BG107018A - Използване на инхибитори на il-18 - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до използване на инхибитори на IL-18 за приготвяне на медикаменти за лечение и/или профилактика на чернодробно увреждане, наартрит, по-специално ревматоиден артрит, на чревни възпалителни заболявания, по-специално болест наКрон и язвен колит.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящето изобретение се отнася до терапевтичното приложение на инхибитори на IL-18 при няколко патологични състояния. По-специално, изобретението се отнася до лечение и/или предпазване от артрит, до лечение и/или предпазване от чернодробни заболявания и до лечение и/или предпазване от чревни възпалителни заболявания (IBD).

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

През 1989 година, е описана ендотоксин-индуцирана активност на серумният интерферон-γ (IFN-γ), изолиран от миши далачни клетки (Micallef et al., 1996). Тази серумна активност е функционална не като директен индуктор на IFN-γ, а по-скоро като ко-стимулант заедно със IL-2 или митогени. Опит да се пречисти активната форма от серум на мишки след ендотоксин-индукция, даде като резултат значително хомогенен 50-55 кДа протеин. Въпреки, че и други цитокини могат да действат като ко-стимуланти за продукцията на INF-γ, липсата на ефект на антителата, неутрализиращи IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 или TNF, използвани за неутрализиране на серумна активност, предполага че става въпрос за различен от тях фактор. През 1995 година, същите учени показват че ендотоксин-индуциращ ко-стимулант на продукцията на INF-γ присъства в екстракти от черни дробове от мишки, предварително третирани с P.acnes (Novick et al., 1992). В този модел, популацията шашшма

;5

• · · · _ _А • · · · · ·· · ·· · : ·· · · . ·* от чернодробни мСЗкрофагиЧ^Кулфер^р^ .клетки) се увеличава и в тези мишки, ниска доза от бактериален липополизахарид (LPS), който при не-третирани мишки не е летален, се оказва летален. Факторът, наречен INF-у-индуциращ фактор (IGIF) и по-късно означен като интерлевкин-18 (IL-18) е пречистен до хомогенност от 1,200 грама от P.acens-третирани миши черни дробове. Изродени олигонуклеотиди, получени на база на аминокиселинни секвенции от пречистен IL-18 се използват за клониране на миша IL-18 кДНК (Novick et al., 1992). IL-18 е 18-19 кДа белтък, представен от 157 аминокиселини, които нямат очевидни прилики с който и да е пептид от базата-данни. Информационни РНКи за IL-18 и интерлевкин-12 (IL-12) се наблюдават често в Купферовите клетки и активираните макрофаги. Рекомбинантен IL-18 има по-голяма индуцираща INF-гама активност, в сравнение с IL-12, очевидно чрез различен сигнален път (Novick et al., 1992). Подобно на ендотоксининдуцираната серумна активност, IL-18 не индуцира INF-y самостоятелно, но функционира първоначално като ко-стимулант с митогени или IL-2. IL-18 повишава Т-клетичната пролиферация очевидно по IL-2 независим сигнален път и повишава продукцията на Thl цитокините in vitro и показва синергизъм когато е в комбинация с IL-12 по отношение на повишената INF-y продукция (Maliszewski et al., 1990).

Показано е, че антитела неутрализиращи мишия IL-18 предпазват от леталния ефект на ниски дози LPS при предварително третирани с P.acnes мишки. Други автори съобщават за значението на INF-y, като медиатор на LPS леталния ефект при предварително третирани мишки. Например, неутрализиращите анти- INF-y антитела защитават мишките от Shwartzman-подобен шок (Fantuzzi et al., 1998) и галактозамин-третирани мишки, дефицитни по отношение на рецептора за INF-y са резистентни към LPS-

_W._Wr„„ ·· ·· • · · • · · ···· ·· • · • · • · • 9 индуцираната смърт iBvny 19*901 ·♦ ·· • · · • 9 • * · • · ·

Сле^ойАШггно. че е неочаквано, че неутрализиращите антитела за мишия IL-18 предпазват предварително третираните с P.acnes мишки срещу леталния ефект на LPS (Novick et al., 1992). Третиране с анти-мишо IL-18 също защитава преживяемостта на мишките при остра чернодробна токсичност.

След като мишата форма е клонирана, през 1996 е съобщена и човешка форма на кДНК последователност за IL-18 (Okamura et al., 1995). Рекомбинантен човешки IL-18 показва естествена IL-18 активност (Okamura et al., 1995). При човешки рекомбинантен IL-18 липсва директна INF-γ индуцираща активност върху човешки Т-клетки, но той действа като ко-стимулант за продукцията на INF-y и други Т хелперни (Thl) цитокини (Okamura et al., 1995). Днес се счита, че IL-18 действа първо като ко-стимулант за продукцията на Thl цитокините (INF-γ, IL-2 и гранулоцитмакрофагиален колонно стимулиращ фактор) (Izaki, 1978) и също така, като ко-стимулант за FAS лиганд медиираната цитотоксичност на мишите клонове от клетки-естествени убийци (Novick et al., 1989).

Чрез клониране на IL-18 от засегнати тъкани и изучаване на генната експресия на IL-18, е открита тясна връзка между цитокините и автоимунните заболявания. Мишки заболели от формата на диабет, при която липсва затлъстяване (NOD) спонтанно развиват автоимунни инсулити и диабети, които могат да бъдат ускорени и синхронизирани чрез еднократно инжектиране с циклофосфамид. IL-18 иРНК е доказана, чрез обратнотранскриптазна полимеразна верижна реакция (RT-PCR) на панкреаси от NOD мишки в ранни етапи на инсулити. Нивата на IL18 иРНК се увеличават бързо след третирането на циклофосфамид и предизвикват повишаване на иРНК за INF-y и последващи диабети.

л-a. .

• · · . . ··· . .·

...... ..··..·

Интересно е, че тези киизтиги паподсблгат тези па II·.- 12 р40 иРНК, които показват тясна връзка между отделните иРНК профили. Клонирането на IL-18 кДНК от РНК взети от панкреаси и последващото секвениране показва идентичност със секвенцията на IL-18 клониран от Купферови клетки и in vivo активиращ макрофагите. Също така NOD миши макрофаги от паралелно третирани Balb/c мишки, не показват такава идентичност. Ето защо, експресията на IL-18 е ненормално регулирана при автоимунни NOD мишки и се в тясна връзка с развиването на диабети (Novick et al., 1992).

IL-18 играе основна роля в имунорегулацията или при възпалителните реакции, чрез повишаване на функционалната активност на Fas лиганда на Thl клетките (Conti et al., 1997). IL-18 също се експресира в адреналния кортекс и затова може да бъде секретиран, като невро-имуномодулатор, който играе основна роля в регулацията на имунната система, чрез стрес-активиране (Chater, 1986).

In vivo IL-18 се образува от късането на npo-IL-18 и неговата ендогенна активност изглежда води до продукцията на INFγ при P.acens и LPS-медииран летален ефект. Зрялата форма на IL-18 се образува от неговия прекурсор, чрез LL-Ιβ конвертиращ ензим (1Ь-1в-конвертиращ ензим, ICE, каспаза-1).

IL-18 рецептора се състои най-малко от два компонента, коопериращи се при свързването с лиганда. Високо и нискоафинитетни свързващи места за IL-18 са открити в миши IL-12 стимулирани Т-клетки (Yoshimoto et al., 1998), което предполага рецепторен комплекс от много вериги. Две рецепторни субединици са открити за сега, и двете принадлежат към семейството на IL-1 рецептора (Pmet et al., 1996). Предаването на сигнала, чрез IL-18 рецептора, включва активиране на NF-kB (DiDonato et al., 1997).

I AvllvvjiKO

<53 разтворими цитокинови рецептори и отговарят на извънклетъчните

лиганд-свързващи домени съответстващи на техните цитокинови рецептори, разположени върху клетъчните повърхности. Те се получават както в резултат от алтернативен сплайсинг от пре-иРНК, обща за клетъчно повърхностния рецептор, или чрез протеолитично късане на клетъчно-повърхностния рецептор. Такива разтворими рецептори на IL-6 и INF-γ (Nakamura et al., 1989), TNF (Dao et al., 1996; Engelmann et al., 1989), IL-1 и IL-4 (John, 1986), INF -α/β (Mizushima и Nagata, 1990) и други. Един цитокин-свързващ белтък, наречен остеопротегерин (OPG, също известен като остеокластинхибиращ фактор - OCIF), член на TNFR/Fas семейството е първия пример за разтворим рецептор, който съществува само като секреторен протеин (Anderson, 1997; Bollon, 1980).

Наскоро открит разтворим белтък, който има висок афинитет към IL-18 е изолиран от човешка урина и са описани човешките и мишите кДНКи (Novick et al., 1990; WO 99/09063). Белтъкът е означен като IL-18 свързващ белтък (IL-18BP).

IL-18BP не е извънклетъчния домен на известните IL-18 рецептори, но се секретира естествено като циркулиращ протеин. Той принадлежи на ново семейство секреторни протеини. Семейството по-нататък включва някои Поксвирусни-кодирани протеини, които притежават висока хомология със IL-18BP (Novick et al., 1999). IL-18BP се експресира постоянно в далака и принадлежи към суперсемейството на имуноглобулините и има ограничена хомология с IL-1 тип II рецептора. Неговия ген е локализиран в човешката хромозома 1 lql3 и липсва екзон, кодиращ трансмембранен домен в 8.3 кЬ геномната секвенция (Novick et al., 1999).

Четипи човешки и гтке*миши изосЬопми на IL-18BP. водещи до иРНК сплайсинг са открити в няколко кДНК библиотеки и са експресирани, пречистени и анализирани за свързващата им способност и за неутрализиране на биологичните активности на IL18 (Kim et al., 2000). Изоформа на човешки IL-18BP (IL-18BPa) показва по-висок афинитет към IL-18 с бърза скорост на стартиране и спиране и дисоциационна константа (K(d)) 399 рМ. IL-18BPC притежава общ Ig домен с IL-18Pa, с изключение на С-крайните 29 аминокиселини; K(d) на IL-18Pc е 10 пъти по-ниска (2.94 пМ). Въпреки това, IL-18Pa и IL-18Рс неутрализират над 95% IL-18 при р”·· крайните моларности и на двата. При IL-18BPb и IL-18BPd изоформите липсва пълния Ig домен и те притежават идентичен Ig домен, който също неутрализира над 95 % мишия IL-18 при крайните моларности и на двата. IL-18BPd обаче, който има общ Скраен мотив с човешкия IL-18BPa също неутрализира човешкия IL18. Чрез молекулно моделиране е идентифициран голямо смесено електростатично и хидрофобно свързващо място в Ig домена на IL18ВР, на което би могло да се дължи високият афинитет към свързване с лиганд (Kim et al., 2000).

Наскоро се предположи, че интерлевкин IL-18 е включен в индуцирането на патогенността на хроничните възпалителни реакции, включващи ендотоксинов шок, хепатити и автоимунни диабети (Kahiwamura и Okamura, 1998). Следваща индикация за възможната роля на IL-18 при развитието на чернодробни заболявания е резултат от експериментите, публикувани от Tsuij et al., (Tsuij et al., 1999), който показва повишаване на нивото на IL-18 в липополизахарид-индуцираното остро чернодробно увреждане в миши модел. За сега обаче не е изяснен механизма на мултифункционалния фактор IL-18 отговарящ за развитието на чернодробни увреждания.

·· ·· • · · • · • · • · ···· ·· • · · • · • ·

Чернодробните нарушения’ или увреждания могат да бъдат причинени от различни фактори. Могат да се дължат на вирусни или бактериални инфекции, на злоупотреба с алкохол, на имунологични нарушения или на ракови заболявания, например.

Вирусните хепатити, които се дължат на Хепатит-В вируса и Хепатит С вируса, са слабо управляеми заболявания, които засягат голям брой хора в световен мащаб. Броят на известните хепатитни вируси постоянно се повишава. Освен Хепатит В и С

вирусите, най-малко още четири вируса, предизвикващи вирусасоциирани хепатити са открити до сега, наречени Хепатит A, D, Е и G- вируси.

Чернодробните заболявания при алкохолиците е друго широко разпространено заболяване, свързано със хронична консумация на алкохол. Имунните хепатити са рядко авто-имунно заболяване, което е слабо-контролирано. Чернодробните увреждания също включват увреждания на жлъчните канали. Първичната жлъчна цироза (РВС) е автоимунно чернодробно заболяване, което се характеризира с деструкция на вътречернодробните жлъчни канали

Някои проучвания показват, че уврежданията на черния дроб при заболявания, като хепатити при алкохолици, чернодробни цирози, вирусни хепатити и първични жлъчни цирози са свързани отговора на Т-хелперните клетки - тип 1 (Thl отговори). В едно от проучванията, нов модел на чернодробно заболяване е установено при мишки, чрез насочване на овоалбумин-съдържащи липозоми към черният дроб и последващ овоалбумин-специфичен отговор от Thl клетките. Комбинирано третиране на мишките с овоалбуминсъдържащи липозоми и Thl клетъчно пренасяне предизвиква повишаване на серумната трансаминазна активност, паралелно с увеличаването на нивата на серумния INF-γ. В остър противовес, &

·· ·♦ • · · · • · · • · · • · · ···· ·· овоалбумин-специфично повишаване на нивата ·· ·· • fl • · · • 4 • · ·

Тп2“ клеТьЗйр пренасяне, води до на серумния IL-4, но не предизвиква • ·· • · · • · е · ·

чернодробни увреждания. Чернодробното увреждане се блокира от анти-INF-y антитела и анти-тумор некрозис фактор (TNF)-a антитела. Тези открития показват, че Thl клетките са главните ефекторни клетки при остри чернодробни увреждания (Nishimura и Ohta, 1999). В друга група изследвания е показано, че свръхекспресията на миши INF-γ води до спонтанни хепатити без какъвто и да е патоген или какъвто и да е стимулант (Okamoto et al., 1998).

Друго изследване показва Thl отговорите при първична жлъчна цироза (РВС). РВС е автоимунно чернодробно заболяване, което се характеризира с деструкция на вътречернодробните жлъчни канали. Обикновенно се смята, че клетъчния имунен механизъм, по специално въвличането на Т-клетките води до увреждания в жлъчния канал. Наскоро беше предположено, че относително силните Thl и Th2 отговори са важен фактор в патофизиологията на много автоимунни заболявания. В това изследване, се оценява баланса между двата типа Т-клетки при РВС, чрез детекция на цитокини, специфични за двата Т-клетъчни типа, т.е. INF γ за Thl клетикте и IL-4 за Th2 клетките. Отчитат се INF γ и IL-4 информационна РНК (иРНК) позитивните клетки в чернодробни срези от 18 пациенти с РВС и 35 контроли на заболяването, включващи активни форми на хроничен хепатит С, екстрахепатитни жлъчни обструкции и нормални черни дробове, като се използва неизотопна in situ хибридизация и имунохистохимия. Мононуклеарни клетки, експресиращи INF γ и IL-4 иРНК образуват агрегати на входовете на възпалените пътища в черни дробове на болни от РВС, но те присъстват в известно количество и в екстрахепатитните жлъчни обструкции, във фиброзите при алкохолици или в нормалните чернодробни срези. INF γ и IL-4 иРНК позитивните

ма zΛΖ

···· ·· ·· фж/ · · · клетки при РВС «черните дробове* *с^*.'йаблю дават в значително увеличен брой, в сравнение с контролните черни дробове (Р<0.01). Още повече, експресията на INF γ иРНК по-често се наблюдава в сравнение са тази на IL-4 при черни дробове на болни от РВС, и нивата на експресия на INF γ иРНК корелират в голяма степен с тези при порталните възпалителни реакции. ΙΝΈ γ иРНК позитивни клетки се наблюдават първоначално около увредените жлъчни канали, които са оградени от лимфоидни агрегати. Данните показват, че Thl клетките са по-често срещащият се тип Т-клетки в лимфоидните инфилтрати при РВС (Harada et al., 1997).

Цитокиновия профил на разпознаване на вирусни антигени също се счита че оказва силно влияние върху вирусните инфекции и вирусното пречистване. Едно проучване изследва дали цитокиновия имбаланс в посока към тип Th2 клетъчен отговор играе роля при хроничния хепатит В. Цитокиновите профили на мононуклеарните клетки в периферната кръв се свързва с хроничния хепатит Вие анализиран чрез RT-PCR. Що се отнася да стимулирането на Хепатит В-повърхностния антиген (HbsAg), експресията на INF γ, IL-2, IL-4 и IL-10 се наблюдава като 41%, 8%, 41% и 50% от пациентите, съответно. Между тези цитокини, експресията на Thl цитокина INF γ се свързва с високите нива на серумните AST/ALT (Аспартат аминотрансфераза/Аланин аминотрансфераза), кито представляват типични маркери за чернодробно увреждане. Не се наблюдава, Th2 тип цитокините да указват защитен ефект върху хепатоцити. В заключение, продукцията на Thl цитокина, INF γ, от HBsAg-реактивните клетки се свързва с хепатоцитно увреждане при хроничен хепатит В (Lee et al., 1999). Високи нива на FAS лиганд и неговия рецептор (CD95) са съобщени за черните дробове на пациенти с хепатит В (Luo et al.,

ПО'·’ ,).

FAS лиганда се е • φ · ·

’ΤΗ Π

Г’ГТГ*Г‘.*>лг_!п>т*#>ттГТТУТЖ м,Хж агенти, водещи до апоптозис.

Друго проучване идентифицира фактори, свързани с прогресията на чернодробните увреждания при 30 хепатит С вирус/РНК (HCV/RNA) - позитивни нелекувани пациенти с хронични хепатити. Некротичните възпалителни и структурни увреждания се определят по Ishak точкова система. Активираните хепатоцитни звездовидни клетки (HSC) се визуализират имунохистохимично, с реакция за α-актин на гладкомускулните клетки (aSMA) и се прави морфометрична количествена оценка. Плазмения HCV/RNA се анализира, чрез използване на конкурентен RT-PCR метод. За проследяване на типа на имунен отговор, включен при прогресията на чернодробни заболявания, INF γ- позитивни клетки (както при експресия при Thl-подобен отговор) се анализират имунохистохимично и количествено - морфометрично. Установено е, че HSC се наблюдават най-често, близо до областите на възпалени некротични лобуларни учасъци или до тези постилащи фиброзните септи. a-SMA и Sirius Red- позитивната паренхима показват значителна корелация с точките за некротичните възпалителни и структурни увреждания. Ето защо може да се направи заключение, че активирането на HSC и прогресията на черондробни увреждания се свързва с Thlотговорите (Baroni et. al., 1999). Подобно на случаите на Хепатит В, FAS лиганда и неговия рецептор са открити в черни дробове и серуми на хепатит С пациенти (Hiramatsu et al., 1994; Okazaki et al., 1996; Lio et al., 1998).

Thl цитокините и други Thl маркери са открити асоциирани с хепатитите при алкохолици и при чернодробни цирози. Възпалителни стимули и активирането на липидна пероксидация, активира ядрения фактир кВ (NF кВ) и увеличава ммж

Шйиаа.

йШШй ««ЛЙЙЙШ»

• ♦ · · • · · • · · • · · ·♦ ♦···

1ТТДГГП ГЛУУ ни и уемокчни- В едно проучване се анализира връзката между патологичните чернодробни увреждания, ендотоксемиата, липидната пероксидащия и NF-kB активирането, и имбаланса между про- и анти-възпалителните цитокини. Плъхове (по 5 в група) се хранят с етанол, и са подложени на диета с храни наситени с мазнини, чрез интрастомашна инфузия на палмово масло, царевично олио или рибено масло. При контролните плъхове, декстрозата се използва, като изокалоричен заместител на етанола. Провежда се анализ на патологията и измерване на ендотоксините, както и на липидната пероксидация, на нивото на NF-kB и на информационна РНК (иРНК) на провъзпалителните цитокини (TNFa, IL-beta, INF γ и IL-12), на C-C хемокините (регулирани от активирането на нормални Т-клетки, експресирани и секретирани [RANTES], на моноцитния хемотактичен хемокин [MCPJ-1, макрофагиален възпалителен протеин [MIPJ-1-α), на С-Х-С хемокините (цитокин индуциран неутрофилен хепоатрактант [CINC], на MIP-2, на IP-10 и на епителиалния неутрофил активиращ протеин [ΕΝΑ]-7 8) и антивъзпалителните цитокини (IL-10, IL-4 и IL-13). Активирането на NFkB и повишаването на експресията на про-възпалителните цитокини С-С и С-Х-С хемокините се набюдава в плъхове, показващи некротични възпалителни увреждания (хранени с рибено масло, етанол, царевично олио и етанол). Тези групи също имат повишени нива на ендотоксини и липидна пероксидация. Нивата на IL-10 и IL4 иРНК са по-ниски в групите показващи възпалителни чернодробни увреждания. Така активирането на NF-kB се появява в присъствие на про-възпалителни стимули и води до повишена експресия на Thl про-възпалителни цитокини и хемокини (Naji et al., 1999). FAS лиганда и неговия рецептор също са анализирани при чернодробни заболявания при алкохолици, които показват още един път че Thl

.......... .·· ·· • · » · ; · ·· · • · ··· *. _e * · · ···· ·· ,.·· · · · . ♦· ·· ·*«.

цитокипите участгат а затоим’ '^ΖΣΉΙΜΤ? процеси, индуцирани при хепатити при алкохолици (Galle et al., 1995; Taieb et al, 1998; Fiore et al., 1999).

TNF-α също се явява основен сигнален път за некротичните възпаления, характерни за патогенезата на хепатитите при алкохолици. Доказани са повишени нива на чернодробен и серумен TNF при животински модели, изучаващи чернодробните увреждания при алкохолици и при чернодробни заболявания при хора-алкохолици (Grove et al., 1997; McClain и Cohen, 1989). Например открито е при едно от проучванията, че пациентиалкохолици с хепатити имат по-високи нива на TNF-α (средно 26.3 ng/L; 95%С1, 21 до 30.9) в сравнение с нормални обекти (6.4 ng/L; Cl, 5.4 до 7.4). Пациентите, които в последствие умират имат по-високи нива на TNF-a ( 34.7 ng/L; Cl, 27.8 до 41.6) в сравнение с пациентите, които преживяват (16.6 ng/L; Cl, 14.0 до 19.2). При пациенти-алкохолици с хепатити нивото на TNF-a показва позитивна корелация със серумния билирубин (г=0.74; Р=0.0009) и серумния креатинин (г=0.81; Р=0.0003). Пациенти-алкохолици с хепатит имат повишени нива на TNF-a в сравнение с пациентиалкохолици с неактивни цирози (11.1 ng/L; Cl, 8.9 до 13.3) и при хора с остра форма на алкохолизъм но без чернодробни заболявания (6.4 ng/L; Cl, 5.0 до 7.8). Пациенти с аномална бъбречна функция имат по-ниски нива на TNF-a (14.1 ng/L;Cl, 5.4 до 22.8) в сравнение с пациенти-алкохолици с хепатити. Ето защо може да се направи заключението че тези анализи на TNF-a при хепатити при алкохолици са по-показателни при острите форми, което предполага, че TNF-a играе роля за патогенезата (Bird et al., 1990).

TNF медиира много от биологичните действия на ендотоксина. Последни изследвания показват, че въвеждането на

TNF може да причини чернодробни увреждания и че TNF може да ·· ·· • · · · • · ·· J ♦ · · · • · · · ·♦ ·· ·· ·· • · · · • ·· • ·· • ·· ···♦ ·· ·· ·· • ♦ · · • * · J · ♦ , ........ T-.

