PL206549B1 - Zastosowanie inhibitora IL-18, wektora ekspresyjnego zawierającego kodującą go sekwencję, wektora wywołującego lub wzmacniającego endogenną produkcję inhibitora IL-18 oraz genetycznie zmodyfikowanej komórki - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitora IL-18, wektora ekspresyjnego zawierającego kodującą go sekwencję, wektora wywołującego lub wzmacniającego endogenną produkcję inhibitora IL-18 oraz genetycznie zmodyfikowanej komórki.

Obecny wynalazek dotyczy w szczególności terapeutycznego zastosowania wyżej wskazanych czynników do leczenia i/lub zapobiegania zapaleniu stawów, chorobom wątroby i zapalnym chorobom jelita (IBD, ang. inflammatory bowel disease).

Dziedzina wynalazku

W 1989 roku opisano wywołaną endotoksyną zachodzącą w surowicy aktywność, która indukowała interferon-γ (IFN-γ) z mysich splenocytów (Micallef i wsp., 1996). Ta aktywność w surowicy nie działała jako bezpośredni czynnik indukujący IFN-γ, ale raczej jako kostymulator razem z IL-2 lub mitogenami. Próba oczyszczenia tej aktywności z surowicy myszy po endotoksynie wykazała 50-55 kDa pozornie homogenne białko. Ponieważ inne cytokiny mogą działać jako kostymulatory wytwarzania IFN-γ, nieskuteczność przeciwciał neutralizujących przeciwko IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 albo TNF w neutralizacji zachodzącej w surowicy aktywności sugeruje, że aktywność ta była wywoływana przez inny czynnik. W 1995 roku ci sami naukowcy wykazali, że indukowany przez endotoksynę kostymulant wytwarzania IFN-γ był obecny w ekstraktach wątroby myszy wstępnie traktowanych P. acnes (Novick i wsp., 1992). W modelu tym populacja makrofagów wątrobowych (komórki Kupffera) ulega namnażniu, zaś niska dawka lipopolisacharydu (LPS) bakteryjnego, która nie jest letalna u myszy nietraktowanych wstępnie, staje się letalna. Czynnik nazwany czynnikiem indukującym IFN-γ (IGIF), zaś później nazwany interleukiną (IL-18) oczyszczono do homogenności z 1200 gramów wątrób myszy traktowanych P. acnes. Zdegenerowane oligonukleotydy otrzymane na podstawie sekwencji aminokwasowych oczyszczonej IL-18, zastosowano do klonowania cDNA mysiej IL-18 (Novick i wsp., 1992). IL-18 jest białkiem 18-19 kDa o 157 aminokwasach, które nie ma ewidentnego podobieństwa do żadnego peptydu w bazach danych. Informacyjne RN A dla IL-18 i interleukiny-12 (IL-12) łatwo wykryć w komórkach Kupffera i aktywowanych makrofagach. Rekombinowana IL-18 indukuje IFN-gamma silniej niż IL-12 zapewne przez odrębny szlak (Novick i wsp., 1992). Podobnie do indukowanej przez endotoksynę aktywności surowicy, IL-18 nie indukuje IFN-γ sama, ale działa przede wszystkim jako kostymulant z mitogenami lub IL-2. IL-18 wzmaga proliferację komórek T, wydaje się, że przez szlak zależny od IL-2, i wzmaga wytwarzanie cytokiny Th1 in vitro i wykazuje synergizm w połączeniu z IL-12 zwiększając wytwarzanie IFN-γ (Maliszewski i wsp., 1990).

Wykazano, że przeciwciała neutralizujące wobec mysiej IL-18 zapobiegają letalności niskiej dawki LPS u myszy traktowanych wstępnie P. acnes. Opisuje się również znaczenie IFN-γ jako mediatora śmiercionośnej aktywności LPS u myszy wstępnie traktowanych. Na przykład neutralizujące przeciwciała anty-IFN-γ chronią myszy przed wstrząsem typu Schwartzmana (Fantuzzi i wsp., 1998) i myszy traktowane galaktozaminą pozbawione receptora IFN-γ były oporne na śmierć indukowaną przez LPS (Byrn, 1990). Tak więc nie było to zaskakujące, że przeciwciała neutralizujące mysią IL-18 chronią traktowane wstępnie P. acnes myszy przed letalnym LPS (Novick i wsp., 1992). Traktowanie przeciwciałami przeciwko mysiej IL-18 chroniło myszy również przed ciężką cytoksycznością wątrobową.

Ludzką sekwencję cDNA dla IL-18 opisano w 1996 po sklonowaniu mysiej postaci (Okamura i wsp., 1995). Zrekombinowana ludzka IL-18 wykazuje naturalną aktywność IL-18 (Okamura i wsp., 1995). Ludzka rekombinowana IL-18 nie działa bezpośredniego na indukującą IFN-γ aktywność ludzkich limfocytów T, ale działa jako kostymulator wytwarzania IFN-γ i innych cytokin limfocytów T pomocniczych typu 1 (Th1) (Okamura i wsp., 1995). Do tej pory, IL-18 uważano głównie za kostymulator wytwarzania cytokin Th1 (IFN-γ, IL-2 oraz czynnika stymulującego kolonie granulocytów-makrofagów) (Izaki, 1978) oraz za kostymulator cytotoksyczności zachodzącej za pośrednictwem liganda FAS klonów mysich komórek naturalnych zabójców (komórek NK, ang. natural killer) (Novick i wsp., 1989).

Przez klonowanie IL-18 z chorych tkanek i badanie ekspresji genu IL-18, ujawniono ścisłą zależność chorób autoagresyjnych od tej cytokiny. Nieotyłe myszy z cukrzycą (NOD, ang. non-obese diabetic) spontanicznie rozwijają zapalenie wysepek trzustkowych i cukrzycę, które mogą być przyspieszone i zsynchronizowane przez pojedyncze wstrzyknięcie cyklofosfamidu. W trzustkach myszy NOD w trakcie wczesnych etapów zapalenia wysepek wykazano obecność mRNA IL-18 przez PCR z odwrotną transkryptazą. Poziomy mRNA dla IL-18 wzrastały gwałtownie po traktowaniu cyklofosfamidem i poprzedzały wzrost mRNA IFN-γ, a następnie cukrzycy. Co ciekawe, kinetyka ta naśladowała kinetykę mRNA IL-12-p40, czego wynikiem była bliska korelacja indywidualnych poziomów mRNA.

PL 206 549 B1

Klonowanie cDNA IL-18 z RNA trzustki, a następnie sekwencjonowanie, wykazało identyczność z klonowaną sekwencją IL-18 z komórek Kupffera i makrofagów aktywowanych in vivo. Również makrofagi myszy NOD reagowały na cyklofosfamid ekspresją genu IL-18, podczas gdy makrofagi myszy Balb/c traktowanych identycznie nie reagowały. Zatem, ekspresja IL-18 ulega nieprawidłowej regulacji u myszy NOD z autoagresyją i jest ś ciś le zwią zana z rozwojem cukrzycy (Novick i wsp., 1992).

IL-18 odgrywa potencjalną rolę w immunoregulacji lub w zapaleniu przez wzmacnianie funkcjonalnej aktywności ligandu Fas na komórki Th1 (Conti i wsp., 1997). IL-18 jest także wyrażana w korze nadnerczy, a stąd może być wydzielana jako neuroimmunomodulator odgrywając istotną rolę w kierowaniu układem odpornościowym po stresujących doświadczeniach (Chater, 1986).

In vivo IL-18 jest tworzona przez cięcie pro-IL-18, zaś jej endogenna aktywność przyczynia się do wytwarzania IFN-γ przy zachodzącej przy udziale P. acnes oraz LPS śmiertelności. Dojrzała IL-18 jest produkowana z prekursora przez enzym konwertujący IL-1 β (enzym konwertujący IL-lbeta, ICE, kaspaza-1).

Receptor IL-18 jest złożony z przynajmniej dwóch składników kooperujących w wiązaniu ligandu. Miejsca wiązania IL-18 z wysokim i niskim powinowactwem znaleziono w komórkach T myszy stymulowanych IL-12 (Yoshimoto i wsp., 1998) sugerując kompleks receptora z wieloma łańcuchami. Dotychczas zidentyfikowano dwie podjednostki receptora, obie należą do rodziny receptora IL-1 (Panet i wsp., 1996). Transdukcja sygnału IL-18 obejmuje aktywację NF-kB (DiDonato i wsp., 1997).

Kilka znanych białek wiążących cytokiny stanowią rozpuszczalne receptory cytokiny odpowiadające zewnątrzkomórkowym domenom wiążącym swoich odpowiednich receptorów cytokin na powierzchni komórki. Pochodzą albo z alternatywnego składania pre-mRNA, wspólnego dla receptora na powierzchni komórki, lub z proteolitycznego cięcia receptora z powierzchni komórki. W przeszłości opisano takie rozpuszczalne receptory, między innymi rozpuszczalne receptory IL-6 i IFN-γ, (Nakamura i wsp., 1989), TNF (Dao i wsp., 1996; Engelmann i wsp., 1989), IL-1 i IL-4 (John. 1986). IFN-α/β (Mizushima i Nagata, 1990) i inne. Jedno białko wiążące cytokinę, zwane osteoprotegeryną (OPG, znane też jako czynnik hamujący osteoklasty - OCIF, ang. osteoclast inhibitory factor), członek rodziny TNFR/Fas, wydaje się być pierwszym przykładem rozpuszczalnego receptora, który istnieje tylko jako wydzielane białko (Anderson, 1997; Bollon, 1980).

Niedawno wyizolowano białko o wysokim powinowactwie do IL-18 z moczu ludzkiego, i opisano ludzkie i mysie cDNA (Novick i wsp., 1999; WO 99/09063). Białko określono jako białko wiążące IL-18 (IL-18BP).

IL-18BP nie jest zewnątrzkomórkową domeną jednego ze znanych receptorów IL18, ale wydzielanym, naturalnie krążącym białkiem. Należy do nowej rodziny wydzielanych białek. Rodzina dalej zawiera kilka białek kodowanych przez wirusy ospy, które mają wysoką homologię do IL-18BP (Novick i wsp., 1999). IL-18BP, wyrażane konstytutywnie w śledzionie, należy do nadrodziny immunoglobulin i ma ograniczoną homologię do receptora IL-1 typu II. Jego gen zlokalizowano w chromosomie ludzkim 11q13 i nie znaleziono żadnego eksonu kodującego domenę transbłonową w genomowej sekwencji 8,3 kb (Novick i wsp., 1999).

Znalezione w różnych bibliotekach cDNA cztery ludzkie i dwie mysie izoformy IL-18BP, wynikające ze składania mRNA i znalezione w różnych bibliotekach cDNA, wyrażano, oczyszczano i oceniano pod kątem wiązania i neutralizacji aktywności biologicznych IL-18 (Kim i wsp., 2000). Ludzka izoforma a IL-18BP (IL-18BPa) wykazywała największe powinowactwo do IL-18 z szybkim tempem wiązania i wolnym dysocjacji, oraz stałą dysocjacji (K(d)) wynoszącą 399 pM. IL-18BPc ma domenę Ig IL-18BPa z wyjątkiem 29 C-końcowych aminokwasów; K(d) IL-18BPc jest 10-krotnie niższa (2,94 nM). Tym niemniej izoformy IL-18BPa i IL-18BPc neutralizują IL-18 >95% przy dwukrotnym nadmiarze molowym. Izoformy IL-18BPb i IL-18BPd nie mają całej domeny Ig i nie mają zdolności do wiązania lub neutralizacji IL-18. Mysie izoformy IL-18BPc i IL-18BPd mające tę samą domenę Ig także neutralizują >95% IL-18 przy dwukrotnym nadmiarze molowym. Jednak mysi IL-18BPd, który ma wspólny motyw C-końcowy z ludzkim IL-18BPa także neutralizuje ludzką IL-18. Molekularne modelowanie zidentyfikowało duże mieszane miejsce wiązania - elektrostatyczne i hydrofobowe - w domenie Ig IL-18BP, które mogło tłumaczyć jego wiązanie ligandu z wysokim powinowactwem (Kim i wsp., 2000).

Niedawno zasugerowano, że interleukina IL-18 bierze udział w postępowaniu patogenności w przewlekłych chorobach zapalnych, w tym szoku endotoksynowym, zapaleniu wątroby i cukrzycy autoimmunizacyjnej (Kawakimura i Okamura, 1998). Dalsze wskazanie możliwej roli IL-18 w uszkodzeniach wątroby wynika z doświadczeń opublikowanych przez Tsuij i wsp. (Tsuij i wsp., 1999), wykazujących podwyższony poziom IL-18 w indukowanym lipopolisacharydami ostrym uszkodzeniu wątroby

PL 206 549 B1 w modelu mysim. Jednak mechanizm wielofunkcyjnego czynnika IL-18 w rozwoju uszkodzenia wą troby nie został dotychczas wyjaśniony.

Uszkodzenie czy zniszczenie wątroby może mieć różne przyczyny. Może być spowodowane przez zakażenia wirusami lub bakteriami, nadużywaniem alkoholu, zaburzeniami immunologicznymi, lub rakiem, na przykład.

Wirusowe zapalenie wątroby powodowane przez wirus zapalenia wątroby typu B i wirus zapalenia wątroby typu C, na przykład, są słabo kontrolowanymi chorobami dotykającymi dużą liczby osób na całym świecie. Liczba znanych wirusów zapalenia wątroby ciągle wzrasta. Poza wirusami zapalenia wątroby typu B i C odkryto dotychczas przynajmniej cztery inne wirusy powodujące zapalenie wątroby związane z wirusami, zwane wirusami zapalenia wątroby typu A, D, E i G.

Alkoholowa choroba wątroby jest inną szeroko rozpowszechnioną chorobą związaną z przewlekłym spożywaniem alkoholu. Immunizacyjne zapalenie wątroby jest rzadką chorobą autoimmunizacyjną, która jest słabo kontrolowana. Uszkodzenie wątroby także obejmuje uszkodzenia przewodów żółciowych. Pierwotna marskość żółciowa wątroby (PBC, ang. primary bilary cirrhosis) jest chorobą autoimmunizacyjną wątroby charakteryzującą się zniszczeniem wewnątrzwątrobowych przewodów żółciowych.

Kilka badań wykazało, że uszkodzenie wątroby w chorobach takich jak alkoholowe zapalenie wątroby, marskość wątroby, wirusowe zapalenie wątroby i pierwotna żółciowa marskość wątroby są związane z odpowiedziami komórek T pomocniczych (Th1). W jednych badaniach ustalono nowy model uszkodzenia wątroby u myszy przez adresowanie liposomów zawierających owoalbuminę do wątroby, po czym następowało adopcyjne przeniesienie komórek Th1 specyficznych dla owoalbuminy. Skojarzone traktowanie myszy liposomami zawierającymi owoalbuminę i przenoszenie komórek Th1 powodowało wzrost aktywności transaminazy w surowicy, który zachodził równolegle ze wzrostem poziomu IFN-γ w surowicy. Dla odmiany przenoszenie komórek Th2 specyficznych dla owoalbuminy powodowało wzrost poziomów IL-4 w surowicy, ale nie powodowało uszkodzenia wątroby. Uszkodzenie wątroby było blokowane przez przeciwciała anty-IFN-γ i przeciwciała przeciwko czynnikowi martwicy nowotworów (TNF)-a. Te wyniki wskazują, że komórki Th1 są głównymi komórkami efektorowymi w ostrym uszkodzeniu wątroby (Nishimura i Ohta, 1999). W innym zestawie badań wykazano, że myszy nadmiernie wyrażające IFN-γ wykazują spontaniczne zapalenie wątroby bez patogenu lub jakiegokolwiek innego stymulatora (Okamoto i wsp., 1998).

Inne badania implikowały odpowiedzi Th1 w pierwotnej marskości żółciowej wątroby (PBC). PBC jest autoimmunizacyjną chorobą wątroby charakteryzującą się zniszczeniem wewnątrzwątrobowych przewodów żółciowych. Ogólnie uważa się, że odpowiedzi immunologiczne komórek, szczególnie obejmujące komórki T, powodują to zniszczenie przewodów żółciowych. Niedawno zaproponowano, że względna siła odpowiedzi Th1 i Th2 jest ważnym czynnikiem w patofizjologii różnych chorób autoimmunizacyjnych. W tych badaniach oceniano proporcje podzbiorów w PBC przez wykrywanie cytokin specyficznych dla dwóch podzbiorów komórek T, tzn. IFN-γ dla komórek Th1 i IL-4 dla komórek Th2. Komórki dodatnie względem informacyjnego RNA (mRNA) IFN-γ i IL-4 zliczano w skrawkach wątroby z 18 pacjentów z PBC i 35 kontrolach choroby obejmujących przewlekłe czynne zapalenie wirusowe wątroby typu C, pozawątrobową obstrukcję przewodu żółciowego oraz prawidłową wątrobę, stosując in situ nieizotopową hybrydyzację i immunohistochemię. Komórki jednojądrzaste wyrażające mRNA IFN-γ i IL-4 były zagregowane w zapalnych przewodach wrotnych w wątrobach PBC, ale były rzadko obecne w przypadkach pozawątrobowej obstrukcji żółciowej, zwłóknienia alkoholowego lub prawidłowych skrawkach wątroby. Komórki dodatnie względem mRNA IFN-γ i IL-4 w wątrobach PBC były wykrywane w znacząco wyższych liczbach niż w wątrobach kontrolnych (p<0,01). Co więcej, ekspresja mRNA IFN-γ była częściej wykrywana niż ekspresja IL-4 w wątrobach PBC, a poziomy ekspresji mRNA IFN-γ były wysoce skorelowane ze stopniem aktywności zapalnej wrotnej. Komórki dodatnie względem mRNA IFN-γ były wykryte przede wszystkim wokół zniszczonych przewodów żółciowych, które były otoczone przez agregaty limfoidalne. Dane wskazują że komórki Th1 są bardziej dominującym podzbiorem komórek T w limfoidalnych infiltratach w PBC (Harada i wsp., 1997).

Uważa się także, że wzór cytokin przy rozpoznaniu antygenu wirusa wywiera głęboki wpływ na przebieg infekcji wirusowych i pozbycie się wirusa. Jedne badania sprawdzały czy niezbilansowanie cytokin zorientowane w kierunku odpowiedzi Th2 odgrywa rolę w przewlekłym zapaleniu wątroby typu B. Profile cytokin jednojądrzastych komórek krwi obwodowej związanych z przewlekłym zapalenie wątroby typu B analizowano za pomocą RT-PCR. Po stymulacji antygenem powierzchniowym (HbsAg) wirusa zapalenia wątroby typu B wykryto ekspresję IFN-γ, IL-2, IL-4 i IL-10 u 41%, 8%, 41% i 50%

PL 206 549 B1 pacjentów, odpowiednio. Wśród tych cytokin ekspresja cytokiny Th1 IFN-γ była związana z wysokimi poziomami AST/ALT w surowicy (aminotransferaza asparaginianowa/aminotransferaza alaninowa), reprezentującymi typowe markery uszkodzenia wątroby. Nie wykazano, aby cytokiny typu Th2 wywoływały efekt ochronny na hepatocyty. W konkluzji, wytwarzanie cytokiny Th1, IFN-γ, przez komórki reaktywne wobec HBsAg było związane z uszkodzeniem hepatocytów w przewlekłym zapaleniu wątroby typu B (Lee i wsp., 1999). Opisano wysokie poziomy ligandu FAS i jego receptora (CD95) w wątrobie pacjentów z zapaleniem wątroby typu B (Luo i wsp., 1997). Ligand FAS uważany jest za jeden z głównych czynników cytotoksycznych prowadzących do apoptozy hepatocytów.

Inne badania zidentyfikowały czynniki związane z postępem uszkodzenia wątroby u 30 nieleczonych pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby dodatnich względem RNA wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV/RNA). Oceniano uszkodzenia nekrozapalne i strukturalne stosując wartości Ishaka. Aktywowane gwiaździste komórki wątroby (HSC, ang. hepatic stellate cells) wizualizowano za pomocą immunocytochemii dla a-aktyny mięśni gładkich (aSMA) i określano ilościowo za pomocą morfometrii. HW/RNA osocza oceniano stosując kompetycyjną metodę RT-PCR. Aby badać typ odpowiedzi immunologicznej biorącej udział w postępie uszkodzenia wątroby komórki IFN-γ dodatnie (jako ekspresja odpowiedzi typu Th-1-podobnej) oceniano za pomocą immunohistochemii i określano ilościowo za pomocą morfometrii. Stwierdzono, że HSC najczęściej wykrywano w pobliżu obszarów zrazikowego nekrozapalenia lub wyścielającego przegrody fibrotyczne. Miąższ dodatni względem aSMA i czerwieni Sirius korelował znacząco z uszkodzeniami strukturalnymi. Wywnioskowano więc, że aktywacja HSC i postęp uszkodzenia wątroby są związane z odpowiedzią typu Th1 (Baroni i wsp., 1999). Podobnie jak w przypadku zapalenia wątroby typu B, ligand FAS i jego receptor znaleziono w wątrobie i surowicy pacjentów z zapaleniem wątroby typu C (Hiramatsu i wsp., 1994; Okazaki i wsp., 1996; Lio i wsp., 1998).

