на чуствителност към инсулин, който се постига с взетите по отделно количества от първото и второто съединение, и фармацевтично приемлив разредител или носител.
23. Фармацевтичен състав съгласно претенция 22, в който инхибиторът на алдозо редуктаза е 1-фтаразиноцетна киселина, 3,4дихидро-4-оксо-3-[ [ 5-трифлуорометил)-2-бензотиазолил] метил]- или тяхна фармацевтично приемлива сол.
24. фармацевтичен състав съгласно претенция 23, в който инхибиторът на гликоген фосфорилаза е

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-(2R)хидрокси-3-((38)-хидроксипиролидин-1 -ил)-3-оксопропил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1в)-бензил-3((38,48)-дихидроксипиролидин-1 -ha)-(2R) -хидрокси-3-оксопропил] амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnдиметилкарбамоил-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xHflpoKcnметокси -метил-карбамоил)-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcn[ (2-хидрокси-етил) -метил-карбамоил]-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (18)-бензил-2-(3хидроксиимино-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(cis-3,4дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-((38,48)дихидрокси-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-2-((cis)3,4- дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-(2-оксо-етил]-амид;

143

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-3-((cis)-3 дихидроксипиролидин-1 -ил)-(2А)-хидрокси-3-оксопропил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(1,1-диоксотиазолидин-3-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ (13)-(4-флуоробензил)-2-(4-хидрокси-пиперидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1 S)-6eH3HA-2-((3RS)хидрокси-пиперидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-оксо-2-((1 RS)оксо-тиазолидин-3-ил)-етил]-амид; или

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бензил-2-(3хидрокси-азетидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид.
25. Фармацевтичен състав съгласно претенция 24, в който количеството инхибитор на алдозо редуктаза е от около 0.1 мг/кг до около 20 мг/кг.
26. фармацевтичен състав съгласно претенция 25, в който количеството инхибитор на алдозо редуктаза е от около 0.1 мг/кг до около 15 мг/кг.
27. Метод за постигане на ефект на чуствителност към инсулин при млекопитаещо, което е в състояние на резистентност към инсулин, характеризиращ се с това, че на това млекопитаещо се дава

a. определено количество от първо съединение, като споменатото първо съединение е инхибитор на алдозо редуктаза; и

b. определено количество от второ съединение, като споменатото второ съединение е инфибитор на гликоген фосфорилаза като количеството само на първото съединение или количеството на второто съединение самостоятелно е недостатъчно да се постигне ефекта на чуствителност към инсулин и в който комбинирания ефект от количествата на първото и второто

144 съединения е по-голям от сумата на ефектите на чуствителност към инсулин, който се постига с взетите по отделно количества от първото и второто съединение.
28. Метод съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че инхибиторът на алдозо редуктаза е 1-фталазиноцетна киселинар

3.4- дихидро-4-оксо-3-[[ 5-трифлуорметил)-2-бензотиазолил] метил]или тяхна фармацевтично приемлива сол.
29. Метод съгласно претенция 28, каракттеризиращ се с това, че инхибиторът на гликоген фосфорилаза е

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-бензил-(2R)хидрокси-3-((38)-хидроксипиролидин-1-ил)-3-оксопропил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1в)-бензил-3((38,48)-дихидроксипиролидин-1 -ил)-(2В)-хидрокси-3-оксопропил] амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnдиметилкарбамоил-метил)-2-фенйл-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (18)-((В)-хидроксиметокси -метил-карбамоил)-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcn[ (2-хидрокси-етил) -метил-карбамоил]-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (18)-бензил-2-(3хидроксиимино-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(cis-3,4дихидрокси-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ 2-((3S,4S)дихидрокси-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-2-(cis-

3.4- дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [ 2- (1,1 -диоксотиазолидин-3-ил)-2-оксо-етил]-амид;