мелиира леталенн ефект на хепатотоксина галактозамин. Едни от мощните индуктори на TNF е ендотоксина. Тъй като пациенти алкохолици с хепатити, често имат ендотоксемия и тъй като много от клиничните показатели за хепатит при алкохолици са известни с това че имат биологичните действия на TNF, направен е анализ за неговата активност при пациенти-алкохолици с хепатити. Базалното и липополизахарид-стимулирано TNF освобождаване от моноцитите на периферната кръв, като основен източник на TNF продукцията, са анализирани при 16 пациенти-алкохолици с хепатити и 16 здрави доброволци. Осем от 16-те пациента-алкохолици с хепатити и само един от 16-те здрави доброволци показаха спонтанна активност на TNF (р по-малко от 0.05). След липополизахаридното стимулиране, средните стойности на освобождаването на TNF от моноцитите на пациенти-алохолици с хепатити е значително увеличено над два пъти, в сравнение със здравите контроли (25.3 +/- 3.7 спрямо 10.9 +/2.4 единици на ml, р по-малко от 0.005). Ето защо може да се направи заключението, че моноцитите на пациентите-алкохолици с хепатити показват значително повишаване на спонтанно освободения и липополизахарид-стимулирано освобождаване на TNF в сравнение с моноцити от здрави доброволци (Me Clain и Cohen, 1989)

Липополизахарид (ЬР8)-свърз вашия протеин (LBP) и CD 14 играят ключови роли, като интермедиатори при активирането на клетките от ендотоксини. Смята се че изолиран от черва LPS участва в предизвикването на патологично чревно увреждане при чернодробни увреждания при алкохолици. Показано е че при плъхове, хранени интрагастрално с етанол в масло за 4 седмици се повишават нивата на CD 14 иРНК и LBP в техните Купферови клетки и хепатоцити, съответно. Експресията на CD 14 иРНК също се анализира в не-миелоидни клетки. Повишената LBP и CD 14 ·· ·· • · ·· • ·♦ • ·· ···· ·· • · • · ··

..14 ·♦ ·· • · ···· о г» Т ЗГ «V £ / V'-=U

Т£ТГ<У

експресия различни про-възпалителни цитокини и корелира с присъствието на патологични чернодробни увреждания при алкохолици (Su et al., 1998; Lukkari et al„ 1999).

Артритът е заболяване, което включва ставни възпаления. Ставните възпаления се проявяват като подувалия, втвърдявания, увреждания свързани със сухожилията, зачервявания и затопляния. Симптомите могат да бъдат съпроводени със загуба на тегло, повръщане или слабост. Когато тези симптоми продължават повече от две седмици, възпалителните артрити, например ревматоидните артрити могат да бъдат причина. Ставните възпаления могат да бъдат също причинени от инфекции, които могат да водят до специфични артрити. Много типове ставни артрити представляват дегенеративни ставни заболявания (остеоартрити).

Медикаментите, които обикновенно се предписват за артрити и се отнасят до такива състояния са не-стероидни антивъзпалителни лекарствени препарати (NSAIDs). NSAIDs включват аспирин и аспирин-подобни лекарствени препарати. Те редуцират възпалителните реакции, които причиняват ставната болка, втвърдяване и подуване на ставата. Обаче, NSAIDs са неспецифични лекарствени препарати, които предизвикват голям брой странични ефекти, включително къркорене на стомаха (Интернет страница на Департамента по Ортопедия, Вашингтонски Университет по Артритни заболявания, с Frederick Matsen (Chairman), www.orthop.washington.edu). В допълнение към NSAIDs, Celebrex , циклооксигеназен (СОХ-2) инхибитор, се използва за да облекчи признаците и симптомите на остеоартрит и ревматоиден артрит при възрастни. Предписва се също за лечението на пациенти с фамилни аденоматозни полипозиси.

»· .Hi

hi : <>.

J .’ :·ίλ

fU

Ri и?

»vX

if

/.V R'j

!>. 4‘ • '..··. .”..··. .·· ·· • · · · · .. i · · · .* : : · : :; ; · · : .·

5V(V 01/0Q99Q Λπνςηο ΐΑ-ΛΐίΓΜΛτίΟτττχσ ryr 3 М’7'ПГП1ДМС'^ГИ H9, тумор некрозис фактор (TNF) и СОХ-2 инхибитори за лечение на възпаления.

TNF антагонистите също се използват за лечение на артрити. TNF антагонистите са описани например в WO 9103553.

Последни проучвания показват, че интрелевкин IL-18 играе про-възпалителна роля при ставният метаболизъм. Olee et al. (1999) показват, че IL-18 се продуцира от артикуларните хондроцити и индуцира про-възпалителни и катаболитни отговори. иРНК на IL18 се индуцира от IL-Ιβ в хондроцитите. Хондроцитите продуцират прекурсора на IL-18 и в отговор на IL-1 стимулират секрецията на зрялата форма на IL-18. Изследвания върху ефектите на IL-18 върху хондроцитите, по-нататък показват, че той инхибира TGF-βиндуцираната пролиферация и увеличават продукцията на азотен окис. IL-18 стимулира експресията на някои гени в нормалните човешки артикуларни хондроцити, включително и тези за азотеноксид синтетазата, индуцируемата циклооксигеназа, IL-6 и стромелизин. Генната експресия е свързана със синтезата на съответните протеини. Третирането на нормални човешки артикуларни хрущяли с IL-18 повишава освобождаването на глюкозаминогликани. Тези открития показват, че IL-18 е цитокин, който регулира хнодроцитните отговори и допринася за хрущялната деструкция.

Локализацията на интерлевкин Ι-β-конвертиращия ензим (1СЕ)/каспаза-1 в човешките остеоартритни тъкани и неговата роля при зреенето на интерлевкин - 1бета и интерлевкин -18 е показана от Saha et al. (1999). Saha et al. изучават експресията и продукцията на каспаза-1 в човешки нормални и остеоартритни (ОА) хрущяли и сухошилия, като правят количествен анализ на нивото на ICE в ОА хондроцитите и изследват връзката между

Vi

a;

< ·.

X

топографското разположение на ICE, интерлевкин-ΐβ (IL-1-β) и IL18, както и апоптозиса на хондроцитите. Експериментите проведени при тези изследвания, показват, че ICE се експресира и синтезира и в човешки синовиални мембрани и в хрущяла, при значително поголям брой позитивно оцветени клетки в ОА тъканите, в сравнение с нормалните тъкани. ICE продукцията предимно се локализира в супрафициалната и горна средна обвивка на артикуларния хрущял. Продукцията на зрял IL-Ιβ в ОА хрущялни експланти и хондроцити се блокира напълно от третиране със специфичен ICE инхибитор, който също значително намалява броя на IL-18 позитивните клетки. Връзката между активния 1Ь-1бета и ICE предполага, че ICE може да стимулира ОА прогресията чрез активиране на този провъзпалителен цитокин и че IL-18 може да играе роля при хрущялните патологични промени.

Gracie et al. (1999) предполагат за про-възпалителната роля на IL-18 при ревматоидните артрити. Gracie et al., забелязват значително по-високи нива на IL-18 иРНК и протеин в синовиалните тъкани при ревматоидни артрити в сравнение с нивата им при остеоартритните контроли. Показано е също така, че комбинацията от IL-12 и IL-15 с IL-18 индуцира продукцията на INF-γ от синоивалните тъкани in vitro. По-нататък, въвеждането на IL-18 във колаген/непълни Freund’s адювант-имунизирани мишки, улеснява развитието на ерозивни възпалителни артрити, което предполага, че IL-18 може да бъде и про-възпалител in vivo.

Обаче, за сега, освен за някои химични съединения, само за TNFa и IL-Ιβ е показано, че чрез използването на разтворими техни рецептори или моноклонални антитела се редуцира колаген-индуцирания артрит (CIA, който е миши модел на ревматоиден артрит) (Williams et al., 1994), ето се предлага като терапевтично средство за ревматоидни артрити.

-V

:“····· • · ·· ! · · · · • · · · ·· ·· ·· ♦· • · · « • · · • · 9 •99

......·· ..

Терминът 'хронично или ‘Тихиопатично възпалително чревно заболяване” включва най-малко две състояния: Болест на

Crohn и язвени колити. И двете са заболявания на стомашно-чревния тракт, болестта на Crohn най-често оказва влияние върху тънкото черво. Тъй като той също засяга и дебелото черво, диференциална диагностика на язвените колити (виж по-долу) може да се окаже проблем.

Хронични възпалителни и язвени признаци при болестта на Crohn често започват със малки чревни обструкции или анормални болки, които могат да имитират остър апендицит; други прояви могат да доведат до усложнения. Протичането на болестта е хронично, и може да покаже ремисии при терапията. Появява се обикновенно в ранните етапи от живота на възрастния индивид, като при половината от всички случаи започва между 20-30 години и в 90% от случаите между 10 и 40 години. Малко повече от мъжете са

засегнати, в сравнение с жените.

Микроскопията показва общи прояви. Възпалението е непрекъснато: проявява се като фокуси на възпаление или като петна. Събиране на лимфоцити и плазмени клетки се среща главно в мукозата и субмокозата, но обикновенно засяга всички слоеве (транс-стенно възпаление). Класическа микроскопска характеристика на болестта на Crohn е наличието на гранулирани клетки, заобиколени от лимфоцити. Разпространението на идиопатичните възпалителни чревни заболявания показват значителни вариации в географско отношение. Тези заболявания имат по-широко разпространение в северна Европа и Съединените Щати, отколкото в страните от южна Европа, Африка, Южна Америка и Азия, въпреки че с нарастването на урбанизацията и просперитети води до по-високо разпространение в частите на южна

··«· ·· ·· ·,····

Европа и Япония (СеЬегак abd SVstelfiatic Pathology, Churchill Livingstone, 3^rd edition 2000, JCE Underwood, Ed.).

При болестта на Crohn, клинично се различават две главни групи, първата включва пациенти, чиито заболявания продължават с ремисия около 3 години след началото на болестта, втората включва пациенти със заболявания продължаващи по-малко от три години.

Независимо от етиологията, има доказателства за присъствието на неподходящи Т-клетки и макрофагиално активиране при болестта на Crohn с повишена продукция на провъзпалителни цитокини, по-специално интерлевкини (IL) 1,2,6 и 8, интерферон (INF)- γ и тумор некрозис фактор (TNF)a. Болестта на Crohn се характеризира с постоянно (хронично) възпаление, съпроводено от фибрози. Процесите на фибробластна пролиферация и отлагане на колаген, могат да бъдат медиирани от трансформиращият растежен фактор β, който има доказано противовъзпалително действие, именно подпомагащо фибробластното възстановяване, синтеза на матрикс и подтискане на възпалителните клетки, но вероятно участват също и много други медиатори.

Язвените колити са не-специфични възпалителни увреждания на дебелите черва, които обикновенно започват в ректума и се разпространяват в различна степен. За разлика от болестта на Crohn, язвените колити са характерни само за дебелите черва.

Все повече данни показват, че язвеният колит е последствие от променена автоимунна реактивност, на мукозните увреждания, също могат да бъдат резултат от неподходящо Тклетьчно активиране и индиректно увреждане, което е резултат от действието на цитокини, протеази и реактивни метаболити на

I

♦ · ·· • · · · • · · • · · · • · ·	·♦ * · • 9 • · • . ф'	19 .··. .·· ·· • ! ♦ · · ·
···· ·· кислорода от макрофаг	·«	• · · · · ·· ·· »<··	Тозч по-късен
' Г ’'ТГ·	Ji

механизъм на увреждане на чревния епител е наречен увреждане чрез “неправилния заместител”. Доказателства за автоимунна реакция е присъствието на себе-активирани Т-лимфоцити и авто антитела, насочени срещу чревно епителните клетки и ендотелните клетки и анти-неутрофилни цитоплазмени авто-антитела (ANCA). Язвените колити, обаче не могат да бъдат считани за автоимунни заболявания, при които мукозното увреждане е директно последствие от автоимунна реакция на собствените антигени (General and Systematic Pathology, supra).

По отношение на терапията на болестта на Crohn, повечето хора първо са лекувани с лекарствени препарати, съдържащи мезаламин, субстанция, която подпомага контрола върху възпалителните реакции. Пациенти, които не се повлияват от него, или които немогат да го приемат могат да бъдат подложени на други мезаламин-съдържащи лекарствени препарати, общо известни като 5-ASA агенти. Възможни странични ефекти на мезаламиновите препарати включват гадене, повръщане, парливо усещане в гърдите, диария и главоболия.

Някои пациенти взимат кортикостероиди за контролиране на възпалителните реакции. Тези лекарствени препарати са по-ефективни при активна форма на болестта на Crohn, но те могат да предизвикат сериозни странични ефекти, включващи дори по-голямо предразположение към инфекция.

Лекарствени препарати, които супресират имунната система също се използват за лечение на болестта на Crohn. Найчесто се предписват 6-меркаптопурин и подобния лекарствен препарат, азатиопин. Имуносупресивните агенти действат, чрез блокиране на имунната реакция, което допринася за възпалението. Тези лекарствени препарати могат да причинят странични ефекти,

·· • · · • · • · • · ···· като гадене, повръщане и диария и мотат да понижа! резистентността на пациента към инфекции. Когато пациентите са лекувани с комбинация от кортикостероиди и имуносупресивни лекарствени препарати, дозата на кортикостероидите трябва във всички случаи да бъде намалена. Някои изследвания дават основание да се предположи, че имунносупресивните лекарствени препарати могат да повишат ефективността на кортикостероидите.

U.S. Food and Drug Administration одобрява лекарството инфликсимаб за лечение на умерена до остра форма на боластта на Crohn, което не отговаря на стандартните терапии (мезаламинови субстанции, кортикостероиди, имуносупресивни агенти) и за лечение на отворени, течащи фистули. Инфликсимаба първоначално е използван за лечение специфично за болестта на Crohn и представлява анти-тумор некрозис фактир- моноклонално антитяло. Анти-TNF премахва TNF от кръвния поток преди той да достигне до червата, и по този начин предотвратява възпалителните процеси.

Антибиотиците се използват за лечение на увеличаване на бактериалната флора в тънките черва, причинено от фистули или се дават при предхирургично състояние. За този общ проблем, доктора може да предпише един или повече от следните антибиотици: ампицилин, сулфонамид, цефалоспорин, тетрациклин или метронидазол.

Диарията и аномалната спазматична болка често се развиват, когато възпалението е отстранено, но допълнително лечение може също да бъде необходимо. Някои вещества против диария могат да бъдат използвани, включително дифеноксилат, лоперамид и кодеин. Пациенти, които са дехидратирани поради диария често са лекувани с флуиди и електролити.

Остава като необходимост за ефективна терапия за лечение и/или предпазване от чревни възпалителни заболявания, поΛ· s ·· ·· • · ·· • ·· • ·· · • ·· ···· ··

·· ···· специално oojicvi /-» . . , . .. . /ΊΓΤ/^»\ - , . ... , , ίΐα </ΐνι1ιι И Лоьипн KWmiH (UC), AvttlU vU характеризират c намалени странични ефекти или при които почти липсват странични ефекти.

И хистологични и имунологични наблюдения показват,

че клетъчно-медиирания имунитет и Т-клетъчното активиране са ключови характеристики на CD. Изследвания при хора и експериментални модели показват, че при CD, локалния имунен отговор предимно е Thl-тип (Desreumaux et al. 1997) и че локално освободените цитокини, като INF-γ и TNF-α допринасят за подобряването и разширяването на възпалителния отговор (Reimund et al. 1996).

Цитокинът IL-18 играе важна роля за Thl медиираният имунен отговор и е в тясна връзка с действието на цитокина IL-12, при стимулирането на INF-γ. IL-18 също повишава продукцията на GM-CSF и IL-2, стимулира анти-СОЗ индуцираната Т-клетъчна пролиферация и повишава Fas-медиираното унищожаване на клетките - естествени убийци (NK клетките). Зрелия IL-18 се получава от неговия прекурсор чрез IL-Ιβ- конвертиращия ензим (ICE, каспаза - 1). Рецепторът за IL-18 се състои от най-малко два компонента, коопериращи се при свързването с лиганда. Високо и ниско афинитетни свързващи места за IL-18 са открити в миши IL12 стимулирани Т клетки (Okamoto et al., 1998), което предполага многостранен верижен рецепторен комплекс. Две рецепторни субединици са открити за сега и двете принадлежат на IL-1 рецепторното семейство (Okamoto et al., 1999). Сигналната трансдукция на IL-18 включва активиране на NF-kB (Matsumoto et al. 1997).

Наскоро е предположено, че IL-18 има известно участие при чревните възпалителни заболявания (Pizarro et al., 1999;

Monteleone, et al. 1999).

2.2 ·· ·· • · • · · ·· ·· ·· ····

·· ·· • · · · • · · • · · • · · • · · · · ·

W . - .. .... < - ч i Vt <41.

локализацията на IL-18 във видовете чревни клетки и изолираните мукозни клетъчни популации от пациенти с болест на Crohn. Чрез използване на полуколичествен RT-PCR протокол, е открито че IL18 иРНК транскриптите се увеличават при свежо изолирани чревни епителни клетки и мононуклеарни клетки от ламина проприа при CD и сравнени с такива от язвени колити и контролни пациенти при които липсва възпаление. Имунохистохимични анализи на хирургично отстранени чревни тъкани, показват локализация на IL18 в мононуклеарните клетки от ламина проприа (по-специално в макрофагите и в дендритните клетки), както и в чревно-епителните клетки. Western блот анализът доказва наличието на 18,3 кДа ивица, която дава реакция и с рекомбинантен и със зрял човешки IL-18 белтък, който се открива предимно при CD в сравнение с UC чревни мукозни биопсии; втора ивица отговаряща на 24 кДа, която дава реакция с IL-18 прекурсора се наблюдава в невъзпалените области както при CD така и при UC биопсии и е единствената която се среща при контроли, при които липсва възпаление.

Monteleone et al. (1999) потвърждават тези открития.

Цялата чревна мукозна тъкан и мононуклеарните клетки на ламина проприа при 12 пациента с болест на Crohn и 9 пациента с язвени колити, и 15 пациента-контроли, които не страдат от чревни възпалителни заболявания са тествани за IL-18 чрез полуколичествен RT-PCR и Western блот анализ. Транскриптите на IL-18 се откриват при всички тествани проби. Повишено акумулиране на IL-18 иРНК, обаче, се наблюдава в мукозните клетки и в мононуклеарните клетки на ламина проприа при болни от болест на Crohn, за разлика от пробите от пациенти с язвени колити и пациентите-контроли. При пробите от пациенти с болест на Crohn, транскриптите за IL-18 са в по-голямо количество в мукозните

...... 23

•проби, взети от засегнатите еблаетн. 18 кДа ивица, даваща реакщгл със зрелия IL-18 се открива предимно при мукозните проби. При мукозни проби от пациенти-контроли, не страдащи от IBD, IL-18 присъства, като 24 кДа полипептид. Субединицата (р20) на стабилно активния IL-1-бета-конвертиращ ензим (ICE) се експресира в проби от CD или UC, където при чревно мукозните клетки от не-страдащи от IBD контроли, ICE се синтезира само като прекурсор (р45).

Dayer (1999) обобщава различните и частични противоречия относно функциите на IL-18. Накратко, IL-18 е плейотропен интерлевкин, който има повишаваща възпалителните реакции и отслабваща функция. От друга страна, той повишава продукцията на про-възпалителни цитокини, като TNF-α, поради което подпомага възпалението. От друга страна, той индуцира продукцията на N0, и е инхибитор на каспаза-1, и по този начин блокира зреенето на IL-Ιβ и IL-18, и вероятно намалява възпалението. Тази двусмислена роля на IL-18 сериозно отправя въпроса относно ефикасността на IL-18 инхибиторите по отношение на възпалителните реакции. По-нататък, поради взаимодействието на голям брой различни цитокини и хемокини в регулацията на възпалителните реакции, позитивния ефект при терапията или предпазването от възпалителни заболявания чрез блокиране само на един от участниците в предизвикването на възпалителните реакции, не е предвидим.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение се базира на откритието, че инхибиторите на IL-18 са ефективни за лечение и/или предпазване от различни заболявания или нарушения.

'2.4

Първата цел на настоящето изобретение е да’ осигури нови средства за лечение и/или предпазване от увреждане. Ето защо изобретението се отнася до използването на инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от чернодробно увреждане, било то остро или хронично. По-специално, изобретението се отнася до лечение и/или предпазване от хапатит при алкохолици, вирусен хепатит, имунен хепатит, фулминантен хепатит, чернодробна цироза и първична жлъчна цироза.

Втората цел на настоящето изобретение е да осигури нови средства за лечение и/или предпазване от артрит. Ето защо изобретението също се отнася до използването на инхибитори на IL18 за приготвянето на медикамент за лечение и/или предпазване от артрит. Позитивният ефект на инхибиторите на IL-18 включва понижаване на остротата на заболяването, както и предпазване от разпространение на заболяването. Това откритие е неочаквано, тъй като от нивото на техниката, описано по-горе, не би могло да се заключи, че блокирането на един специфичен фактор, причинител на артрита, именно интерлевкин IL-18, би могъл да доведе до облекчаване на артрита или даже до лечение на ставни артритни заболявания.

Открито е също, че въвеждането на инхибитор на EL-18 значително намалява хрущялната ерозия в модел на зряла форма на артрит. Настоящето изобретение, следователно по-нататък се отнася до изоплзването на инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от хрущялна деструкция.

Трета цел на настоящето изобретение е да осигури нови средства за лечение и/или предпазване от чревни възпалителни заболявания (IBD), по-специално на болест на Crohn и язвени колити. Изобретението, следователно също се отнася до използването на инхибитор на IL-18 за производство на медикамент • · · ·

за Лечение и/или iipe^xxuSijuxiv ох х> «/ъхЛ<ллю ν на^хх/лгдсхо изобретение е открито, че концентрациите на IL-18BP иРНК и белтък се повишават във възпалените райони на мукозата при биопсия, взета от пациенти страдащи от болест на Crohn. По-нататък при миши модел на чревни възпалителни заболявания е показано, че два различни инхибитора на IL-18 предпазват животните от тези заболявания.

Използването на комбинации от инхибитор на IL-18

и/или интерферон и/или TNF антагонист и/или СОХ-2 инхибитор също се считат, че са в съответствие с настоящето изобретение. За да се приложат генно терапевтични подходи за доставяне на инхибитор на IL-18 към заболелите тъкани или клетки, следващи аспекти на изобретението се отнасят до използването на експресионни вектори, включващи кодиращи секвенции на инхибитор на IL-18 за лечение и/или предпазване на болестни състояния. Изобретението по-нататък се отнася до изоплзването на ендогенно генно активиране на инхибитори на IL-18 и до използването на клетки, генетично модулирани да експресират инхибитори на IL-18 за предпазване и/или лечение на чернодробни заболявания, артрити и IBD.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фиг. 1 показва хистограма, отбелязваща нивата на серумен INF-γ (pg/ml) след инжектиране на различни количества от рекомбинантен IL18BP (0; 0,04; 0,4; 4 mg/kg) в мишки, 1 час преди инжектирането на LPS. Кръвните проби са взети 5 часа след LPS инжекцията и са анализирани за циркулиращ IFN-γ чрез ELISA.

Фиг. 2 показва хистограма, отбелязваща нивата на серумен Аланин аминотрансфераза (ALT). Мишките са инжектирани

4'	s Ж ·· ·· ·· «26 ·* .. ···· ···· ···· • · · ···· · · · ···· .·· ·· ·· ·· ···· c нарастващи дози от рекомбинантен IL18BP (и, 0,04, 0,4, 4 mg/kg), преди инжектиране с LPS в P.acnes сензитирани мишки. Кръвните проби са взети 5 часа след LPS инжецията и серумните нива на ALT са измерени SF=Sigma-Frankel: 1SF Единица от AST/ALT ще бъде 4,82х104 μιηοΐ глутамат/минута при pH 7.5 при 25 0 С.
Ζ V Λ 1, i,.	Фиг. 3 показва времето на оцеляване на мишките след LPS инжеция. Мишките са инжектирани с различни дози от рекомбинантен IL18BP (0; 0,04; 0,004; 4 mg/kg) 20 минути преди
r,t	преди инжектирането на LPS в Р. acnes сензитирани мишки. Триъгълници: 4 mg/kg; малък ромб: 0,4; голям ромб 0,04; кръгове: неинжектирани с IL-18ВР. Фиг. 4 показва хистограма, отбелязваща нивата на
· 'f У·. ; · l' A '. V	серумен INF-γ измерени 5 часа след инжектиране на различни количества от рекомбинантен IL18BP (0; 0,4; 4 mg/kg), който е въведен 20 минути преди инжектирането на LPS в P.acnes сензитирани мишки. Фиг. 5 показва оцеляването на мишките след инжектиране на поликлонален IL-18 антисерум или нормален заешки серум (NDS = контрола) 30 минути преди инжектирането на 40 mg/ml (летална доза) LPS получен от E.coli (Фиг. 5А) или от S.thyphimurum (Фиг. 5Б). Триъгълници: мишките са инжектирани с IL-18 антисерум; кръгчета: мишките са инжектирани с NDS. Върху Х-осите са отбелязани дните след LPS въвеждането. *р<0.05.
· 'i	Фиг. 6 показва хистограма, отбелязваща н средното + SEM от 5 мишки на група, третирани по следния начин. Мишки, инжектирани интраперитонеално (i.p.) с анти-IL-lS антисерум, с

• · · ···· · · · разтворими TNF-ά ‘рецептори (INFsRp55J*HnH със солеви разтвор, непосредствено след интравенозно (i.v.) въвеждане на Конкавалин А (Con А; Фиг. 6А) или PEA (Pseudomonas aeruginosa, Фиг. 6Б). **р<0.01, ***р<0.001, спрямо СопА или РЕА само; # р<0.01 спрямо

TNFsRp55 или IL-18, обработени чрез ANOVA.