Stwierdzono, że cytokiny Th1 i inne markery Th1 są związane z alkoholowym zapaleniem wątroby i marskością wątroby. Bodźce zapalne i peroksydacja lipidów aktywują jądrowy czynnik kB (NF-kB) i podwyższają poziom prozapalnych cytokin i chemokin. W jednych badaniach oceniano stosunek między patologicznym uszkodzeniem wątroby, endotoksemią, peroksydacja lipidów i aktywacją NF-kB, a niezbilansowaniem między cytokinami pro- i przeciwzapalnymi. Szczury (5 na grupę) karmiono etanolem i dietą zawierającą nasycony tłuszcz, olej palmowy, olej kukurydziany, lub olej rybny przez infuzję dożołądkową. Dekstroza izokalorycznie zastąpiła etanol u szczurów kontrolnych. Przeprowadzono analizę patologiczną i zmierzono poziomy endotoksyny, peroksydacji lipidów, NF-kB i informacyjnego RNA (mRNA) cytokin prozapalnych (TNFa, IL-1 beta, IFN-γ, i IL-12), chemokin C-C (regulowane po aktywacji, wyrażane i wydzielane przez prawidłowe komórki T [RANTES], białko chemotaktyczne monocytów [MCP]-1, białko zapalne makro fagów [MIP]-1-a), chemokin C-X-C (indukowany przez cytokiny chemoatraktant neutrofili [CINC], MIP-2, IP-10 i białko aktywujące neutrofile nabłonkowe [ENA]-78), i cytokin przeciwzapalnych (IL-10, IL-4 i IL-13). Zaobserwowano aktywację NF-kB i zwiększoną ekspresję cytokin prozapalnych C-C i C-X-C u szczurów wykazujących uszkodzenie nekrozapalne (olej rybny-etanol i olej kukurydziany-etanol). Te grupy także miały najwyższe poziomy endotoksyny i peroksydacji lipidów. Poziomy mRNA IL-10 i IL-4 były niższe w grupie wykazującej zapalne uszkodzenie wątroby. Tak wiec aktywacja NF-kB występuje w obecności bodźców prozapalnych i w efekcie daje zwiększoną ekspresję cytokin prozapalnych Th1 i chemokin (Naji i wsp., 1999). Ligand FAS i jego receptor są także podwyższone w alkoholowych chorobach wątroby, sugerując jeszcze raz, że cytokiny Th1 biorą udział w procesach autoimmunizacyjnych indukowanych w alkoholowym zapaleniu wątroby (Galio i wsp., 1995; Taieb i wsp., 1998; Fiore i wsp., 1999).

TNFa też okazał się być wspólnym szlakiem w patogenezie nekrozapalenia wątroby związanego z alkoholem. Zwiększone poziomy TNF w wątrobie i surowicy były udokumentowane w modelach zwierzęcych alkoholowej choroby wątroby i w ludzkiej chorobie alkoholowej wątroby. Postulowano, że ten rozregulowany metabolizm TNF odgrywa rolę w wielu komplikacjach metabolicznych i uszkodzeniach wątroby w alkoholowej chorobie wątroby (Grove i wsp., 1997; McClain i Cohen, 1989). Na przykład, w jednych badaniach stwierdzono, że pacjenci z alkoholowym zapaleniem wątroby mieli wyższe poziomy TNF-α (średnia 26,3 ng/L; 95% CI, 21,7 do 30,9) niż osoby prawidłowe (6,4 ng/L; CI 5,4 do 7,4). Pacjenci, którzy następnie zmarli mieli wyższy poziom TNF-a (34,7 ng/L; CI, 27,8 do 41,6) niż osoby, które przeżyły (16,6 ng/L; CI, 14,0 do 19,2). U pacjentów z alkoholowym zapaleniem wątroby poziomy TNF-a korelowały dodatnio z bilirubiną w surowicy (r=0,74; P = 0,0009) i kreatyniną w surowicy (r = 0,81; P = 0,0003). Pacjenci z alkoholowym zapaleniem wątroby mieli wyższe poziomy TNF-a niż pacjenci z nieaktywną marskością alkoholową wątroby (11,1 ng/L; CI 8,9 do 13,3) i notoryczni

PL 206 549 B1 alkoholicy bez choroby wątroby (6,4 ng/L; CI 5,0 do 7,8). Pacjenci z anormalną funkcją nerek mieli niższe poziomy TNF-α (14,1 ng/L; CI, 5,4 do 22,8) niż pacjenci z alkoholowym zapaleniem wątroby. Wywnioskowano więc, że podwyższenie poziomu TNF-α w alkoholowym zapaleniu wątroby jest najsilniejsze w ostrych przypadkach sugerując, że TNF-α odgrywa rolę w patogenezie (Bird i wsp., 1990).

TNF pośredniczy w wielu biologicznych działaniach endotoksyny. Niedawne badania wykazały, że podanie TNF może powodować uszkodzenie wątroby i że TNF może brać udział w letalności hepatotoksyny galaktozaminy. Jednym z najsilniejszych induktorów TNF jest endotoksyna. Ponieważ pacjenci z alkoholową chorobą wątroby często mają endotoksemię i ponieważ wiele objawów klinicznych alkoholowego zapalenia wątroby jest znanymi biologicznymi działaniami TNF, oceniono jego aktywność u pacjentów z alkoholowym zapaleniem wątroby. Podstawowe i stymulowane przez lipopolisacharyd uwalnianie TNF z obwodowych monocytów krwi, ważnego źródła wytwarzania TNF, określono u 16 pacjentów z alkoholowym zapaleniem wątroby i 16 zdrowych ochotników. Ośmiu z 16 pacjentów z alkoholowym zapaleniem wątroby i tylko dwóch z 16 zdrowych ochotników miało wykrywalną spontaniczną aktywność TNF (p mniejsze niż 0,05). Po stymulacji lipopolisacharydem średnie uwalnianie TNF u pacjentów z alkoholowym zapaleniem wątroby było znacząco zwiększone do ponad dwukrotnego u zdrowych kontroli (25,3+/-3,7 w stosunku do 10,9+/-2,4 jednostek na ml, p mniejsze niż 0,05). Wywnioskowano, że monocyty pacjentów z alkoholowym zapaleniem wątroby mają znacząco zwiększone spontaniczne i stymulowane przez lipopolisacharyd uwalnianie TNF w porównaniu z monocytami zdrowych ochotników (McCain i Cohen, 1989).

Białko wiążące lipopolisacharyd (LBP) i CD14 ogrywają kluczowe role pośredników aktywacji komórek przez endotoksynę. Postulowano, że pochodzący z jelita LPS bierze udział w promowaniu patologicznego uszkodzenia wątroby w alkoholowej chorobie wątroby. Wykazano, że szczury karmione dojelitowo etanolem w oleju przez 4 tygodnie miały podwyższone poziomy CD14 i LBP w komórkach Kupffera i hepatocytach, odpowiednio. Ekspresja mRNA CD14 była także podwyższona w komórkach niemieloidalnych. Wzmożona ekspresja LBP i CD14 szybko zwiększa indukowaną przez LPS ekspresję różnych prozapalnych cytokin i koreluje z obecnością patologicznego uszkodzenia wątroby w alkoholowym uszkodzeniu wątroby (Su i wsp., 1998; Lukkati i wsp., 1999).

Artretyzm jest chorobą obejmującą zapalenie stawów. Stawy wykazują obrzęk, sztywność, tkliwość, zaczerwienienie lub rozgrzanie. Objawom może towarzyszyć utrata wagi, gorączka lub osłabienie. Gdy te objawy trwają dłużej niż dwa tygodnie, przyczyną może być zapalenie stawów o podłożu zapalnym np. reumatoidalne zapalenie stawów. Zapalenie stawów może być także powodowane przez zakażenie, co może prowadzić do septycznego zapalenia stawów. Bardzo częstym zapaleniem stawów jest zwyrodnieniowa choroba stawów (osteoartretyzm - zapalenie kości i stawów).

Leki często przepisywane na zapalenie stawów i pokrewne stany są niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi (NSAID). NSAID obejmują aspirynę i leki podobne do aspiryny. Zmniejszają zapalenie, które jest przyczyną bólu stawów, sztywności i obrzęku stawów. Jednak NSAID są niespecyficznymi lekami mającymi szereg efektów ubocznych, w tym krwawienie w żołądku (strona internetowa na temat zapalenia stawów Wydziału Ortopedii Uniwersytetu Washington, Frederick Matsen (chairman), www.orthop.washington.edu). Poza NSAID, do zmniejszania oznak i objawów osteoartretyzmu i reumatoidalnego zapalenia stawów u dorosłych stosowany jest Celebrex™, inhibitor cyklooksygenazy (COX-2). Jest też wskazany do leczenia pacjentów z rodzinną gruczolakowatą polipowatością.

WO 01/00229 opisuje kombinację antagonistów czynnika martwicy nowotworów (TNF) i inhibitorów COX-2 do leczenia zapalenia.

Antagoniści TNF są też stosowani do leczenia zapalenia stawów. Antagoniści TNF są opisani, na przykład, w WO 9103553.

Niedawne badania wskazują że interleukina IL-18 odgrywa rolę prozapalną w metabolizmie stawów. Olee i wsp. (1999) wykazali, że IL-18 jest wytwarzana przez chondrocyty stawowe i indukuje odpowiedzi prozapalne i kataboliczne. mRNA IL-18 był indukowany przez IL-1e w chondrocytach. Chondrocyty wytwarzały prekursor IL-18 iw odpowiedzi na stymulację IL-1 wydzielały dojrzałą formę IL-18. Badania nad wpływem IL-18 na chondrocyty wykazały dalej, że hamuje proliferację indukowaną przez TGF-β i wzmaga wytwarzanie tlenku azotu. IL-18 stymulowała ekspresję kilku genów w prawidłowych ludzkich chondrocytach stawowych, w tym indukowalną syntazę tlenku azotu, indukowalną karboksygenazę, IL-6 i stromelizynę. Ekspresja genów była związana z syntezą odpowiednich białek. Traktowanie prawidłowej chrząstki stawów IL-18 zwiększało uwalnianie glikozoaminoglikanów. Te wyniki zidentyfikowały IL-18 jako cytokinę, która reguluje odpowiedzi chondrocytów i bierze udział w degradacji chrząstki.

PL 206 549 B1

Lokalizacja enzymu konwertującego interleukinę-1 β (ICE)/kaspaza-1 w ludzkich tkankach osteoartretycznych i jej rola w dojrzewaniu interleukiny-1 beta i interleukiny 18 były wykazane przez Saha i wsp. (1999). Saha i wsp. badali ekspresję i wytwarzanie kaspazy-1 w chrząstce ludzkiej oraz maziówce prawidłowej i z osteoartrozą (OA), określili ilościowo poziom ICE w chondrocytach OA i badali stosunek między topograficznym rozmieszczeniem ICE, interleukiny-1 β (IL-1 B) i IL-18, jak i apoptozą chondrocytów. Doświadczenia przeprowadzone w tych badaniach wskazały, że ICE był wyrażany i syntetyzowany w zarówno ludzkiej maziówce i chrząstce, ze znacząco większą ilością dodatnio barwiących się komórek w tkance OA niż w tkance normalnej. Wytwarzanie ICE było korzystnie zlokalizowane w powierzchniowych i górnych pośrednich warstwach chrząstki stawów. Wytwarzanie dojrzałej IL-1 beta w eksplantach chrząstki OA i chondrocytach było całkowicie blokowane przez traktowanie specyficznym inhibitorem ICE, który także znacząco zmniejszał liczbę komórek dodatnich względem IL-18. Stosunek między aktywną IL-1 beta i ICE sugeruje, że ICE może promować postępowanie OA przez aktywację tej prozapalnej cytokiny i że IL-18 może odgrywać rolę w patologii chrząstki.

Gracie i wsp. (1999) sugerowali prozapalną rolę dla IL-18 w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Gracie i wsp. wykryli mRNA i białko IL-18 w obrębie tkanek maziówki w przypadku reumatoidalnego zapalenia stawów na znacząco wyższych poziomach niż w kontroli z osteoartrozą. Wykazano także, że kombinacja IL-12 lub IL-15 z IL-18 indukowała wytwarzanie IFN-γ przez tkanki maziówki in vitro. Co więcej, podanie IL-18 myszom immunizowanym kolagenem/niekompletnym adiuwantem Freunda ułatwiało rozwój erozyjnego zapalnego artretyzmu, sugerując, że IL-18 może być prozapalną in vivo.

Jednak dotychczas poza związkami chemicznymi wykazano, że tylko blokada TNFa i IL-1e przez stosowanie rozpuszczalnych receptorów lub przeciwciał monoklonalnych zmniejszają zapalenie stawów u myszy indukowane przez kolagen (CIA, ang. collagen-induced arthrirtis, który jest mysim modelem dla reumatoidalnego zapalenia stawów) (Williams i wsp., 1994), i sugerowano je więc jako lek do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów.

Określenie „przewlekłe lub idiopatyczne choroby jelita” obejmuje przynajmniej dwa stany: Chorobę Crohna i wrzodziejące zapalenie okrężnicy. Obie są chorobami przewodu pokarmowego, choroba Crohna najczęściej wpływa na jelito cienkie. Gdy także obejmuje jelito grube, różnicowa diagnoza względem wrzodziejącego zapalenia okrężnicy (patrz poniżej) może stanowić problem.

Przewlekłe zapalenie i wrzody w chorobie Crohna na ogół rozpoczynają się od obstrukcji jelita cienkiego lub bólu brzucha, który może przypominać ostre zapalenie wyrostka robaczkowego; inne prezentacje mogą dotyczyć jego powikłań. Przebieg choroby jest przewlekły i mogą występować zaostrzenia i remisje mimo terapii. Początek na ogół występuje u młodych osób dorosłych i około połowa przypadków rozpoczyna się w wieku między 20 i 30 lat i 90% między 10 i 40 lat. Dotkniętych jest nieco więcej mężczyzn niż kobiet.

Mikroskopia odzwierciedla z grubsza wygląd. Udział zapalenia jest nieciągły: jest ono ogniskowe lub plamkowe. Skupienia limfocytów i komórek plazmatycznych znajduje się głównie w śluzówce i podśluzówce, ale na ogół dotyczą wszystkich warstw (zapalenie przezścienne). Klasyczną cechą mikroskopową choroby Crohna jest obecność komórek ziarnistych otoczonych przez mankiet limfocytów. Występowanie idiopatycznych chorób zapalnych okrężnicy wykazuje znaczną zmienność geograficzną. Te choroby występują dużo częściej w Europie północnej i Stanach Zjednoczonych, niż w krajach Europy południowej, Afryki, Ameryki Południowej i Azji, choć rosnąca urbanizacja i zamożność prowadzi do wyższej częstości występowania w częściach europu Południowej i Japonii (General and Systematic Pathology, Churchill Livingstone, wyd. 3, 2000, JCE Underwood, red.).

W chorobie Crohna klinicznie występują dwie główne grupy, pierwsza z pacjentami, których choroba wchodzi w trwającą remisję w ciągu trzech lat od początku choroby, i druga z pacjentami, których choroba trwa dłużej niż trzy lata.

Niezależnie od etiologii są dowody na utrzymywanie się i nieodpowiednią aktywację komórek T i makrofagów w chorobie Crohna ze zwiększonym wytwarzaniem cytokin prozapalnych, w szczególności interleukin (IL) 1,2, 6 i 8, interferonu (IFN)-y i czynnika martwicy nowotworów (TNF) α. Choroba Crohna charakteryzuje się utrzymującym (przewlekłym) zapaleniem, któremu towarzyszy włóknienie. Proces proliferacji fibroblastów i odkładanie kolagenu może zachodzić z udziałem transformującego czynnika wzrostowego β, który ma pewne działania przeciwzapalne, a mianowicie rekrutację fibroblastów, syntezę macierzy i obniżenie ilości komórek zapalnych, ale jest prawdopodobne, że wiele innych mediatorów będzie brało w tym udział.

PL 206 549 B1

Wrzodziejące zapalenie okrężnicy jest niespecyficzną chorobą zapalną jelita grubego, zazwyczaj rozpoczynającą się w odbycie i rozchodzącą się w różnym stopniu. W odróżnienia od choroby Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy jest ograniczone do jelita grubego.

Istnieje coraz więcej dowodów, że wrzodziejące zapalenie okrężnicy jest konsekwencją zmienionej aktywności autoimmunizacyjnej, ale uszkodzenie śluzówek może też być wynikiem nieodpowiedniej aktywacji komórek T i pośrednich uszkodzeń spowodowanych przez cytokiny, proteazy i czynne metabolity tlenu z makrofagów i neutrofili. Ten ostatni mechanizm uszkodzenia nabł onka okrężnicy został określony jako uszkodzenie „niewinnych komórek postronnych”. Dowodem na autoimmunizację jest obecność autoreaktywnych limfocytów T i autoprzeciwciał skierowanych wobec komórek nabłonka okrężnicy i komórek śródbłonka i cytoplazmatyczne autoprzeciwciała przeciwko neutrofilom (ANCA, ang. anti-neutrophil cytoplasmic auto-antibodies). Jednak wrzodziejące zapalenie okrężnicy nie powinno być traktowane jako choroba autoimmunizacyjną, w której uszkodzenie śluzówki jest bezpośrednią konsekwencją reakcji immunologicznej na autoantygeny (Genral and Systematic Pathology, powyżej).

Pod względem leczenia choroby Crohna większość osób jest najpierw leczonych za pomocą leków zawierających mezalaminę, substancję, która pomaga w kontrolowaniu zapalenia. Pacjenci, którym to nie pomaga lub którzy tego nie tolerują mogą otrzymywać inne leki zawierające mezalaminę, ogólnie znane jako czynniki 5-ASA. Możliwe efekty uboczne preparatów mezalaminy obejmują nudności, wymioty, zgagę, biegunkę i bóle głowy.

Niektórzy pacjenci przyjmują kortykosteroidy, aby kontrolować zapalenie. Leki te są najbardziej skuteczne w przypadku aktywnej choroby Crohna, ale mogą powodować poważne efekty uboczne obejmujące większą podatność na zakażenia.

Leki, które tłumią układ odpornościowy są też stosowane do leczenia choroby Crohna. Najczęściej przepisywane są 6-merkaptopuryna i pokrewny lek, azatiopryn. Leki immunosupresyjne działają przez blokowanie reakcji odpornościowej, która bierze udział w zapaleniu. Leki te mogą powodować efekty uboczne, takie jak nudności, wymioty i biegunki i mogą obniżać oporność danej osoby na zakażenia. Gdy pacjenci są leczeni kombinacją kortykosteroidów i leków immunosupresyjnych można w końcu obniżyć dawkę kortykosteroidów. Niektóre badania sugerują, że leki immunosupresyjne mogą zwiększać skuteczność kortykosteroidów.

US Food and Drug Administration dopuściła lek inflixmab do leczenia umiarkowanej do ciężkiej choroby Crohna, która nie reaguje na standardowe terapie (substancje mezalaminowe, kortykosteroidy, czynniki immunosupresyjne) i do leczenia otwartych, sączących przetok. Inflixmab, pierwsza terapia dopuszczona specyficznie dla choroby Crohna, jest monoklonalnym przeciwciałem przeciwko czynnikowi martwicy nowotworów (TNF). Anty-TNF usuwa TNF z krwiobiegu zanim dojdzie do jelit, w ten sposób zapobiegają c zapaleniu.

Do leczenia przerostu bakterii w jelicie cienkim powodowanego przez przewężenia, przetoki lub uprzednie operacje stosuje się antybiotyki. Dla tego częstego problemu lekarz może przepisać jeden lub więcej z następujących antybiotyków: ampicylina, sulfonamid, cefalosporyna, tetracyklina lub metronidazol.