145

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-3-((cis)дихидроксипиролидин-1 -ил)-(2Я)-хидрокси-3-оксопропил] -амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (18)-(4-флуоробензил)-2-(4-хидрокси-пиперидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3i4A-2-((3RS)хидрокси-пиперидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-оксо-2-((1 RS)оксо-тиазолидин-3-ил)-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киседина[ (13)-бензил-2-(3хидрокси-азетидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид.
30. метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че количеството инхибитор на алдозо редуктаза е от около 0.1 мг/кг до около 20 мг/кг.
31. Метод съгласно претенця 30, характеризиращ се с това, че количеството инхибитор на гликоген фосфорилаза е от около 0.1 мг/кг до около 15 мг/кг.
32. Метод съглаасно претенция 31, характеризиращ се това, че млекопитаещото е мъж или жена.
33. Метод за намаляване увреждането на тъканта в резултат на исхемия, характеризиращ се това, че на нуждаещото се млекопитаещо се дава терапевтично ефективно количество от:

a. инхибитор на алдозо редуктаза; и

b. инхибитор на гликоген фосфорилаза.
34. Метод съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че тъканта е от сърце, мозък,черен дроб, бъбрек, бял дроб, стомах, скелетен мускул, далак, панкреас, гръбначен мозък, тъкан от ретина, васкулатурата или тъкан от танките черва.
35. Метод съгласно претенция 34, характеризиращ се с това, че инхибиторът на алдозо редуктаза е 1-фталазиноцетна киселина,

3,4-дихидро-4-оксо-3-{[5-трифлуорметил)-2-бензотиазолил]метил]или тяхна фармацевтично приемлима сол.

146
36. Метод съгласно претенция 35, характеризиращ се това, че инхибиторът на гликоген фосфорилаза е

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-бензил- (2 R)хидрокси-3-((33)-хидроксипиролидин-1-ил)-3-оксопропил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1Б)-бензил-3((33,43)-дихидроксипиролидин-1-ил)-(2Н)-хидрокси-3-оксопропил]амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnдиметилкарбамоил-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcnметокси -метил-карбамоил)-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-((R)-xnflpoKcn[ (2-хидрокси-етил) -метил-карбамоил]-метил)-2-фенил-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бензил-2-(3хидроксиимино-пиролидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(cis-3,4дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-((33,43)дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бензил-2(cis-3,4- дихидрокси-пиролидин-1 -ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина [2-(1,1-диоксотиазолидин-3-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3HA-3-((cis)дихидроксипиролидин-1 -ил)-(2Р)-хидрокси-3-оксопропил] -амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-(4-флуоробензил)-2-(4-хидрокси-пиперидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (1S)-6eH3iM-2-((3RS)хидрокси-пиперидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид;

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[2-оксо-2-((1 RS)оксо-тиазолидин-3-ил)-етил]-амид; или

147

5-хлоро-1 Н-индол-2-карбоксилна киселина[ (13)-бензил-2-(3хидрокси-азетидин-1-ил)-2-оксо-етил]-амид.
37. Метод съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че количеството на инхибитор алдозо редуктаза е от около 0.1 мг/кг до около 20 мг/кг и количеството на ихибитор гликоген фосфорилаза е около 0.1 мг/кг до около 15 мг/кг.
38. Метод съгласно претенция 37, характеризиращ се с това, че млекопитаещото е мъж или жена.
39. Метод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че тъканта е тъкан от сърце.
40. Метод съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че тъканта е тъкан от мозък.
41. Метод съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че тъканта е тъкан от черен дроб.
42. Метод съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че споменатата тъкан е тъкан от бъбрек.
43. Метод съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, тъканта е тъкан бял дроб.
44. Метод съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че тъканта е тъкан от стомах.
45. Метод съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че тъканта е тъкан от скелетен мускул.
46. Метод съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че тъканта е тъкан от далак.
47. Метод съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че тъканта е тъкан от панкреас.
48. Метод съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че тъканта е тъкан от ретина.
49. Метод съгласно претенция 39, характеризиращ се с това, че споменатата комбинация се прилага профилактично.

148
50. Метод съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че споменатата комбинация се прилага преди операция на сърцето.
51. Метод съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че увреждането на тъканта в резултат на исхемично увреждане е претърпяно при трансплантация на орган.
52. Метод за лечение на млекопитаещо в състояние на резистентност към инсулин, характеризиращ се с това, че на млекопитащето се дава състав съгласно претенция 1.
53. Метод за намаляване увреждането на тъканта в резултат от исхемия, характеризиращ се с това, че при нужда от такова лечение на млекопитаещото се дава състав съгласно претенция 1.