Фиг. 7 показва ефекта на IL-18BP върху клинични стойности при миши модели на артрити. Фиг. 7А показва диаграма, отбелязваща стойностите, измерени 1 ден след въвеждането в мишки на различни количества IL18BP или INF-β или NaCl i.p. (интраперитонеално). Символи: запълнени триъгълници: 10 000 IU IFN-β; незапълнени триъгълници: 3mg/kg IL-18BP; ромбове: lmg/kg IL-18BP; кръгчета: 0.5 mg/kg IL-18BP; незапълнени квадратчета: 0.25 mg/kg IL-18BP и запълнени квадратчета: NaCl. Дните на третиране са отбелязани върху х-осите. Статистическите данни са изчислени чрез Mann Whitney тест-а. Фиг. 7Б показва хистограма, отбелязваща AUC (областта под кривата) получена от графиката на Фиг. 7А η = броя на животните.

Фиг. 8 показва ефектът на IL18BP върху подуването на лапата. Фиг. 8А показва диаграма, отбелязваща резултатите, получени от измерването на плътността на лапата (подуването) на засегнатите задни лапи на всяко едно от животните, третирани с различни количества IL-18BP. У-оста показва промените в плътността в милиметри от началото на третирането. Символите са както в предишната фигура 7. Фиг. 8Б показва хистограма, отбелязваща AUC получена от Фиг. 8А. η = броя на животните.

Фиг. 9 показва анализа от броя на засегнатите задни лапи по време на остри артрити, т.е. разпространението на

л.

•Ч

заболяването към други стави. Символи: запълнени квадратчета NaCl (контрола), триъгълничета: 10 mg/kg IL-18BP, обърнати триъгълничета: 3mg/kg IL-18BP, ромбове: lmg/kg IL-18BP, кръгчета: 0,5 mg/kg IL-18 ВР и незапълнени квадратчета: 0.25 mg/kg IL-18BP=

Фиг. 10 показва хистограма, отбелязваща скоростта на ерозиа на хрущялите при ставни заболявания.

Фиг. 11 показва хистопатологията на миши стави. В

края на експеримента, лапите които първо са развили артрит се дисектират, фиксират се и се обработват, както е описано в Пример 10 по-долу. Фиг. 11 А: нормална миша става. Фиг. 11Б: става от мишка развила артрит. Фиг. 11 В: става от мишки третирани с rhllL18ВР.

Фиг. 12 показва хистограма, отбелязваща нивата на

анти-колаген тип II антитела от изотип IgGl (незапълнени колони) или IgG2a (защриховани колони) от мишки третирани с 3mg/kg IL18ВР или солеви разтвор, съответно. Измерванията са направени на

4-тия ден (D4) или 8-ия ден (D8) от заболяването.

Фиг. 13 показва хистограма, отбелязваща нивата IL-6 в pg/ml при животни третирани с 1, 3 или 10 mg/kg от IL18BP, 10 000 IU от интерферон β (IFN-b), нормален миши серум (NMS) или солеви разтвор (NaCl), съответно.

транскрипти в чревни биопсии от пациенти страдащи от активна форма на болестта на Crohn, язвени колити или от нормални здрави индивиди. Представените RT-PCR продукти са показани за IL-18BP,

·♦ ·· ·♦ ·· ·· • · · · ···· ···· • · · ···· ·· · за IL-18 и за housekeeping генът»<^-аМ1^>{фиг. 14А). Относителни количествени анализи въз основа на ивиците, оцветени с етидиев бромид са направени, чрез използването на Kodak Digital Imaging Software и са представени като съотношение спрямо прицелният ген за β-актин. Прицелният ген за IL-18 е показан на Фиг. 14Б и за IL18ВР е показан на Фиг. 14 В.

Фиг. 15 показва експресията на hIL-18BP транскрипти и на белтък в HUVECs (човешки ендотелни клетки на пъпната връв) и експресията на белтъка в ТНР1 (човешка моноцитна клетъчна линия). РНК е изолирана от не-третирани ендотелни клетки (в средата) и ендотелни клетки, стимулирани с IL-Ιβ, TNF-a, INF-γ. Положителна контрола: черво от пациент, страдащ от болест на Crohn; негативна контрла: без кДНК. Анализ на IL-18BP и IL-18 експресията се прави чрез полуколичествен RT-PCR (Фиг. 15А). Културална супернатанта от не-третирани клетки (в средата) и след 24 часа активиране с IL-Ιβ, TNF-a, INF-γ на HUVEC (Фиг. 15Б) или ТНР1 (Фиг. 15В) клетки се анализират за IL-18BP и IL-18 белтъчна продукция, чрез ELISA.

Фиг. 16 показва промени в телесното тегло между ден 1 и ден 10 при миши модел на IBD след интраперитонеално (i.p.) въвеждане на солеви разтвор (NaCl) или на IL-18BP (8mg/kg). Промените в телесното тегло се представят като процент променено тегло спрямо ден 1. Показани са средните стойности на SEM от две групи, 8 мишки на група.

Фиг. 17 показва анализа при чревни клетки, каудални лимфни възли и далак, изолирани от IL-18 ВР третирани спрямо нетретирани IBD мишки. Фиг. 17 Б показва общият брой на клетките,

S«МЙ

Z S

9999

9 99

99

99

999999 • · ·· • ·· • 9· ··9999 ·♦ ·· • · ·9

999 • 9 99

9999

КОИТО ПрИСЪСТВа! ь ixUjp,uuinri±L· лймфхш xjjujjlm. 4>Hi . 17 U ПОКаЗВа процента от клетките, оцветени позитивно за CD 4⁺/CD69⁺ в далака. Данните представят средните стойности и SEM. * показва статистически значимите стойности.

Фиг. 18 показва количеството на INF γ (Фиг. 18А и Б) и TNFa (Фиг. 18 В и Г) продуцирани след 48 часа от клетките на каудалните лимфни възли (Фиг. 18 А и В) и от клетките на далака (Фиг 18 Б и Г) след стимулиране с CD3/CD28, присъстващ в супернатантите. Показани са средните стойности и SEM.

Фиг. 19 показва съдържанието на TNF-a (Фиг. 19А) и INFy (Фиг.19Б) в чревни хомогенати. Данните са коригирани за теглото на червото. Показани са средните стойности и SEM. * показва статистически значима разлика.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение се базира на откритието за позитивният ефект на инхибиторите на IL-18 при различни заболявания и нарушения.

Терминът “инхибитор на IL-18” във връзка със същността на това изобретение, се отнася до която и да е молекула, модулираща продукцията на IL-18 и/или действието му, по такъв начин, че продукцията на IL-18 и/или действието му се намалява, редуцира или частично, съществено или напълно се предотвратява или блокира. Терминът “инхибитор на IL-18” се използва за да обхване инхибитори на продукцията на IL-18 както и инхибитори на действието на IL-18.

·· ·· ·. ·· ···· ···· • · ·· · · · • · · · · · · ·· ·♦ • · · · • · · • · · • · ·

Инхибитор**на поопукиията мгНже да бъле която и дя « молекула, която негативно влияе върху синтезата, процесинга или зреенето на IL-18. Инхибитори, считани съгласно настоящето изобретение могат да бъдат например, супресори на генната експресия на интерлевкин IL-18, антисенс-иРНК редуциращи или предотвратяващи транскрипцията на IL-18hPHK или водещи до деградиране на иРНК, протеините предотвратяващи коректното нагъване, или такива, които частично или значително предотвратяват секрецията на IL-18, протеази разграждащи IL-18, след като веднъж е синтезиран, инхибитори на протеазите късащи прекурсора на IL-18 с цел да се предотврати образуването на зряла форма на IL-18, такива като инхибиторите на каспаза-1 и други подобни.

Инхибитор на действието на IL-18 може да бъде IL-18 антагонист. Антагонистите могат или да се свързват или да отделят самата молекула на IL-18 тъй като притежават значителен афинитет и специфичност за частично или значително неутрализиране на IL-

или на IL-18 свързващото място (свързващите места) отговорни за свързването на IL-18 с неговите лйганди (като например към неговия рецептор). Антагонистът може също да инхибира IL-18 сигналния път, който се активира в клетките при свързване на IL-18 с рецептора.

Инхибитори на действието на IL-18 могат също да бъдат разтворими IL-18, рецептори или молекули, имитиращи рецепторите, или агентите блокиращи рецепторите за IL-18, или IL18 антитела, такива като поликлонални или моноклонални антитела, или който и да е друг агент или молекула, предотвратяваща свързването на IL-18 с неговите прицелни места, като по този начин намалява или предотвратява насочването на вътреклетъчни или извънклетъчни реакции, медиирани от IL-18.

·· ·· • · · · • ·· • · ·· • ·· ···· ·· ·* ·· ·· • ··· • · · ·« • ·· · •· · · •· · •· · • ·· ·· ····

Съгласно 11 ЬрВил avilCAi ila ΊίώνϊΟΛΪΙί,Οΐΰ

инхибитори на IL-18 се използват за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от чернодробно увреждане. Поспециално, изобретението се отнася до използване на инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от остри и хронични чернодробни заболявания, и поспециално от хапатит при алкохолици, вирусен хепатит, имунен хепатит, фулминантен хепатит, чернодробна цироза и първична жлъчна цироза.

Терминът чернодробно увреждане или чернодробно заболяване, използван тук включва различни и разнообразни патологични състояния. Някои от състоянията са отнесени към настоящето изобретение и са обяснени в детайли в “Предшестващо ниво на техниката” по-горе. По-нататък чернодробните заболявания, които могат да бъдат лекувани и/или предотвратени съгласно настоящето изобретение включват, например пирогенен чернодробен абсцес. Това заболяване също се нарича бактериално чернодробно заболяване и представлява гной-избиваща дупка в черния дроб. Причините за чернодробен абсцес са многостранни. Той може да се развие при абдоминална инфекция като апендицит, дивертикулит или перфорация на червата; инфекция на кръвта; инфекция на жлъчните ( в чернодробния секрет) пътища; или травма при която нараненият черен дроб се инфектира. Най-често срещаните причинители на чернодробен абсцес са Escherichia coli, Proteus vulgaris и Enterobacter aerogenes. Случаите обхващат 1 на 10,000 хора.

Чернодробните заболявания при алкохолици могат да бъдат лекувани и/или предотвратени, чрез използването на инхибитори на IL-18, съгласно изобретението. Те включват остри или хронични възпаления на черния дроб индуцирани от

I

зз ♦••••••••Ο • · ♦ · · · · · · · · · • · · ···· ·· · _eJ ·· ···· ··»· золупотреба c алкохол **Хеп4тит1?те цЛй ЛЖ>холици, обикновенно се появяват след години на продължително пиене. Колкото по-дълго продължава и в колкото по-големи количества е алкохолната консумация, толкова по-голяма е вероятността от развиване на чернодробни заболявания. Липсата на хранителни вещества се получава като резултат от поемането на празни калории от алкохола, редукция на апетита и понижена абсорбция (неадекватна абсорбция на хранителни вещества в чревния тракт). Липсата на хранителни вещества води до чернодробни заболявания. Токсичността на етанола върху черния дроб, индивидуалното предразположение към алкохол-индуцирани чернодробни заболявания и генетичните фактори също допринасят до развитието на чернодробни заболявания при алкохолици.

В съответствие с настоящето изобретение, чернодробната цироза може да бъде лекувана и/или предотвратена чрез използване на инхибитори на IL-18. Цирозата е хронично чернодробно заболяване, което причинява увреждане на чернодробната тъкан, нараняване на черния дроб (фибрози, нодуларни регенерации), прогресивно намаляване на чернодробната функция, изтичане на течност в абдомена (асцити), нарушения свързани с кървенето (коагулопатия), повишено налягане на кръвоносните съдове (портална хипертензия) и нарушения в мозъчната функция (чернодробна енцефалопатия). В следствие на увреждания и наранявания на черния дроб, той става неспособен за адекватно отстраняване на остатъчните продукти на обмяната (токсините) от кръвта, нараняването на тъканите води до повишено налягане (портална хипертензия) във вените между червата и слезката към черния дроб. Повишена алкохолна консумация води до цироза. Други причини за цироза включват инфекции (като хепатити), заболявания и дефекти при филтрирането на жлъчката

9·99 •999

999

9 9 9 9'

9 9 9

9999 ’V·'г—.

X*W л. f, j ·· ··

9 99

99

99

99

999999 (като жлъчна стексза

9 9 ·

• · • ·

-,.,,,.,:7 дисти^ша фибрроза и ·· ; '*

ГJ * повишена абсорбция на желязо и кобалт.

Типа на цироза зависи от причината на заболяването.

Усложненията причинени от цироза могат да бъдат много остри. В U.S. цирозата е 9-тата поред причина за смъртността. Неврологични проблеми (като хепатитна енцефалопатия) могат да бъдат развити. Повишено събиране на течност в абдоминалната празнина (асцити) се причинява от понижено ниво на телесните протеини, повишен натрий и повишено налягане на кръвоносните съдове в черния дроб (портална хипертензия). Порталната хипертензия може да причини повишено налягане, повишен размер и напълване с кръв на кръвоносните съдове в езофагуса (езофагиални разширения). Могат да се появят проблеми с кървенето и съсирването. Повишеното налягане на кръвоносните съдове и проблемите с кръвосъсирването могат да повишат вероятността от остри и живото-застрашаващи хеморагии.

Следващо увреждане, което може да бъде причислено към термина “чернодробно увреждане” съгласно настоящето изобретение е автоимунния хепатит. Това заболяване е възпаление на черния дроб, причинено от взаимодействие с имунната система. Автоимунния хепатит е тип хронично активен хепатит. Клетъчни имунни реакции могат да причинят хроничен активен хепатит. Много от циркулиращите антитела могат да бъдат открити в кръвта на пациенти с хронични активни хепатити. Други автоимунни заболявания могат да бъдат свързани с хроничен активен хепатит или могат да се намерят в роднини на пациенти с хроничен активен хепатит. Тези заболявания са тироидит, захарен диабет, язвени колити, Combs-позитивна хемолитична анемия, пролиферативни гломерулонефрити и синдром на Sjogren. Рисковите фактори могат да включват тези заболявания или рискови фактори свързани с

хроничен активен xenaiiii. Забиллвогкаи Се среща пра 4 ei веещ; 10,000 хора.

Жлъчната артрезия е следващо заболяване в обхвата на термина “чернодробно увреждане”. Тя представлява обструкция на жлъчните канали, причинена от неспособност да функционират още в процеса на образуването им преди раждането (in utero). Жлъчната артрезия се причинява от аномално и неадекватно развитие на жлъчните канали вътре или извън черния дроб. Целта на жлъчната система е да отвежда остатъчните продукти от черния дроб, да доставя жлъчните соли необходими за разграждане на мазнините до тънките черва. При това състояние, жлъчния поток от черния дроб до жлъчния мехур е блокиран. Това може да доведе до чернодробно увреждане и цироза на черния дроб, което ако не се лекува при всички случаи е фатално.

Съгласно изобретението, инхибитори на IL-18 също се използват за производството на медикамент, за лечение и/или предпазване от хроничен активен хепатит, също наречен хроничен агресивен хепатит. Той представлява продължително възпаление на черния дроб, което причинява увреждания на чернодробните клетки. Причините за хроничен активен хепатит, включват вирусна инфекция, реакция срещу въвеждане на лекарствен препарат, метаболитни нарушения или автоимунни заболявания. Може да няма и никаква очевидна причина. Заболяването се характеризира с некроза или смърт на чернодробните клетки, активна възпалителна реакция и фиброза, която моеже да доведе до чернодробна дисфункция, цироза или смърт. Заболяването се среща при всеки 1 от 10,000 хора. Рискови фактори са автоимунните заболявания, предишна инфекция с хепатит С или позитивна реакция за хепатит А или хепатит В антиген над 6 месеца.

.··..··. .··.♦··.

··· · · · · · · · •J !·· * * ··· · · * · · ··«· · · ·

Хроничйкя? xentfrnf· npoftbjfOBa известно нремсч като мека, непрогресивна форма на чернодробно възпаление и също е заболяване, причисляващо се към термина “чернодробно увреждане”, съгласно настоящето изобретение.

Съгласно настоящето изобретение, инхибитори на IL-18 също се използват за производството на медикаменти за лечение и/или предпазване от първична жлъчна цироза (РВС). РВС е състояние на възпаление, причинено от обструкции на жлъчния поток в черния дроб, причиняващи увреждания на чернодробните клетки. Жлъчните канали в черния дроб се възпаляват поради неизвестна причина. Заболяването се среща предимно при жени на средна възраст. Началните симптоми са постепенни, като първо се появява сърбеж на кожата. Появява се и възпаление на жлъчните канали в черния дроб. Във всички случаи се развива жлъчна цироза. Заболяването може да бъде свързано с автоимунни нарушения. Заболяването се среща при всеки 8 от 100,000 души. Инхибиторите на IL-18 описани тук, могат да бъдат използвани за лечение на остри чернодробни натравяния, например причинени от високо количество парацетамол. Такива остри чернодробни натравяния могат да се дължат на предозиране с парацетамол и могат да бъдат случайно или нарочно причинени.

Както е показано в примерите по-долу, изобретателите на настоящето изобретение изненадващо откриват че инхибитори на IL-18 са отчасти ефективни за предпазването и лечението на фулминантен хепатит (остър хепатит). Ето защо изобретението за предпочитане се отнася до предпазване и/или лечение на флуминантен хепатит.

Съгласно втори аспект на настоящето изобретение, инхибитори на IL-18 се използват за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от артрит. Терминът “артрит кадто се z s ·· ·· • · · · • · ·· • · · · · • · · · .

·· ·· ·· • · · • · • · • · ···· ·· ·· ·· • · · · * · · • · · • · · ···· ·· използва тук включва всички типове αρϊρΐίΐΗ й артритни иъсюмйил, и острите и хронични артрити, како е дефинирано например в интернет страницата на Департамента по Ортопедия на Университета по Артритни заболявания, Вашингтон (www.orthop.washington.edu). Примери за артритни състояния са анкилозните спондилити, болки в гърба, синдрома на разместената китка (carpal), синдрома на Ehlers-Danlos, подагра, младежки артрит, лупус еритроматозус, миозити, остеогенени нарушения, остеопорози, полиартрерити, полимиозити, псориазис-артрити, синдром на Reiter, склеродема, артрити свързани с чревни заболявания, болест на Behcet, детски артрити, дегенеративни ставни заболявания, фибромиалгия, инфекциозни артрити, болест на Lyme, синтдром на Marfan, остеоартрити, остеонекрози, болест на Pagets, полимиалгия ревматика, превдоподагра, дистрофия на симпатикусовия рефлекс, ревматоиден артрит, ревматизъм, синдром на Sjorgen, семейни аденоматози, полипоза и други подобни.

За предпочитане, съгласно настоящето изобретение, инхибитори на IL-18 са осигурени, за лечение и/или предпазване от възпалителни артрити. Възпалителните артрити се класифицират като хронични артрити, съгласно появата и продължителността им, или повтарящата се поява на болестта.

В предпочитан вариант на изобретението, възпалителен____ артрит е ревматоидния артрит (RA). RA причинява възпаление на обвивките на ставите (синовиалната мембрана, епителна клетъчна обвивка) и/или на вътрешните органи. Тенденцията на заболяването е да продължи много години, като засяга обикновенно много различни стави на тялото и от друга страна може да причини увреждания на хрущялите, костите, сухожилията и лигаментите.

Ставите, които могат да бъдат засегнати от RD са вратните стави, раменните стави, лакътните стави, бедрените стави, китките, ставите

···· ·· ·· ·· ·· ··»· на ръцете, ко?т?г.ч, гл??ч ставчтс ни стъпяпзтя например. В много случаи, ставите са възпалени симетрично, което е типична картинка за RA.

RA преобладава при 1% от популацията на Съединените Щати и е разпространен при всички етнически групи и възрасти. Появява се по целия свят и като броят на жените превъзхожда 3 пъти този на мъжете страдащи от RA.

Както е показано в примерите по-долу, доказано е, че инхибитор на IL-18 показва висока ефективност и позитивен ефект върху ерозирането на хрущялите. Ето защо изобретението понататък се отнася до използване на инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване на хрущялна деструкция, т.е. до използването на инхибитор на IL-18 като хондропротективен агент. Инхибиторът на IL-18 може да се използва за всяко едно състояние, при което се появява хрущялна деструкция или ерозия. Хрущялната деструкция представлява е прогресивно разрушаване на структурният интегритет на ставния артикуларен хрущял. Тя се появява например при състояния, засягащи артикуларния хрущял, като ревматоиден артрит, младежки ревматоиден артрит или остеоартрит, но също и при синовиални инфекции например.

Трети аспект от настоящето изобретение се отнася до използването на инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от възпалително чревно заболяване. То се базира на откритието, че инхибитор на IL-18 подтиска възпалението на мукозата при пациенти страдащи от CD. По-нататък то се базира на откритието, че въвеждането на различни инхибитори на IL-18 имат предпазен ефект при миши модели на колити.

• · ·· ···· пациенти, вече е описана в нивата на техниката (Monteleone, et. al.

1999, Pizarro, et al. 1999).

След като е демонстрирано присъствието на големи количества от IL-18 ВР във районите на възпаление на чревната мукоза, съгласно изобретението, още по-изненадващо е откритието, че системното въвеждане на IL-18BP има изявен позитивен ефект

при развиването на симптомите на колити при животински модели. Въпреки че IL-18BP вече ендогенно се повишава при подагра на CD пациенти, демонстрирано е в примерите по-долу, че количеството на IL-18BP в тялото, което е възможно да се продуцира, не е достатъчно за да се пребори с болестта.

За предпочитане, съгласно настоящето изобретение, възпалителното заболяване на червата е болест на Crohn или язвен колит.

В предпочитан вариант на настоящето изобретение, инхибитор на IL-18 се избира от инхибиторите на каспаза-1 (ICE), от антитела насочени срещу IL-18, от антитела срещу която и да е субединица на рецептора за IL-18, от инхибитори на IL-18 сигналния път, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират IL-18 рецептора и IL-18- свързващи белтъци, от изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални пермутирани производни, активни фракции или произхождащи от тях циклични премутирани производнии, които имат същата активност.

Терминът “IL-18 свързващи белтък” се използва тук като синоним на “IL-18BP”. Той включва IL-18 свързващи белтъци дефинирани в WO 99/09063 или в

Novick et al., 1999, включващи комбинирани варианти и/или изоформи на IL-18 свързващите белтъци, както е ·· ·· • · · ·

• · · · • · · · дефинирано • · · · · · в K?m et я • · · ·

00П • · · ·· ··· ·

Πη-специално, човешките изоформи а и с на IL-18BP се използват, съгласно настоящето изобретение. Белтъците използвани, съгласно настоящето изобретение могат да бъдат гликозилирани или не-гликозилирани, те могат да бъдат производни на естествени източници, като урината или за предпочитане да бъдат получени, като рекомбинантни. Рекомбинантната експресия може да бъда осъществена в прокариотни експресионни системи, като E.coli или в еукариотни и за предпочитане от бозайници, експресионни системи.