Biegunka i skurczowy ból brzucha często ustępują gdy zapalenie ustępuje, ale mogą być też konieczne dodatkowe leki. Można stosować kilka leków przeciwbiegunkowych, obejmujących difenoksylan, loperamid i kodeinę. Pacjenci, którzy są odwodnieni ze względu na biegunkę, sana ogół leczeni płynami i elektrolitami.

Pozostaje zapotrzebowanie na skuteczną terapię do leczenia i/lub zapobiegania zapalnym chorobom jelit, w szczególności chorobie Crohna i wrzodziejącemu zapaleniu okrężnicy, która miałaby zmniejszone efekty uboczne lub idealnie byłaby wolna od efektów ubocznych.

Zarówno histologiczne i immunologiczne obserwacje wskazują, że odporność z udziałem komórek i aktywacją komórek T są kluczowymi cechami CD. Badania u ludzi i modele doświadczalne sugerują, że w CD miejscowa odpowiedź zapalna jest przeważająco typu Th1 (Desreumaux, i wsp, 1997) i że lokalnie uwalniane cytokiny, takie jak IFN-γ IL-1 β i TNF-α mają udział w promowaniu i rozszerzaniu odpowiedzi zapalnej (Reimund i wsp. 1996).

Cytokina IL-18 odgrywa ważną rolę w odpowiedzi odpornościowej z udziałem Th1 we współpracy z cytokiną IL-12 przez stymulację wytwarzania IFN-γ. IL-18 także zwiększa wytwarzanie GM-CSF i IL-2, umożliwia indukowaną przez anty-CD3 proliferację komórek T i zwiększa zachodzące z udziałem Fas zabijanie przez komórki naturalnych zabójców. Dojrzała IL-18 jest wytwarzana ze swojego prekursora przez enzym konwertujący IL-1 β (ICE, kaspaza 1). Receptor IL-18 jest złożony z przynajmniej

PL 206 549 B1 dwóch komponent kooperujących we wiązaniu ligandu. Miejsca wiązania IL-18 o wysokim i niskim powinowactwie znaleziono w mysich komórkach T stymulowanych przez IL-12 (Okamoto i wsp., 1998), sugerując kompleks receptora z wielu łańcuchów. Dotychczas zidentyfikowano dwie podjednostki receptora, obie należą do rodziny receptora IL-1 (Okamoto i wsp., 1999). Transdukcja sygnału IL-18 obejmuje aktywację NF-kB (Matsumoto i wsp. 1997).

Niedawno zasugerowano, że IL-18 ma pewien udział w chorobach zapalnych jelit (Pizarro i wsp., 1999; Monteleone i wsp. 1999).

Pizarro i wsp. (1999) scharakteryzowali ekspresję i lokalizację IL-18 w próbkach jelita grubego i izolowanych populacjach komórek śluzówki od pacjentów z chorobą Crohna. Stosując półilościowy protokół RT-PCR stwierdzono, że transkrypty mRNA IL-18 były zwiększone w świeżo izolowanych komórkach nabłonka jelita i jednojądrzastych komórek blaszki właściwej z CD, w porównaniu z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy i kontrolnych pacjentów bez zapalenia. Transkrypty mRNA IL-18 były bardziej obfite w komórkach nabłonka jelita w porównaniu z jednojądrzastymi komórkami blaszki właściwej. Immunohistochemiczna analiza wyciętych chirurgicznie tkanek jelita grubego zlokalizowała IL-18 do zarówno jednojądrzastych komórek blaszki właściwej (specyficznie makro fagów i komórek dendrytowych), jak i komórek nabłonka jelit. Analiza Western biot wykazała, że prążek 18,3 kDa, zgodny z zarówno zrekombinowanym i dojrzałym białkiem ludzkim IL-18, był znaleziony przede wszystkim w biopsjach śluzówki CD w stosunku do UC; drugi prążek 24 kDa zgodny z nieaktywnym prekursorem IL-18 wykryto w niezapalnych obszarach z zarówno biopsji CD i UC i był jedyną postacią wykrytą w niezapalnych kontrolach.

Monteleone i wsp. (1999) potwierdzili te wyniki. Pod kątem IL-18 testowano całą tkankę śluzówki jelita i komórki jednojądrzaste blaszki właściwej od 12 pacjentów z chorobą Crohna i 9 z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy i 15 kontroli chorób jelita bez zapalenia za pomocą półilościowej RT-PCR i Wester biot. We wszystkich badanych próbkach znaleziono transkrypty IL-18. Jednak zwiększoną akumulację mRNA IL-18 wykryto zarówno w próbkach śluzówki, jak i jednojądrzastych komórkach blaszki właściwej z choroby Crohna, w porównaniu z wrzodziejącym zapaleniem jelit i kontrolami. W chorobie Crohna transkrypty IL-18 były bardziej liczne w próbkach śluzówek pobranych z dotkniętych obszarów. Znaleziono prążek 18 kDa zgodny z dojrzałą IL-18 w próbkach śluzówki choroby Crohna. W próbkach śluzówki z kontroli nie-IBD IL-18 była obecna jako polipeptyd 24 kDa. Konsekwentnie podjednostka aktywnego enzymu konwertującego IL-1beta (ICE) (p20) była wyrażana w próbkach z CD lub UC, podczas gdy w śluzówkach jelita z kontroli nie-IBD ICE był syntetyzowany tylko jako prekursor (p45).

Dayer (1999) zrobił przegląd różnych i częściowo sprzecznych funkcji IL-18. Podsumowując IL-18 jest plejotropową interleukiną mającą zarówno aktywność wzmagającą i osłabiającą zapalenie. Z jednej strony wzmaga wytwarzanie prozapalnych cytokin, takich jak TNFa w ten sposób promując zapalenie. Z drugiej strony indukuje wytwarzanie NO, inhibitora kaspazy-1, w ten sposób blokując dojrzewanie IL-1 β i IL-18 i możliwie łagodząc zapalenie. Ta dwuznaczna rola IL-18 poważanie podawała w wątpliwość skuteczność inhibitorów IL-18 w chorobach zapalnych. Co więcej, ze względu na interakcję ogromnej ilości różnych cytokin i chemokin w regulacji zapalenia, korzystny efekt leczenia lub zapobiegania chorób zapalnych przez blokowanie tylko jednego z graczy nie jest przewidywalny.

Streszczenie wynalazku

Obecny wynalazek jest oparty na ujawnieniu, że inhibitory IL-18 są skuteczne w leczeniu i/lub zapobieganiu różnym chorobom lub zaburzeniom.

Pierwszym celem wynalazku jest dostarczenie nowego sposobu leczenia i/lub zapobiegania uszkodzeniu wątroby. Wynalazek dotyczy więc zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania uszkodzeniu wątroby, korzystnie ostremu lub przewlekłemu. Korzystniej lek wytworzony zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do leczenia i/lub zapobiegania alkoholowemu zapaleniu wątroby, wirusowemu zapaleniu wątroby, immunizacyjnemu zapaleniu wątroby, piorunującemu zapaleniu wątroby, marskości wątroby i pierwotnej żółciowej marskości wątroby, a najkorzystniej do leczenia i/lub zapobiegania piorunującemu zapaleniu wątroby.

Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie nowego sposobu leczenia i/lub zapobiegania zapaleniu stawów. Przedmiotem wynalazku więc też zastosowanie inhibitorów IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania zapaleniu stawów. Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do leczenia i/lub zapobiegania zapaleniu stawów o podłożu zapalnym, korzystniej reumatoidalnemu zapaleniu stawów.

PL 206 549 B1

Korzystny efekt inhibitorów IL-18 obejmuje zmniejszenie ostrości choroby jak i zapobieganie rozprzestrzenianiu się choroby. Ten wynik jest nieoczekiwany jako, że ze stanu wiedzy naszkicowanego powyżej nie można było wywnioskować, że blokada jednego specyficznego czynnika biorącego udział w zapaleniu stawów, a mianowicie interleukiny IL-18, mogłaby prowadzić do złagodzenia zapalenia stawów lub nawet do wyleczenia chorego artretycznego stawu.

Stwierdzono także, że podanie inhibitora IL-18 znacząco zmniejsza erozję chrząstki w mysim modelu zapalenia stawów. Obecny wynalazek dotyczy więc zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania zniszczeniu chrząstki.

Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie nowego sposobu leczenia i/lub zapobiegania zapalnej chorobie jelit (IBD), w szczególności chorobie Crohna i wrzodziejącemu zapaleniu okrężnicy. Wynalazek dotyczy więc zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania IBD, korzystnie chorobie Crohna i wrzodziejącemu zapaleniu okrężnicy. Zgodnie z obecnym wynalazkiem stwierdzono, że stężenia mRNA i białka IL-18BP są zwiększone w regionach zapalnych śluzówek w biopsjach pochodzących od pacjentów z chorobą Crohna. Co więcej wykazano, że dwa różne inhibitory IL-18 chronią zwierzęta przed chorobą w mysim modelu zapalnej choroby jelit.

Korzystnie inhibitorem IL-18 stosowanym według wynalazku jest inhibitor wybrany spośród inhibitorów kaspazy-1 (ICE), przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek i blokujących receptor IL-18, oraz białek wiążących IL-18, ich izoform, mutein, białek fuzyjnych, pochodnych funkcjonalnych, frakcji aktywnych albo ich kołowo permutowanych pochodnych o zasadniczo takiej samej aktywności jak białka wiążące IL-18.

Bardziej korzystnie inhibitorem IL-18 stosowanym według wynalazku jest przeciwciało przeciwko IL-18, korzystniej przeciwciało humanizowane wobec IL-18, a najkorzystniej ludzkie przeciwciało wobec IL-18.

Alternatywnie inhibitorem IL-18 stosowanym według wynalazku jest białko wiążące IL-18, albo jego izoforma, muteina, białko fuzyjne, pochodna funkcjonalna, frakcja aktywna albo ich kołowo permutowana pochodna, które wykazują zasadniczo taką samą aktywność jak białko wiążące IL-18. Korzystnie białko wiążące IL-18 jest modyfikowane PEG. Również korzystnie inhibitor IL-18 jest białkiem fuzyjnym zawierającym całość albo część białka wiążącego IL-18 w formie fuzji z całością albo częścią immunoglobuliny, przy czym białko fuzyjne wiąże IL-18, korzystniej białko fuzyjne zawiera cały region stały immunoglobuliny albo jego część, a najkorzystniej immunoglobulina jest izotypu IgG1 albo IgG2.

Zastosowanie kombinacji inhibitora IL-18 i/lub interferonu i/lub antagonisty TNF i/lub inhibitora COX-2 jest też rozważane zgodnie z wynalazkiem.

Zatem korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku ponadto zawiera interferon, korzystniej interferon-β. Także zgodnie z zastosowaniem według wynalazku inhibitor IL-18 jest stosowany z interferonem równocześnie, kolejno albo oddzielnie.

Również korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku ponadto zawiera antagonistę czynnika martwicy nowotworów (TNF), korzystniej będącego rozpuszczalnym receptorem I TNF (TBPI) i/albo rozpuszczalnym receptorem II TNF (TBPII). Najkorzystniej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku inhibitor IL-18 i/albo interferon jest stosowany z antagonistą TNF równocześnie, kolejno albo oddzielnie.

Ponadto korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawiera również inhibitor COX, korzystniej inhibitor COX-2.

Zgodnie zastosowaniem według wynalazku inhibitor IL-18 jest korzystnie stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała, albo około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała albo około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała albo około 1 do 2 mg/kg masy ciała, a korzystniej w ilości około 0,1 do 1000 μg/kg masy ciała, albo około 1 do 100 μg/kg masy ciała albo około 10 do 50 μg/kg masy ciała. Również korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku dostarcza inhibitor IL-18 podskórnie lub domięśniowo. Ponadto lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do dostarczania inhibitora IL-18 codziennie lub co drugi dzień.

Aby zastosować podejścia terapii genowej do dostarczania inhibitora IL-18 do chorych tkanek lub komórek, dalsze aspekty wynalazku dotyczą stosowania wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencję kodującą inhibitor IL-18 do leczenia i/lub zapobiegania stanom chorobowym.

Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania uszkodzeniu

PL 206 549 B1 wątroby, zapobiegania zapaleniu stawów oraz chorobie zapalnej jelit. Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do terapii genowej.

Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania aktywacji endogennego genu inhibitora IL-18 oraz zastosowanie komórek poddanych inżynierii genetycznej do wyrażania inhibitorów IL-18 do zapobiegania i/lub leczenia uszkodzeń wątroby, zapalenia stawów i IBD. Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie wektora do wywoływania i/albo wzmacniania endogennej produkcji inhibitora IL-18 w komórce lub zastosowanie genetycznie zmodyfikowanej do wytwarzania inhibitora IL-18 komórki do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania wyżej wymienionym chorobom.

Krótki opis figur

Fig. 1 prezentuje histogram przedstawiający poziomy IFN-γ (pg/ml) w surowicy po wstrzyknięciu różnych ilości zrekombinowanego IL18BP (0, 0,04, 0,4; 4 mg/kg) myszom 1 godz. przed wstrzyknięciem LPS. 5 godz. po wstrzyknięciu LPS pobrano próbki krwi i analizowano za pomocą ELISA pod kątem krążącego IFN-γ.

Fig. 2 prezentuje histogram przedstawiający poziomy aminotransferazy alaninowej (ALT) w surowicy. Myszom wstrzykiwano wzrastające dawki zrekombinowanego ludzkiego IL18BP (0; 0,04, 0,4; 4 mg/kg) przed wstrzyknięciem LPS myszom uwrażliwionym przez podanie P. acnes. Próbki krwi pobierano 5 godz. po wstrzyknięciu LPS i mierzono poziomy ALT w surowicy. SF = Sigma-Frankel: 1 jednostka SF AST/ALT tworzy 4,82 x 10⁴ umol glutaminianu/minutę przy pH 7,5 w 25°C.

Fig. 3 prezentuje czas przeżycia myszy po wstrzyknięciu LPS. Myszom wstrzyknięto różne ilości zrekombinowanego ludzkiego IL18BP (0, 0,04, 0,004; 4 mg/kg) 20 min. przed wstrzyknięciem LPS myszom uwrażliwionym przez podanie P. acnes. Trójkąty: 4 mg/kg; małe romby: 0,4; duże romby: 0,04; kółka: bez IL18BP (tylko LPS).

Fig. 4 prezentuje histogram przedstawiający poziomy w surowicy IFN-γ mierzone 5 godz. po wstrzyknięciu różnych ilości IL18BP (0; 0,4; 4 mg/kg), które były podawane 20 min przed wstrzyknięciem LPS myszom uwrażliwionym przez podanie P. acnes.

Fig. 5 prezentuje przeżycie myszy nastrzykniętych albo poliklonalną surowicą odpornościową IL-18 lub prawidłową surowicą królika (NDS = kontrola) 30 min. przed wstrzyknięciem 40 mg/ml (dawka letalna) LPS pochodzącego z E. coli (Fig. 5 A) lub S. typhimurium (Fig. 5 B). Trójkąty: myszom wstrzyknięto surowicę odpornościową IL-18; kółka: myszom wstrzyknięto NDS. Na osi x podano dni po prowokacji LPS. *p<0,05.

Fig. 6 prezentuje histogram podający średnią + SEM pięciu myszy na grupę traktowanych w następujący sposób. Myszom wstrzykiwano dootrzewnowo (i.p.) surowicę odpornościową anty-IL18, rozpuszczalne receptory TNF-α (TNFsRp55) lub nośnik (sól fizjologiczna) bezpośrednio po dożylnym (i.v.) podaniu konkanawaliny A (Con A; Fig. 6 A) lub PEA (Pseudomonas aeruginosa, Fig. 6 B). **p<0,01; ***p<0,001 w stosunku do ConA lub PEA samych; # p <0,01 w stosunku albo do analizy czynnikowej ANOVA TNFsRp55 albo anty-IL-18.

Fig. 7 przedstawia wpływ IL-18BP na wartości kliniczne w mysim modelu zapalenia stawów. Fig. 7 A przestawia wykres pokazujący wartości kliniczne mierzone po codziennym podaniu różnych ilości IL-18NP lub IFN-β lub nośnika (NaCl) i.p. (dootrzewnowo) myszom. Symbole: wypełnione trójkąty: 10000 IU IFN-β; puste trójkąty: 10 mg/kg IL-18BP, odwrócone trójkąty: 3 mg/kg IL-18BO; romby: 1 mg/kg IL-18BP; kółka: 0,5 mg/kg IL-18BP, puste kwadraty: 0,25 mg/kg IL-18BP i wypełnione kwadraty: NaCl. Dni traktowania są przedstawione na osi x, wartości kliniczne (wartości średnie) są przedstawione na osi y. Statystykę wyliczono za pomocą testu Manna Whitneya. Fig. 7 B prezentuje histogram przedstawiający AUC (ang. area under the curve - powierzchnia pod krzywą) z wykresu z Fig. 7 A. n = liczba zwierząt.

Fig. 8 przedstawia wpływ IL-18BP na obrzęk łap. Fig. 8 A prezentuje wykres przedstawiający wyniki otrzymane przez pomiar grubości łap (obrzęk) chorych tylnych łap poszczególnych zwierząt traktowanych różnymi ilościami IL-18BP. Oś y przestawia zmianę grubości łap w milimetrach od początku leczenia. Symbole są jak na Fig. 7. Fig. 8 B przedstawia histogram pokazujący AUC z wykresu z Fig. 8 A. n = liczba zwierząt.

Fig. 9 przedstawia analizę ilości chorych tylnych łap w czasie ostrego zapalenia stawów, tzn. rozszerzania choroby do innych stawów. Symbole: wypełnione kwadraty: NaCl (kontrola), trójkąty: 10 mg/kg IL-18BP, odwrócone trójkąty: 3 mg/kg IL-18BP; romby: 1 mg/kg IL-18BP, kółka: 0,5 mg/kg IL-18BP i puste kwadraty: 0,25 mg/kg IL-18BP.

PL 206 549 B1

Fig. 10 prezentuje histogram przedstawiający wartości erozji chrząstki chorych stawów.

Fig. 11 przedstawia histopatologię stawów myszy. Na koniec doświadczenia odcinano łapę, w której najpierw rozwinęło się zapalenie stawów, utrwalano i poddawano obróbce, jak opisano w Przykładzie 10 poniżej. Fig. 11 A: normalny staw myszy; Fig. 11 B: staw z myszy z zapaleniem stawów; Fig. 11 C: staw z myszy traktowanej rhIL-18BP.

Fig. 12 prezentuje histogram przedstawiający poziomy przeciwciał typu II przeciw kolagenowi izotypu IgG1 (puste kolumny) lub IgG2a (kreskowane kolumny) myszy traktowanych 3 mg/kg IL-18BP lub solą fizjologiczną (nośnik), odpowiednio. Pomiary wykonywano w dniu 4 (D4) lub dniu 8 (D8) choroby.

Fig. 13 prezentuje histogram przedstawiający poziomy IL-6 w pg/ml zwierząt traktowanych 1, 3 lub 10 mg/kg IL-18BP, 10000 IU interferonu β (IFN-b), prawidłową surowicą myszy (NMS) lub solą fizjologiczną (NaCl), odpowiednio.

Fig. 14 przedstawia ekspresję transkryptów mRNA hIL-18BP i IL-18 w biopsjach jelita pacjentów cierpiących na aktywną chorobę Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy lub prawidłowych zdrowych osób. Reprezentatywne produkty RT-PCR są przedstawione dla IL-18BP, dla IL-18 i dla genu metabolizmu podstawowego (β-aktyna) (Fig. 14 A). Względne oznaczenie ilościowe prążków barwionych bromkiem etydyny przeprowadzono stosując oprogramowanie Kodak Digital Imaging i są podane jako stosunek docelowego genu do β-aktyny. Docelowym genem jest IL-18 na Fig. 14 B i IL-18BP na Fig. 14 C.

Fig. 15 przedstawia ekspresję transkryptów mRNA ML-18BP i białka przez HUVEC (ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej) i ekspresję białka przez THP1 (ludzka linia komórkowa monocytów). RNA izolowano z nietraktowanych komórek śródbłonka (podłoże) i komórek śródbłonka stymulowanych IL-1 β, TNFa, IFNy. Kontrola pozytywna: jelito grube pacjenta z chorobą Crohna, kontrola negatywna: bez cDNA. Ekspresję IL-18BP i IL-18 analizowano za pomocą półilościowej RT-PCR (Fig. 15 A). Supernatant hodowli z nietraktowanych komórek i komórek aktywowanych 24 godz. przez IL-1 β, TNFa, IFNy HUVEC (Fig. 15 B) lub THP1 (Fig. 15 C) analizowano pod kątem wytwarzania białka IL-18BP i IL-18 za pomocą ELISA.