Както се използва тук, терминът “мутеини” се отнася до аналози на IL-18BP, или аналози на вирусен IL

18ВР, при които един или повече аминокиселинни остатъка, са отстранени или един или повече аминокиселинни остатъка са добавени към естествената секвенция на IL-18BP, или на вирусният IL-18BP без да се променя съществено активността на получените продукти, в сравнение с дивия тип IL-18BP. Тези мутеини се приготвят чрез известни синтетични методи и/или чрез техника на насочен мутагенез или чрез други подходящи известни техники.

Всеки мутеин за предпочитане има секвенция от аминокиселини, значително дублираща тази на IL-18BP, или значително дублираща тази на вирусният IL-18BP. Една от активностите на IL-18BP е свързана със способността му да се свързва с IL-18. Колкото по-дълго време мутеина има значителна свързваща активност към IL-18, толкова по-успешно той може да бъда използват за пречистване на IL-18 чрез афинитетна хроматография и по този начин може да се счита, че има значително • ·· · · · · ··· наподобяваща актйвйо‘йт на”таЗй на’11>‘!ЗВР. Следователно, може да се определи дали даден мутеин има по същество същата активност, като IL-18BP чрез рутинни експериментални средства, включващи подлагане на такъв мутеин, например на прост сандвич-конкурентен анализ за определяне дали се свързва или не се свързва правилно с белязан IL-18, чрез радиоимуно-анализ или чрез ELISA.

Мутеините на полипептидите на IL-18BP или мутеините на вирусните IL-18BP, които могат да бъдат използвани, съгласно настоящето изобретение, или кодиращите ги нуклеинови киселини, включват ограничена група от значително съответстващи секвенции или заместващи пептиди или полинуклеотиди, които могат да бъдат рутинно получени от който и да е специалист в областта, без провеждане на крайни експерименти, на базата на техники и ръководства, представени тук.

Предпочитани промени при приготвянето на мутеини, съгласно настоящето изобретение са тези, известни като “консервативни замествания”. Консервативни аминокиселинни замествания в полипептидите или в белтъците на IL-18BP или във вирусните IL-18BP могат да включват синонимни аминокиселини, от групата в която аминокиселините имат съществено еднакви физикохимични свойства, при които замествания между отделните членова на групата ще се запази биологичната функция на молекулата (Grantham, 1974). Ясно е че инсерции и делеции на аминокиселини, могат също да бъдат направени в горе-дефинираните секвенции, без да се промени тяхната функция, поспециално ако инсерциите или делециите да обхващат само

·· ·· ·· ·· ···· ···· · · · · • · · ···· ·· · • ·· ···· ··· ···· ·· ·· ·· ·· »··· _ няколко аминокисечинн, например пол 30 и за предпочитане под десет, и при които не се отстранява или заместват аминокиселините които са от критично значение за функционалната конформация, например цистеинови остатъци. Белтъци и мутеини, получени чрез такива делеции и/или инсерции са включени в настоящето изобретение.

За предпочитане синонимните аминокиселинни групи са тези, дефинирани в Таблица I. По-предпочитани, синонимни аминокиселинни групи за тези, дефинирани в Таблица II; и най предпочитани синонимни аминокиселинни групи са тези дефинирани в Таблица III.

ТАБЛИЦА I

ПРЕДПОЧИТАНИ ГРУПИ ОТ СИНОНИМНИ

АМИНОКИСЕЛИНИ

Аминокиселини	Синонимни групи
Ser !	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	lie, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu
Pro ;	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr

Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	« « I · ·· ! i	Met, Tyr,' Phe, lie, Leu, Val
Gly	♦ * i i «··· »· * И ·« * ..	Ala, Thr, Pro. Ser, Gly
He		Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie
Phe 1		Trp, Met, Tyr, He, Val, Leu, Phe
Tyr ;		Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr
Cys		Ser, Thr, Cys
His		Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin		Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn		Gin, Asp, Ser, Asn
Lys		Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp		Glu, Asn, Asp
Glu		Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met		Phe, lie, Val, Leu, Met
Trp	ТАБЛИЦА II	Trp

ПО-ПРЕДПОЧИТАНИ ГРУПИ синонимни АМИНОКИСЕЛИНИ

Аминокиселини	Синонимни групи
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, lie, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, lie
GJy	Gly
J	He, Met, Phe, Val. Leu
Phe	Met, Tyr, lie, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His

Itt —i ·· ·· ..44. ··· . ·· . . ·. . . ...

• · · .... ··.

. · · .......

···. ·· ·· ·· ·· ····

Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, lie, Val, Leu
Trp	Trp

© ТАБЛИПА III

НАЙ-ПРЕДПОЧИТАНИ ГРУПИ ОТ СИНОНИМНИ

АМИНОКИСЕЛИНИ

Аминокиселини

Синонимни групи

Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, lie, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
lie	lie, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met,

• Φ фф • · · · фф ·♦ • · · • · ··

Примери яа получаването на яминокиселинни замествания в белтъци, които могат да бъдат използвани за получаване на мутеини от полипептиди или белтъци на IL18 ВР, или мутеини от вирусни IL-18BP за приложение в настоящето изобретение включват които и да са известни стъпки на метода, както са предстванени в US патенти RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, и 4,737,462 на Mark et al.; 5,116,943 на Koths et al., 4,965,195 на Namen et al.; 4,879,111 на Chong et al., и 5,017,691 на Lee et al; и лизин заместени белтъци представени в US патенти No. 4,904,584 (Shaw et al).

Терминът “рекомбинантен белтък” се отнася до полипептид, включващ IL-18BP или вирусен IL-18BP, или мутеин или фрагменти от тях, рекомбинантно свързани с друг белтък, който например има по-дълго време на живот в телесните течности. IL-18 ВР или вирусен IL-18BP може по този начин да бъде рекомбинантно свързан с друг белтък, полипептид или подобни, например с имуноглобулин или фрагмент от него.

“Функционални производни”, както се използва тук, включва производни на IL-18 BPs или на вирусен IL-18BP и техни мутеини и рекомбинантни белтъци, които могат да бъдат приготвени от функционални групи, които се явяват странични вериги на остатъците или на N- или на С-крайно разположените групи, известни в областта и които са включени в изобретението дотолкова доколкото те остават фармацевтично приемливи, т.е. те не нарушават активността на белтъка, която е по същество същата като активността на IL-18BP или на вирусните IL-18BP и не се ·· ·· ·· 46* · ·· • · · η · · · · · · • · · · · ·· ·· · • ·· · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ···· съобщава съединенията, които ги включват да имат токсични свойства.

Тези производни могат например да включват полиетилен гликолови странични вериги, които могат да маскират антигенните места и да удължат времето на живот на IL-18BP или на вирусния IL-18BP в телесните течности. Други производни включват замествания със алифатни естери на карбоксилни групи, със амиди на карбоксилни групи, чрез реакция с амоний или първични или вторични амини, с N-ацилни производни на свободни амино групи на аминокиселинни остатъци образувани с ацилни остатъци (например алканоил или карбоциклени арилни групи) или О-ацилни производни на свободни хидроксилни групи (например тези на серилови или треонилови остатъци) формиращи ацилови остатъци.

Като “активни фракции” на IL-18BP, или на вирусен IL-18BP, мутеини и рекомбинантни белтъци, настоящето изобретение включва който и да е фрагмент или прекурсори на полипептидни вериги от белтъчните молекули, самостоятелни или заедно със свързани към тях молекули или остатъци, например захари или фосфатни остатъци, или агрегати на белтъчна молекула, или самите захарни остатъци, които осигуряват споменатата функция да запазят по същество същата активност на IL-18BP.

В предпочитан вариант на изобретението, инхибитор на IL-18 е IL-18 антитялото. Ahth-IL-18 антителата могат да бъдат поликлонални или моноклонални, химерни, хуманизирани, или даже да са човешки. Рекомбинантните антитела и фрагментите от тях се характеризират с висок афинитет на свързване към IL-18

xtOiiiV ivividl

in vivo бъдат използвани в изобретението са характеризирани в зависимост от тяхната способност за лечение на пациенти за достатъчен период за да се получи добра регресия или облекчаване на патогенно състояние или симптом или група от симптоми, отнасящи се до патогенно състояние или ниска токсичност.

Неутрализиращите антитела лесно се получават от животни, като плъхове, кози, мишки чрез имунизация с IL-18. По-специално се използват имунизираните мишки, като източник осигуряващ В-клетки за производство на хибридоми, които се култивират за да продуцират големи количества от анти-1Ь-18 моноклонални антитела.

Химерните антитела са имуноглобулинови молекули, характеризирани по два или повече сегмента или

участъци, получени от различни животински видове. Найобщо, вариабълните райони на химерните антитела се получават от бозайници, различни от човека, като от миши моноклонални антитела, а имуноглобулиновия константен район се получава от човешка имуноглобулинова молекула. За предпочитане е двата района и комбинацията от тях да дава ниска имуногенност както рутинно е определено (Elliott et al., 1994). Хуманизираните антитела са имуноглобулинови молекули, създадени чрез генно инженерни подходи в които мишата константна област е заместена с човешка част и е оставена мишата антигенсвързваща част. Получените мишо-човешки химерни антитела за предпочитане притежават редуцирана имуногенност и подобрени фармакокинетични свойства при прилагане при хора (Knight et al., 1993).

• ♦ · • · · · • · 9 • ·· ···· ·«· ··*· ·· ·· ·· ·· ····

Следователпи, no-на гатък в предпочитан вариант, IL-18 антитялото е хуманизирано IL-18 антитяло. Предпочитани примери на хуманизирани анти-IL-18 антитела са описани, например в заявка на Европейски патент ЕР 0 974 600.

В още по-предпочитан вариант, IL-18 антитялото

е напълно с човешки произход. Технологията за продуциране на човешки антитела е описана в подробности, например в WO00/76310, WO99/53049, US 6,162,963 или AU5336100. Човешките антитела са за предпочитане рекомбинанантни антитела, получени от трансгенни животни, например ксеномишки, вкючващи всички части на функционалните човешки Ig локуси.

В един от най-предпочитаните варианти на настоящето изобретение, инхибитора на IL-18 е IL-18 ВР или изоформа, мутеин, рекомбинантен протеин, функционално производно или негово цикличен пермутирано производно. Тези изоформи, мутеини, рекомбинантни протеини или функционални производни, запазват биологичната активност на IL-18BP, по-специално свързващата способност на IL-18 и за предпочитане имат по същество активност най-малко подобна на тази на IL18ВР. Такива идеални протеини имат даже повишена биологична активност в сравнение са немодифицирания IL18ВР. Предпочитаните активни фракции имат активност, която е по-добра от активността на IL-18BP или имат други предимства, като по-добра стабилност или намалена токсичност или имуногенност, или са по-лесни за получаване в големи количества или са по-лесни за пречистване.

s

iiiitc no. IL 1SEP « варианти на сплайсинг/изоформи могат да бъдат взети от W099/09063 или or Novick et al., 1999, както и от Kim et al., 2000.

Функционалните производни на IL-18BP могат да бъдат конюгирани към полимери за да се подобрят качествата на белтъка, като например стабилност,

полуживот, бионаличност, толерантност към човешкото тяло, или имуногенност. За да се осъществи тази цел, IL18ВР може да бъде свързан например към Полиетиленгликол (PEG), PEG-свързването може да бъде

направено, например чрез известни методи, описани в WO 92/13095.

Ето защо в предпочитан вариант на настоящето изобретение, IL-18BP е PEG-свързан.

По-нататък в предпочитан вариант на изобретението, инхибитор на IL-18 е рекомбинантен белтък, включващ целия или част от IL-18 свързващия протеин, която се свързва рекомбинантно със целия или с част от имуноглобулин. За специалистите в областта ще стане ясно, че полученият рекомбинантен протеин запазва биологичната активност на IL-18BP, по-специално способността да се свързва с IL-18. Рекомбинантното свързване може да бъде опосредствено, от къс линкерен пептид, който може да бъде къс от 1 до 3 аминокиселинни остатъка или по-дълъг, например 13 аминокиселинни остатъци. Споменатият линкер може да бъде трипептид на секвенцията E-F-M (Glu-Phe-Met), например или 13 аминокиселинният линкер може да има секвенция Glu-PheGly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met въведен между IL-18BP секвенцията и имуноглобулиновата

• · • · • · · · секвенция. Полученият подобрени качества, като

5Q··..··. .··..··.

.: · ·· : ·: :

*........

рекомбинантен белтък има повишено време на живот в телесните течности (време на полуживот), повишена специфична активност, повишено ниво на експресия или възможност за улеснено пречистване на рекомбинантния протеин.

В предпочитан вариант, IL-18 ВР е рекомбинантно свързан с константната област на Ig молекулата. За предпочитане, той е рекомбинантно свързан

с тежката верига на районите, като например СН2 и СНЗ домените на човешкия IgGl. Създаването на специфични рекомбинантни белтъци, съдържащи IL-18BP и части от имуноглобулини е описано например в Пример 11 на WP99/09063. Други изоформи на Ig молекулите са също подходящи за създаването на рекомбинантни белтъци, съгласно настоящето изобретение, като изоформите IgG2 или IgG4 или други Ig класове, като например IgM или IgA. Рекомбинантните белтъци могат да бъдат мономерни и мултимерни, хетеро- или хомомултимерни.

Интерфероните са известни предимно с техните инхибиторни ефекти върху вирусната репликация и върху клетъчната пролиферация. Интерферон-γ, например играе основна роля в стимулирането на имунните и възпалителните . отговори. За интерферон β (INF-β, интерферон тип I) се казва, че играе противо-възпалителна роля. Изследвания, публикувани от Triantaphyllopoulos et al (1999) показват, че INF-β има благоприятен ефект при лечение на ревматоиден артрит, както е показано за миши модел на заболяването, и при модел на колаген-индуциран • ·· : : : .. · : .· „ ΖΟ =-==-- ^:···.·=·· арТрйТ ^Clzxy. 1 03il Ouiai ОИрйя 1 Cxi СфеКГ Η3 ΙΝΦ-β β потвърден в примерите по-долу.

Изобретението също се отнася до използването на комбинация на инхибитор на IL-18 и интерферон за производството на медикамент за лечение на артрит, поспециално за лечение на ревматоиден артрит.

Интерфероните могат също да бъдат свързани с полимери за да подобрят стабилността на белтъците. Конюгат между интерферон-β и полиолът Полиетилентликол (PEG) е описана например в WO99/55377.

В друг предпочитан вариант на изобретението, интерферонът е интерферон -β (INF-β), и в още попредпочитан вариант INF-β 1а.

Инхибиторът на продукцията и/или действието

·£.. на IL-18 за предпочитане се използва едновременно, последователно или поотделно с интерферонът.

В друг следващ вариант на изобретението, инхибитор на IL-18 се използва в комбинация с TNF антагонист. TNF антагонистът оказва влияние върху тяхната активност по няколко начина. Първо, антагонистът може да свърже към или пооделно да се свърже към самата TNF молекула със значителен афинитет и специфично или частично или съществено да неутрализира TNF епитопа или епитопите отговорни за TNF рецепторното свързване (дадени тук с термина “секвесиращи антагонисти”). Секвестиращ антагонист може да бъде например, антитяло, 'Λ'· насочено срещу TNF.

От друга страна, TNF антагонистите могат да инхибират TNF сигналният път, активиран от клетъчно повърхностния пепел • ·

TNF свързването (дадени тук с термина “сигнални антагонисти”). И двете групи антагонисти са приложими самостоятелно или заедно, в комбинация с инхибитор на IL-18 за лечение на артрити, по-специално на ревматоиден артрит.

TNF антагонистите лесно се идентифицират и се анализират чрез рутинен скрининг на кандидатите притежаващи техния ефект, на активността на нативният TNF върху in vitro компетентна клетъчна линия, например човешки В-клетки, в които TNF води до пролиферация или секреция на имуноглобулини. Анализът касае TNF състава на различни разреждания на кандидатите антагонисти, например от 0,1 до 100 пъти моларната концентрация на използвания TNF в анализа и контроли без TNF или само с антагонисти (Tucci et al., 1992).

Секвестиращите антагонисти са предпочитаните TNF антагонисти, които се използват съгласно настоящето изобретение. Между секвестиращите антагонисти, тези полипептиди, които свързват TNF с висок афинитет и притежават ниска имуногенност са предпочитани. Поспециално предпочитани са разтворимите TNF рецепторни молекули и неутрализиращите антитела за TNF. Например разтворимият TNF-RI и TNF-RII се използват в настоящето изобретение. Скъсени форми на тези рецептори, включващи извънклетъчни домени на рецепторите или функционални части от тях са още по-предпочитани антагонисти, съгласно настоящето изобретение. Скъсени разтворими TNF тип-I и тип-П рецептори са описани например в ЕР914431.

53..

.:..·..· ·..·*..’ ·· ··.··

Скъсените фирми на TNF рецепторите, са разтворими и те се срещат в урината и серума, като 30 кДа и 40 кДа протеини, инхибиращи свързването с TNF, които се наричат TBP I и TBP II, съответно (Engelmann et al., 1990). Едновременното, последователното или поотделното използване на инхибитори на IL-18 с TNF антагонисти и/или предпочитан интерферон, е за предпочитане съгласно настоящето изобретение.

Съгласно изобретението TBP I и TBP II са предпочитани TNF антагонисти, които се използват в комбинация с инхибитор на IL-18. Производни, фрагменти, райони и биологично активни участъци на рецепторните молекули функционално наподобяващи рецепторните молекули, могат също да бъдат използвани в настоящето изобретение. Такива биологично активни еквиваленти или производни на рецепторните молекули се отнасят към участъци от полипептида или от секвенцията кодиращ рецепторните молекули, които са със значителен размер и са способни да свързват TNF с такъв афинитет, че взаимодействието с мембранно-свързания TNF се инхибира или блокира.

В следващ предпочитан вариант, човешки разтворим TNF-RI (TBPI) е TNF антагонист, който се използва съгласно настоящето изобретение. Естествени и рекомбинантни TNF рецепторни молекули и методи за тяхното получаване са описани в Европейски патенти ЕР 308 378, ЕР 398 327 и ЕР 433 900.

Инхибиторът на IL-18 може да бъде използван едновременно, последователно или поотделно с TNF инхибитор. Предимно, комбинация от IL-18 антитяло или ··

антисерум и разтворим? форма ч? ^TNF рецептора, коя^п притежават TNF инхибираща активност се използват.

В следващ предпочитан вариант на изобретението, медикаментът по-нататък включва СОХинхибитор, за предпочитане СОХ-2инхибитор. СОХ инхибиторите са известни в областта. Специфичните СОХ2 инхибитори са описани в W001/00229, например.

Изобретението по-нататък се отнася до използването на комбинация от IL-18 инхибитори и/или интерферони, и/или TNF антагонисти и/или СОХ-2 инхибитори. Комбинацията е подходяща за лечение и/или предпазване от артрит, по-специално от ревматоиден артрит и за лечение и/или предпазване от чернодробни увреждания и за лечение и/или предпазване от чревни възпалителни заболявания, по-специално болест на Crohn и язвен колит. Активните компоненти могат да бъдат

използвани едновременно, последователно или поотделно.

В предпочитан вариант на настоящето изобретение, инхибитор на IL-18 се използва в количество около 0,0001 до. 10 mg/kg от телесното тегло, или около 0,01 до 5 mg/kg от телесното тегло или около 0,1 до 3 mg/kg от телесното тегло или около 1 до 2 mg/kg от телесното тегло. В друг следващ вариант на изобретението, инхибиторът на IL-18 се използва в количество от около 0,1 до 1000 gg/kg или от 1 до 100 gg/kg от телесното тегло, или около 10 до 50 gg/kg от телесното тегло.

Изобретението по-нататък се отнася до използване не експресионен вектор, включващ кодираща последователност на инхибитор на IL-18 при приготвянето на медикамент за предпазване и/или лечение на артритни χ· ✓

състояния или артрити, по-специално ревматоиден артрит, за лечение на чернодробни увреждания, и за лечение на чревни възпалителни заболявания. Следователно се прилага подход на генна терапия, за лечение и/или предпазване от заболявания. С предимство се използва in situ експресията на инхибитор на IL-18, като така се блокира директно IL-18 в засегнатите тъкан (тъкани) или клетки при заболяванията.

За да оказва ефект при лечението и/или предпазването от артрит, за генната терапия се използва вектор, включващ последователност на инхибитор на IL-18 продукцията и/или действието и той може да бъде инжектиран в заболялата става, например, като по този начин се избягват проблемите при системното въвеждане на вектори за генна терапия, като разтваряне на векторите, насочване и достигането им до прицелните клетки или тъкани, и странични ефекти.

Използването на вектор за индуциране и/или повишаване на ендогенната продукция на инхибитор на IL18 в клетка, която нормално не експресира инхибитор на IL-18 или която експресира недостатъчни количества от инхибитора, също се обсъждат съгласно изобретението. Вектора може също да включва регулаторни последователности, които функционират в клетките по желаният начин, за да експресират инхибитор на IL-18. Такива регулаторни последователности могат да бъдат въведени в правилния локус на генома чрез хомоложна рекомбинация, като по този начин оперативно свързват регулаторната последователност с гена, чиято експресия трябва да се индуцира или повиши. Технологията t

·· ·· • · · ·

·· · ·

обикновенно се отнася до “едногеннб генно активиране” (EGA) и е описана, например в WO91/09955.

Ще се разбере от този, който е специалист в областта, че също е възможно да се подтисне експресията на IL-18, чрез използване на същия метод, т.е чрез

I въвеждане на негативно регулаторен елемент, като например елемент, който подтиска експресията в локуса на гена за IL-18, като това води до намаляване или предотвратяване на експресията на IL-18. Този, който е специалист в областта, ще разбере, че това намаляване или подтискане на експресията на IL-18 има същия ефект, както и използването на инхибитор на IL-18 за да се предотврати и/или осъществи лечение на заболяването.

Изобретението също се отнася до използване на клетка, която е генетично модифицирана да продуцира инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване на чернодробно увреждане, артрит или чревно възпалително заболяване.

Изобретението по-нататък се отнася до фармацевтични състави, частично използвани за предпазване и/или лечение на възпалителни артрити, чернодробни увреждания или чревни възпалителни заболявания, които включват прилагането на терапевтично ефективно количество на инхибитор н IL-18 и терапевтично ефективно количество от интерферон. Като инхибитор на IL-18, съставът може да включва инхибитори на каспаза-1, антитела срещу IL-18 , антитела срещу която и да е субединица на рецептора за IL-18, инхибитори на IL18 сигналния път, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират рецептора за IL-18 и IL-18 свързващи белтъци,

• ·

изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или циклични пермутирани техни производни, същата активност.

които имат

IL-18BP и изоформите, мутеините, рекомбинантните белтъци, функционалните производни, активните фракции или цикличните пермутирани производни, както е описано по-горе са предпочитани активни съставки на фармацевтичните състави.

Интерферонът, включен във фармацевтичния състав за предпочитане е INF-β.

В друг предпочитан вариант, фармацевтичният състав включва терапевтично ефективни количества от инхибитор на IL-18, по избор интерферон и TNf антагонист. TNF антагонистите могат да бъдат антитела, неутрализиращи TNF активността, или разтворими скъсени фрагменти от рецептора за TNF, също наречени TBPI и ТВРП. Фармацевтичен състав, съгласно изобретението може по-нататък да включва един или повече СОХ инхибитори, за предпочитане СОХ-2 инхибитори.

Дефиницията “фармацевтично приемлив” има за цел да обхване който и да е носител, който не взаимодейства ефективно с биологичната активност на активната съставка и следователно не е токсичен за гостоприемника при който се прилага. Например, за пренатално въвеждане, активния белтък (белтъци) може да бъде формулиран в единица доза от инжекция със солеви разтвор, декстрозен разтвор, серумен албумин и Рингеров разтвор.

·· ..58 • . · . . · .

. · · ···· ..

Активните съставки на фармацевтичния състав съгласно изобретението могат да бъдат въведени в индивида по различни начини Начините на въвеждане включват интрадермално, трансдермално (например като слабо освобождаващи се състави), вътремускулно,

интраперитонеално, интравенозно, подкожно, орално, епидурално, повърхностно и интраназално. Всеки от терапевтично ефикасните пътища на въвеждане може да бъде използван, например абсорбцията чрез епителната или ендотелната тъкан или генната терапия, където ДНК

молекула кодираща активния агент се въвежда в пациент (например чрез вектор), която води до експресията на активен агент или секрецията му in vivo. В допълнение, белтъкът (белтъците) съгласно настоящето изобретение могат да бъдат въведени заедно с други компоненти на биологично активни агенти, като фармацевтично приемливи сърфактанти, ексципиенти, носители, разтворители или физиологични разтвори.

За пренатално (например интравенозно, подкожно вътремускулно) въвеждане на активния белтък (белтъци) може да бъде направен разтвор, суспензия, емулсия или лиофилизиран прах във фармацевтично приемлив пренатален физиологичен разтвор (например вода, солеви разтвор, декстрозен разтвор) и добавки които поддържат изотоничността (например манитол) или химичната стабилност (например презервативи или буфери). Смесите се стерилизират, съгласно общоприети използвани техники.

Бионаличността на активният белтък (белтъци) съгласно изобретението могат също да бъдат подобрени

Г

·· ·· • · · · • · ·· • · ··· ·· °· • · · · · · · ···· ·· ·· ··

чрез използването на конюгираши методи, които увеличават полуживота на молекулите в човешкото тяло, например свързването на молекули с полиетиленгликол, както е описано в РСТ Патентна заявка WO 92/13095.

Терапевтично ефективните количества от активния белтък (белтъци) ще зависят от много параметри, включващи типа на антагониста, афинитета на антагониста за IL-18, който и да е остатък с цитотоксична активност от страна на антагониста, пътя на въвеждане, клиничното състояние на пациента (включително и изискването за поддържане на не-токсично ниво на ендогенната активност на IL-18).

“Терапевтично ефективно количество” е това, което когато е въведено, инхибитора на IL-1-8 води до инхибиране на биологичната активност на IL-18. Дозата на въвеждане като единична доза или като многократни дози, в индивид ще варира в зависимост от много фактори, включително фармакокинетиката на инхибитора на IL-18, пътя на въвеждане, състоянията на пациента и други характеристики (пол, възраст, телесно тегло, здраовсловно състояние, размер) степента на симптомите, текущо лечение, честота на лечението и желания ефект. Нагласяването и манипулациите с установени дозови вариации са в компетенцията на специалистите в областта, както и in vitro така и in vivo методите за определяне на инхибирането на IL-18 в един индивид.

Съгласно изобретението, инхибитор на 1L-18 се използва в количество около 0,0001 до 10 mg/kg или около

0,01 до 5 mg/kg на телесно тегло или около 1 до 2 mg/kg от телесното тегло. Други предпочитани количества от

Г ·· фф φ φ ·· • φ· φ φ· φ ·· φ«φφ ··

инхибитори на IL-18 са количествата около 0,1 до 1000 pg/kg телесно тегло или около 1 до 1 OOpg/kg телесно тегло или около 10 до 50 pg/kg телесно тегло.

Пътят на въвеждане, който е за предпочитане съгласно изобретението е подкожно въвеждане. На второ място, съгласно изобретението се предпочита вътремускулното въвеждане.

По-нататък в предпочитани варианти, инхибиторът на IL-18 се въвежда всеки ден или през ден.

Дневните дози обикновенно се дават на разделни дози или като задържащо освобождаване до ефективно за да се получат желаните резултати. Повторни или последващи въвеждания могат да се приложат при дозиране, което е същото, по-малко или повече от първоначалното или от предишното дозово въвеждане в индивида. Второто или последващо въвеждане може да бъде приложено по време или преди началото на заболяването.

Съгласно изобретените, инхибитор на IL-18 може да бъде въведен профилактично или терапевтично в индивид преди, по време на или последователно при терапевтичен режим или агент (например многократен лекарствен режим) в терапевтично ефективно количество, по-специално с интерферон и/или TNF антагонист и/или СОХ инхибитор. Активни агенти които се въвеждат едновременно с други терапевтични агенти могат да бъдат въведени в същия или като други състави.

Изобретението по-нататък се отнася до метод за приготвяне на фармацевтичен състав, включващ смесване на ефективно количество на IL-18 инхибитор и/или

• · ·· •· · · •· ♦ •· · • ·· w· ···· интерферон и/или TNF антагонист и/или COX инхибитор с фармацевтично приемлив носител.

Описанието на това изобретение, ще може полесно да се разбере чрез посочените примери, които са илюстративни и които не ограничават настоящето изобретение.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

ЧАСТ 1: Примери от 1 до 8, отнасящи се до използването на инхибитори на IL-18 при чернодробни увреждания,

ПРИМЕР 1: ПРОДУКЦИЯ НА IL-18BP-His tag

Пречистеният, рекомбинантен човешки IL18BP съдъжащ his-tag (rhIL-18BP-His tag) се продуцира от СНО клетки. Продукцията на рекомбинантни белтъци в еукариотни клетки е известна на специалистите в областта. Добре известни методи са налични за конструиране на подходящи вектори, носещи ДНК, която кодира IL-18BP и подходящи за трансфекция в еукариотни клетки, за да се продуцира рекомбинантен IL-18BP. Например за да бъде експресирана в клетки, ДНК кодираща IL-18BP (виж например Novick et al., 1999) се изрязва и се въвежда в експресионен вектор, подходящ за трансфекция на клетки. От друга страна, такава ДНК може да бъде направена, чрез PCR с използването на подходящи сенс- и антисенс праймери. Получените кДНК конструкти след това се въвеждат в подходящи конструирани еукариотни

I • · • ♦

·· ·· • · · · • · ·· • ♦ * · · · · • е ·· експресионни вектори, чрез техники добре известни в областта (Maniatis, 1982). Рекомбинантният белтък е пречистен с над 95% чистота и за него се знае, че е биологично активен in vitro и in vivo с висок афинитет към лиганда.

ПРИМЕР 2:

ЗАЩИТЕН ЕФЕКТ НА 1L18BP СЕРЩУ ЕНДОТОКСИНИНДУЦИРАНА СМЪРТ В МИШИ МОДЕЛ

Миши модел се използва, за да се провери дали IL18BP, инхибитор на IL-18 има защитна функция срещу високи дози на липополизахариди (LPS). LPS предизвиква остри, чернодробни увреждания, които водят· до бърза смърт при мишките.

4mg/kg от рекомбинантния, човешки 1L-18BP (rh IL-18BPhis) носещ his-tag (получен при продукцията на рекомбинантния протеин) се инжектират интрапериотенално (i p ) в C57BL/6 мишки. 1 час покъсно, се инжектират 60 mg/kg LPS (летална доза). Оцеляването на мишките се сравнява с група животни, които са получили само LPS (без IL-18BP).

Пет от 7 мишки, инжектирани с rh IL-18BP-his оцеляват след LPS инжекцията, за разлика от контролните мишки, при които всички животни умират за 3 дни.

Кръвни проби са взети 5 часа след LPS инжекцията в отсъствие или присъствие на нарастващи дози на rh IL-18BP-his и са анализирани чрез ELISA за определяне на INF-γ. Това инхибиране се губи при ниските дози от rh IL-18BP (0,004 и 0,4 mg/kg).

Г ·· «« • · · » · • · • · ···· ··

• · · • · • · · • · · ·· *· ··

ПРИМЕР 3:

1L-18BP ИМА ЗАЩИТЕН ЕФЕКТ ПРИ ЧЕРНОДРОБНО УВРЕЖДАНЕ В МИШИ МОДЕЛ НА ЗАБОЛЯВАНЕТО

Миши модел на фулминантен хепатит се използва за да се провери ефекта на IL-18BP. Мишките развиват остра форма на чернодробно увреждане, когато са подложени на последователно въвеждане на Propinabacterium acens (P.acens) и липополизахарид (LPS).

Мишките се инжектират с нарастващи дози от rh IL-18BP-his (4; 0,4; 0,04,0 mg/kg) на различни времеви интервали (1 час, 20 минути едновременно) преди инжектиране с LPS в C57BL/6 Р. acens сензитирани мишки. Когато rh IL-18BP-his се подава i.p. едновременно с LPS, нито една от мишките не оцеляват и нивата на циркулиращият INF-γ г TNF-α не се променят. Изненадващо, rh IL-18BP (4 и 0,4 mg/kg) индуцира 70% редукция на циркулираща Аланин аминотрансфераза (маркер за чернодробно увреждане), както е показано на Фиг.2.

В допълнение на това, е проследено оцеляването (Фиг.З): Когато rh IL-18BP се подава i.p. 20 минути преди LPS при двете от най-високите дози на 1L-18BP (4 и 0,4 mg/kg) се забавя смъртта на мишките със 10 часа, в сравнение с контролните мишки, които получават NaCl вместо IL-18BP.

Резултатите от измерването на серумният INF-γ са показани на Фиг.4. rh IL-18BP (4mg/kg) показват инхибиране на 90%<от нивата на циркулиращият INF-γ и

·· ·· ·· ·· ····

80% от циркулиращата Аланин аминотрансфераза (не е показано).

Когато rh IL-18BP-his се подава 1 час преди LPS, кривите на оцеляване и нивата на циркулиращия INF-γ са същите като тези, наблюдавани когато се подава rhlL

18BP-his 20 минути преди LPS, но нивата на циркулираща Аланин аминотрансфераза остават непроменени (не е показано).

В допълнение на това, миши чернодробни тъкани се анализират чрез хематоксилин-еозин оцветяване, както и чрез тунелна микроскопия. Черните дробове на мишки в които преди това са индуцирани остри хепатити, показват остри некрози в сравнение с нормалната чернодробна тъкан. За разлика от тях, чернодробна тъкан на мишки, третирани с IL-18BP показва значително по-малко некротични фокуси, в сравнение с нетретирани мишки.

ПРИМЕР 4;

АНТИ- 1L-18 АНТИТЕЛАТА ПРЕДПАЗВАТ ОТ ЛЕТАЛНА

ЕНДОТОКСЕМИЯ.

За да се оцени, дали блокирането на IL-18 с IL18 антитела, ще предпази от летални дози на бактериални липоподизахариди, C57BL/6J мишки първо се инжектират със неутрализиращи заешки анти-миши IL-18 антитела (поликлонални) или с нормален заешки серум (NDS) като контрола. 30 минути след третирането с антитяло, летални дози от LPS получени от E.coli (Фиг.5А) или от

S.Thyphimurium (Фиг. 5Б) се инжектират. Експериментите

..64 включват 10-12 мишки/група и се провеждат два пъти за два различни случая.

Като е показано на Фиг. 5А, третирането на мишки с анти IL-18 антисерум предпазва от смъртността, индуцирана от 40 mg/kg E.coli LPS. 100% от мишките оцеляват след анти- IL-18BP третирането срещу 10% от мишките оцеляли след третиране с нормален заешки серум (р<0.005).

Фиг. 5Б показва, че мишки третирани с антитела също са защитени срещу леталният ефект на S. typhimurium (50% спрямо 0% оцелели; р<0,05).

ПРИМЕР 5

БЛОКИРАНЕТО НА 1L-18 И TNF-α ЗАЩИТАВА МИШКИТЕ ОТ СопА- и РЕА-ИНДУПИРАНА ХЕПАТОТОКСИЧНОСТ

Два експериментални модела на хепатотоксичност се използват за да се оцени ролята на IL18 и TNF-a при чернодлобни увреждания. Инжектирането на Конкавалин A (Con А) и Pseudomonas aeruginos (PEA) в мишки индуцират чернодробно увреждане и същевременно са модели за Т-клетъчно медииран хепатит.

C57BL/6J мишки се претретират с анти- IL-18 антисерум или разтворим рецептор за TNF-α, TNFsRp55. Нивата на серумната Аланин аминотрансфераза (ALT) се измерват като индикатори за чернодробно увреждане (Фиг.6).

Както е показано на Фиг.6 А, и IL-18 антисерума и разтворимите TNF-a-рецептори значително редуцират

Con-А-индуцираните нива на ALT, в сравнение с контроли ·· · · ·· ·· ·· · · ···· ···· ···· ··· ···· ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ···· инжектирани само със солеви разтвор (не-пирогенен солеви разтвор).

TNF-a рецептор инхибиране на

Паралелното въвеждане на разтворим и IL-18 антисерум води

Con-А индуцираното до напълно чернодробно увреждане.

Както е показано на Фиг. 6Б при

РЕАинжектирани мишки, неутрализирането инхибитори или с анти- IL-18 антитела води до инхибиране на нивата на серумната ALT, Комбинираното блокиране и на двете

TNF-a

93% и 83% съответно.

води до 99% предпазване.

ПРИМЕР 6

ПЛАЗМЕНИТЕ НИВА НА lL-18-СВЪРЗВАЩИЯТ БЕЛТЪК СЕ ПОКАЧВАТ ПРИ ПАЦИЕНТИ С ХРОНИЧНИ ЧЕРНОДРОБНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ

Плазмените нива на IL-18BP се измерват при 133 пациента с хронични чернодробни заболявания (CLD) с различни етиологии и при 31 здрави пациента-контроли чрез специфична ELISA, с използване на 1L-18BP моноклонално антитяло.

Плазмените нива на IL-18BP са значително повишени в пациентите с CLD (12.91 ± 0 89 ng/ml;

осреднено ± SEM) в сраднение с тези при здрави лица (4.96±0.43 ng/ml, р<0.001). Пациентите с цироза имат значително повишени нива в сравнение с пациентите с CLD, които не страдат от цироза (19.23 ± 1.28 ng/ml п=67, спрямо 6.49 ± 0.51 ng/ml n=66, р<0.001). Пациенти в стадий В според Child-Pugh, класификацията имат повишени нива ·· ·· ··“ ' ·· ·· ·· • .... ....

····..· .. .

• · ... .· ... . .

• ·· ··.. ...

···· .. «. ,, ,, ,,,, на IL-18BP в сравнение с тези в стадий А (22.48 ± 2.44 ng/ml в спрямо 9.57 ± 1.25 ng/ml, р<0.001). Няма обаче статистически достоверни разлики при Child стадий В и С (22.48 ± 2.44 ng/ml спрямо 20 20.62 ± 4.57 ng/ml, р=0.7). Плазмените нива на IL-18BP корелират позитивно с тези на GOT, билирубина и скоростта на еритроцитна седиментация. Наблюдава се негативна корелация спрямо времето за протромбина.

В заключение, резултатите показват, че плазмените нива на IL-18BP се повишават при CLD и корелират при острите форми на заболяването независимо от етиологията на заболяването. Въпреки че ендогенен антагонист на про-възпалителния IL-18 повишава нивата на IL-18BP, изглежда не е достатъчно да попречи и да подтисне про-възпалителните медиатори при CLD.

ПРИМЕР 7

ПОДТИСКАНЕ НА ХЕПАТИТ ПРИ АЛКОХОЛИЦИ, ЧРЕЗ IL18ВР

Четири групи плъхове (по 5 на група) се хранят с етанол и диета, съдържаща царевично олио, чрез интрагастрална инфузия за 4 седмици. Декстрозата изокалорично замества етанола при контролни плъхове. Плъховете се инжектират всеки ден с миши 1L-18BP (lmg/kg) или със солеви разтвор. Анализ на патологията се провежда върху чернодробни срези и се вземат предвид измерванията на серумните ензими, TNF-a, Fas-лиганда и INF-γ . Некро-възпалителните увреждания и експресията на чернодробни ензимц, TNF-a, Fas-лиганда и INF-γ се

наблюдават при плъховете, хранени с ентанол инжектирани със солеви разтвор.

Плъховете, иншекитрани с миши IL-18BP са защитени от некро-въпзалителни увреждания и нивата на серумните ензими, TNF-a, Fas-лиганда и INF-γ са значително понижени (>90%).

ПРИМЕР 8;

ИНХИБИРАНЕ НА КОНКАВАЛИН А-ИНДУЦИРАН ХЕПАТИТ

ЧРЕЗ 1L-18BP

Balb/c имшки се инжектират с 12mg/kg Конкавалин A (Con А), като при някои от тях се инжектира IL-18BP (1 mg/kg), два часа преди Con А въвеждането и след това един път дневно. Чернодробните увреждания се анализират, чрез определяне на нивата на чернодробните ензими, TNF-a, Fas-лиганда и INF-γ. Хистологични препарати, са приготвени и от черен дроб на мишки, третирани само с Конкавалин А.

Третирането с повишени дози IL-18BP значително редуцира нивата на чернодробните ензими, TNF-α без да се наблюдава възпаление при хистопатологичния анализ, в сравнение с контролни мишки, третирани само с Con А.

ЧАСТ п: Примери 9 и 10, отнасящи се до използването на инхибитори на IL-18 при артрити

ПРИМЕР 9:

• «

ПОЛУЧАВАНЕ НА 1L-18BP-His tag

За експериментът, описан подробно в Пример 10, по-долу, рекомбинантен, човешки IL-18BP, носещ his-tag от 6 остатъка (rg IL-18BP-His tag) се продуцира от СНО клетки и се пречиства както е описано от Kim et al., 2000. Рекомбинантният белтък е пречистен с чистота над 95% и за него е открито че е биологично активен in vitro и in vivo с висок афинитет към неговият лиганд.

Получаването на рекомбинантни белтъци в еукариотни системи със или без tag последователности, улесняващи пречистването на рекомбинантните протеини, е известно на специалистите в областта. Използват се добре известни методи за конструиране на подходящи вектори, които носят ДНК, която кодира IL-18BP и подходящи за трансфекция еукариотни клетки, които да продуцират рекомбинантния IL-18BP. За експресирането в клетки, ДНК кодираща IL-18BP (виж например Novick et al., 1999) се изрязва от клонирания вектор и се въвежда в експресионни вектори, подходящи за трансфекция на клетки. От друга страна, такава ДНК може да бъде получена, чрез PCR с използването на подходящи сенс и антисенс праймери. Получените кДНК конструкти след това се въвеждат в подходящи конструирани еукариотни експресионни вектори, чрез техники известни в областта (Manitatis et al., 1982).

ПРИМЕР 10:

БЛОКИРАНЕ НА ЕНДОГЕННИЯ IL-18 В МИШИ МОДЕЛ НА < АРТРИТ г

МЕТОДИ:

Индуциране на колаген-индуциран артрит (CIA)

CIA е индуциран в мъжки DBA/1 мишки (на възраст от 8 до 12 седмици), чрез имуниризаре с нативен говежди колаген, тип П(СП), както е описано преди (PlaterZyberk et al., 1995). 25 дена след СП имунизацията, мишките се изследват ежедневно за начало на заболяването.

Третиране с rh IL-18BP-6his

Третирането на СП-имунизирани DBA/1 започва при първите симптоми на заболяването. Рекомбинантен, човешки IL-18BP съдържащ tag от 6 хистидина (rh- IL18BPa6his) се използва за неутрализиране на ендогенния IL-18 при колаген-третирани мишки, rh- IL-18BP-6his се инжектира всеки ден в продължение на 7 дни в 5 различни концентрации 10, 3, 1, 0.5, 0.25 mg/kg/инжекция интрапериотнеално (ip). Плацебо контролните мишки получават само солеви разтвор (0.9% NaCI).

Анализ на развитието на заболяването Клиничен анализ (точки на клинична оценка)

На първо време, клиничните симптоми на мишките се проверяват всеки ден от изследовател, който не е известен за третирането. Всеки крак се степенува за нмнмт .

·« ·· ·· ·· ·· ·· ············ ·········· • · · · · · · ··· ···· ·· ·· ·· «· ···· острога на'заболяването (точки 0-3.5, мзкеимзлен брой точки = 14/мишка). Напредването на едемата (възпалението) се измерва на първите лапи, показали признаци на заболяването, чрез използване на точни калипери (Proctest 2Т, Kroeplin Langenmesstechnik).

Напредването на заболяването се оценява всеки ден в продължение на 8 дена, след като е започнало, за което време всички мишки са заболели и лапите им са ; събрани за хистопатологичен анализ.

Хистопатологичен анализ на хрущялната ерозия и мукозното възпаление

В края на експеримента, т.е. на 8 ден след началото, мишките се убиват и лапата, която първа развива симптомите на заболяването се дисектира. Ставите се фиксират, декалцифицират и се включват в парафин. Стандартни срези (5 до 7μπι) от ставите се приготвят и се оцветяват с хематоксилин/еозин/Сафранин О. Всяка става се оценява от двама изследователя, които не са известени за протокола на третиране (липса на деструкция на хрущялът или костта = 0; локализирани хрущялни ерозии =

1-2; по-разпространени ерозии = 3; общи хрущялни деструкции и наличие на костни ерозии = 4). Крайните резултати за всяка мишка са осреднените резултати за всяка от ставите. Микроскопски възпалението или синовитите се изчисляват от 0 до 4, както следва: липса на възпаление = 0; слабо уплътняване на покриващата обвивка и/или известно количество инфилтрирани клетки под обвивката = 1-2; уплътняване на покриващата обвивка и

·· ·· • · · • · · ·· • · • · · · • · · · • · · • · ·

9 9

9 · · · 9 ця vneTw ПОД зприсъствие на клетки в синовиалното пространство и наличие на голямо количество инфилтрат в синовиума, със много клетки, характерни за възпалителни реакции = 4.

Определяне наличието на анти-колагеновите антитела

Антитела срещу говежди колаген тип II се анализират чрез използване на ензим-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Титрите на IgGl и IgG2a се измерват. Накратко, плаките се покриват с 10 pg говежки колаген и след това неспецифично свързаните места се блокират с 0.1М етаноламин (Sigma). Серийни разреждания 1:2 от серумите се добавят след инкубацията със специфични за изотипа кози анти-миши анти пероксидазни антитела (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA) и субстрат (5-аминосиалоциклична киселина, Sigma). Плаките се анализират колориметрично при 492 nm. Титрите се определят като средни стойности за разреждане ± SD, което дава полу-максимална стойност.

Анализ на IL-6 } Нивата на IL-6 се определят чрез ELISA кит (R&D systems Minneapolis, MN, USA). IL-6 биоактивността I се определя, чрез пролиферативен анализ с използването на

В9 клетки. Накратко 5x10³ В9 клетки в 200 pl на гнездо, .¼.

& със RPMI 1640 среда, съдъжаща 5% FCS се посяват в у’ микротитрови плаки, със заоблени дъна на гнездата и се инкубират 3 дена, с човешки рекомбинантен IL-6 (R&D

Λ ?

; >

?;

.> ί .» • · · · ·*·« ·*·» ·**··**· _#· ······ · 9· • · · 9 9 9 9 · ·· ···· ·· 99 99 999999 systems, Minneapolis, MN, USA.) ^v?.ro стандарти. В края на инкубацията във всяко гнездо се добавят 0.5 gCi от ³[Н]тимидин (MEN-Dupont, Boston, МА, USA). Три часа покъсно, клетките се събират и се определя инкорпорирането на тимидира. Границата на детекция за IL-6 биоанализа е lpg/ml.

Статистически анализ

Статистически достоверните разлики се оценяват чрез Mann Whitney теста, с използване на SigmaStat програма за статистически анализ и с програма за GraphPad Prism.

Резултати

Миши експериментален модел, CIA (колагениндуциран артрит) се използва за анализ на ефектвността на IL-18BP, като вещество за лечение на артрит. Въвеждането на колаген и непълен адювант на Freund в DBA/1 мишки индуцира развите на ерозивни, възпалителни артрити и представя идеална възможност за изследване на терапевтичните възможности на IL-18BP. До тук ендогенния IL-18 се неутрализира, чрез използването на IL-18BP и се оценява ефекта на различни патогенни параметри.

Проведено е дозо-зависимо изследване. Три групи DBA/1 мишки с колаген-индуциран артрит се третират с терапевтична цел (т.е. след началото на заболяването) с 5 дози от IL-18BP i.p.