Fig. 16 przedstawia rozwój masy ciała między dniem 1 i dniem 10 w modelu mysim IBD po dootrzewnowym (i.p.) podaniu albo soli fizjologicznej (NaCl) albo IL-18BP (8 mg/kg). Zmiana masy ciała jest wyrażona jako procent zmiany masy ciała od dnia 1. Podano wartości średnie i SEM dla dwóch grup, 8 myszy na grupę.

Fig. 17 przedstawia wyniki analizy okrężnie, ogonowych węzłów chłonnych i śledziony pochodzącej od myszy IBD traktowanych w stosunku do nietraktowanych IL-18BP. Fig. 17 A przedstawia masę ostatnich 6 centymetrów okrężnicy w mg. Fig. 17 B przedstawia całkowity procent komórek barwiących się dodatnio dla CD4⁺/CD69⁺ w śledzionie. Dane przedstawiają średnie wartości i SEM. * oznacza znaczącą różnicę.

Fig. 18 przedstawia ilość IFNy (Fig. 18 A i B) i TNFa (Fig. 18 C i D) wytworzonych po 48 godzinach przez komórki ogonowego węzła chłonnego (Fig. 18 A i C) i komórki śledziony (Fig. 18 B i D) po stymulacji CD3/CD28 obecnymi w supernatantach. Podano wartości średnie i SEM.

Fig. 19 przedstawia zawartość TNFa (Fig. 19A) i IFNy (Fig. 19 B) w homogenatach okrężnicy. Dane są skorygowane dla masy okrężnicy. Podano średnie wartości i SEM. * oznacza znaczącą różnicę.

Opis wynalazku

Rozwiązania według wynalazku są oparte na ujawnieniu korzystnego efektu inhibitora IL-18 na różne choroby i zaburzenia.

Określenie „inhibitor IL-18” w kontekście niniejszego wynalazku dotyczy dowolnej cząsteczki modulującej wytwarzanie i/lub działanie IL-18, w taki sposób, że produkcja i/lub działanie IL-18 jest atenuowane, zmniejszone lub częściowo, zasadniczo lub całkowicie uniemożliwione lub zablokowane. Określenie „inhibitor IL-18” ma obejmować inhibitory wytwarzania IL-18, jak i inhibitory działania IL-18.

Inhibitor hamujący wytwarzanie może być dowolną cząsteczką negatywnie wpływającą na syntezę, przetwarzanie lub dojrzewanie IL-18. Inhibitory rozważane według wynalazku mogą być na przykład supresorami ekspresji genów interleukiny IL-18, antysensownymi mRNA obniżającymi lub zapobiegającymi transkrypcji mRNA IL-18 lub prowadzącymi do degradacji mRNA białkami upośledzającymi prawidłowe składanie lub częściowo lub zasadniczo zapobiegającymi wydzielaniu IL-18, proteazami degradującymi IL-18, gdy już została ona zsyntetyzowana, inhibitorami proteaz tnących pro-IL-18, aby wygenerować dojrzałą IL-18, takie jak inhibitory kaspazy-1 i tym podobne.

PL 206 549 B1

Inhibitor działania IL-18 może być, na przykład, antagonistą IL-18. Antagoniści mogą się wiązać do albo wychwytywać cząsteczkę IL-18 z dostatecznym powinowactwem i swoistością, aby częściowo lub znacząco neutralizować IL-18 lub miejsce (miejsca) wiążące IL-18 odpowiedzialne za wiązanie IL-18 do jej ligandów (jak np. do jej receptorów). Antagonista może także hamować szlak sygnalizacji IL-18, który jest aktywowany w komórkach po wiązaniu IL18/receptor.

Inhibitory działania IL-18 mogą także być rozpuszczalnymi receptorami IL-18 lub cząsteczkami imitującymi receptory, lub czynnikami blokującymi receptory IL-18 lub przeciwciałami IL-18, takimi jak przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne lub dowolnym innym czynnikiem lub cząsteczką zapobiegającym wiązaniu IL-18 do jej czynników docelowych, w ten sposób zmniejszając lub zapobiegając wewnątrz- lub pozakomórkowym reakcjom z udziałem IL-18.

Według pierwszego aspektu wynalazku inhibitory IL-18 są stosowane do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania uszkodzeniu wątroby. Korzystnie wynalazek dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania ostrym i przewlekłym chorobom wątroby i bardziej korzystnie alkoholowemu zapaleniu wątroby, wirusowemu zapaleniu wątroby, immunizacyjnemu zapaleniu wątroby, piorunującemu zapaleniu wątroby, marskości wątroby i pierwotnej marskości żółciowej wątroby.

Określenie uszkodzenie wątroby lub choroba wątroby jak jest to stosowane obejmuje różne stany patologiczne. Kilka ze stanów rozważanych w tym wynalazku zostało wyjaśnionych szczegółowo w podrozdziale „Dziedzina wynalazku” powyżej. Inne choroby wątroby, które mogą być leczone i/lub którym zapobiega się zgodnie z wynalazkiem obejmują na przykład pirogenne ropnie wątroby. Jest ono też nazywane wątrobą bakteryjną, i odnosi się do wytwarzającej ropę jamy w wątrobie. Powody ropni wątroby są liczne. Choroba ta może rozwinąć się z zakażenia brzusznego, takiego jak zapalenie wyrostka robaczkowego, zapalenie uchyłku lub perforacji jelita; zakażenia krwi, zakażenia z przewodu żółciowego (wydzielanie wątrobowe) lub uszkodzenia, gdy wątroba po urazie ulegnie zakażeniu. Najczęstsze organizmy powodujące ropnie wątroby to Escherichia coli, Proteus vulgaris i Enterobacter aerogenes. Częstość występowania wynosi 1 na 10000 osób.

Alkoholowe choroby wątroby mogą być leczone lub można im zapobiegać za pomocą stosowania inhibitorów IL-18 zgodnie z wynalazkiem. Obejmują one ostre lub przewlekłe zapalenie wątroby powodowane przez nadużywanie alkoholu. Alkoholowe zapalenie wątroby na ogól występuje po latach nadmiernego picia alkoholu. Im dłużej trwa używanie alkoholu i im większe spożycie alkoholu, tym większe prawdopodobieństwo wystąpienia choroby wątroby. W efekcie pustych kalorii z alkoholu występuje niedożywienie, obniżone łaknienie i malabsorpcja (niedostateczna absorpcja składników odżywczych z przewodu pokarmowego). Niedożywienie ma udział w chorobie wątroby. Toksyczność etanolu dla wątroby, indywidualna podatność na indukowaną przez alkohol chorobę wątroby i czynniki genetyczne też mają udział w rozwoju alkoholowej choroby wątroby.

Zgodnie z wynalazkiem inhibitory IL-18 mogą być stosowane do leczenia i/lub zapobiegania marskości wątroby. Marskość wątroby jest przewlekłą chorobą wątroby, która powoduje uszkodzenie tkanki wątroby, blizny wątroby (zwłóknienie, regeneracja guzowata), postępujący spadek funkcjonowania wątroby, występowanie nadmiernego płynu w jamie brzusznej (płyn wysiękowy); związanych z krwawieniem zaburzeń (koagulopatia), zwiększone ciśnienie w naczyniach krwionośnych (nadciśnienie wrotne), i zaburzenia funkcjonowania mózgu (encefalopatia wątrobowa). Uszkodzona wątroba z bliznami staje się niezdolna do właściwego usuwania produktów zbędnych (toksyn) z krwi, i tworzenie tkanki blizn prowadzi do nadmiernie wysokiego ciśnienia (nadciśnienie wrotne) w naczyniach między jelitami i śledzioną, a wątrobą. Nadużycie alkoholu jest wiodącą przyczyną marskości. Inne przyczyny obejmują zakażenia (takie jak zapalenie wątroby), choroby i wady systemu odprowadzania żółci (takie jak stenoza lub obstrukcja żółci), mukowiscydoza i zwiększona absorpcja żelaza i miedzi.

Typ marskości zależy od przyczyny choroby. Komplikacje marskości mogą być poważne. W USA marskość jest 9 przyczyną zgonów. Mogą powstać problemy neurologiczne (takie jak encefalopatia wątrobowa). Zwiększone nagromadzanie płynu w jamie brzusznej (płyn wysiękowy) jest powodowane przez zmniejszoną zawartość białka w organizmie, zwiększoną ilość sodu i zwiększone ciśnienie w naczyniach krwionośnych wątroby (nadciśnienie wrotne). Nadciśnienie wrotne może powodować zwiększone ciśnienie, zwiększoną wielkość i pełność w naczyniach krwionośnych przełyku (żylaki przełyku). Mogą wystąpić problemy z krwawieniem i krzepnięciem. Zwiększone ciśnienie w naczyniach krwionośnych i problemy z krzepnięciem krwi mogą zwiększyć możliwość poważnego i zagrażającego życiu krwotoku.

PL 206 549 B1

Innym zaburzeniem, które ma być objęte przez określenie „uszkodzenie wątroby” według wynalazku jest autoimmunizacyjne zapalenie wątroby. Jest to zapalenie wątroby powodowane przez interakcję z układem odpornościowym. Autoimmunizacyjne zapalenie wątroby jest typem przewlekłego aktywnego zapalenia wątroby. Przyczyną przewlekłego zapalenia wątroby mogą być komórkowe reakcje immunologiczne. We krwi pacjentów z przewlekłym czynnym zapaleniem wątroby można znaleźć szereg krążących autoprzeciwciał. Inne choroby autoimmunizacyjne mogą być związane z przewlekłym czynnym zapaleniem wątroby lub mogą występować u krewnych pacjentów z przewlekłym czynnym zapaleniem wątroby. Te choroby to zapalenie tarczycy, cukrzyca, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, Coombs-dodatnia anemia hemolityczna, proliferacyjne zapalenie kłębuszków nerkowych i zespół Sjogrena. Czynniki ryzyka mogą obejmować te choroby lub czynniki ryzyka związane z przewlekłym czynnym zapaleniem wątroby. Częstość występowania wynosi 4 na 10000 osób.

Atrezja żółciowa jest następną chorobą mieszczącą się w zakresie określenia „uszkodzenie wątroby”. Jest to obstrukcja przewodów żółciowych powodowana przez ich niezdolność do normalnego rozwoju przed narodzinami (w macicy). Atrezja żółciowa jest powodowana przez nieprawidłowy i niewystarczający rozwój przewodów żółciowych w obrębie i poza wątrobą. Celem układu żółciowego jest usuwanie produktów odpadu z wątroby i przenoszenie soli żółciowych potrzebnych do trawienia tłuszczu do jelita cienkiego. W tym stanie przepływ żółci z wątroby do pęcherzyka żółciowego jest zablokowany. To może prowadzić do uszkodzenia wątroby i marskości wątroby, która może być zabójcza, jeśli nie jest leczona.

Według wynalazku inhibitory IL-18 są także stosowane do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania przewlekłemu czynnemu zapaleniu wątroby, zwanemu także przewlekłym agresywnym zapaleniem wątroby. Jest to ciągnące się zapalenie wątroby, które uszkadza komórki wątroby. Przyczyny przewlekłego czynnego zapalenia wątroby obejmują zakażenie wirusem, reakcję na lek/spożycie leku, zaburzenia metaboliczne lub zaburzenia immunologiczne. Może też nie być żadnej widocznej przyczyny. Choroba charakteryzuje się występowaniem martwicy lub śmierci komórek wątroby, aktywnego zapalenia i włóknienia, które może prowadzić do niewydolności wątroby, marskości i śmierci. Częstość występowania wynosi 1 na 10000 osób. Czynnikami ryzyka stanowią choroby autoimmunizacyjne, uprzednie zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C, lub dodatni antygen wirusa zapalenia wątroby A lub wirusa zapalenia wątroby B przez ponad 6 miesięcy.

Przewlekłe utrzymujące się zapalenie wątroby jest łagodną, niepostępującą postacią zapalenia wątroby, i jest też chorobą objętą przez określenie „choroba wątroby” według wynalazku.

Według wynalazku inhibitory IL-18 są także stosowane do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania pierwotnej żółciowej marskości wątroby (PBC). PBC jest stanem zapalnym wynikającym z obstrukcji przepływu żółci w wątrobie, powodującej uszkodzenie komórek wątroby. Przewody żółciowe w wątrobie wykazują stan zapalny z nieznanych przyczyn. Na chorobę najczęściej zapadają kobiety w średnim wieku. Pojawianie się objawów jest stopniowe. Pierwszym objawem jest swędzenie skóry. W obrębie wątroby występuje zapalenie przewodów żółciowych. W końcu rozwija się marskość wątroby. Choroba może być też związana z zaburzeniami autoimmunizacyjnymi. Częstość występowania wynosi 8 na 100000 osób. Inhibitory IL-18 tu rozważane mogą być także stosowane do leczenia ostrego zatrucia wątrobowego, na przykład, powodowanego przez wysoką ilość paracetamolu. Takie ostre zatrucie wątrobowe może być powodowane przez zbyt wysoką dawkę paracetamolu przypadkową lub celową.

Jak pokazano w przykładach poniżej, Twórcy niniejszego wynalazku w sposób zaskakujący stwierdzili, że inhibitory IL-18 są szczególnie skuteczne w zapobieganiu i leczeniu piorunującego zapalenia wątroby (ostre zapalenie wątroby). Tak więc, wynalazek korzystnie dotyczy zapobiegania i/lub leczenia piorunującego zapalenia wątroby.

Według drugiego aspektu wynalazku, inhibitory IL-18 są stosowane do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania zapaleniu stawów.

Określenie „zapalenie stawów”, jak jest to tu stosowane obejmuje różne typy zapaleń stawów i stanów artretycznych, zarówno ostre i przewlekłe zapalenie stawów, jak zdefiniowano np. w witrynie internetowej Department of Orthopedics of the University of Washington on Arthritis (www.orthop.washington.edu). Przykładami stanów artretycznych są zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, ból pleców, zespół odkładania się złogów w nadgarstku, zespół Ehlers-Danlos, dna, młodzieńcze zapalenie stawów, rumień ogólnoustrojowy, zapalenie mięśni, niedoskonała osteogeneza, osteoporoza, poliartretyzm, zapalenie wielomięśniowe, łuszczycowe zapalenie stawów, zespół Reitera, twardzina, artretyzm z chorobą jelit, choroba Behceta, zapalenie stawów u dzieci, degeneracyjna

PL 206 549 B1 choroba stawów, fibromialgia, zakaźne zapalenie stawów, choroba Lyme, zespół Marfana, osteoartretyzm, osteonekroza, choroba Pageta, reumatoidalne zapalenie wielomięśniowe, dna rzekoma, dystrofia odruchu współczulnego, reumatoidalne zapalenie stawów, reumatyzm, zespół Sjogrena, rodzinna gruczolakowa polipowatość okrężnicy i tym podobne.

Korzystnie według wynalazku inhibitory IL-18 są dostarczone do leczenia i/lub zapobiegania zapalnemu artretyzmowi. Zapalny artretyzm klasyfikuje się jako artretyzm przewlekły, według utrzymującego się, ciągłego lub nawracającego toku choroby.

Według korzystnego wykonania wynalazku zapalny artretyzm jest reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA). RA powoduje zapalenie wyściółki stawów (błona maziowa, nabłonek jednowarstwowy) i/lub narządów wewnętrznych. Choroba ma skłonność do utrzymywania się przez wiele lat, typowo zajmując wiele stawów w ciele i ostatecznie może powodować uszkodzenia chrząstki, kości, ścięgien i więzadeł. Stawy, które mogą być dotknięte przez RA stanowią stawy znajdujące się, przykładowo, w szyi, ramionach, łokciach, biodrach, przegubach, rękach, kolanach, kostkach i nogach. W wielu przypadkach stawy w RA wykazują zapalenie w sposób symetryczny.

RA występuje u około 1% populacji w Stanach Zjednoczonych i jest rozprzestrzenione u wszystkich grup etnicznych i wiekowych. Występuje na całym świecie, i wśród chorych na RA stosunek kobiet do mężczyzn wynosi 3 do 1.

Jak przedstawiono w przykładach poniżej, udowodniono, że inhibitor IL-18 wykazuje wysoce skuteczne działanie korzystne wobec erozji chrząstki. Wynalazek więc dalej dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania niszczeniu chrząstki, tzn. zastosowania inhibitora IL-18 jako czynnika ochronnego dla chrząstki. Inhibitor IL-18 może być stosowany w dowolnym stanie, w którym występuje niszczenie lub erozja chrząstki. Niszczenie chrząstki jest postępującym obniżeniem integralności strukturalnej chrząstki stawu. Występuje na przykład w stanach wpływających na chrząstki stawów, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, lub osteoartretyzm, ale także, na przykład, w zakaźnym zapaleniu maziówki.

Trzeci aspekt wynalazku dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania zapalnej chorobie jelit. Jest on oparty na ujawnieniu, że inhibitor IL-18 jest podwyższony w zapalnej śluzówce pacjentów z CD oraz, że podawanie różnych inhibitorów IL-18 ma ochronny wpływ na mysi model zapalenia okrężnicy.

Podwyższenie IL-18 w zapalnych śluzówkach u pacjentów z CD było już opisane w dziedzinie (Monteleone i wsp., 1999; Pizarro i wsp., 1999).

Po wykazaniu wysokich ilości IL-18BP w zapalnych regionach śluzówek jelita według wynalazku było jeszcze bardziej zaskakujące stwierdzenie wyraźnego korzystnego efektu IL-18BP podanego ogólnoustrojowo na rozwój i objawy zapalenia jelita w modelu zwierzęcym. Choć IL-18BP jest już podwyższony endogennie w jelicie pacjentów z CD, jak wykazano w przykładach poniżej, ilość IL-18BP, do której wytwarzania jest zdolny organizm nie wydaje się być wystarczająca do zwalczenia choroby.

Korzystnie według wynalazku zapalna choroba jelita jest chorobą Crohna lub wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy.

W korzystnym wykonaniu wynalazku inhibitor IL-18 jest wybrany z inhibitorów kaspazy-1 (ICE), przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18, inhibitorów szlaku sygnalizacji IL-18, antagonistów IL-18, którzy współzawodniczą z IL-18 i blokują receptor IL-18 i wiążących IL-18 białek, ich izoform, mutein, białek fuzyjnych, pochodnych funkcjonalnych, frakcji aktywnych lub kołowo permutowanych pochodnych mających zasadniczo taką samą aktywność.

Określenie „białka wiążące IL-18” jest tu stosowane jako synonim „IL 18BP”. Obejmuje białka wiążące IL-18, jak zdefiniowano w WO 99/09063 lub w Novick i wsp., 1999, w tym ich warianty składania i/lub izoformy białek wiążących IL-18, jak zdefiniowano w Kim i wsp., 2000. W szczególności, ludzkie izoformy a i c IL-18BP są użyteczne w rozwiązaniach według wynalazku. Białka użyteczne według wynalazku mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane, mogą pochodzić z naturalnych źródeł, takich jak mocz lub mogą być korzystnie wytwarzane rekombinacyjnie. Zrekombinowana ekspresja może być prowadzona w prokariotycznych systemach ekspresji, takich jak E. coli lub w eukariotycznych i korzystnie ssaczych systemach ekspresji.

W stosowanym tu znaczeniu określenie „muteiny” dotyczy analogów IL-18BP lub analogów wirusowego IL-18BP, w których jedna lub więcej reszta aminokwasowa naturalnego IL-18BP jest zastąpiona przez inne reszty aminokwasowe, lub są one usunięte, lub jedna lub więcej reszt aminokwasowych są

PL 206 549 B1 dodane do naturalnej sekwencji IL-18BP lub wirusowego IL-18BP bez znaczącej zmiany aktywności powstałych produktów w porównaniu z IL-18BP typu dzikiego lub wirusowego IL-18BP. Muteiny te są przygotowywane znanymi technikami syntezy i/lub mutagenezy ukierunkowanej lub dowolną inną techniką do tego odpowiednią.

Każda taka muteina ma sekwencję aminokwasów dostatecznie podobną do IL-18BP, lub dostatecznie duplikującą wirusowy IL-18BP, aby mieć aktywność zasadniczo podobną do IL-18BP. Jedną taką aktywnością IL-18BP jest jego zdolność do wiązania IL-18. O ile muteina ma zasadniczą zdolność wiązania IL-18 może być stosowana do oczyszczania IL-18, jak na przykład za pomocą chromatografii powinowactwa i tak więc może być uważana za posiadającą zasadniczo podobną aktywność do IL-18BP. Tak więc można określić czy dowolna muteina ma zasadniczo taką samą aktywność jak IL-18BP za pomocą rutynowych doświadczeń obejmujących poddanie takiej muteiny np. prostemu kanapkowemu testowi współzawodnictwa, takiemu jak test radioimmunologiczny lub oznaczenie ELISA, aby określić czy wiąże odpowiednio wyznakowaną IL-18.