(инграпериоiCnajiHO/. lxj-lSxji ν κοχίΐΑνιΐϊриЦгхл ±С, , 1, 0.5, 0.25 mg/kg се въвеждат при първият клиничен симптом на заболяването. Инжекитрането на физиологичен солеви разтвор (натриев хлорид, NaCI) се прилага като контрола. В допълнение на това, 10 000 Ш от интерферонр (INF-β) се въвеждат i.p. за оценка на ефекта на INF при този експериментален модел на артрит. Ефекта на степентта на заболяването се следи чрез дневно визуално определяне на токите за всяка отделна лапа, както е описано по-горе.

Мишките са третирани на 8-мия ден след началото.

Измерени са следните стойности:

визуално определени точки за клиничната картина (0-3,5 на лапа) (Фиг. 7А и Б) на ставата/едема (в mm, с calipers) за първата лапа, подуване измерване признаци на възпалението, показваща задна лапа (Фиг.8) брой на възстановените след заболяването лапи (Фиг.9) точки на ерозията на първата лапа, показваща признаци на заболяването (0-4 за хрушялна деструкция, Фиг. 10) Хистопатологичен анализ на лапата, която първа е развила артрит (Фиг. 11) Нива на анти-колаген тип II антителата (Фиг.12) • Нива на IL-6 (Фиг.13) .·*: : ·!

···· · · ··

Клинична vie>ieH на >аиилнр.и1с1и '1 'V степен

Както е показано на Фигури 7А и Б, клиничната на заболяването се понижава значително при мишки, третирани с lmg/ml (Р<0.01) и 0.5 mg/ml (0.01<Р<0.05) от rhIL-18BP. Мишките получили ниската доза от rhIL-18BP (0.25 mg/kg) или високата доза от 10 mg/kg показват клиничен резултат, подобен на този на плацебо-групата. Дозата от lmg/kg от IL-18BP са почти толкова ефективна, колкото интерферон β (означен като INFb на Фиг7А).

Ставно възпаление и подуване на лапата (едема)

7'

Макроскопски възпалението (подуването) се края на

8А и Б.

mg/kg.

анализира, като се измерва едемата на лапата от първия ден след началото на заболяването, до 8-ия ден експеримента. Резулатите са показани на Фигури Ефективните дози на IL-18BP са 1, 3 и 10

Въвеждането на ниски дози не води до благоприятен ефект върху подуването на лапите. Както е показано на Фигури 8А и 8Б, Интерферон-β (INFb) при концентрации от 10 000 Ш показва благоприатен ефект върху подуването на лапата.

Микроскопски, синовитите се изследват в края на експеримента врху хистопатологични срези и резултатите се дават като точки (“точки за синовит”).

Резултатите за възпалението (подуването) и за синовитите са обобщени в Таблица 1. Докато третирането с rhIL-18BP с дози 1 и 3 mg/kg водят до тендеция на понижаване на ·· ·· • · · » • ·· • ·· • ·· ·· ·· • · ·· •· ·· • · ·· • “ * • <- · · • · · · • · · • · · подуването, трети^йеТо с КЪяТО и ята ^*доза от IL-18BP има само ограничен ефект върху възпалителните синовити (Таблица 1).

ТАБЛИЦА 1:

ЕФЕКТ НА ТРЕТИРАНЕТО С IL-18BP ВЪРХУ СТАВНО

ВЪЗПАЛЕНИЕ

Лечение	Подеване (AUC, средни стойности ±sem)	Синовит точки (средни стойности ±sem)
RhIL-18BP-6his 3 mg/kg	1.55±0.64	2.17±0.5
1 mg/kg	1.53±0.60	1.98±0.4
0.5 mg/kg	3.38±0.70	1.92±0.5
0.25 mg/kg	3.06±0.90	2.08±0.5
Плацебо	3.11±0.77	2.23±0.3

Фиг. 9 показва, че бройт на засегнатите лапи от заболяването се намалява, след въвеждането на IL-18BP. По-специално, терапевтични инжекции с IL-18BP при дози от 1 до 0.5 mg/kg редуцира броят на лапите, засегнати при заболяването, което демонстрира, че блокирането на IL-18 in vivo спира разпространяването на артрито към други стави. При лечението с 1 и 0.5 mg/kg от IL-18 даже се става възможно да се възстановят някои от артритните стави до нормални.

• · · • · • · • · ···· ·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · _π ........ ·· ···:.·

Предпазване от деструкциg на стдвата

Третирането на мишки с rh IL-18BP води до предпазване на лапите от деструкция (Фиг. 10). Полуколичествено отчитаща система показва, че по отношение на костната ерозия се проявява дозо-зависим защитен ефект, който е значителен при 10 и 3 mg/kg (Р<0.05, Фиг. 10). Мишки, получаващи lmg/kg rh IL-18BP показват по-слаба ерозия, в сравнение с мишки, които получават само солеви разтвор. Липсва предпазен ефект при дози 0.5 mg/kg и 0.25 mg/kg. Интересно е, че предпазният ефект върху ставите при дози 3 и 10 mg/kg IL-18BP е сравним с или даже по-голям отколкото благоприятният ефект на 10 000 Ш Интерферон p(INF-p).

Фиг. 11 показва хистология на здрави (А) и заболели (Б) стави в сравнение със стави на животни, третирани с IL-18BP (В). Срезите са направени в края на експеримента от лапите, които първи са развили артрит.

Ставата от артритна мишка показва остри деструктивни артрити с хрущялно намаляване и ерозии и много инфилтрирани клетки във възпаленият синовиум. При стави от мишки, третирани с rh IL-18BP, хрущялът изглежда почти нормален, с изключение на присъствието на клетки, характерни за възпалителен процес в синовиалното пространство. Не само че се наблюдава голямо количество хрущял, но хрущялът също има погладка повърхност.

i

• · • · · • · ·

колаген тип II антителата

CIA мишките показват повишени нива на IgGl и IgG2a анти-колаген тип II антителата в циркулиращата кръв. Аниттелата от изотип IgGl са свързани с ТН2 медиираните заобявания, докато антителата от изотип IgG2a и IgG2b са свързани с ТН1 медиираните заболявания.

Анти-колаген тип II (СП) IgGl и IgG2a антитяло изотиповете се наблюдават в серуми от животни, които са третирани с IL-18BP (Фиг. 12). Нивата на анти-СП от IgG изотипове IgGl и IgG2a не се променя значително от третирането с IL-18BP на 4-ия или на 8-ия (D4, D8) от клиничните прояви на заболяването. 2.6 и 3.4 пъти намаляване на колаген-специфичните съотношения IgGl/IgG2a, обаче, се наблюдава 8 дена след третиране с rh IL-18BP при 1 и 3 mg/kg съответно. Фиг. 12 показва експеримент при който са приложени 3 mg/kg. По същество същите резултати се получават, когато се използва количество lmg/kg IL-18BP. Редуцираното съотношение IgGl/IgG2a на анти-СП антителата показва намаляване на концентрацията на анти-колаген тип II антителата от изотип IgG2a и повишаване на концентрацията на антиколаген тип II антителата от изотип IgGl, от което може да се предположи че се преминава към ТН2 медиирано заболяване при този модел на артрит.

·· ·· ·· ·· · ·· • · · · ···· ···· ······· ··· • · · · · · · ··· • •99 99 99 99 99 ·99·

Поннж^ьапс ria rinoaia Ha 1L-6 CJWA неутрализирането на IL-18

За да се вникне в ефектите на блокирането на IL-18, IL-6 се измерва в серумите на IL-18BP третирани животни. Фиг. 13 показва, че нивата на блокиращият IL-6 значително се понижават при животни, получили IL-18BP, при всички измерени дози, т.е. 1, 3 и 10 mg/kg, както е и с интерферон β (INF-b). Имуноактивните нива на IL-6 се измерват в серуми на животни, третирани с 3 mg/kg rh IL-18BP, значително се понижават (Р<0.0023) в сравнение с животните, третирани със солеви разтвор. Нивата на IL-6 в серума на заболели животни, третирани с 1,3 или 10 mg или IL-18BP или 10 000 Ш от INF-β наподобяват тези на нормалният серум (NMS), получен от здрави животни, т.е. от тези животни, при които не се наблюдават заболявания, свързани с възпаления.

Тези открития показват, че IL-18 контролира нивата на IL-6 по време на заболяването. Тъй като IL-6 е маркер за възпалителна реакция, тези открития показват, че лечението на заболелите мишки с IL-18BP понижават възпалителните реакции на животното.

От експериментите описани по-горе, могат да бъдат направени следните изводи:

• Въвеждането на IL-18BP понижава клинично остротата на артрит.

I

·· ·· • · · · • · ··

по-нататъшно разпространение на заболяването.

• Въвеждането на IL-18BP подтиска едемата.

• Въвеждането на IL-18BP понижава хрущялната деструкция.

• Серумните нива на IL-6 се понижават и съотношението IgGl/IgG2a на анти-СП антителата се понижава след IL18ВР терапията.

Данните изложени по-горе, показват че неутрализирането на биоактивността на IL-18 след началото на заболяването представлява модифицираща заболяването, анти-ревматоидна терапия. Резултатите ясно показват, че блокирането на IL-18 понижава клиничното

продължаване на артрита и по-важно, спира продължаването на хрушщялна и костна деструкция. Блокирането на IL-18 чрез IL-18BP, чрез анти- IL-18 антитела или чрез друг блокиращ агент на IL-18, следователно предствавлява нова модифицираща заболяването, анти-ревматоидна терапия.

Гореизложените описания на специфичните варианти, разкриват общата природа на изобретението, отклоняват от главната концепция, и следователно такива адаптации и модификации ще могат да бъдат разбрани в така че другите да могат да придобият общи знания, които да могат веднага да бъдат модифицирани и/или адаптирани за приложения, като специфични варианти без да се

	81 .··..··. .··..··. • · · ··>. · : : • · · · · ·· « · · · · • ·· · · · · ··· ···· ·· ·· ·· ·· ····
смксълл	и '''г“Л?чт,я нч ркнивапентите на описаните
варианти.	Това е с цел да се разбере, че фразите или

терминнологията използвани тук са с описателна цел, а не с ограничителна.

ЧАСТ ш: Примери 11 и 12, отнасящи се до чревни възпалителни заболявания

ПРИМЕР 11:

ЕКСПРЕСИЯ НА IL-18BP ОТ ЕНДОТЕЛНИ КЛЕТКИ И МАКРОФАГИ ПО ВРЕМЕ НА АКТИВНА ФОРМА НА БОЛЕСТТА НА CROHN

Събиране на проби

Чревните мукозни биопсии са изолирани от хирургично отстранени проби от пациенти с CD или UC. Включени са четиринадесет CD пациента (трима мъже и единадесет жени) на средна възраст 37,8 години (в границите от 20 до 78 години) и с продължителност на заболяването 8.3 години (в границите 1-21 години). В осем пациента, заболяването е локализирано в илеума, а в шест в дебелото черво. Дванадесет пациента вземат имуносупресивни лекарства. Диагнозите на активна форма на CD се определя чрез хисто-патологично изследване и се базира на следните критерии: наличие на улцерации, повишен брой на клетките, характерни за възпалителните реакции и възпаление на стените. При седем от пациентите *4 • · ♦ • · • · • · ···· ·· «

·· ·· ·· • ·· •99

99 • 99 ·· • ·9

9· •· cs наблюдава«я сп*и при седем - .неактивна форма. Няма значителни разлики по отношение на

възрастта, локализирането, пола, приемането на лекарства и продължителността на заболяването, при наблюдаваните пациенти с активна и неактивна форма на CD. Средната възраст на 5-имата UC пациента (трима мъже и две жени) е 37.6 години (варира от 30 до 44 години). При всички пациенти заболяването се локализира в дебелото черво и всички се подлагат на имуносупресивна терапия. Средната продължителност на заболяването е 4 години (от 1 до 9 години). Контролни проби се вземат от 5 пациента, които не страдат от IBD или подобни нарушения (трима мъже и две жени). Средната възраст на тази група е 55.2 години (от 24 до 76 години). При всички пациенти, заболяването се локализира в червото.

Полу-количествен RT-PCR на човешки IL-18 и IL-18BP

Тотална РНК се екстрахира от замразени чревни биопсии на пациенти с CD, с UC или от контролни пациенти. РНК екстрацкията се прави, чрез Trizol (Gibco) съгласно инструкциите на производителя. Получените проби, се определят количествено, чрез измерване на абсорбциите при 260 nm. Целостта на РНК се анализира, чрез електрофореза в 1% агарозен гел. кДНК се синтезира от 1 pg тотална РНК, чрез използване на Promega обратна транскриптазна система, съгласно протокол на производителя. PCR реакциите се провеждат в тотален обем 50 μΐ в присъствието на Ш от AmpliTaq ДНК Полимераза (Perkin Elmer, Roche, U.S.A), 2.5 mM dNTPs

·· ·· ·· Ой ··>

ft··· ···· · ··· ······· ··· • · · ···· ··· ft··· ·· ·· ·· ······ (Amersham, U.S.A) и зи pmoi от правия и обратният PCR праймери. Реакциионните смеси се инкубират в РТС-200 Peltier Effect Thermal Cycler (MJ Research, U.S.A) при следните условия: денатурация 1 мин. при 94 ⁰ С, хибридизация за 1 мин. при 55 ⁰ С и елонгация за 1 мин. при 72 ⁰ С. Оптималният брой цикли за IL-18 BP, IL-18 и βактин преди сатурацията на ивиците (31, 28 и 25, съответно). PCR праймерите се приготвят на базата на публикувани секвенции (AF110799, D49950, Х00351) и са следните: за IL-18, обратният праймер 5’GCGTCACTACACTCAGCTAA-3’; правият праймер 5’GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3’; за IL-18BP, правият праймер 5’-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3’; обратният праймер е 5’-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3’, за βактина, обратният праймер е 5’GGAGGAGC AATGATCTTGATCTTC-3 ’; правият 5 ’ GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’. За да се изключи амплифициране на геномна ДНК, съдържаща се в пробите, PCR реакциите се провеждат в отсъствие на кДНК матрица. PCR продуктите (10 μΐ) се анализират електрофоретично в 1% агарозни гелове в ТАЕ буфер. Размерът на PCR продуктите се определя, чрез 1КЬ стълбица (Gibco) след оцветяване на теловете. Относителен количествен нализ се прави по интензитетът на оцветените с етидиев бромид ивици под UV светлина, чрез използване на Kodak Digital Sciences аналитичен софтуер и се дава като съотношение прицелен гел (hIL-18BP, hIL-18) спрямо “housekeeping” гена (Ιιβ-актин).

•999 «φ •· • · · ·« * · ·· ·· ·♦%

Съсздаване на моноклонални антитела, насочени срещу hIL-18BP

BALB/c мишки се инжектират подкожно в

четирите крайника, както и интранукално с 50 pg от изоформата rhIL-18BP-6his (пречистен от клетки от яйчник на китайски хамстер, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel) в PBS c адювант (MPL +TDM емулсия, RIBI Immunochem Research, Inc) на ден 0, 7 и 28. Четири дена след третата имунизация, лимфните възли се отделят с 2.4 ?g/ml колагеназа (колагеназа IV, Worthington Biochemical Corp.) и 0.1% Dnase (Sigma). Изолираните клетки след това се ресуспендират в DMEM-F12, 10% FCS (Gibco) в присъствието на НАТ (хипоксантин, аминоптерин, тимидин) и се разпределят в 96 гнездни плаки с концентрация 5 х 10⁴ клетки/ml. Пробите от хибридомната културална супернатанта се скринират за присъствието на реактивни антитела чрез директен скрининг анализ (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland), хибридомтните културални супернатанти се добавят, след което се добавя биотинилиран rhIL-18BP-6his (пречистен от COS клетки както е описано (Novick et.al, 1999)) със или без rhIL-18 (пречистен, рекомбинантно от E.coli, Serano Pharmaceutical Research Institute, Geneva ) и накрая страптавидин-хрянова пероксидаза (HRP) (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland) разработена, чрез използване на фениленедиамин (OPD) (Sigma). Ненеутрализиращите антитела са избрани и субклонирани. В това изследване се използва 95-Н2О, мише IgGl моноклонално антитяло.

• ·

>

Имунохисто2химични изследвания за локализацията на IL-18bp- позитивни клетки

Тъканни проби се нарязват, замразяват се и се съхраняват на - 80 ⁰ С. Получават се серийни криосрези (10 gm), монтирани върху поли-Ь-лизин покрити Supefrost/Plus стъкла (Plylabo, Plan-les-Ouates, Switzerland) и фиксирани в ¢) изстуден на лед ацетон. Локализацията на човешкият IL18ВР белтък се анализира, чрез имунохистохимия, като се използва Mab 95-Н2О. След кратко рехидратиране в PBS, срезите се пре-инкубират за 30 минути в PBS, допълнен с 2% Фетален Телешки Серум (FCS) (Cansera, Ontario, Canada), 1% човешки серум (АВ* серум, Transfusion Center, Annemasse, France) и 0.5% Говежди Серумен Албумин (BSA) (Sigma, St. Louis, МО, U.S.A). Ендогенната пероксидазна активност се блокира чрез поставяне на стъклата в разтвор от PBS, 2% FCS, 1% човешки серум, © ' 0.5% BSA и 1% водороден прекис (Н2О2) (Fluka,

Switzerland) за 1 час. След промиване в PBS, срезите се инкубират за една нощ в неразредена културална супернатанта от МаЬ-95-Н2О. След още една промивка в PBS, срезите се инкубират с биотинилирано козе, антимишо антитяло (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland) (5 ?g/ml) в PBS, съдържащо 0.5% BSA за 1 час. Чуствителността на оцветяването се увеличава, чрез инкубиране с авидинОН/биотинилиран HRP комплекс (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, CA, U.S.A) за 30 минути. Стъклата след това се промиват с PBS и се .··..··. ”86..

·:::υ·υ?<·Πγ проявяват, като се използва разтвор съдържащ 30% Н2О2,

3,3-амино-9-етил карбазол (AEC) (Sigma), Ν,Νдиметилформамид (Merk) в ацетатен буфер, pH 5. След оцветяване с хематоксилин (Sigma), срезите се покриват с глицерол и се покриват със покривни стъкла. Мишето IgGl антитяло (R и D система) се използва като контрола изотип.

За да се идентифицира локализацията на IL-18BP

в клетката, двойно имунохистохимично изследване се провежка върху срези от чревна мукоза. След 10 минути рехидратиране в PBS, срезите се пре-инкубират за 30 минути в PBS допълнен с 2% FCS, 1% човешки серум и 0.5% BSA. За колокализация с ендотелни клетки, срезите се инкубират цяла нощ с биотинилирано Mab 95-Н2О (20pg/ml) смесват се с FITC-конюгирано мише античовешки CD31 (1:50) (Pharmingen, СА, U.S.A) в PBS/0.5% BSA. За кодокализиране с макрофаги, срезите се инкубират цяла нощ с биотинилирано Mab 95-Н2О (20pg/ml) смесено с FITC-конюгирано анти човешко CD68 (1:25) (Dako, Denmark). След промивка с PBS се добавя стрептавидин Texas Red (Southern Biotechnology Associates, AL, U.S.A) за 1 час. Стъклата се промиват още един път и срезите се покриват с мовиол и се монтират покривни стъкла. Биотинилираното мише IgGl антитяло (Pharmingen) последвано от стрептавидин Texas-Red се използва като контрола-изотип.

Клетъчно култивиране

Човешки ендотелни клетки на пъпна връв (HUVECs) (Clonetics Corp., San Diego, СА) се култивират, като се използва Среда за ендотелни клетки (EGM) допълнена с човешки рекомбинантен епидермален растежен фактор (hEGF) (lOng/ml), с говежки мозъчен екстракт (ВВЕ) (3mg/ml) и 2 % фетален говежди серум (FBS) (Clonetics Corp, San Diego, СА) съгласно инструкциите на производителя. Културалните петрита се покриват с човешки фибронектин (10?g/cm²/) (Boehringer, Mannheim). Клетките се инкубират във влажни условия в инкубатор, поддържащ 5% СОг и експериментите се провеждат, като се изполлзат HUVECs на 3-ти пасаж HUVECS се третират с човешки IL-Ιβ (10 ng/ml), TNF-a (10 ng/ml) и INFy (20 ng/ml) (R и D система, Germany) за 24 часа. В края на периода на култивиране, клетките се събират, изолира се РНК и се провежда RT-PCR за IL-18BP и IL-18 иРНК транскриптен анализ. Супернатантите се събират и се анализират за IL-I8BP и IL-18 белтъчна експресия, чрез ELISA.

Човешка моноцитна клетъчна линия ТНР-1 се поддържа като суспензионна култура в RPMI среда, допълнена с 10% топлинно инактивиран FCS, L-глутамин (2тМ), пеницилин-стрептомицин (10U/ml) (Gibco BRL, Life Technologies) и β-меркаптоетанол (50?M) (Fluka). Те се инкубират във влажни условия, в инкубатор поддъжащ 5% СО2 и се пасажират 1:10 на всеки 5 дни. Три дни преди експеримента, човшките моноцитни клетки се довеждат до плътност 0.4 х 10 ⁶ клетки/ml, добавя се Vitamin D3 (80пМ)

..88 • · • · • · ·

....... ’·· ^:.:j.

(Biomol Research Laboratories, USA> и се оставят да адхерират. Веднъж отдиференцирани, към тях се добавя LPS (100 ng/ml) (Calbiochem), човешки IL-Ιβ (10 ng/ml),

TNFa (10ng/ml) и INFy (20 ng/ml). След 48 часа, супернатантите се събират и се анализират за IL-18BP и IL18 белтъчна експресия, чрез ELISA.

Измерване на продукцията на човешки IL-18bp и IL-18

Присъствието на IL-18BP се оценява чрез ELISA в културални супернатанти, без клетки, от HUVECs, които не са стимулирани и са стимулирани за 24 часа с коктейл от цитокини (IL-Ιβ, TNFa, INFy), както и от клетъчната линия ТНР-1, не-стимулирана и стимулирана за 48 часа (LPS, IL-Ιβ, TNFa, INFy). За тази цел, плаките се покриват за една нощ с МаЬ (клон 657.27 0.5 pg /10071/ на гнездо, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel) насочени срещу rhIL-18BP (изоформа а). Разтворимия hIL-18BP се • детектира, като се използва плъшо поликлонално антитяло ♦ ^; (разредено 1/10,000) срещу rhIL-18BP-6his (пречистено от клетки от яйчник на китайски хамстер, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel) и последваща инкубация с пероксидаза-конюгирано афинитетно пречистено козе анти-плъшо IgG (разредено 1/20,000) (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland). Mab както и плъшото поликлонално антитяло се тестват чрез Western Blot за да се потвърди тяхната специфичност спрямо IL18ВР. Рекомбинантно hIL-18BP-his се използва като стандарт. Чуствителността на ELISA метода е 100 pg/ml. Паралелно се определят количествено нивата на IL-18, като се използва • · · · • · · • · · • · · ···· ··

ELISA кит ,89..

•Ο ······ · * · · . : · за човешки

Immunotech). Чуствителността на ELISA метода е 12.5 pg/ml.

Експресия на hlL-18ВРа

His6 в СНО клетки

Рекомбинантния човешки IL-18BP (hIL-18BPa

His6-tag) е пречистен от клетки от яйчник на китайски хамстер (СНО, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel).

РЕЗУЛТАТИ

Експресия на IL-18BP иРНК транскрипти в чревни биопсии

Анализ за експресията на IL-18BP иРНК е проведен, чрез RT-PCR на тъанни хомогенати от хирургически отстранени чревни проби на пациенти с активен CD, не-активен CD или UC и от не-възбалени чревни тъкани (Фиг. 14). IL-18BP и актиновите транскрипти се наблюдават във всички тествани чревни хомогенати. Подобно на това, транскриптите за IL-18 се откриват във всички тъканни хомогенати от CD, UC или от контроли не страдащи от IBD (Фиг.14А). Съотношението на IL-18BP или IL-18 спрямо нивата на актин иРНК показват статистически достоверно повишаване (както е описано подолу) в количеството на транскриптите на IL-18BP и IL-18 в биопсии, получени от пациенти с активни CD в сравнение с биопсии от пациенти с не-активни CD, UC и контроли, не

9Р.

• ♦ • ·· • · • · страдащи от IBD (Фиг. 14Б и повишена продукция на IL-18BP • · ··*

В). Те ези данни показват в мукозна тъкан от активна форма на CD и осигурява първото доказателство, че нивото на IL-18BP експресията ясно се отличава при активна и неактивна форма на CD, UC и при незаболели от

IBD контроли.

Статистически анализ на експресията на IL-18BP иРНК транскрипти от чревни биопсии

Провежда се вариационен анализ за да се обобщят всички налични данни. Изводите ясно показват статистически отнасяния на резултатите на един от пациентите от групата на тези с CD (много високо съотношение на OD за IL-18, именно 16252 и много ниско съотношение на OD за IL-18BP именно 1058). Тези единични нетипични измервания не позволяват да се направи анализ чрез ANOVA модела (р-стойността при теста на Shapiro-Wilks при нормални остатъци < 0.0001). Поради тази причина анализа на сдвояване на измерванията се игнорира при провеждане на статистическия анализ.

При ANOVA, който се използва се взема предвид фактор - Група (Контрола, Активна форма на CD, Неактивна форма на CD и UC), Белтък (IL-18 или IL-18BP) и Брой пациенти (23 пациента). Наблюдават се значителни разлики между групите (р стойността < 0,0001). Също така е интересно да се отбележи че разликите при OD съотношението между IL-18 и IL-18BP не се различават значително (р стойността е = 0.369). Още повече

..91

наблюдава се също корелацията между експресията на IL18 и IL-18BP. Коефициентът на корелация между IL-18 и IL-18BP е 0,67, което предполага очевидна връзка между OD съотношението измерено за IL-18 и IL-18BP. След получаване на резултатите, отнасящи се до ефекта в Групите, се използва метода на Scheffe за да се направи сравнение между отделните групи. Може да се заключи, че съотношението между OD за активна форма на CD е значително повишено в сравнение с Контролната група (+3280), Групата на UC (+2590) и по-специално Групата на неактивна форма на CD (+4580) както и за експресията на IL-18BP и IL-18.

Имунохистохимична локализация на IL-18BP в чревни тъкани

За да се оцени клетъчната експресия на IL-18BP in situ, се провежда имунохистохимична реакция с използването на анти-hIL-l8ВР специфични моноклонални антитела върху криосрези, приготвени от чревни тъкани, получени от пациенти с активна форма на CD и от контроли, не страдащи от IBD. IL-18BP позитивните клетки се наблюдават в ламина проприа, в субмуказата и в мускулната обвивка (не е показано). Позитивно оцветените мононуклеарни клетки присъстващи в ламина проприа и субмукозата, притежават много цитоплазма, везикуларни ретиформени ядра и са морфологично съответстващи на тъканните макрофаги. В мускулната обвивка, позитивно оцветените клетки имат много цитоплазма с няколко отворени лумена в средната част, което предполага оцветяване на съответстващи • ·

микросъдовете • * · ·

и те* са морфологично на ендотелните клетки

Г олемите кръвоносни съдове също се оцветяват специфично с анти-h IL-18BP моноклоналните антитела. Значително повишаване на позитивно оцветените клетки се наблюдава във проби, получени от пациенти с активна форма на CD в сравнение със проби получени от контроли, нестрадащи от IBD, което корелира с повишеното ниво на експресия на IL-18BP, наблюдавано при RT-PCR анализа. Съседни срези са инкубирани със съответната миша контрола-изотип.

Идентифициране на il-18bp продуциращи клетки, присъстващи в мукозните биопсии

IL-18BP позитивни клетки, псисъстващи във възпалените чревни тъкани се идентифицират, като се използват специфични маркери за макрофагите (антиCD68) и ендотелни клетки (анти-СО31) (не е показано). CD68 позитивни клетки (в зелено) и IL-18BP позитивни - клетки (в червено) се наблюдават в субмукозата. За да се потвърди че макрофагите и ендотелните клетки също са позитивни за IL-18 ВР, и позитивно зелено оцветените контроли за анти-СО68 или анти-CD 31 и червено оцветените за анти- IL-18BP се анализират заедно, като се показва че всички тези клетки, които се свързват с антиIL-18BP антителата са позитилни или за CD68 или за CD31 (оранжево-жълт цвят). Двойното имунобелязане показва, че макрофагите и ендотелните клетки са главен източник на оцветяване за IL-18BP на възпалените тъкани, получени от пациенти с CD.

Експресия на Il-18bp иРНК и белтък от ендотелните клетки

За да се изследва способността на човешките

ендотелни клетки да продуцират IL-18BP и за да се потвърди резултатът наблюдаван от имунооцветяването и RT-PCR на всички биопсии, по-нататък RT-PCR експерименти се провеждат с човешки ендотелни клетки от пъпна връв (HUVECs) (Фиг. 15А). Ендотелните клетки се третират с коктейл от цитокини (hIL-Ιβ, hTNFa, hlNFy) и се събират след 24 часа за екстракция на РНК и за PCR анализ. Съотношението на IL-18BP спрямо контролните нива на иРНК за актин показва повишаване на количеството на IL-18BP транскриптите в третирани клетки, в сравнение с не-стимулирани клетки след 24 часа Още повече, IL-18BP иРНК изглежда се експресира постоянно в ендотелните клетки. Нивата на IL-18 иРНК също се анализират и е показано слабо повишаване при третираните клетки. IL-18 иРНК обаче, не се експресира при не-стимулирани ендотелни клетки.

ELISA на културални супернатанти от нестимулирани клетки (среда) и HUVECs третирани 24 часа, показват че IL-18BP белтъка присъства в средата и при стимулирани клетки се повишава 30 пъти след 24 часа стимулиране (Фиг. 15 Б) • · ·

Експресия на IL-18bp в моноцитнаГ клетъчна линия (ТНР-1)

Експресията на IL-18 и на IL-18BP се анализира в културални супернатанти на нестимулирани и стимулирани, диференцирани ТНР-1 клетки, чрез ELISA (Фиг. 15 В). Този експеримент показва повишаване на експресията на IL-18BP след 48 часа стимулиране с LPS, hIL-Ιβ, hTNFa, hlFNy. Паралелно, секрецията на IL-18 се повишава след стимулиране (Фиг.15В).

ОБОБЩЕНИЕ

В настоящето изследване, се характеризират експресията на IL-18BP и локализацията в мукозна тъкан, получена от пациенти с болест на Crohn и язвени колити Чрез използване на полуколичествен RT-PCR протокол, се установява че IL-18BP иРНК транскриптите се увеличават в мукозни биопсии на пациенти с активна форма на болестта на Crohn, в сравнение с пациенти с язвени колити или контролни пациенти, не страдащи от възпаления. Имунохистохимичен анализ за локализацията на IL-18BP белтък в ендотелните клетки и в активираните макрофаги от мукозни биопсии е потвърдено в първични човешки ендотелни клетки от пъпна връв (HUVECs) и в ТНР1 моноцитна клетъчна линия, стимулирани in vitro. След стимулиране, тези клетки секретират биоактивен IL-18BP.

ПРИМЕР 12: ‘

ЛЕЧЕНИЕТО С ИНХИБИТОРИ НА IL-18 ОБЛЕКЧАВА ЕКСПЕРИМЕНТАЛНО ПРЕДИЗВИКАНИ КОЛИТИ

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Мишки и индуциране на колити

За всички експерименти бе получено разрешение от Animal Studies Ethics Committee, University of Amsterdam, The Netherlands. BALB/c мишките са доставени от Harlan Sprague Dawley Inc (Horst, the Netherlands) Мишките се гледат при стандартни условия и им се доставя вода и храна (АМ-П 10 mm, Hope Farms, Woerden, The Netherland).

Експериментите се провеждат с 8 и 10 седмични женски BALB/c мишки. Колитите се индуцират чрез ректално въвеждане на две дози (подавани на 7 дневен интревал) от 2 mg 2,4,6-тринитробензен сулфониева киселина (TNBS) (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA) в 40 % етанол (Merk, Darmstadt, Germany), c използване на винилов катетер, който се поставя в позиция на 3 сантиметра от ануса (10 мишки във всяка група). По време на инстилацията, мишките се анестезират с изофлуран (1хлоро-2,2,2-трифлуоретил-изофлуран-дифлуорметил-етер, Abbott Laboratories Ltd, Queenborough, Kent, UK) и след интстилацията те се държат вертикално за 60 секунди. Контролните мишки преминават през същите процедури, но им се инстилира физиологичен разтвор. Всички мишки siasijjj се убиват 9 дена след

.. *).

• · · · • · ·· • · · · · • · · . ·· ·· първото

- ♦·· • · · · • · · • · · *··* ·£· ΤΝΒ5 въвеждане (т.е.

часа след второто TNBS въвеждане).

Мишките се третират с човешки IL-18BP в 500 μΐ

0.9% солеви разтвор интраперитонеално.

HIL-18BP е свързан 6 пъти с хистидин - tag човешки рекомбинантен протеин, получен от СНО експресионна система. HIL-18BP е биологично активен и инхибира INFy продукцията в KG-1 клетъчна линия и редуцира INFy продукцията от миши далачни клетки (Kim et al., 2000).

Оценка на възпалението

Телесните тегла се записват всеки ден.

Далачните, каудалните лимфни възли и чревните се отстраняват при убиването. Червата се отстраняват чрез срез във средната част и чрез надлъжно отваряне. След остраняване на фекалният материал, се измерва и се записва теглото за дисталните 6 см и се използва като

индекс на плътността на чревната стена отнасяща се до заболяването. В последствите, червата се разделят надлъжно на две части, едната от които се използва за хистологична оценка.

Хистологичен анализ

Надлъжно разделените черва се навиват, фиксират се в 4% формалин и се включват в парафин за рутинна хистология. Двама изследователи, които не са в течение за третирането на мишките, оценяват по следните r

• · · • · ···· параметри: 1) процент включена площ; 2) хиперплазия на фоликулни агрегати, 3) едема, 4) ерозия/улцерация 5) загуба на крипти и 6) инфилтрация на моно- и полиморфонуклеарни клетки. Процента от площта и заг2убата на крипти се оценява по скала, варираща от 0 до

4, както следва: 0, нормално; 1, по-малко от 10% ; 2, 10%;

3, 10 до 50%; 4, повече от 50%. Ерозиите се определят като ако епителия е интактен, 1 при засягане на ламина проприя, 2 при улцерации на субмукозата и 3, когато улцерациите пробили стената. Остротата на другите параметри се оценява по скала от 0 до 3, както следва: 0, липса; 1, слабо; 2, средно; 3 остра форма. Тези оценки се дава от 0 до максимум 26 точки.

Чревни хомогенати

Червата се отстраняват и хомогенати се приготвят чрез тъканен хомогенизатор в 9 обема от Greenburger лизисбуфер (300 mM NaCl, 15тМ Трие, 2тМ MgCl, 2 тМ Тритон (Х-100), Пепстатин А, Леупептин, )

Апринин (всички 20 ng/ml), pH 7.4). Тъканите се лизират за минути на лед, след 2 пъти центрофугиране (10 минути,

000 g). Хомогенатите се съхраняват при - 20 ⁰ С преди да се използват.

Клетъчно култивиране и ELISA за цитокини

За приготвяне на клетъчни суспензии от далачни и каудални лимфни възли се използва филтър за клетъчно ·* ·· ·

Клетките се суспендират в среда RPMI 1640 (BioWhittakerBoehringer, Verviers, Belgium), съдържащ 10% FCS и ципроксин (10 pg/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Далачните клетки се центрофугират със стерилен Фикол (Pharmacia, Uppsala, Sweeden), мононуклеарните ;ι

клетки се прехвърлят в RPMI и клетъчните суспензии се броят. Общият брой от 1 х 10 ⁵ клетки от мишка се инкубират в 20 pl RPMI (BioWittaker Europe, A Cambrex Company, Verviers, Belgium) съдържаща антибиотици и 10% фетален телешки серум в трикратно повторени гнезда.

Клетките се стимулират чрез покрития от анти-СОЗ антитяло (1:30 концентрация; 145.2С11 клон) и с разтворимо анти-СО28 антитяло (1:1000 концентрация; Pharminogen). Супернатантите се отстраняват след 48 часа и IFN γ (Pharminogen) и TNFa (R&D системи, Abingdon, United Kingdom) концентрациите се измерват чрез ELISA анализ.

Изолираните далачни клетки се промиват с Facs буфер (PBS, съдържащ 0.5% BSA, 0.3 mmol/L ЕДТА и

0.01% натриев азид) и се държат на лед до края на процедурата. 2.10⁵ клетки на гнездо (96 гнездна, v-образна микротитърнаплака, Greiner B.V. labor techniek, Alphen aan de Rijn, The Netherlands) се инкубират със следните антитела (mAbs): Cy-chrome-конюгирано плъшо анти-мишо

CD4 (клон RM4-5), Fitc-конюгирано плъшо анти-мишо

CD69 и Fitc-конюгирано плъшо анти-мишо CD25

• 4·· • · · · • ·4 • · 4· •44 ····44

.. Я9 • · · · • · ·· • 4 · « · • 4 4 · •44 • · ·4 • 4· • · · <·4 · · 4 4 4 (Pharmingen, San Diego, СА). Лимфоцитите се пропускат отпред и отстрани чрез разпръскване, като се използва FACScan flow цитометер свързан със Facscan софтуер (Becton Dickinson, Mountain View, USA), като се отброяват 5000 клетки. Резултатите се дават като процент позитивни за използваните mAbs от пропуснатите клетки,.

Статистически анализ

Стойностите се дават като средни стойности и SEM за всяка третирана група. Разликите между групите се анализират, като се използва не-параметричният МаппWithney U тест. Разликите в теглата във времето се анализират чрез едностранният вариационен анализ. Стойностите Р<0,05 се считат като статистически значими. SPSS статистически софтуер (SPSS Inc, Chicago, USA) се използва за анализите.

РЕЗУЛТАТИ

IL-18BP предпазва от загуба на тегло при миши модел на колити

За да се изследва ролята на IL-18 при експериментални колити и по-специално предпазният ефект на IL-18 свързващия белтък (IL-18BP), TNBS колити се индуцират в BALB/c мишки. Този модел включва локално подаване на три-нитробензен сулфониева киселина (TNBS) в 40% етанол. То води до късна форма на хиперчувствителна реакция към хаптена (тринитрофенил)

9

9

9999 модифицираща собственият антиген и Th!-тип отговор с повишено ниво на продукция на цитокини.

Третирането с IL-18BP, както и при мишките контроли, е чрез ежедневно интраперитонеално въвеждане (ip).

Дневните интраперитонеални дози вариращи от

12.5 pg до 50pg hIL-18BP не се отразяват на остротата на заболяването (данните не са показани). Използвайки дневна доза от 200 pg hIL-18BP, обаче, ежедневно интраперитонелано въвеждана, показва ефект на редукция на загубата на тегло, което е свързано с индукцията на заболяването.

Както се очаква, интраректалната инстилация на TNBS води до диярия и загуби. Както е показано на Фиг. 16, животните в двете третираните групи губят 15% от основното си тегло на третия ден. Обаче в противовес на контролните мишки, 4 дена след TNBS инстилирането, h 1Ь-18ВР-третираните животни започват бързо да възстановяват първоначалната загуба на тегло, като се връщат до основното си тегло на 8 ден. При контролните мишки, второто въвеждане на TNBS на 8 ден, отново води до значителна загуба на тегло, което се предотвратява в голяма степен при въвеждане на hIL-18BP. Въвеждането на hIL-18BP при мишките третирани със солеви разтвор не оказва ефект (данните не са показани). Следователно, въвеждането на hIL-18BP значително намалява телесната загуба, при TNBS-индуцираните колити (р<0.05).

Ефекти върху параметрите на възпалителните реакции

На 10 ден, мишките се убиват и се определя теглото на последните 6 сантиметра на червото (Фиг. 17А). При TNBS колитите, теглото на червото се увеличава, в сравнение с това при третираните със солеви разтвор мишки. Това повишаване на теглото е значително по-малко при hIL-18BP третирани мишки (181.6 mg ±11.4 в сравнение с 268 mg ± 27.3 при третираните със солеви разтвор мишки (р<0.05)). В предходни изследвания е съобщено че TNBS колитите са свързани с повишена миграция на клетки в каудавните лимфни възли (Camoglio et al., 2000). Третирането с IL-18BP редуцира броя на клетките в каудалните лимфни възли в сравнение с броя на клетките в каудалните лимфни възли при TNBS мишки третирани със солеви разтвор (Фиг. 17 Б).

Промяната в експресията на CD69 , която е маркер за ранно активиране на Т-лимфоцитите, се определя чрез Facscan анализ (Фиг. 17В). Процента на CD4⁺ далачните клетки експресиращи CD 69 е 11.4% при TNBSтретирани мишки, но при TNBS третирани и 11IL-18BP третирани мишки процента на CD4⁺/CD69⁺ е 7.3% (р<0.05).

Продукция на цитокини в далака, в клетките на каудалните лимфни възли и в чревните хомогенати.

' k

Я

Д f За да се изследва ефекта на 11IL-18BP върху > способността на Т-лимфоцитите да продуцират про; възпалителни цитокини, синтезата на които следва

102 ···· • · ·« •· ·· • · ·· · • · ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·♦·· ·· активирането на Т-*· петъчните изолирани от каудални лимфни възли и от далак и са е

·· · r ·· • « · • · • · • · ецептори, клетките са стимулирани за 48 часа с анти-СОЗ/СО28 антитела. В супернатантите се измерва продукцията на INFy и TNFa (Фигура 18). Не се наблюдават значителни разлики между продукцията на цитокини при hIL-18BP третираните мишки

и при контролните мишки. Следователно, неутрализирането на IL-18 от hIL-18BP не води до обща редукция на способността на Т-лимфоцитите да отговарят на Т-клетъчното рецепторно активиране.

Чревните хомогенати са анализирани за тяхните нива на цитокини, затова се измерва локалната продукция на цитокини (Фиг. 19). Не се наблюдават разлики в нивата на INFy в чревните хомогенати на TNBS-третирани мишки, и TNBS третирани мишки, третирани и с 11IL-18BP (134 pg/ml ± 7.8 и 139 pg/ml + 23 съответно). Нивата на

TNFa, обаче значително се понижават в чревни хомогенати на мишки, третирани с hIL-18BP от 110 pg/ml ± 3 в TNBS третирани мишки до 59 pg/ml +2.7 в мишки, третирани с TNBS и hIL-18BP.

Хистологични наблюдения

За да се изследва, дали hIL-18BP- медиираната редукция на параметрите на възпалителните реакции се отразява също на резултатите от хистологичните изследвания, хистопатологични изследвания се провеждат върух парафинови срези. Общият резултат за въпалителни реакции, при хистологичните изследвания, значително се понижава при 11IL-18BP третирани мишки, в сравнение с ^Μ>ί>Ί^Η>ν·>»ΐ4^·χ· :^л; tfriiiai

103

S • · • ·· • ·· • ·· ·· «· • · · · • · · · • · · · л ·· ·· • · · · • · · контролни-третирами’*ми1й«й*4!

при не-третирани мишки до 9,8±1,3 при hIL-18BP третирани мишки) (не е показано), главно като резултат от редукцията на броя на левкоцитите инфилтрирани в мукозата (р<0.05).

Забележително откритие е напълното отсъствие на мукозни улцерации при IL-18BP третирани мишки (р<0.05). Откритията са сумирани в Таблица 2, по-долу. Пълното предпазване от улцерации при IL-18BP третирани мишки е забележително в тези случаи.

ТАБЛИЦА 2:

РАЗЛИЧНИ ТОЧКИ ОТ СЪРЦЕВИНАТА НА РАЗВИТИТЕ

КОЛИТИ ПРИ TNBS ТРЕТИРАНИ МИШКИ, ТРЕТИРАНИ СЪС

СОЛЕВИ РАЗТВОР ИЛИ С rhIL-18BPa

	Контролни третирани с TNBS мишки	hIL-18BP третирани мишки, третирани и с TNBS
% Засегната площ	3.4 ±0.4	3.2 ±0.5
Фоликулни агрегати	2.0 ±0.4	1.5 ±0.4
Едема	2.1 ±0.3	1.3 ±0.3
Фибрози	0.85 ±0.26	0.50 ±0.2
Улцерации	2.0 ±0.3	0.0 ±0.0*
Загуба на крипти	1.7 ±0.3	1.0 ±0.3
Полимороядрени клетки	2.6 ±0.2	1.3 ±0.2*
Мононуклеарни клетки	1.1 ±0.1	0.33 ±0.21*

Данните са показани, като средни стойности + SEM по скалата от 0-4, с * са показани статистически значимите разлики.

104 ·· ·· • · · ·· ·· • · ·· ··

Анти mIL-18 .:. · · · :: : ·: : .· поликУ/оналните ашигела предпазват от заболявания, свързани с миши модел на декстран сулфат натрий - индуциран колит

В този модел, декстран сулфат натрий (DSS) се подава с водата за пиене, като началото на отчитането преди убиването на животните се отбелязва, като ден 0. Ahth-IL-18BP поликлонални антитела се въвеждат на ден 0, 4 и 8 i.p. Дозите са 200 и 400 ?1 от заешки серум. Найвисоката доза (400 μΐ) дава значителна редукция на загубата на тегло, клинични резултати, ректално кървене и скъсяване на дебелото черво (не е показано). Третирането със заешки анти-ш1Ь-18 показва забавяне на началото на симптомите и предотвратяване на развитието на заболяването (не е показано).

ОБОБЩЕНИЕ

Пример 12, описан по-горе, показва че неутрализирането на IL-18 чрез въвеждането на hIL-18BP или на поликлонален антисерум срещу IL-18, ефективно редуцира остротата на експериментално индуцирани колити в мишки.

Мишките, третирани дневно с 11IL-18BP интраперитонеално, бързо се възстановяват от първоначалната загуба на тегло, в сравнение с контролнотретирани мишки. Други параметри на чревни възпалителни реакции се определят чрез измерване на теглото на червата и инфлукса на клетки в каудалните лимфни възли, които се редуцират при 11IL-18BP третирани

• ·

• · мишки.

Хистопатологптпата картина при третирани мишки, се характеризира с редукция на остра форма на тъканна деструкция (улцерации) и със значителна редукция на количеството инфилтрирани клетки. Ефектът на hIL•ή 18ВР е също системен, което се демонстрира от редукцията в експресията на CD69 от далачните клетки.

Локалната продукция на TNFa, измерен в 4 чревни хомогенати, значително се редуцира при TNBS h третирани мишки, третирани и с hIL-18BP. Това показва,

Ρί₄ΐ λ ф че TNFa играе важна роля за развитието на заболяването, h Нивата на INFy са сравними при TNBS третирани мишки и ' мишки третирани с TNBS и с hIL-18BP, което може да се обясни с редукцията на ЮТу-индуциращи стимули.

s В заключение, данните представени по-горе показват благоприятен ефект на инхибиторите на IL-18 при ? лечение на чревни възпалителни заболявания.

.+06··.

• · ··

ЛИТЕРАТУРА

1. Afford, S.C., et al., Distinct patterns ofchemokine expression are associated with leukocyte recruitment in alcoholic hepatitis and alcoholic cirrhosis. J Pathol, 1998. 186(1): p. 82-9.

2. Anderson. D.M., et al., A homologue of the TNF receptor and itsligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function. Nature, 1997. 390(6656): p. 175-179.

3. Baroni, G.S., et al., Hepatic stellate cell activation and liver fibrosis are associated with necroinflammatory injury and Th 1-like response in chronic hepatitis C. Liver, 1999. 19(3): p. 212-9.

4. Bird, G.L., et al., Increased plasma tumor necrosis factor in severe alcoholic hepatitis. Ann Intern Med, 1990. 112(12): p. 917-20.