Muteiny polipeptydów IL-18BP lub muteiny wirusowych IL-18BP, które mogą być stosowane według wynalazku lub kwasy nukleinowe je kodujące obejmują skończony zestaw zasadniczo odpowiadających sekwencji, takich jak peptydy lub polinukleotydy substytucyjne, które mogą być uzyskane rutynowo przez osobę o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie, bez nadmiernych eksperymentów w oparciu o ujawnienia i wytyczne tu przedstawione.

Korzystne zmiany dla mutein, które mogą być stosowane w rozwiązaniach według wynalazku, są to tak zwane podstawienia „konserwatywne”. Konserwatywne podstawienia aminokwasów polipeptydów lub białek IL-18BP lub wirusowych IL-18BP mogą obejmować synonimiczne aminokwasy w grupie, które mają dostatecznie podobne właściwości fizykochemiczne, tak że podstawienie wśród członków grupy zachowa funkcję biologiczną cząsteczki (Grantham, 1974). Jest jasne, że delecje i insercje aminokwasów mogą być też zrobione w sekwencjach zdefiniowanych powyżej bez zmiany ich funkcji, szczególnie jeśli insercje lub delecje tylko obejmują kilka aminokwasów, np. poniżej trzydziestu i korzystnie poniżej dziesięciu, i nie usuwają ani nie przemieszczają aminokwasów, które są krytyczne dla konformacji funkcjonalnej, np. reszty cysteinowe. Białka i muteiny wytworzone przez takie delecje i/lub insercje są użyteczne w rozwiązaniach według wynalazku.

Korzystnie synonimiczne grupy aminokwasów zostały zdefiniowane w Tabeli I, bardziej korzystnie synonimiczne grupy aminokwasów zostały zdefiniowane w Tabeli II, a najbardziej korzystnie synonimiczne grupy aminokwasów zostały zdefiniowane w Tabeli III.

Korzystne grupy synonimicznych aminokwasów

Aminokwas

Ser

Arg

Leu

Pro

Thr

Ala

Val

Gly

Ile

Phe

Tyr

Cys

His

Gln

Asn

Lys

Asp

Glu

Met

Trp

Grupa synonimiczna

Ser, Thr, Gly, Asn

Arg, Gln, Lys, Glu, His

Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Gly, Ala, Thr, Pro

Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Gly, Thr, Pro, Ala

Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Ser, Thr, Cys

Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Gln, Asp, Ser, Asn Glu, Gln, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp

Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp

PL 206 549 B1

T a b e l a II

Bardziej korzystne grupy synonimicznych aminokwasów

Aminokwas Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp

Grupa synonimiczna Ser His, Lys, Arg Leu, Ile, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro, Ala Val, Met, Ile Gly Ile, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Phe, Tyr Cys, Ser His, Gln, Arg Glu, Gln, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp

T a b e l a III

Najbardziej korzystne grupy synonimicznych

Aminokwas Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys ASP Glu Met Trp

Grupa synonimiczna Ser Arg Leu, Ile, Met Pro Thr Ala Val Gly Ile, Met, Leu Phe Tyr Cys, Ser His Gln Asn Lys Asp Glu Met, Ile, Leu Trp

Przykłady generowanych podstawień aminokwasów w białkach, które mogą być stosowane w celu uzyskania muteiny polipeptydów lub białek IL-18BP lub mutein wirusowych IL-18BP do zastosowania w obecnym wynalazku obejmują dowolne znane sposoby, takie jak przedstawiono w Patentach US RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, i 4,737,462 dla Mark i wsp.; 5,116,943 dla Koths i wsp., 4,965,195 dla Namen i wsp; 4,879,111 dla Chong i wsp., i 5,017,691 dla Lee i wsp. i białka podstawione lizyną przedstawione w Patencie USA Nr 4,904,584 (Shaw i wsp.).

PL 206 549 B1

Określenie „białko fuzyjne” dotyczy polipeptydu zawierającego IL-18BP lub wirusowy IL-18BP, lub jego muteinę lub fragment w formie fuzji z innym białkiem, które np. ma przedłużony czas trwania w płynach ustrojowych. IL-18BP lub wirusowy IL-18BP może więc być w formie fuzji z innym białkiem, polipeptydem lub tym podobnym, jak np. immunoglobuliną lub jej fragmentem.

Określenie „pochodne funkcjonalne” w stosowanym tu znaczeniu, obejmuje pochodne IL-18BP lub wirusowego IL-18BP i ich muteiny i białka fuzyjne, które mogą być przygotowane z grup funkcjonalnych, które występują jako łańcuchy boczne lub na resztach grup N- lub C-końcowych, za pomocą sposobów znanych w dziedzinie i są włączone do wynalazku o ile pozostają farmaceutycznie dopuszczalne, tzn. nie niszczą aktywności białka, które jest zasadniczo podobne do IL-18BP lub wirusowego IL-18BP i nie nadają toksycznych właściwości zawierających im kompozycjom.

Te pochodne mogą, na przykład, obejmować łańcuchy boczne glikolu polietylenowego, które mogą maskować miejsca antygenowe i wydłużać przebywanie IL-18BP lub wirusowego IL-18BP w płynach ustrojowych. Inne pochodne obejmują estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych powstałe w reakcji z amoniakiem lub pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi aminami, pochodne N-acylowe wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych wytworzonych z resztami acylowymi (np. grupami alkanoilowymi lub karbocyklicznymi grupami aroilowymi), lub O-acylopochodne wolnych grup hydroksylowych (na przykład reszt serylowych lub treonylowych) wytworzonych z resztami acylowymi.

Jako „aktywne frakcje” IL-18BP lub wirusowego IL-18BP, mutein i białek fuzyjnych obecny wynalazek obejmuje dowolny fragment lub prekursory łańcucha polipeptydowego cząsteczki białka, samej lub razem z zasocjowanymi cząsteczkami lub resztami z nimi połączonymi, np. resztami cukru lub fosforanowymi, lub agregaty cząsteczki białka lub same reszty cukru, o ile ta frakcja ma aktywność zasadniczo podobną do IL-18BP.

W dalszym korzystnym wykonaniu inhibitor IL-18 jest przeciwciałem na IL-18. Przeciwciała antyIL-18 mogą być poliklonalne lub monoklonalne, chimero we, humanizowane lub całkowicie ludzkie. Zrekombinowane przeciwciała i ich fragmenty charakteryzuje wiązanie IL-18 z wysokim powinowactwem in vivo i niska toksyczność. Przeciwciała, które mogą być stosowane w rozwiązaniach według wynalazku charakteryzują się zdolnością do leczenia pacjentów przez okres czasu wystarczający by uzyskać dobrą do znakomitej regresję lub złagodzenie patogennego stanu lub dowolnego objawu lub grupy objawów związanych ze stanem patogennym, oraz niską toksycznością.

Przeciwciała neutralizujące łatwo uzyskuje się u zwierząt, takich jak króliki, kozy lub myszy przez immunizację IL-18. Immunizowane myszy są szczególnie pożyteczne w dostarczaniu źródeł komórek B do wytwarzania hybrydoma, które z kolei są hodowane, aby uzyskać duże ilości przeciwciał monoklonalnych anty-L-18.

Chimerowe przeciwciała są cząsteczkami immunoglobuliny charakteryzowanymi przez dwa lub więcej odcinków lub części pochodzących z różnych gatunków zwierząt. Na ogół zmienna część chimerowego przeciwciała pochodzi z przeciwciała od ssaka nie będącego człowiekiem, a stały region immunoglobuliny pochodzi z ludzkiej cząsteczki immunoglobuliny. Korzystnie oba regiony i kombinacja mają niską immunogenność, co można wykazać w rutynowych oznaczeniach (Elliott i wsp., 1994). Humanizowane przeciwciała są cząsteczkami immunoglobuliny uzyskanymi za pomocą technik inżynierii genetycznej, w których stałe regiony mysie są zastąpione przez swoje ludzkie odpowiedniki przy zachowaniu mysich regionów wiążących antygen. Powstałe chimerowe przeciwciało mysz-człowiek korzystnie ma zmniejszoną immunogenność i lepszą farmakokinetykę u ludzi (Knight i wsp., 1993).

Tak więc w dalszym korzystnym wykonaniu przeciwciało IL-18 jest humanizowanym przeciwciałem IL-18. Korzystne przykłady humanizowanych przeciwciał IL-18 są opisane, na przykład, w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0974600.

W jeszcze dalszym korzystnym wykonaniu przeciwciało IL-18 jest w pełni ludzkie. Technologia wytwarzania ludzkich przeciwciał jest opisana szczegółowo np. w WO00/76310, WO99/53409, US 6,162,963 lub AU5336100. W pełni ludzkie przeciwciała są korzystnie przeciwciałami zrekombinowanymi, wytwarzanymi w zwierzętach transgenicznych np. ksenomyszach, zawierającymi całość lub część funkcjonalnych ludzkich loci Ig.

W wysoce korzystnym wykonaniu wynalazku inhibitor IL-18 jest IL-18BP, lub jego izoformą, muteina białkiem fuzyjnym, pochodną funkcjonalną frakcją aktywną lub kołowo permutowaną pochodną. Te izoformy, muteiny, białka fuzyjne lub funkcjonalne odpowiedniki zachowują aktywność biologiczną IL-18BP, w szczególności wiązanie IL-18 i korzystnie mają zasadniczo aktywność przynajmniej podobną do IL-18BP. Idealnie takie białka maja aktywność biologiczną, która jest nawet zwiększona

PL 206 549 B1 w porównaniu z niezmodyfikowanym IL-18BP. Korzystne frakcje aktywne mają aktywność, która jest lepsza niż aktywność IL-18BP, lub mają inne zalety takie jak lepsza stabilność lub niższa toksyczność lub immunogenność lub są łatwiejsze do wytwarzania w dużych ilościach lub łatwiejsze do oczyszczenia.

Sekwencje IL-18BP i jego wariantów składania/izoform przedstawiono w WO99/09063 lub z Novick i wsp., 1999 jak i w Kim i wsp., 2000.

Funkcjonalne pochodne IL-18BP mogą być koniugowane z polimerami, aby polepszyć właściwości białka, takie jak stabilność, okres półtrwania, biodostępność, tolerancja przez organizm ludzki, lub immunogenność. Aby osiągnąć ten cel IL-18BP może być połączone np. z glikolem polietylenowym (PEG). Modyfikowanie PEG (pegylacja) może być przeprowadzone za pomocą znanych sposobów opisanych na przykład w WO 92/13095.

Tak więc w korzystnym wykonaniu wynalazku IL-18BP jest modyfikowane PEG.

W dalszym korzystnym wykonaniu wynalazku inhibitor IL-18 jest białkiem fuzyjnym zawierającym całość lub część białka wiążącego IL-18 w formie fuzji do całości lub części immunoglobuliny. Osoba biegła w dziedzinie zrozumie, że powstałe białko fuzyjne zachowuje aktywność biologiczną IL-18BP, w szczególności wiązanie IL-18. Fuzja może być bezpośrednia lub przez krótki peptyd linkerowy, który może być tak krótki jak 1 do 3 reszt aminokwasów długości, lub dłuższy i wynosić, na przykład, 13 reszt aminokwasowych długości. Ten linker może być, na przykład, tripeptydem o sekwencji E-F-M (Glu-Phe-Met) lub 13-aminokwasową sekwencją linkera zawierającą Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met wprowadzoną między sekwencją IL-18BP i sekwencją immunoglobuliny. Powstałe białko fuzyjne ma ulepszone właściwości, takie jak wydłużony czas przebywania w płynach ustrojowych (okres półtrwania), zwiększona aktywność specyficzna, zwiększony poziom ekspresji lub ułatwione jest oczyszczanie białka fuzyjnego.

W korzystnym wykonaniu IL-18BP jest w formie fuzji z regionem stałym cząsteczki Ig. Korzystnie jest ono połączone z regionami łańcucha ciężkiego, takimi jak, na przykład, domeny CH2 i CH3 ludzkiej IgG1. Generowanie specyficznych białek fuzyjnych zawierających IL-18BP i część immunoglobuliny opisano, na przykład, w przykładzie 11 WO99/09063. Inne izoformy cząsteczek Ig, takie jak izoformy IgG2 lub IgG4, lub inne klasy Ig, jak na przykład, IgM lub IgA, są także odpowiednie do generowania białek fuzyjnych użytecznych w rozwiązaniach według wynalazku. Białka fuzyjne mogą być monomeryczne lub multimeryczne, hetero- lub homomultimeryczne.

Interferony są przede wszystkim znane ze względu na efekty hamujące replikację wirusa i proliferację komórek. Na przykład, interferon-γ odgrywa ważną rolę w promowaniu odpowiedzi immunologicznych i zapalnych. Interferon β (IFN-β, interferon typu 1) uważany jest za odgrywający rolę przeciwzapalną. Badania opublikowane przez Triantaphyllopoulos i wsp. (1999) wykazały, że IFN-γ ma korzystny efekt w leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów jak wykazano w mysim modelu choroby, modelu zapalenia stawów indukowanego przez kolagen (CIA). Korzystny efekt IFN- β potwierdzono w przykładach poniżej.

Wynalazek także dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 i interferonu do wytwarzania leku do leczenia zapalenia stawów, w szczególności reumatoidalnego zapalenia stawów.

Interferony mogą być też koniugowane z polimerami w celu poprawienia stabilności białek. Koniugat między interferonem β i poliolem glikolem polietylenowym (PEG) był, na przykład, opisany w WO 99/55377.

W innym korzystnym wykonaniu według wynalazku interferon jest interferonem- β (IFN- β) i bardziej korzystnie IFN-β 1a.

Inhibitor wytwarzania i/lub działania IL-18 jest korzystnie stosowany równocześnie, kolejno lub oddzielnie z interferonem.

W jeszcze innym wykonaniu według wynalazku inhibitor IL-18 jest stosowany w kombinacji z antagonistą TNF. Antagoniści TNF wywierają swoje działanie na kilka sposobów. Po pierwsze antagoniści mogą się wiązać z lub usunąć cząsteczkę samego TNF z dostatecznym powinowactwem i specyficznością by częściowo lub znacznie zneutralizować epitop lub epitopy TNF odpowiedzialne za wiązanie receptora TNF (dalej określane tu jako „usuwający antagoniści”). Usuwający antagonista może być na przykład przeciwciałem skierowanym przeciwko TNF.

Alternatywnie antagoniści TNF mogą hamować szlak sygnalizacji TNF aktywowany przez receptor na powierzchni komórki po wiązaniu TNF (dalej określani jako „antagoniści sygnalizacji”). Obie grupy antagonistów są pożyteczne albo pojedynczo albo razem w kombinacji z inhibitorem 11-18 w terapii zapalenia stawów, w szczególności reumatoidalnego zapalenia stawów.

PL 206 549 B1

Antagoniści TNF są łatwo identyfikowani i oceniani przez rutynowe badania przesiewowe kandydatów pod kątem ich działania na aktywność natywnego TNF na wrażliwych liniach komórkowych in vitro, na przykład, ludzkich komórek B, w których TNF powoduje proliferację i sekrecję immunoglobulin. W oznaczeniu wykorzystywana jest formulacja TNF o zmiennych rozcieńczeniach antagonistykandydata, np. od 0,1 do 100 razy molarna ilość TNF stosowana w oznaczeniu i kontrole bez TNF lub tylko z antagonistą (Tucci i wsp., 1992).

Usuwający antagoniści są korzystnymi antagonistami TNF do stosowania w rozwiązaniach według wynalazku. Wśród antagonistów usuwających te polipeptydy, które wiążą TNF z wysokim powinowactwem i posiadają niską immunogenność są korzystne. Rozpuszczalne cząsteczki receptora TNF i neutralizujące przeciwciała przeciwko TNF są szczególnie korzystne. Na przykład, rozpuszczalny TNF-RI i TNF-RII są pożyteczne w rozwiązaniach według wynalazku. Skrócone formy tych receptorów, zawierające zewnątrzkomórkowe domeny receptorów lub ich funkcjonalne części są szczególnie korzystnymi antagonistami. Skrócone rozpuszczalne receptory TNF typu-I i typu-II są, na przykład, opisane w EP914431.

Skrócone formy receptorów TNF są rozpuszczalne i były wykryte w moczu i surowicy jako białka hamujące TNF 30 kDa i 40 kDa, które są odpowiednio nazywane TBPI i TBPII (Engelmann i wsp., 1990). Równoczesne, kolejne lub oddzielne stosowanie inhibitora IL-18 z antagonistą TNF i/lub interferonem jest korzystne w rozwiązaniach według wynalazku.

Według wynalazku TBPI i TBPII są korzystnymi antagonistami TNF do stosowania w kombinacji z inhibitorem IL-18. Pochodne, fragmenty, regiony i biologicznie czynne części cząsteczki receptora funkcjonalnie przypominają cząsteczki receptora, które mogą być także stosowane w rozwiązaniach według wynalazku. Takie biologicznie czynne ekwiwalenty lub pochodne cząsteczki receptora dotyczą części polipeptydu lub sekwencji kodującej cząsteczkę receptora, która ma wystarczającą wielkość i jest zdolna do wiązania TNF z takim powinowactwem, że interakcja z receptorem TNF związanym z błoną jest hamowana lub blokowana.

W dalszym korzystnym wykonaniu ludzki rozpuszczalny TNF-RI (TBPI) jest antagonistą TNF do stosowania w rozwiązaniach według wynalazku. Naturalne i zrekombinowane cząsteczki receptora TNF i metody ich wytwarzania były opisane w patentach europejskich EP 308378, EP 398327 i EP 433900.

Inhibitor IL-18 i inhibitor TNF mogą być stosowane równocześnie, kolejno lub oddzielnie. Korzystnie stosowana jest kombinacja przeciwciała lub surowicy odpornościowej IL-18 i rozpuszczalnego receptora TNF o aktywności hamującej TNF.

W dalszym korzystnym wykonaniu wynalazku lek dalej zawiera inhibitor COX, korzystnie inhibitor COX-2. Inhibitory COX są dobrze znane w dziedzinie. Specyficzne inhibitory COX-2 są, na przykład, ujawnione w WO 01/00229.

Wynalazek dalej dotyczy zastosowania kombinacji inhibitorów IL-18 i/lub interferonów i/lub antagonistów TNF i/lub inhibitorów COX-2 do leczenia i/lub zapobiegania zapaleniu stawów, w szczególności reumatoidalnemu zapaleniu stawów i do leczenia i/lub zapobiegania uszkodzeniom wątroby i do leczenia i/lub zapobiegania zapalnym chorobom jelita, w szczególności chorobie Crohna i wrzodziejącemu zapaleniu okrężnicy. Składniki czynne mogą być stosowane równocześnie, kolejno lub oddzielnie.

W korzystnym wykonaniu wynalazku inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała, lub około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała lub około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała lub około 1 do 2 mg/kg masy ciała. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu wynalazku inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,1 do 1000 ug/kg masy ciała, lub około 1 do 100 ug/kg masy ciała lub około 10 do 50 ug/kg masy ciała.

Wynalazek dalej dotyczy zastosowania wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania stanom artretycznym lub zapaleniu stawów, szczególnie reumatoidalnemu zapaleniu stawów, do leczenia uszkodzenia wątroby i do leczenia zapalnej choroby jelit. Stosowane jest więc podejście terapii genowej do leczenia i/lub zapobiegania chorobie. Korzystnie ekspresja inhibitora IL-18 będzie zachodziła in situ skutecznie blokując IL-18 bezpośrednio w tkance (tkankach), na które wpływa choroba.

Aby leczyć i/lub zapobiegać zapaleniu stawów, wektor do terapii genowej zawierający sekwencję inhibitora wytwarzania i/lub działania IL-18 może być wstrzykiwany bezpośrednio do chorego stawu, w ten sposób unikając problemów związanych z ogólnoustrojowym podawaniem wektorów do

PL 206 549 B1 terapii genowej, jak rozcieńczenie wektorów, osiąganie i adresowanie komórek lub tkanek docelowych i efekty uboczne.