5. Bollon, D. P., et al. (1980) J. Clin. Hematol. Oncol 10:39-48.

6. Botstein, D., et al. (1982) Miami Wint. Symp. 19:265-274.

7. Broach, J. R., in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 445-470 (1981).

8. Broach, J. R., (1982) Cell 28:203-204.

9. Bym R. A. et al., 1990, Nature (London) 344:667-670.

10. Camoglio L, te Velde AA, de Boer A, ten Kate FJ, Kopf M, van Deventer SJ. Hapten-induced colitis associated with maintained Th1 and inflammatory responses in IFN-gamma receptor-deficient mice. Eur J Immunol 2000;30:148695.

11. Car, B. D., V. M. Eng, B. Schnyder, L. Ozmen, S. Huang, P. Gallay, D. Heumann, M. Aguet, and B. Ryffel. 1994. Interferon gamma receptor deficient mice are resistant to endotoxic shock. J. Exp. Med. 179:1437-44 issn: 00221007.

12. Chater, K. F. et al., in Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54).

13. Conti. B.. J. W. Jahng, C. Tinti, J. H. Son, and Τ. H. Joh. 1997. Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex. J. Biol. Chem. 272:20352037.

-J

14. Dao, T., K. Ohashi, T. Kayano, M. Kurimoto, and H. Okamura. 1996. Interferon· gamma-inducing factor, a novel cytokine, enhances Fas ligand-mediated cytotoxicity of murine T helper 1 cells. Cell-lmmunol. 173:230-5 issn: 0008-8749.

15. Dayer. J-M (1999). J. Cin. Inv. 104, 1337-1339.

16. Desreumaux P, Brandt E, Gambiez L, Emilie D, Geboes K, Klein O, Ectors N, Cortot A, Capron M, Colombel JF. Distinct cytokine patterns in early and chronic ileal lesions of Crohn's disease. Gastroenterology 1997; 113:118-126.

17. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997), Nature 388,16514-16517.

18. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344,1125-1127.

19. Engelmann, H., D. Aderka, M. Rubinstein, D. Rotman, and D. Wallach. 1989. A ♦

tumor necrosis factor-binding protein purified to homogeneity from human urine protects cells from tumor necrosis factor toxicity. J. Biol. Chem. 264:1197411980.

20. Engelmann, H., D. Novick, and D. Wallach. 1990. Two tumor necrosis factorbinding proteins purified from human urine. Evidence for immunological crossreactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265:1531-1536.

21. Fantuzzi, G., et al., IL-18 regulation of IFN-g production and cell proliferation as revealed in interleukin-1b converting enzyme-deficient mice. Blood, 1998. 91: p. 2118-2125.

22. Fiore, G., et al., Liver tissue expression of CD80 and CD95 antigens in chronic hepatitis C: relationship with biological and histological disease activities. Microbios, 1999. 97(386): p. 29-38

23. Galle, P.R., et al., Involvement of the CD95 (АРО-1/Fas) receptor and ligand in liver damage. J Exp Med, 1995.182(5): p. 1223-30.

24. Grade, A J, Forsey, R J, Chan, W ' Gilmour. A, Leung, В P, Greer, A R,

KenncJ,. h Carter, R, Wei, X-Q, Xu, D., Fieia, M, “ ·.~... ^v ^nd

Mclnnes, I B.(1999). J. Clin. Inv. 104: 1393-1401

25. Grantham (1974), So'jnce. 185. 862-864.

108

j· » » · · Φ ·

26. Grove. J., et al.,.f^sb,cietroS o! & tomqr npcrfesis factor promoter polymorphism * ·· ·· ·· ···· with susceptibility to alcoholic steatohepatitis [see comments]. Hepatology, 1997. 26(1): p. 143-6.

27. Gryczan, T., The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329).

28. Gutkind, J.S., et al., A novel c-fgrexon utilized in Epstein-Barr virus-infected B lymphcytes but not in mormal monocytes. Molec. Cell. Biol., 1991. 11: p. 15001507.

29. Harada, K., et al., In situ nucleic acid hybridization of cytokines in primary biliary cimhosis: predominance of the Th1 subset. Hepatology, 1997. 25(4): p. 791-6.

30. Heremans, H., J. Van Damme, C. Dillen, R. Dijkmans, and A. Billiau. 1990. Interferon gamma, a mediator of lethal lipopolysaccharide-induced Shwartzmanlike shock reactions in mice. J. Exp. Med. 171:1853-69 issn: 0022-1007.

31. Hill, D.B., et al., Increased plasma interieukin-6 concentrations in alcoholic hepatitis. J Lab Clin Med, 1992.119(5): p. 547-52.

32. Hill, D.B., LS. Marsano, and C.J. McClain, Increased plasma interieukin-8 concentrations in alcoholic hepatitis. Hepatology, 1993.18: p. 576-580.

33. Hiramatsu, N.. et al., Immunohistochemical detection of Fas antigen in liver tissue of patients with chronic hepatitis C. Hepatology, 1994. 19(6): p. 1354-9.

34. Huang, Y.S., et al., Serum levels of interieukin-8 in alcoholic liver disease: relationship with disease stage, biochemical parameters and survival. J Hepatol, 1996. 24(4): p. 377-84.

35. iio, S., et al., Serum levels of soluble Fas antigen in chronic hepatitis C patients. J Hepatol, 1998. 29(4): p. 517-23.

36. Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742).

37. John, J. F„ et al. (1986) Rev. Infect. Dis. 8:693-704).

38. Kahiwamura, S., Okamura, H. (1998), Nippon. Rinsho. 56, pp. 1798-4806.

39. Kendall, K. J. et al. (1987) J. Bacteriol. 169:4177-4183).

40. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL18 binding protein to inhibit IL-18. Proc NatJ Acad Sci U S A 2000;97:1190-1195.

109

··	··	• €	• e
• ·	• · · e	• ·
е e	·· е e	_ ·
• · e ·	• · · · · • · · ·
• ·	• ·	е ·	• ebe

41. Knight DM. Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M. Scallon B, Moore

MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody.Mol Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53

42. Kohno. K.. J. Kataoka, T. Ohtsuki, Y. Suemoto, I. Okamoto. M. Usui, M. Ikeda, and M. Kurimoto. 1997. IFN-gamma-inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Th1 but not Th2 cells and exerts its effect independently of IL-12. J. Immunol. 158:1541-1550.

43. Lee, M., et al., Expression of Th1 and Th2 type cytokines responding to HBsAg and HBxAg in chronic hepatitis B patients. J Korean Med Sci, 1999. 14(2): p. 175-81.

44. Lukkari, T.A., et al., Short-term ethanol exposure increases the expression of Kupffer cell CD14 receptor and lipopolysaccharide binding protein in rat liver.

Alcohol Alcohol, 1999. 34(3): p. 311-9.

45. Luo, K.X., et al., In situ investigation ofFas/FasL expression in chronic hepatitis B infection and related liver diseases. J Viral Hepat, 1997. 4(5): p. 303-7.

46. Maliszewski, C. R., T. A. Sato, T.Vanden Bos, S. Waugh, S. K. Dower, J. Slack, Μ. P. Beckmann, and K. H. Grabstein. 1990. Cytokine receptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1- and IL-4induced B cell activities in vitro. J. Immunol. 144:3028-3033.

47. Maniatis, T., in Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3: Gene Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608 (1980).

48. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1982.

49. Martinez, F.₍ et al., Ethanol and cytokine secretion. Alcohol, 1992. 9(6): p. 455-8.

50. McClain, C.J., et al., Tumor necrosis factor and alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res, 1998. 22(5 Suppl): p. 248S-252S.

51. McClain, C.J. and D.A. Cohen, Increased tumor necrosis factor production by monocytes in alcoholic hepatitis. Hepatology, 1989. 9(3): p. 349-51.

52. Micallef, M. J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1996. Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production. Eur-J-lmmunol 26:1647-51 issn: 0014-2980.

110 ·· ·» ·· ·♦ ·€ ·* • · · · · · ♦ · ···· • · · · · · · · · ·

53. Mizushima, S. . W¥*. ^а*93&^: V 0 &9J Ж F-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acid Res. 18:5322-5328.

54. Monteleone G. Trapasso F, Parrello T, Biancone L, Stella A, luliano R, Luzza F, Fusco A, Pallone F. Bioactive IL-18 expression is up-regulated in Crohn's disease. J Immunol 1999;163:143-147.

55. Muhl H, Kampfer H, Bosmann M, Frank S, Radeke H, Pfeilschifter J. Interferongamma mediates gene expression of IL-18 binding protein in nonleukocytic cells. Biochem Biophys Res Commun 2000;267:960-963.

56. Nakamura. K., H. Okamura, M. Wada, K. Nagata, and T. Tamura. 1989. Endotoxin-induced serum factor that stimulates gamma interferon production. Infect-lmmun 57:590-5 issn: 0010-9567.

57. Nanji, A.A., et al., Activation of nuclear factor к B and cytokine imbalance in experimental alcoholic liver disease in the rat. Hepatology, 1999. 30(4): p. 93443.

58. Nishimura, T. and A. Ohta, A critical role for antigen-specific Th1 cells in acute liver injury in mice. J. Immunol, 1999.162: p. 6503-6509.

59. Novick, D., B. Cohen, and M. Rubinstein. 1994. The Human Interferon alpha/beta Receptor - Characterization and Molecular Cloning. Cell 77:391-400.

60. Novick, D., B. Cohen, and M. Rubinstein. 1992. Soluble Interferon-alpha Receptor Molecules Are Present in Body Fluids. FEBS Lett 314:445-448.

61. Novick, D., H. Engelmann, D. Wallach, and M. Rubinstein. 1989. Soluble cytokine receptors are present in normal human urine. J. Exp. Med. 170:14091414.

62. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C. and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.

63. Ohlinger, W., et al., Immunohistochemical detection of tumor necrosis factor-a, other cytokines and adhesion molecules in human livers with alcoholia hepatitis. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol, 1993. 423(3): p. 169-76.

64. Okamura, Η., H. Tsutsui, T. Komatsu, M. Yutsudo, A. Hakura, T. Tanimoto, K. Torigoe, T. Okura, Y. Nukada, K. Hattori, K. Akita, M. Namba, F. Tanabe, K. Konishi, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1995. Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells. Nature 378:88-91.

Ί.14·*.

• ·· • · · • · · · ·· ··

65. Okamoto, Τ.. et al., Induction of Fas ligand arfd Fas antigen mRNA expressions in interferon-γ transgenic mouse liver. Jpn J Pharmacol, 1998. 78(2): p. 233-5.

66. Okazaki, M.. et al., Hepatic Fas antigen expression before and after interferon therapy in patients with chronic hepatitis C. Dig Dis Sci, 1996. 41(12): p. 2453-8.

67. Okamoto, T., K. Yamamura, and 0. Hino, The mouse interferon-γ transgene chronic hepatitis model (Review). Int J Mol Med, 1999. 3(5): p. 517-20.

68. Olee T, Hashimoto S, Quach J, Lotz M. (1999). J Immunol 162:2 1096-1QO

69. Pamet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271,3967-3970.

70. Plater-Zyberk C, Bonnefoy JY. Marked amelioration of established collageninduced arthritis by treatment with antibodies to CD23 in vivo. Nat Med 1995;1:781-785.

71. Pizarro TT. Michie MH, Bentz M, Woraratanadharm J, Smith MF, Jr., Foley E, Moskaluk CA, Bickston SJ, Cominelli F. IL-18, a novel immunoregulatory cytokine, is up-regulated in Crohn's disease: expression and localization in intestinal mucosal cells. J Immunol 1999;162:6829-6835.

72. Reimund JM, Wittersheim C, Dumont S, Muller CD, Baumann R, Poindron P, Dudos B. Mucosal inflammatory cytokine production by intestinal biopsies in patients with ulcerative colitis and Crohn's disease. J Clin Immunol 1996;16:144150.

73. Rothe, H., N. A. Jenkins, N. G. Copeland, and H. Kolb. 1997. Active stage of autoimmune diabetes is associated with the expression of a novel cytokine, IGIF, which is located near Idd2. J-Clin-lnves.t 99:469-74 issn: 0021-9738.

74. Saha N, Moldovan F, Tardif G, Pelletier JP, Cloutier JM, Martel-Pelletier J.(1999). Arthritis Rheum 42:8 1577-87.

75. Sambrook, J., E.F. Fritsch, and Μ. T., Molecular Cloning: A laboratory manual. 2nd ed. ed. 1989, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

76. Simonet, W.S., et al., Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell, 1997. 89(2): p. 309-319.

77. Sheron, N., et al., Elevated plasma interleukin-6 and increased severity and mortality in alcoholic hepatitis. Clin Exp Immunol, 1991. 84(3): p. 449-53.

112 ’ :”····. .· ..

• · ···_!·· J · · · ·

78. Sompayrac, L.H. andK<CD3nna_t^ci£nf ipfyctiprf of monkey cells with DNA of simian virus 40. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA. 1981. 78: p. 7575-7578.

79. Sparks. C.A., et al.. Assignment of the nuclear mitotic apparatus protein NuMA gene to human chromosome 11ql3. Genomics, 1993. 17: p. 222-224.

80. Su. G.L., et al.. CD14 and lipopolysaccharide binding protein expression in a rat model of alcoholic liver disease. Am J Pathol, 1998. 152(3): p. 841-9.

81. Taieb, J., et al.. Raised plasma soluble Fas and Fas-ligand in alcoholic liver disease [letter]. Lancet. 1998. 351(9120): p. 1930-1.

82. Triantaphyllopoulos, K A. Williams. R, Tailor, H, and Chernakovsky, Y‘('1999).

Arthritis and Rheumatism 42, 90-99.

83. Tsutsui, Η.. K. Nakanishi, K. Matsui, K. Higashino. H. Okamura, Y. Miyazawa, and K. Kaneda. 1996. IFN-gamma-indudng factor up-regulates Fas ligandmediated cytotoxic activity of murine natural killer cell clones. J. Immunol. 157:3967-73 issn: 0022-1767.

84. Tsuij, H., Mukaida, N.. Harada A., Kaneko. S., Matsushita, E., Nakanuma, Y.. Tsutsui, H.. Okamura. N.. Nakanishi, K., Tagawa.m Y, Iwakura, Y., Kobayashi, K., and Matsuschima, K.(1999), J. Immunol. 162, pp. 1049-1055.

85. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler. R.H., 1992. J.lmmunol. 148,2778-2784.

86. Ushio, S.. M. Namba, T. Okura, K. Hattori, Y. Nukada, K. Akita, F. Tanabe, K. Konishi, M. Micallef, M. Fujii, K. Torigoe, T. Tanimoto, S. Fukuda, M. Ikeda, H. Okamura, and M. Kurimoto. 1996. Cloning of thecDNA for human IFN-gammaindudng factor, expression in Escherichia coli, and studies on the biologic activities of the protein. J. Immunol. 156:4274-4279.34. Okayama, H. and Berg. P. (1983) A cDNA doning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 3:280-289.

87. Williams RO. Mason LJ, Feldmann M, Maini RN. Synergy between ant^CD4 and anti-tumor necrosis factor in the amelioration of established collagen-induced arthritis. Proc Natl Acad Sd U S A 1994 Mar 29 91:7 2762-6.

88. Yasuda. H., et al., Identity of osteodastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteodastogenesis in vitro. Endocrinology, 1998.139: p. 1329-1337.

113 ·**····. .· < ·· .·· · · ί ί.*· · *ί* ί

89. Yoshimoto Τ, Takeda? fc,.Tana&r, ^;T_kOAl4bsC, tf.’Kashiwamura. S, Okamura, H, ·· ····

Akira, S and Nakanishi, K (1998), J. Immunol. 161,3400-3407.

Claims (49)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Използване на инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от чернодробно увреждание.
2. 2. Използване, съгласно претенция 1, където чернодробното увреждане е остра форма.
3. 3. Използване, съгласно претенция 1, където чернодробното увреждане е хронично.
4. 4. Използване, съгласно която и да е от претенции 1 до 3, където чернодробното увреждане е хепатит при алкохолици, вирусен хепатит, имунен хепатит, фулминантен хепатит, чернодробна цироза и първична жлъчна цироза.
5. 5. Използване, съгласно претенция 4, където чернодробното увреждане е е фулминантен хепатит.
6. 6. Използване на инхибитор на IL-18 за производство на медикамент за лечение и/или предпазване от артрит.
7. 7. Използване съгласно претенция 6, където артритът е възпалителен артрит.
8. 8.

   Използване, съгласно претенция

   7, къдею възпалителният артрит е ревматоиден артрит.
9. 9. Използване на инхибитор на IL-18 за производство на медикамент за лечение и/или предпазване от хрущялна деструкция.
10. 10. Използване на инхибитор на IL-18 за производство на медикамент за лечение и/или предпазване на чревно възпалително заболяване.
11. 11. Използване, съгласно претенция 10, където чревното възпалително заболяване е болест на Crohn.
12. 12. Използване, съгласно претенция 10, където чревното възпалително заболяване е язвен колит.
13. 13. Използване, съгласно която и да е от претенции от 1 до 12, където инхибиторът на IL-18 е избран от групата на инхибитори на каспаза-1 (ICE), антитела срещу IL-18, антитела срещу която и да е субединица на рецептора за IL-18, инхибитори на сигналният път на IL-18, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират рецептора за IL-18, и IL-18 свързващи белтъци, изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или циклични пермутирани техни производни, които имат по същество същата активност както и IL-18 свързващият белтък.

    ·· ·· • · • · • · • · ··· ··

    .. Ц6 • · · · • · · · • · ·· • ·♦ • · • · ♦ · · ·· ·· • · ·· ····
14. 14. Използване, съгласно претенция 13, където инхибитор на IL-18 е IL-18 антитяло.
15. 15. Използване, съгласно претенция 14, където IL-18 антитялото е хуманизирано IL-18 антитяло.
16. 16. Използване, съгласно претенция 15, където IL-18 антитялото е човешко IL-18 антитяло.
17. 17. Използване, съгласно претенция 13, където инхибитор на IL-18 е IL-18 свързващ белтък, или изоформа, мутеин, рекомбинантен белтък, функционално производно, активна фракция или циклично пермутирано нейно производно.
18. 18. Използване, съгласно претенция 17, където IL-18 свързващият белтък е PEG-свързан.
19. 19. Използване, съгласно претенция 17, където инхибиторът на IL-18 е рекомбинантен белтък, който включва целият или част от IL-18 свързващ протеин, рекомбинантно свързан с целият или с част от имуноглобулин, и където рекомбинантният протеин се свързва също с IL-18.
20. 20. Използване, съгласно претенция 19, където рекомбинантният белтък включва целият или част от константният район на имуноглобулин.

    .. ш • · · · • · ·· • · · · · • · · · ·· ··
21. 21. Използване, съгласно претенция 20, където имуноглобулинът е изотип IgGl или IgG2.
22. 22. Използване, съгласно която и да е от гореизложените претенции, където медикаментът понататък включва интерферон.
23. 23. Използане, съгласно претенция 22, където интерферонът е интерферон-β.
24. 24. Използване, съгласно претенции 22 или 23, където инхибиторът на IL-18 се използва едновременно, последователно или поотделно с интерферона.
25. 25. Използване, съгласно която и да е от гореизложените претенции, където медикаментът понататък включва антагонист на Тумор Некрозис Фактора (TNF-антагонист).
26. 26. Използване, съгласно претенция 25, където TNF-антагонистът е TBPI и/или ТВРП.
27. 27. Използване, съгласно претенция 25 или 26, където инхибиторът на IL-18 и/или на интерферона се използва едновременно, последователно или поотделно с антагониста на TNF.
28. 28. Използване, съгласно която и да е от гореизложените претенции, където медикаментът понататък включва СОХ-инхибитор.

    а j 118 ·· ♦· ·. ·· • ♦ ♦ · · · · · • · ··· · « · • · · · · · · • · · · · · > · · ·

    • · • · · * · ·
29. 29. Използване, съгласно претенция 28, където СОХ-инхибиторът е СОХ-2 инхибитор.
30. 30. Използване, съгласно която и да е от гореизложените претенции, където инхибиторът на IL-18 f

    : се използва в количество около 0,0001 до 10 mg/kg от *1 телесното тегло, или около 0,01 до 5 mg/kg от телесното тегло или около 0,1 до 3 mg/kg от телесното тегло или ΐ около 1 до 2 mg/kg от телесното тегло.

    ; 'j
31. 31. Използване, съгласно която и да е от гореизложените претенции, където инхибиторът на IL-18 се използва в количества от около 0,1 до 1000 pg/kg от телесното тегло или от 1 до 100 pg/kg от телесното тегло, * или около 10 до 50 pg/kg от телесното тегло.

    1 32. Използване, съгласно която и да е от ,= гореизложените претенции, където ин хибиторът на IL-18 се въвежда подкожно. ‘ΰ 33. Използване, съгласно която и да е от гореизложените претенции, където ин хибиторът на IL-18 се въвежда вътремускулно. I 34. Използване, съглосно която и да е от Z гореизложените претенции, където инхибиторът на IL-18 4 ъ се въвежда ежедневно.

    s ·· ·· • · · · • ·· • ·· • ··
32. 35. Използване·,’

    119 • · ·« • · · · J»· • · · · ·'

    СЪглаГЯн»·· която и да е от гореизложените претенции, където инхибиторът на IL-18 се въвежда през ден.
33. 36. Използване на експресионен вектор, включващ кодиращата последователност на инхибитор на IL-18, за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от чернодробнио увреждане.
34. 37. Използване на експресионен вектор, включващ кодираща последователност на инхибитор на IL18, за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от артрит.
35. 38. Използване на експресионен вектор, включващ кодираща последователност на инхибитор на IL18, за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от чревно възпалително заболяване и артрити.
36. 39. Използване, съгласно която и да е от претенции 36 до 38 за генна терапия.
37. 40. Използване на вектор, за индуциране и/или повишаване на ендогенна продукция на инхибитор на IL-18 в клетка, за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от чернодробно увреждане.
38. 41. Използване на вектор, за индуциране и/или повишаване на ендогенна продукция на инхибитор на IL-18 ζ120 ·· ·· ♦ · ·· • 999 • · ·· • -“ ··99

    9 9 9· • · · _9 9· в клетка., за и/или предпазване от артрит.

    • ·· ····*

    ПроЙ*ЗВ?)ЛСтЕотТТ н • · • · е • · • · • · а*· медикамент за лечение
39. 42. Използване на вектор, за индуциране и/или повишаване на ендогенна продукция на инхибитор на IL-18 в клетка, за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от чревно възпалително заболяване.
40. 43. Използване на клетка, която е генетично модифицирана да продуцира инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от чернодробно увреждане.
41. 44. Използване на клетка, която е генетично модифицирана да продуцира инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от артрит.
42. 45. Използване на клетка, която е генетично модифицирана да продуцира инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от чревно възпалително заболяване.
43. 46. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва терапевтично ефективно количество от инхибитор на IL-18 и терапевтично ефективно количество от интерферон.
44. 47. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва терапевтично ефективно количество от ·· ·· • · ·· • ·· • ·· • ·· ···· ··

    ...щ • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· ·· • ·· •е •· • · ···· инхибитор на IL-18 и терапевтично ефективно количество от антагонист на TNF.
45. 48. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва терапевтично ефективно количество от инхибитор на IL-18 и терапевтично ефективно количество от СОХ-2 инхибитор.
46. 49. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва терапевтично ефективно количество от инхибитор на IL-18 в комбинация с терапевтично ефективно количество от който и да е или от всчиките: интерферон, антагонист на TNF или СОХ-2 инхибитор.
47. 50. Метод за лечение и/или предпазване от чернодробно увреждане, характеризиращ се с това че включва, въвеждане в гостоприемник, който се нуждае от това, на ефективно инхибиращо количество от инхибитор на IL-18.
48. 51. Метод за лечение и/или предпазване от артрит, характеризиращ се с това че включва, въвеждане в гостоприемник, който се нуждае от това, на ефективно инхибиращо количество от инхибитор на IL-18.
49. 52. Метод за лечение и/или предпазване от чревно възпалително заболяване, характеризиращ се с това че включва, въвеждане в гостоприемник, който се нуждае от това, на ефективно инхибиращо количество от инхибитор на IL-18.