Zastosowanie wektora do indukcji i/lub wzmagania endogennego wytwarzania inhibitora IL-18 w komórce normalnie nieprodukującej inhibitora IL-18 lub która wyraża ilości inhibitora, które nie są wystarczające, jest też rozważane według wynalazku. Wektor może zawierać sekwencje regulatorowe funkcjonalne w komórkach, w których pragnie się uzyskać ekspresję inhibitora IL-18. Takie sekwencje mogą być, na przykład, promotorami lub enhancerami. Sekwencje regulatorowe mogą wówczas być wprowadzone do właściwego locus genomu przez rekombinację homologiczną w ten sposób funkcjonalnie łącząc sekwencję regulatorową z genem, którego indukcja lub zwiększenie ekspresji jest wymagane. Ta technologia jest na ogół określana jako „endogenna aktywacja genu” (EGA) i jest opisana np. w WO 91/09955.

Będzie zrozumiane przez specjalistę, że jest też możliwe wyłączenie ekspresji IL-18 stosując tę samą technikę, tzn. przez wprowadzenie negatywnego elementu regulacji do locus genu IL-18, w ten sposób obniżając lub zapobiegając ekspresji IL-18. Specjalista zrozumie, że obniżenie ekspresji lub zahamowanie ekspresji IL-18 ma ten sam efekt jak zastosowanie inhibitora IL-18, aby zapobiec i/lub leczyć chorobę.

Wynalazek dalej dotyczy zastosowania komórki, która była genetycznie zmodyfikowana do produkcji inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania uszkodzeniu wątroby, zapaleniu stawów lub zapalnej chorobie okrężnicy.

Niniejszym opisano także kompozycje farmaceutyczne szczególnie użyteczne do zapobiegania i/lub leczenia zapalnego artretyzmu, uszkodzenia wątroby lub zapalnej choroby okrężnicy, które obejmują terapeutycznie skuteczną ilość inhibitora IL-18 i terapeutycznie skuteczną ilość interferonu. Jako inhibitor IL-18 kompozycja może zawierać inhibitory kaspazy-1, przeciwciała przeciwko IL-18, przeciwciała przeciwko dowolnej podjednostce receptora IL-18, inhibitory szlaku sygnalizacji IL-18, antagonistów IL-18, którzy współzawodniczą z IL-18 i blokują receptor IL-18, i białka wiążące IL-18, izoformy, muteiny, białka fuzyjne, pochodne funkcjonalne, aktywne frakcje lub ich kołowo permutowane pochodne mające tę samą aktywność.

IL-18BP i jego izoformy, muteiny, białka fuzyjne, pochodne funkcjonalne, aktywne frakcje lub ich kołowo permutowane pochodne, jak opisano powyżej, są korzystnymi aktywnymi składnikami kompozycji farmaceutycznych.

Interferon zawarty w kompozycji farmaceutycznej jest korzystnie IFN- β.

Opisana niniejszym kompozycja farmaceutyczna zawiera terapeutycznie skuteczne ilości inhibitora IL-18, ewentualnie interferonu i antagonisty TNF. Antagoniści TNF mogą być przeciwciałami neutralizującymi aktywność TNF lub rozpuszczalnymi skróconymi fragmentami receptora TNF, także zwanymi TBPI i TBPII. Kompozycja farmaceutyczna może dalej zawierać jeden lub więcej inhibitorów COX, korzystnie inhibitorów COX-2.

Definicja „farmaceutycznie dopuszczalna” ma na celu objęcie dowolnego nośnika, który nie zakłóca skuteczności aktywności biologicznej składnika czynnego i nie jest toksyczny dla gospodarza, któremu jest podawany. Na przykład, do podawania pozajelitowego, aktywne białko (białka) może być formułowane w formie jednostkowej dawki do wstrzykiwania w nośnikach, takich jak sól fizjologiczna, roztwór dekstrozy, albumina surowicza i roztwór Ringera.

Aktywne składniki kompozycji farmaceutycznej mogą być podawane osobnikowi na różne sposoby. Drogi podawania obejmują drogę śródskórną, przezskórną (np. w preparatach do powolnego uwalniania), domięśniową dootrzewnową, dożylną, podskórną, doustną, dooponową, miejscową i donosową. Dowolna inna terapeutycznie skuteczna droga podawania może być stosowana, na przykład adsorpcja przez tkanki nabłonkowe lub śródbłonkowe lub przez terapię genową, gdzie cząsteczka DNA kodująca składnik czynny jest podawana pacjentowi (np. poprzez wektor), który powoduje, że składnik czynny ulega ekspresji i jest wydzielany in vivo. Dodatkowo białko (białka) mogą być podawane razem z innymi składnikami biologicznie czynnych związków, takich jak farmaceutycznie dopuszczalne związki powierzchniowo czynne, zarobki, nośniki, rozcieńczalniki i podłoża.

Do podania pozajelitowego (np. dożylne, podskórne, domięśniowe) aktywne białko (białka) mogą być formułowane jako roztwór, zawiesina, emulsja lub liofilizowany proszek w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem pozajelitowym (np. woda, sól fizjologiczna, roztwór dekstrozy) i dodatkami, które utrzymują izotoniczność (np. mannitol) lub stabilność chemiczną (np. konserwanty i bufory). Preparat jest sterylizowany przez powszechnie stosowane techniki.

PL 206 549 B1

Biodostępność aktywnego białka (białek) może też być polepszona przez stosowanie procedur koniugacji, które zwiększają okres półtrwania cząsteczki w ciele ludzkim, na przykład przez połączenie cząsteczki z glikolem polietylenowym, jak opisano w zgłoszeniu patentowym PCT WO 92/13095.

Terapeutycznie skuteczne ilości aktywnego białka (białek) będą funkcją wielu zmiennych, w tym typu antagonisty, powinowactwa antagonisty do IL-18, ewentualnej resztkowej cytotoksycznej aktywności wykazywanej przez antagonistów, drogi podania, stanu klinicznego pacjenta (w tym pożądanego utrzymania nietoksycznego poziomu endogennej aktywności IL-18).

„Terapeutycznie skuteczna ilość” jest taka, że gdy jest podana inhibitor IL-18 powoduje zahamowanie biologicznej aktywności IL-18. Podawana osobnikowi dawka, w postaci pojedynczych lub wielokrotnych dawek, będzie się wahała w zależności od szeregu czynników, w tym właściwości farmakokinetycznych inhibitora IL-18, szlaku podania, stanów i cech pacjenta (płeć, wiek, masa ciała, zdrowie, wielkość), stopnia objawów, współistniejących terapii, częstości działania i pożądanego efektu. Dopasowanie i manipulacja ustalonej dawki mieszczą się w zakresie umiejętności specjalisty i mogą być ustalane metodami hamowania IL-18 u osobnika in vitro i in vivo.

Inhibitor IL-18 może być stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała, lub około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała lub około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała lub około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała lub około 1 do 2 mg/kg masy ciała. Dalsze korzystne ilości inhibitorów IL-18 są ilościami około 0,1 do 1000 μg/kg masy ciała, lub około 1 do 100 μg/kg masy ciała lub około 10 do 50 μg/kg masy ciała.

Korzystną drogą podawania leku wytwarzanego zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest podawanie drogą podskórną. Ponadto korzystne jest podanie domięśniowe.

W dalszych korzystnych wykonaniach inhibitor IL-18 jest dostarczany codziennie lub co drugi dzień.

Dawki dzienne są na ogół podawane w podzielonych dawkach lub w postaci preparatu do powolnego uwalniania skutecznych w uzyskiwaniu pożądanych wyników. Drugie lub kolejne podania mogą być przeprowadzone w dawce, która jest taka sama, mniejsza lub większa niż wstępna lub uprzednia dawka podana osobnikowi. Drugie lub kolejne podanie może być podane w czasie lub przed wystąpieniem choroby.

Inhibitor IL-18 może być podany profilaktycznie lub terapeutycznie osobnikowi przed, równocześnie lub kolejno z innymi procedurami lub czynnikami terapeutycznymi (np. w reżimie wielolekowym) w ilości terapeutycznie skutecznej w szczególności z interferonem i/lub antagonistą TNF i/lub inhibitorem COX. Aktywne czynniki, które są podawane równocześnie z innymi czynnikami terapeutycznymi mogą być podawane w tych samych lub różnych kompozycjach.

Niniejszym opisano także sposób przygotowania kompozycji farmaceutycznej obejmujący mieszanie skutecznie hamującej ilości inhibitora IL-18 i/lub interferonu i/lub antagonisty TNF i/lub inhibitora COX z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Po opisaniu wynalazku będzie on łatwiej zrozumiany przez odniesienie do następujących przykładów, które nie mają być ograniczające dla obecnego wynalazku.

PRZYKŁADY

CZĘŚĆ I: Przykłady od 1 do 8, dotyczące zastosowania inhibitorów IL-18 w uszkodzeniu wątroby

P r z y k ł a d 1

Otrzymywanie IL-18BP-znacznik His

Oczyszczone rekombinowane ludzkie IL-18BP zawierające znacznik his (r-hlL-18BP-znacznik His) otrzymano w komórkach CHO. Otrzymywanie rekombinowanych białek w komórkach eukariotycznych jest znane osobom biegłym w tej dziedzinie. Dobrze znane metody umożliwiają konstrukcję stosownych wektorów niosących DNA kodujące IL-18BP i odpowiednich do transfekcji komórek eukariotycznych w celu otrzymania rekombinowanego IL-18BP. W celu ekspresji w komórkach DNA kodujące IL-18BP (zobacz, np. Novick i wsp., 1999) jest wycinane i wstawiane do wektora ekspresyjnego odpowiedniego do transfekcji komórek. Alternatywnie, takie DNA może być przygotowane za pomocą PCR z odpowiednimi sensownymi i antysensownymi starterami. Otrzymane konstrukty cDNA są następnie wstawiane do odpowiednio skonstruowanych eukariotycznych wektorów ekspresyjnych technikami dobrze znanymi w tej dziedzinie (Maniatis, 1982). Rekombinowane białko zostało oczyszczone do czystości 95% i było biologicznie aktywne in vitro i in vivo z wysokim powinowactwem do liganda.

PL 206 549 B1

P r z y k ł a d 2

Ochronny wpływ IL-18BP przeciwko indukowanej endotoksyną śmierci w modelu mysim

Model mysi został użyty w celu przetestowania, czy IL18BP, inhibitor IL-18, uchroni myszy przed wysoką dawką lipopolisacharydów (LPS). LPS wywołuje ostre uszkodzenie wątroby, poprzedzające nagłą śmierć myszy.

mg/kg rekombinowanego ludzkiego IL-18BP (rhIL18BPhis) zawierającego znacznik his (będący wynikiem otrzymywania zrekombinowanego białka) zostało wstrzyknięte dootrzewnowo (i.p.) myszom C57BL/6. 1 godzinę później wstrzyknięto 60 mg/kg LPS (dawki śmiertelne). Przeżywalność myszy została porównane z grupą zwierząt, które otrzymały tylko LPS (bez IL18BP).

Pięć z 7 myszy, którym wstrzyknięto rhIL-18BP-his przeżyły wstrzyknięcie LPS, w przeciwieństwie do myszy z grupy kontrolnej, w której wszystkie zwierzęta zmarły w przeciągu 3 dni.

godzin po wstrzyknięciu LPS w obecności wzrastających dawek rhIL-18BP lub ich braku pobrano próbki krwi i oznaczono w teście ELISA krążący IFN-γ (Fig. 1). 0,4 i 4 mg/kg rhIL-18BP powodowały dwukrotną redukcję IFN-γ w surowicy. To zahamowanie było nieobecne przy niższych dawkach rhIL-18BP (0,004 i 0,04 mg/kg).

P r z y k ł a d 3

IL18BP ma ochronny wpływ wobec uszkodzeniu wątroby w mysim modelu choroby

Do przetestowania efektu IL18BP został użyty mysi model piorunującego zapalenia wątroby. U myszy rozwija się ostre zapalenie wątroby po podaniu następujących po sobie dawek Propionibacterium acnes (P. acnes) i lipopolisacharydu (LPS).

Myszom wstrzykiwano wzrastające dawki rhIL-18BP-his (4; 0,4; 0,04; 0 mg/kg w różnych czasach (1 godz., 20 min., równocześnie) przed wstrzyknięciem LPS myszom C57BL/6 uwrażliwionych na P. acnes. Kiedy rhIL-18BP-his podawano dootrzewnowo w tym samym czasie co LPS, żadna z myszy nie przeżyła i poziomy krążącego IFN-γ oraz TNF-α pozostały niezmienione. Zaskakująco, rhIL-18BP (4 i 0,4 mg/kg) powodował 70% zmniejszenie krążącej aminotransferazy alaninowej (wskaźnik uszkodzenia wątroby), jak widać na Fig. 2.

Ponadto monitorowano przeżywalność myszy (Fig. 3): Kiedy rhIL-18BP podawano dootrzewnowo 20 minut przed LPS, dwie najwyższe dawki IL-18BP (4 i 0,4 mg/kg) opóźniały umieranie myszy o 10 godzin w porównaniu do myszy kontrolnych, które otrzymały NaCl zamiast IL-18BP.

Wyniki pomiarów poziomów IFN-γ w surowicy pokazano na Fig. 4. rhIL-18BP (4 mg/kg) hamował 90% krążącego IFN-γ i 80% krążącej aminotansferazy alaninowej (nie pokazano).

Kiedy rhIL-18BP-his podawany był 1 godz. przed LPS, krzywe przeżywalności i poziomy krążącego IFN-γ były podobne do tych, które były obserwowane kiedy rhlL-18BP-his był podany 20 min. przed LPS, ale poziomy krążącej aminotransferazy alaninowej pozostały niezmienione (nie pokazano).

Ponadto mysia tkanka wątrobowa była analizowana przez barwienie hamatoksyliną-eozyną oraz w mikroskopii tunelowej. W wątrobach myszy, u których wywołany został wcześniej stan ostrego zapalenia wątroby obserwowano martwicę w porównaniu z prawidłową tkanką wątrobową. Tkanka wątrobowa myszy traktowanych IL-18BP wykazywała znacznie mniej ognisk martwiczych niż u myszy nieleczonych.

P r z y k ł a d 4

Przeciwciała anty-IL-18 chronią przed śmiertelną endotoksemią

W celu oceny, czy zablokowanie IL-18 przeciwciałami przeciwko IL-18 ochroni myszy przeciwko śmiertelnym dawkom bakteryjnych polisacharydów, myszom C57BL/6J wstrzyknięto jako pierwsze neutralizujące królicze antymysie przeciwciało przeciwko IL-18 (poliklonalne) lub prawidłową króliczą surowicę (NDS) jako kontrolę. 30 minut po podaniu przeciwciała wstrzyknięto letalną dawkę LPS otrzymanego z E. coli (Fig. 5 A) lub S. typhimurium (Fig. 5 B). Eksperymenty obejmowały 10-12 myszy/grupę i zostały wykonane dwa razy w dwóch różnych przedziałach czasowych.

Jak pokazano na Fig. 5 A, traktowanie myszy surowicą odpornościową anty-IL-18 zapobiegało śmierci indukowanej przez 40 mg/kg LPS z E. coli. Po podaniu anty-IL-18 przeżyło 100% myszy w porównaniu do 10% przeżywalnością myszy traktowanych normalną króliczą surowicą (p<0,005).

Figura 5 B pokazuje, że myszy traktowane przeciwciałami były także chronione przeciwko letalnym wpływom S. typhimurium (50 % w porównaniu z 0%; p<0,05).

PL 206 549 B1

P r z y k ł a d 5

Zablokowanie IL-18 i TNF- α chroni myszy przeciwko toksycznym wpływem ConA i PEA na wątrobę

W celu oceny roli IL-18 i TNF-α w uszkodzeniu wątroby zastosowano dwa eksperymentalne modele toksycznego wpływu na wątrobę. Wstrzykiwanie myszom Konkanawaliny A (Con A) i Pseudomonas aeruginosa (PEA) zarówno indukuje uszkodzenie wątroby i zarazem jest modelem zapalenia wątroby za pośrednictwem komórek T.

Myszy C57BL/6J traktowano wstępnie surowicą odpornościową anty-IL-18 lub rozpuszczalnym receptorem TNF-α TNFsRp55. Jako wskaźniki uszkodzenia wątroby mierzono w surowicy poziomy aminotransferazy alaninowej (ATL) (Fig. 6).

Jak pokazano na Fig. 6 A, zarówno surowica odpornościowa jak i rozpuszczalne receptory TNF znacząco zmniejszały w surowicy poziomy ATL indukowanej przez ConA, w porównaniu z kontrolnym wstrzyknięciem samego nośnika (fizjologicznego roztworu soli wolnego od substancji wyzwalających odczyn gorączkowy). Jednoczesne podanie rozpuszczalnego receptora TNF-α i surowicy odpornościowej anty-IL-18 prowadzi do całkowitego zahamowania uszkodzenia wątroby wywołanego ConA.

Jak pokazano na Fig. 6 B, u myszy, którym wstrzyknięto PEA, neutralizacja inhibitorów TNF-α lub przeciwciał anty-IL-18 powodowała odpowiednio 93% i 83% zahamowania poziomów ALT w surowicy. Jednoczesne zablokowanie obydwu czynników owocowało 99% ochroną.

P r z y k ł a d 6

Poziomy białek wiążących IL-18 w osoczu krwi są podniesione u pacjentów z przewlekłą chorobą wątroby

Poziomy IL-18 w osoczu krwi zmierzono u 133 pacjentów z przewlekłą chorobą wątroby (CLD) o różnych etiologiach i u 31 zdrowych kontroli przy zastosowaniu specyficznego testu ELISA, używając monoklonalnego przeciwciała przeciwko IL-18BP.

Poziomy IL-18 w osoczu krwi były znacząco wyższe u pacjentów z CLD (12,91 ± 0,89 ng/ml; średnia ± błąd standardowy) niż u osób zdrowych (4,96 ± 0,43 ng/ml, p<0,001). Pacjenci z marskością wątroby posiadali znacząco wyższe poziomy niż pacjenci CLD bez marskości wątroby (19,23 ± 1,28 ng/ml, n=67 w porównaniu do 6,49 ± 0,51 ng/ml, n=66, p<0,001). Pacjenci w stadium B klasyfikacji ChildPugh mieli wyższe poziomy IL-18 BP niż ci w stadium A (22,48 ± 2,44 ng/ml, w porównaniu z 9,57 ± 1,25 ng/ml, p<0,001). Jednakże nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy stadium Child B i C (22,48 ± 2,44 ng/ml w porównaniu z 20,62 ± 4,75 ng/ml, p=0,7). Poziomy IL-18 BP w osoczu krwi korelowały dodatnio z GOT, bilirubiną i szybkością sedymentacji erytrocytów. Znaleziono negatywną korelację z czasem protrombinowym.

Podsumowując, wyniki pokazują, że poziomy IL-18 BP w osoczu krwi są podniesione w CLD i korelują z nasileniem choroby niezależnie od jej etiologii. Pomimo istnienia endogennego antagonisty czynnika zapalnego IL-18, podniesione poziomy IL-18 BP wydają się być niewystarczające do przeciwdziałania przeważającym czynnikom prozapalnym w CLD.

P r z y k ł a d 7

Zahamowanie alkoholowego zapalenia wątroby przez IL-18BP

Cztery grupy szczurów (po 5 w każdej grupie) są karmione metodą wlewów dożołądkowych etanolem i dietą zawierającą olej kukurydziany przez 4 tygodnie. U szczurów kontrolnych etanol jest zastąpiony dekstrozą w ilości izokalorycznej. Szczurom raz dziennie jest wstrzykiwany mysi IL-18BP (1 mg/kg) lub roztwór soli fizjologicznej. Na fragmentach wątroby wykonana jest analiza pod kątem patologii oraz wykonywane są pomiary enzymów wątrobowych w osoczu krwi, TNF-α, ligandu Fas i IFN-γ. U szczurów karmionych etanolem, którym wstrzykiwano roztwór soli fizjologicznej obserwuje się uszkodzenie wątroby spowodowane stanem nekrozapalnym oraz ekspresję wątrobowych enzymów, TNF-α, ligandu Fas i IFN-γ.

Szczury, którym wstrzykiwano mysi IL-18BP są chronione przeciwko uszkodzeniu wątroby spowodowanym stanem nekrozapalnym, a poziomy wątrobowych enzymów, TNF-α, ligandu Fas i IFN-γ są znacząco obniżone (>90%).

P r z y k ł a d 8

Zahamowanie przez IL-18BP zapalenia wątroby wywołanego Konkanawaliną A

Myszom Balb/c wstrzykuje się 12 mg/kg Konkanawaliny A (Con A) wraz z lub bez wstrzykiwania mysiego IL-18BP (1 mg/kg) 2 godziny przed podaniem Con A, a następnie codziennie. Zniszczenie wątroby jest określane poprzez oznaczanie enzymów wątrobowych, TNF-α, ligandu Fas i IFN-γ w surowicy. Histopatologia wątroby jest porównywana do myszy traktowanych wyłącznie Konkanawaliną A.

PL 206 549 B1

Leczenie wstępne przy użyciu IL-18BP powoduje znaczące obniżenie poziomów enzymów wątrobowych i TNF-a w surowicy oraz brak dowodów zapalenia w badaniu histopatologicznym w porównaniu z myszami kontrolnymi traktowanymi Con A.

CZĘŚĆ II: Przykłady 9 i 10, dotyczące zastosowania inhibitorów IL-18 w zapaleniu stawów

P r z y k ł a d 9

Otrzymywanie IL-18BP-znacznik His

Do eksperymentu opisanego szczegółowo w Przykładzie 9 poniżej w komórkach CHO wytworzono zrekombinowany ludzki IL-18BP zawierający sześcioaminokwasowy znacznik His (r-hIL-18BP-znacznik His) i oczyszczono w sposób opisany przez Kim i wsp, 2000. Zrekombinowane białko zostało oczyszczone do ponad 95% homogenności i stwierdzono, że jest biologicznie czynne in vitro i in vivo z wysokim powinowactwem do swojego liganda.

Wytwarzanie zrekombinowanych białek w innych eukariotycznych układach w obecności lub przy nieobecności znaczników ułatwiających oczyszczanie zrekombinowanych białek jest znana osobie biegłej w tej dziedzinie. Jest dostępnych wiele dobrze znanych metod służących do konstrukcji odpowiednich wektorów niosących DNA, który koduje IL-18BP i odpowiednich do transfekcji komórek eukariotycznych w celu wytworzenia zrekombinowanego IL-18BP. Do transfekcji komórek DNA kodujące IL-18BP (zobacz, np. Novick i wsp., 1999) jest wycinane z wektora służącego do klonowania i wstawione do wektorów ekspresyjnych odpowiednich do transfekcji komórek.

Alternatywnie, takie DNA może być przygotowane w reakcji PCR z odpowiednimi sensownymi i antysensownymi starterami. Otrzymane konstrukty cDNA są następnie wstawiane do odpowiednio skonstruowanych eukariotycznych wektorów ekspresyjnych z zastosowaniem technik dobrze znanych w tej dziedzinie (Maniatis i wsp., 1982).

P r z y k ł a d 10

Blokowanie endogennego IL-18 w mysim modelu zapalenia stawów Metody

Wywoływanie zapalenia stawów indukowanego kolagenem (CIA)

CIA został wywołany u samców myszy DBA/1 (w wieku 8-12 tygodni) przez immunizację natywnym bydlęcym kolagenem typu II (CII), jak opisano wcześniej (Plater-Zyberk i wsp., 1995). Od 25 dnia po immunizacji CII, myszy badano codziennie w celu stwierdzenia początku choroby.

Traktowanie z zastosowaniem rhIL-18BP-6his

Traktowanie myszy DBA/1 immunizowanych CII zaczęto od chwili pojawienia się pierwszych oznak choroby. Do neutralizacji endogennego IL-18 u myszy traktowanych kolagenem użyto zrekombinowanego ludzkiego IL-18BP zawierającego znacznik złożony z 6 histydyn (rh-IL-18BPa 6his). rh-IL-18BP-6his wstrzykiwano dootrzewnowo (i.p.) codziennie przez 7 dni w 5 różnych stężeniach 10, 3, 1, 0,5, 0,25 mg/kg/wstrzyknięcie. Myszy kontrolne otrzymywały sam nośnik (0,9% NaCl).

Ocena postępu choroby

Ocena objawów klinicznych (kliniczna ocena podana w punktach)

Od chwili pojawienia się pierwszych klinicznych objawów myszy były badane każdego dnia przez badacza niewtajemniczonego w rodzaj leczenia. Dla każdej kończyny oceniano stopień nasilenia choroby (0-3,5 punktów, maks. punktów = 14/mysz). Postęp obrzęku (zapalenia) mierzono używając suwmiarek (Protect 2T, Kroeplin Langenmesstechnik) na tych kończynach, które jako pierwsze wykazywały oznaki choroby.

Postęp choroby oceniano codziennie przez 8 dni od pierwszych objawów, po których myszy były uśmiercane, a kończyny były poddawane badaniu histopatologicznemu.

Histologiczna ocena ubytków chrząstki i mikroskopijnego zapalenia

Na zakończenie eksperymentów, tj. ósmego dnia od pojawienia się objawów choroby myszy były uśmiercane i kończyna, która jako pierwsza wykazała oznaki choroby była odcinana. Stawy były utrwalane, poddane odwapnieniu i zatapiane w parafinie. Ze stawów wykonywano standardowe skrawki (5 do 7 μm) i wybarwiano hematoksyliną/eozyną/ Safraniną O. Każdy staw był oceniany przez dwóch badaczy niewtajemniczonych w protokół leczenia (brak zniszczenia chrząstki lub kości = 0; ograniczone erozje chrząstki = 1-2; bardziej rozległe erozje = 3; ogólne uszkodzenie chrząstki i obecność erozji kości = 4). Końcowa punktacja każdej myszy była średnią wyników uzyskanych dla wszystkich przebadanych stawów. Mikroskopowe zapalenie lub zapalenie błony maziowej było oceniane w skali od 0 do 4 w następujący sposób: brak zapalenia = 0; lekkie pogrubienie warstwy wyściółkowej i/lub nieliczne naciekające komórki w warstwie podwyściółkowej = 1-2; zgrubienie warstwy wyściółkowej i/lub bardziej zaznaczony napływ komórek warstwy podwyściółkowej = 3; obecność komórek w przestrzeni maziowej i błona maziowa z silnymi naciekami i licznymi komórkami zapalnymi = 4.

PL 206 549 B1

Oznaczanie przeciwciał antykolagenowych

Przeciwciała przeciwko bydlęcemu kolagenowi typu II badano stosując enzymatyczny test immunosorbcyjny (ELISA). Mierzono miana IgG1 i IgG2a. W skrócie, płytki zostały pokryte 10 μg bydlęcego kolagenu, a pozostałe niespecyficzne miejsca wiązania zostały zablokowane 0,1 M etanoloaminą (Sigma). Dodano kolejne rozcieńczenia surowic 1:2 i następnie inkubowano z izotypowo specyficzną kozią antymysią peroksydazą (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA) i substratem (kwasem 5-aminosalicylowym, Sigma). Płytki sczytywano przy 492 nm. Miana podawano jako średnie ± odchylenie standardowe rozcieńczenia, które daje połowę wartości maksymalnej.

Oznaczenia IL-6

Poziomy IL-6 oznaczano handlowym testem ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). Aktywność biologiczną IL-6 określano testując stymulację podziałów komórek z użyciem komórek B9. W skrócie, okrągłodenne płytki do mikromiareczkowania opłaszczono po 5 x 10³ komórek B9 na studzienkę w 200 μl pożywki 5% FCS-RPMI 1640 i inkubowano przez 3 dni stosując rekombinowana IL-6 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) jako standard. Na koniec inkubacji dodano 0,5 mCi³[H]tymidyny (NEN-Dupont, Boston, MA, USA) na studzienkę. Trzy godziny później komórki zebrano i oznaczono ilość włączonej tymidyny. Granica detekcji w oznaczaniu IL-6 wynosiła 1 pg/ml.

Analiza statystyczna

Istotność różnić obliczono testem Manna Whitney'a używając programu do analizy statystycznej SigmaStat i programu GraphPad Prism.

Wyniki

Do oceny efektywności IL-18BP jako czynnika w leczeniu zapalenia stawów użyto mysiego modelu doświadczalnego, CIA (zapalenie stawów wywołane kolagenem). Podawanie kolagenu i niepełnego adiuwanta Freunda myszom DBA/1 powoduje rozwój erozyjnej postaci stanu zapalnego stawów i stanowi idealną sposobność do badania terapeutycznych możliwości IL-18BP. Jak dotychczas neutralizowano endogenny IL-18 przy użyciu IL-18BP i oceniano różne patogenne parametry.

Przebadano wpływ różnych dawek. Trzy grupy myszy DBA/1 z zapaleniem stawów wywołanym kolagenem leczono terapeutycznie (tj. po pojawieniu się objawów choroby) pięcioma różnymi dawkami IL-18BP podawanego i.p. (dootrzewnowo). IL-18BP w stężeniach 10, 3, 1, 0,5 lub 0,25 mg/kg podawano w chwili pojawienia się pierwszych klinicznych objawów choroby. Jako kontrolę zastosowano wstrzykiwanie roztworu soli fizjologicznej (chlorek sodu, NaCl). Ponadto, aby ocenić efekt IFN w tym doświadczalnym modelu zapalenia stawów podano dootrzewnowo 10000 IU interferonuP (IFN-β). Wpływ na natężenie choroby monitorowano oceniając wizualnie każdą kończynę z osobna w sposób opisany powyżej. Myszy były uśmiercane po 8 dniach od chwili pojawienia się pierwszych objawów.

Mierzono następujące wartości:

- punkty obserwacji klinicznej (0-3,5 na kończynę) (Fig. 7 A i B)

- puchnięcie/obrzęk stawów (w mm, suwmiarkami) pierwszej kończyny z objawami choroby, pod warunkiem, że była to kończyna tylna (Fig. 8)

- liczbę kończyn objętych chorobą (Fig. 9)

- punkty erozji pierwszej kończyny objętej chorobą (0-4 punkty uszkodzenia chrząstki, Fig. 10).

- Analiza histopatologiczna kończyny, u której jako pierwszej rozwinęło się zapalenie stawów (Fig. 11)

- Poziomy przeciwciał przeciwko kolagenowi typu II (Fig. 12)

- Poziomy IL-6 (Fig. 13).

Nasilenie objawów klinicznych choroby

Jak pokazano na Fig. 7 A i B, natężenie objawów klinicznych choroby było istotnie zmniejszone w grupach leczonych rhIL-18BP w ilości 1 mg/ml (P<0,01 i 0,5 mg/ml (0,01<P<0,05). Myszy otrzymujące mniejszą dawkę rhIL-18BP (0,25 mg/kg) lub wysoką dawkę 10 mg/kg miały wyniki badań klinicznych podobne do grupy placebo. Dawka 1 mg/kg IL-18BP była w przybliżeniu tak efektywna jak interferon β (nazwany IFNb na Fig. 7 A).

Zapalenie stawów i puchnięcie kończyn (obrzęk)

Zapalenie makroskopowe (puchnięcie) badano poprzez pomiar obrzęku kończyny od pierwszego dnia pojawienia się objawów choroby do dnia ósmego, kończącego doświadczenie. Wyniki pokazane sana Fig. 8 A i B. Efektywnymi dawkami IL-18BP były 1, 3 i 10 mg/kg. Podawanie mniejszych dawek nie wywierało korzystnego wpływu na puchnięcie kończyn. Jak pokazano na Fig. 8 A i B, interferon-β (IFNb) w stężeniu 10000 IU wywierał korzystny efekt na puchnięcie kończyn.

PL 206 549 B1

Mikroskopowe zapalenie błony maziowej badano na końcu doświadczenia na skrawkach histopatologicznych i podawano w punktach („ocena punktowa zapalenia błony maziowej”). Wyniki zapalenia (puchnięcia) i stopień zapalenia błony maziowej są zebrane w Tabeli 1. Podczas, gdy leczenie rhIL-18BP w dawkach 1 i 3 mg/kg wykazywało tendencję do zmniejszenia puchnięcia, to leczenie dowolną dawką IL-18BP miało tylko ograniczony wpływ na nasilenie stanu zapalnego błony maziowej (Tabela 1).

T a b e l a 1: Wpływ leczenia IL-18BP na zapalenie stawów

Leczenie	Puchnięcie (AUC, średnia ± błąd standardowy)	Punktowanie zapalenia błony maziowej (średnia ± błąd standardowy)
RhIL-18BP-6his 3 mg/kg	1,55 ± 0,64	2,17 ± 0,5
1 mg/kg	1,53 ± 0,60	1,98 ± 0,4
0,5 mg/kg	3,38 ± 0,70	1,92 ± 0,5
0,25 mg/kg	3,06 ± 0,90	2,08 ± 0,5
Placebo	3,11 ± 0,77	2,23 ± 0,3

Figura 9 pokazuje, że po podaniu IL-18BP liczba kończyn objętych chorobą zmniejszyła się. W szczególności, liczbę kończyn objętych chorobą redukowały lecznicze wstrzyknięcia IL-18BP w dawkach 1 i 0,5 mg/kg, pokazując, że zablokowanie IL-18 in vivo powstrzymuje rozprzestrzenianie się zapalenia na kolejne stawy. Leczenie 1 i 0,5 mg/kg IL-18BP może także spowodować powrót niektórych stawów objętych zapaleniem do stanu normalnego.

Ochrona przed zniszczeniem stawów

Leczenie myszy przy użyciu IL-18BP skutkuje ochroną stawów przez zniszczeniem (Fig. 10). Półilościowy system punktacji pokazuje, erozja kości wykazywała zależny od dawki efekt ochronny, który był istotny przy dawkach 10 i 3 mg/kg (P<0,05, Fig. 10). Myszy otrzymujące 1 mg/kg rhIL-18BP wykazywały mniejszą erozję kości niż myszy otrzymujące tylko nośnik. Przy dawkach 0,5 i 0,25 mg/kg nie obserwowano żadnej ochrony. Interesująco, wpływ IL-18BP na ochronę stawów przy dawkach 3 i 10 mg/kg był porównywalny lub nawet bardziej zaznaczony niż korzystny wpływ 10000 IU interferonu β (IFN-β).

Figura 11 pokazuje histologię zdrowego (A) i objętego chorobą (B) stawu w porównaniu ze stawem pobranym od zwierzęcia leczonego IL-18BP (C). Skrawki pobrano na końcu eksperymentu z kończyny, w której jako pierwszej rozwinęło się zapalenie stawów.

Staw myszy z zapaleniem stawów wykazywał stan silnego destrukcyjnego zapalenia z ubytkami i erozjami chrząstki oraz licznymi komórkami naciekającymi błonę maziową będącą w stanie zapalnym. W stawie myszy leczonej rhIL-18BP chrząstka wyglądała prawie normalnie pomimo obecności komórek zapalnych w przestrzeni maziowej. Obserwowano nie tylko większą ilość chrząstki, ale miała ona również bardziej gładki wygląd.

Traktowanie IL-18 wpływa na poziomy przeciwciał przeciw kolagenowi typu II

Myszy CIA miały podniesione poziomy IgG1 i IgG2a w krążeniu. Przeciwciała izotypu IgG1 są związane z chorobami z udziałem TH2, podczas gdy przeciwciała izotypu IgG2a i IgG2b są związane z chorobami z udziałem TH1. Zapalenie stawów jest zazwyczaj klasyfikowane jako choroba z udziałem TH1.

Izotypy przeciwciał IgG1 i IgG2a przeciwko kolagenowi typu II (CII) zostały oznaczone w surowicy zwierząt leczonych IL-18BP (Fig. 12). W skutek leczenia IL-18BP poziomy izotypów IgG: IgG1 i IgG2a anty-CII nie były znacząco zmienione w dniu 4 lub 8 (D4, D8) choroby klinicznej. Jednakże obserwowano odpowiednio 2,6- i 3,4-krotne zmniejszenie stosunków IgG1/IgG2a specyficznych dla kolagenu po 8 dniach leczenia z zastosowaniem rhIL-18BP w dawkach 1 i 3 mg/kg. Fig. 12 pokazuje doświadczenie, w których zastosowano dawkę 3 mg/kg IL-18BP. Stosując dawkę 1 mg/kg zasadniczo uzyskano te same rezultaty. Zmniejszony stosunek IgG1/IgG2a przeciwciał anty-CII wskazuje na zmniejszone stężenie przeciwciał izotypu IgG2a przeciwko kolagenowi typu II i podniesione stężenie przeciwciał izotypu IgG1 przeciwko kolagenowi typu II, sugerując, że w tym modelu zapalenia stawów nastąpiła zmiana choroby w kierunku udziału TH2.

Zmniejszenie poziomów IL-6 po neutralizacji IL-18

Aby uzyskać obraz efektów zablokowania IL-18 mierzono poziom IL-6 w surowicy krwi zwierząt leczonych IL-18BP. Fig. 13 pokazuje, że poziomy IL-6 aktywnej biologicznie były znacząco zmniejszone u zwierząt, na których zastosowano leczenie z użyciem IL-18BP dla wszystkich badanych

PL 206 549 B1 dawek, tj. 1, 3 i 10 mg/kg, tak samo jak, przy stosowaniu Interferonu-β (IFNb). Aktywne immunologicznie poziomy IL-6 mierzone w surowicy zwierząt leczonych 3 mg/kg rhIL-18BP były znacząco zmniejszone (P < 0,0023) w porównaniu z zwierzętami, którym podawano roztwór soli fizjologicznej. Poziomy IL-6 w surowicy chorych zwierząt leczonych 1, 3, lub 10 mg/kg IL-18BP lub 10000 IU IFN-b były podobne do poziomów w prawidłowej surowicy mysiej (NMS) pobranej ze zdrowych zwierząt, tj. z tych zwierząt, które nie miały choroby zapalnej.

Te obserwacje pokazują, że IL-18 kontroluje poziomy IL-6 podczas pojawiania się choroby. Ponieważ IL-18 jest wskaźnikiem zapalenia te obserwacje pokazują że leczenie chorej myszy przy użyciu IL-18BP zmniejsza u zwierzęcia stan zapalny.

Z doświadczeń wyszczególnionych powyżej można wyciągnąć następujące wnioski:

- Podawanie IL-18BP zmniejsza nasilenie objawów klinicznych zapalenia stawów

- IL-18BP hamuje dalszy postęp lub rozprzestrzenianie się choroby

- Podawanie IL-18BP zmniejsza obrzęk

- Podawanie IL-18BP zmniejsza zniszczenie chrząstki

- Po terapii z użyciem IL-18BP poziomy IL-6 w surowicy są obniżone stosunki IgG1/IgG2a antyCII zmniejszone.

Dane przedstawione powyżej wskazują, że neutralizacja aktywności biologicznej IL-18 po pojawieniu się objawów choroby reprezentuje antyreumatyczną terapię modyfikującą przebieg choroby. Wyniki jasno pokazują, że zablokowanie IL-18 zmniejsza postęp objawów klinicznych zapalenia stawów i, co bardziej ważne hamuje progresję niszczenia chrząstki oraz kości. Zablokowanie IL18 przy użyciu IL-18BP, przeciwciała anty-IL-18 lub przez inny czynnik blokujący IL-18 reprezentuje zatem nową antyreumatyczną terapię modyfikującą przebieg choroby.

Powyższy opis specyficznych zastosowań ujawnia ogólną naturę wynalazku tak więc inni mogą, przy zastosowaniu obecnej wiedzy, łatwo zmodyfikować i/lub zaadoptować te specyficzne zastosowania do różnych celów bez odejścia od ogólnego pomysłu, a zatem takie adaptacje i modyfikacje powinny i zawierają się w treści i szeregu zastosowań równoważnych do ujawnionych zastosowań. Zrozumiałe jest, że frazeologia lub terminologia jest tutaj zastosowana w celu opisu a nie ograniczenia zastosowań wynalazku.

Część III: Przykłady 11 i 12 dotyczące choroby zapalnej jelit (IBD)

P r z y k ł a d 11

Ekspresja IL-18BP przez komórki śródbłonka i makrofagi podczas aktywnej postaci choroby Crohna

Zbieranie próbek tkanek

Biopsje śluzówki jelita wyizolowano z fragmentów tkanek pobranych chirurgicznie od pacjentów z CD lub UC. Badaniem objęto czternastu pacjentów z CD (trzech mężczyzn i jedenaście kobiet) w wieku średnio 37,8 lat (zakres 20-78 lat) i z czasem trwania choroby 8,3 lat (zakres 1-21 lat). U ośmiu pacjentów choroba była zlokalizowana w jelicie krętym, a u sześciu w okrężnicy. Dwunastu pacjentów zażywało leki immunosupresyjne. Diagnoza aktywnej postaci CD była dokonana na podstawie badania histopatologicznego i opierała się na następujących kryteriach: obecność owrzodzeń, zwiększona liczba komórek zapalnych i zapalenie przezścienne. Zidentyfikowano siedmiu pacjentów z aktywną postacią CD i siedmiu pacjentów z nieaktywną postacią CD. Nie zaobserwowano żadnych istotnych różnic w wieku, lokalizacji choroby, płci, leczeniu i czasie trwania choroby pomiędzy pacjentami z aktywną i nieaktywną postacią CD. Średni wiek pięciu pacjentów z UC (trzech mężczyzn i dwie kobiety) wynosił 37,6 lat (w zakresie 30-44 lat). U wszystkich pacjentów choroba była zlokalizowana w okrężnicy i wszyscy byli poddani terapii immunosupresyjnej. Średni czas trwania choroby wynosił 4 lata (w zakresie 1-9 lat). Próbki kontrolne uzyskano od 5 pacjentów (trzech mężczyzn i dwóch kobiet) podczas interwencji chirurgicznej z powodu chorób niezwiązanych ze stanem zapalnym jelit. Średni wiek w tej grupie wynosił 55,2 lat (w zakresie 24-76 lat). U wszystkich pacjentów choroba była zlokalizowana w okrężnicy.

Półilościowy RT-PCR dla ludzkiej IL-18 i IL-18bp

Z zamrożonych biopsji jelita pacjentów z CD, z UC lub pacjentów kontrolnych wyizolowano totalne RNA. Ekstrakcja RNA została wykonana przy użyciu Trizolu (Gibco) według wskazówek producenta. Ilości uzyskanych próbek oceniono poprzez pomiar absorbancji przy 260 nm. Jakość RNA oszacowano przez elektroforezę w 1% żelach agarozowych. cDNA zsyntetyzowano z 1 μg całkowitego RNA przy użyciu układu do odwrotnej transkrypcji firmy Promega według protokołu producenta. Reakcję PCR wykonano w całkowitej objętości 50 μl w obecności 1 U Polimerazy DNA AmpliTaq

PL 206 549 B1 (Perkin Elmer, Roche, U.S.A), 2,5 mM dNTPów (Amersham, USA) i 50 pmoli lewych i prawych starterów PCR. Reakcje przeprowadzano w Termicznym Cyklerze PTC-200 Peltier Effect (MJ Research, USA) w następujących warunkach: denaturacja 1 min w 94°C, przyłączanie starterów przez 1 min w 55°C i wydłużanie przez 1 min w 72°C.

Wyznaczono optymalną liczbę cykli dla IL-18BP, IL-18, i β-aktyny przed nasyceniem prążków (odpowiednio 31, 28 i 25). Startery PCR zaprojektowano na podstawie opublikowanych sekwencji (AF110799, D49950, X00351) w następujący sposób: IL-18, prawy 5'-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3'; lewy 5'-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3'; IL-18BP, lewy 5'-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3'; prawy 5'-GC ACGAAG ATAGG AAGTCTG-3'; β-aktyna, prawy 5'-GGAGGAGC AATGATCTTGATCTTC-3'; lewy 5'-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3'. Aby wykluczyć namnażanie genomowego DNA zanieczyszczającego próbki reakcje PCR wykonano przy braku matrycy cDNA. Produkty PCR (10 μΓ> analizowano w 1% żelach agarozowych prowadząc elektroforezę w buforze TAE 1x. Wielkość produktów PCR została zweryfikowana przez porównanie ze standardem wielkości 1Kb (Gibco) po wybarwieniu żeli. Względną ocenę ilościową prążków barwionych bromkiem etydyny wykonano w świetle UV przy użyciu programu analitycznego Kodak Digital Sciences i przedstawiono jako stosunek docelowego genu (ML-18BP, hIL-18) do genu o stałym poziomie ekspresji (he-aktyny).

Wytwarzanie monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko hIL-18BP

Myszom BALB/c wstrzyknięto do czterech kończyn podskórnie jak również do szyi 50 mg izoformy rhIL-18BP (oczyszczonego z komórek jajnika chomika chińskiego, Interpharm Laboratories, Nes Zioną, Izrael) w PBS z adiuwantem (Emulsja MPL + TDM, RIBI, Immunochem Research, Inc.). w dniach 0, 7 i 28. Cztery dni po trzeciej immunizacji wyizolowano więzły chłonne i strawiono 2,4 μg/ml kolagenazy (kolagenaza IV, Worthington Biochemical Corp.) i 0,1% Dnazy (Sigma). Wyizolowane komórki zfuzjowano z komórkami szpiczaka Sp2/0 używając PEG 1000 (FLUKA). Komórki zawieszono w DMEM-F12, 10% FCS (Gibco) w obecności HAT (hypoksantyna, aminopteryna, tymidina) i wysiano na 96 studzienkowych płytkach w stężeniu 5 x 10⁴ komórek/ml. Próbki supernatantu z hodowli hybrydomy przeszukano pod kątem obecności reaktywnych przeciwciał metodą bezpośredniego przeszukiwania. W tym celu płytki do testu ELISA pokryto kozimi przeciwciałami antymysimy F(ab')2 (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Szwajcaria), dodano supernatanty hodowli hybrydomy, po czym dodano biotynylowane rhIL-18BP-6his (oczyszczone z komórek COS jak opisano (Novick, i wsp. 1999)), z lub bez rhIL-18 (oczyszczonej z rekombinowanej E. coli, Serono Pharmaceutical Research Institute, Geneva) i na końcu streptoawidynę-peroksydazę chrzanową (HRP) (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Szwajcaria) uwidocznioną z użyciem o-fenylenodiaminy (OPD) (Sigma). Wyselekcjonowano i subklonowano przeciwciała nieneutralizujące. W tej pracy użyto mysich przeciwciał monoklonalnych IgG1 95-H20.

Badania immunohistochemiczne mające na celu lokalizację komórek dodatnich względem IL-18BP

Fragmenty tkanek szybko zamrożono i przechowywano w -80°C. Uzyskano kolejne krioskrawki (10 μm), umieszczono na szklanych szkiełkach (Polylabo, Plan-les-Ouates, Szwajcaria) pokrytych poli-L-lizyną i utrwalono acetonem schłodzonym w lodzie. Lokalizację ludzkiego białka IL-18BP analizowano immunohistohemicznie używając Mab 95-H20. Po krótkim ponownym uwodnieniu w PBS, skrawki inkubowano wstępnie przez 30 min w PBS uzupełnionym o 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) (Cansera, Ontario, Kanada), 1% surowicy ludzkiej (surowica AB⁺, Transfusion Center, Annemasse, Francja) i 0,5% albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) (Sigma, St. Luis, MO, U.S.A). Aktywność endogennej peroksydazy zablokowano przez umieszczenie szkiełek w roztworze PBS, 2% FCS, 1% surowicy ludzkiej, 0,5% BSA i 1% nadtlenku wodoru (H2O2) (Fluka, Szwajcaria) na 1 godzinę. Po przepłukaniu w PBS skrawki inkubowano przez noc w nierozcieńczonym supernatancie hodowli Mab 95-H20. Po ponownym płukaniu w PBS skrawki inkubowano przez 1 godzinę z biotynylowanym kozim przeciwciałem antymysim (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Szwajcaria) (5 μg/ml) w PBS zawierającym 0,5% BSA. Czułość barwienia zwiększano przez inkubację z kompleksem awidynoDH/biotynylowana HRP (Vectastain Elitę ABC Kit, Vector Laboratories, CA, U.S.A) przez 30 minut. Szkiełka następnie płukano w PBS i wywoływano przy użyciu roztworu 30% H2O2, 3,3-amino-9-etylokarbazolu (AEC) (Sigma), N,N-dimetyloformamidu (Merck) w buforze octanowym, pH 5. Po wybarwieniu negatywowym z użyciem hematoksyliny (Sigma) skrawki pokryto glicerolem i nałożono szkiełka nakrywkowe. Jako kontrolę izotypową użyto mysie przeciwciało IgG1 (R i D system).

W celu identyfikacji komórkowej lokalizacji ludzkiego IL-18BP, wykonano dwukolorowe badanie immunohistochemiczne na skrawkach śluzówki jelita. Po 10 minutach ponownego uwodnienia w PBS

PL 206 549 B1 skrawki inkubowano wstępnie przez 30 minut w PBS uzupełnionym o 2% FCS, 1% ludzkiej surowicy i 0,5% BSA. W celu kolokalizacji z komórkami śródbłonka skrawki inkubowano przez noc z biotynylowanym Mab 95-H20 (20 μg/ml) zmieszanym z mysim antyludzkim CD31 sprzężonym z FITC (1:50) (Pharmingen, CA, U.S.A) w PBS/0,5% BSA. W celu kolokalizacji z makrofagami skrawki inkubowano przez noc z biotynylowanym Mab 95-H20 (20 μg/ml) zmieszanym z antyludzkim CD68 sprzężonym z FITC (1:25) (Dako, Dania). Po przepłukaniu w PBS dodano na 1 godzinę streptawidynę-Czerwień Teksasu (Southern Biotechnology Associates, AL, U.S.A). Szkiełka ponownie płukano i skrawki pokryto moviolem i nałożono szkiełka nakrywkowe. Jako kontrolę izotypu zastosowano biotynylowane mysie przeciwciało IgG1 (Pharmingen) i następnie streptawidynę-Czerwień Teksasu.

Hodowla komórkowa

Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) (Clonetics Corp., San Diego, CA) hodowano z zastosowaniem Pożywki Wzrostowej Komórek Śródbłonka (EGM) uzupełnionej ludzkim rekombinowanym naskórkowym czynnikiem wzrostowym (hEGF) (10 ng/ml), hydrokortyzonem (1 μg/ml), gentamycyną i amfoterycyną B (50 μg/ml), ekstraktem mózgu bydlęcego (BBE) (3 mg/ml) i 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Clonetics Corp., San Diego, CA) według wskazówek producenta. Szalki do hodowli tkankowych zostały wstępnie pokryte ludzką fibronektyną (10 μg/cm) (Boehringer, Mannheim). Komórki inkubowano w nawilżanym inkubatorze w atmosferze 5% CO2 a eksperymenty wykonywano używając HUVECs przy 3 pasażu. HUVEC traktowano przez 24 godzin ludzką IL-1 p (10 ng/ml), TNFa (10 ng/ml) i IFNy (20 ng/ml) (R i D system, Niemcy). Na koniec okresu hodowli komórki zbierano, izolowano RNA i użyto do analizy transkrypcji mRNA IL-18BP i IL-18 przy użyciu RT-PCR. Supernatanty zbierano i analizowano testem ELISA pod kątem ekspresji białek IL-18BP i IL-18.

Ludzka linia komórkowa monocytów THP-1 była prowadzona w hodowli w zawiesinie w pożywce RPMI uzupełnionej o 10% inaktywowanej przez podgrzanie FCS, L-glutaminę (2 mM), penicylinęstreptomycynę (10 U/ml) (Gibco BRL, Life Technologies) i β-merkaptoetanol (50 μM) (Fluka). Komórki inkubowano w nawilżanym inkubatorze w atmosferze 5% CO2 i pasażowano 1:10 co każde 5 dni. Trzy dni przed eksperymentem, ludzkie komórki monocytów różnicowano przy gęstości 0,4 x 10⁶ komórek/ml witaminą D3 (80 nM) (Biomol Research Laboratories, USA) i pozostawiono do adhezji. Po zróżnicowaniu do hodowli komórkowych dodano LPS (100 ng/ml) (Calbiochem), ludzką IL-1e (10 ng/ml), TNFa (10 ng/ml) i IFNy (20 ng/ml). Po 48 godzinach zbierano supernatanty i analizowano testem ELISA pod kątem ekspresji białek IL-18BPUL-18.

Pomiar wytwarzania ludzkiego IL-18BP i IL-18

Obecność IL-18BP oznaczono testem ELISA w supernatantach pozbawionych komórek z HUVECs, niestymulowanych i stymulowanych przez 24 godziny koktajlem cytokin (IL-1 β, TNFa, IFNy), jak również z linii komórkowej THP-1, niestymulowanej i stymulowanej przez 48 godzin (LPS, IL-1e, TNFa, IFNy). W tym celu szalki pokryto przez noc wychwytującymi przeciwciałami Mab (klon 657.27 w ilości 0,5 μg / 100 ml/ studzienkę, Interpharm Laboratories, Nes Zioną, Izrael) skierowanych przeciwko rhlL-18BP (izoforma a). Rozpuszczalne ML-18BP następnie wykryto przy użyciu przeciwciał poliklonalnych z królika (rozcieńczonych w stosunku 1/10000) skierowanych przeciwko rhIL-18BP-6his (oczyszczonego z komórek jajnika chomika chińskiego, Interpharm Laboratories, Nes Zioną, Izrael), po czym inkubowano z kozimi antykróliczymi IgG oczyszczonymi przez chromatografię powinowadztwa sprzężonymi z peroksydazą (rozcieńczonymi w stosunku 1:20000) (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Szwajcaria). Wychwytujące przeciwciała Mab, podobnie jak królicze przeciwciała poliklonalne testowano przy użyciu techniki Western Biot w celu potwierdzenia specyficzności do IL-18BP. Jako standard użyto rekombinowane hIL-18BP-6his. Czułość testu ELISA wynosiła 10 pg/ml. Równolegle, zmierzono poziomy IL-18 przy użyciu zestawu do testu ELISA ludzkiej IL-18 (MBL, Immunotech). Czułość testu ELISA wynosiła 12,5 pg/ml.

Ekspresja hIL-18BPa-6His i komórkach CHO.

Rekombinowane ludzkie IL-18BP (hIL-18BPa znacznik His6) oczyszczono z komórek jajnika chomika chińskiego (Interpharm Laboratories, Nes Zioną, Izrael).

Wyniki

Ekspresja transkryptów mRNA IL-18BP w biopsjach jelita

Analizę ekspresji mRNA IL-18BP przeprowadzono przy użyciu techniki RT-PCR na homogenatach tkankowych z fragmentów okrężnicy otrzymanych chirurgicznie od pacjentów zarówno z aktywną postacią CD, jak i nieaktywną postacią CD lub UC i tkanek jelitowych nie wykazujących zmian zapalnych (Fig. 14). Transkrypty IL-18BP i aktyny wykryto we wszystkich badanych homogenatach jelitowych.

PL 206 549 B1

Podobnie transkrypty dla IL-18 znaleziono we wszystkich homogenatach tkankowych zarówno z CD, UC lub kontroli nie-IBD (Fig. 14 A). Stosunek IL-18BP lub IL-18 do kontrolnych poziomów mRNA aktyny wykazywał istotny statystycznie wzrost (jak opisano poniżej) w ilości transkryptów zarówno IL-18BP jak i IL-18 w biopsjach uzyskanych od pacjentów z aktywną postacią CD w porównaniu do biopsji pacjentów z nieaktywną postacią CD, UC i kontrolami nie-IBD (Fig. B i C). Te dane pokazują, że ekspresja IL-18BP jest zwiększona w tkance śluzówki podczas aktywnej postaci CD i dostarczają pierwszy dowód, że poziom ekspresji IL-18BP jasno różnicuje aktywną postać CD od nieaktywnej postaci CD, UC i kontroli nie-IBD.

Analiza statystyczna ekspresji transkryptów mRNA IL-18BP w biopsjach jelit

Analizę wariancji przeprowadzono łącząc razem wszystkie dostępne dane. Wynik jasno wskazywał statystycznie różniący się od pozostałych wynik dla jednego z pacjentów należącego do grupy z aktywną postacią CD (bardzo duża wartość przeciętnego odchylenia od średniej dla IL 18, mianowicie 16252, i bardzo mała wartość przeciętnego odchylenia od średniej dla IL-18BP, mianowicie 1058.). Ta pojedyncza i bardzo nietypowa para pomiarów nie pozwalała na zastosowanie modelu ANOVA (wartość p testu Shapiro-Wilk'a dla sprawdzenia rozkładu normalnego odchyleń od średniej <0,0001). Tak więc zdecydowano się odrzucić tę parę pomiarów podczas analizy statystycznej.

Zastosowany model ANOVA brał pod uwagę czynniki: Grupa (Kontrola, Aktywna postać CD, Nieaktywna postać CD i UC), Białko (IL-18 lub IL-18BP) i Liczba pacjentów (23 pacjentów). Stwierdzono istnienie statystycznej różnicy pomiędzy grupami (wartość p <0,0001). Warto zauważyć, że różnica przeciętnego odchylenia pomiędzy IL-18 i IL-18BP nie jest znacząca (wartość p = 0,369). Ponadto, obliczono także korelację pomiędzy ekspresją IL-18 i IL-18BP. Współczynnik korelacji pomiędzy IL-18 i IL-18BP jest równy 0,67, co sugeruje silny związek pomiędzy przeciętnymi odchyleniami mierzonymi dla IL-18 i IL-18BP. Podążając za wynikami uzyskanymi z analizy wpływu rodzaju Grupy, zastosowano metodę Scheffe do porównania różnych grup pomiędzy sobą. Wywnioskowano, że przeciętne odchylenie od średniej dla Aktywnej postaci CD jest znacząco wyższe niż dla Kontroli (+3280), UC (+2590) i szczególnie dla Nieaktywnej postaci CD (+4580) zarówno w przypadku ekspresji IL-18BP jak i IL-18.

Immunohistochemiczna lokalizacja IL-18BP w tkankach jelita

W celu oszacowania komórkowej ekspresji IL-18BP in situ, na krioskrawkach z tkanek jelitowych uzyskanych od pacjentów z aktywną postacią CD i kontroli nie-IBD wykonano analizę immunohistochemiczna używając specyficznych przeciwciał monoklonalnych anty-hIL-18BP. Komórki IL-18BPdodatnie wykryto w blaszce właściwej, warstwie podśluzówkowej i warstwie mięśniowej (niepokazane). Dodatnio wybarwione komórki jednojądrzaste obecne wewnątrz blaszki właściwej i warstwy podśluzówkowej posiadały dużą ilość cytoplazmy, jądro z pęcherzykami podobnymi do siatki i były morfologicznie zgodne z tkankowymi makrofagami. W warstwie mięśniowej, dodatnio wybarwione komórki posiadały dużą ilość cytoplazmy, czasami z otwartą przestrzenią pośrodku sugerując dodatnie barwienie mikropęcherzyków i były morfologicznie zgodne z komórkami śródbłonka. Duże naczynia były także specyficznie wybarwione przez monoklonalne przeciwciała anty-IL-18BP. Znaczący wzrost dodatnio wybarwionych komórek obserwowanych w biopsjach uzyskanych od pacjentów z aktywną postacią CD w porównaniu z biopsjami uzyskanymi od kontroli nie-IBD korelował z podniesioną ekspresją IL-18BP obserwowaną w analizie RT-PCR. Sąsiednie skrawki inkubowano z odpowiednimi kontrolami mysiego izotypu. Identyfikacja komórek produkujących il-18bp obecnych w biopsjach śluzówki

Komórki IL-18BP-dodanie obecne w tkankach jelitowych będących w stanie zapalnym zidentyfikowano używając specyficznych wskaźników makrofagów (anty-CD68) i komórek śródbłonka (antyCD31) (niepokazane). Komórki CD68-dodatnie (na zielono) i komórki IL-18BP-dodatnie (na czerwono) wykryto w blaszce właściwej i warstwie podśluzówkowej. Aby potwierdzić, że makrofagi i komórki śródbłonka były także dodatnie dla IL-18BP, przeanalizowano obydwa kolory razem, zielony od antyCD68 lub anty-CD31 i czerwony od anty-IL18BP pokazując, że wszystkie komórki, które związały przeciwciała anty-IL-18BP były także CD68-dodatnie lub CD31 -dodatnie (kolor pomarańczowo-żółty). Podwójne immunobarwienie pokazało, że makrofagi i komórki śródbłonka były głównym źródłem barwienia IL-18BP w tkankach w stanie zapalnym uzyskanych od pacjentów z CD.

Ekspresja mRNA i białka 11-18bp przez komórki śródbłonka.

Aby zbadać zdolność ludzkich komórek śródbłonka do wytwarzania IL-18, jak również, aby potwierdzić wynik uzyskany przez immunobarwienie i RT-PCR na całkowitych biopsjach, wykonano dalsze eksperymenty z użyciem RT-PCR na komórkach śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) (Fig. 15 A). Komórki śródbłonka traktowano mieszanką cytokin (IL-1 β, hTNFα, hlFNY) i zbierano po 24 godzinach

PL 206 549 B1 do izolacji RNA i analizy PCR. Stosunek IL-28BP do poziomów kontrolnego mRNA aktyny wykazywał na wzrost ilości transkryptów IL-18BP w stymulowanych komórkach w porównaniu do komórek nie stymulowanych przez 24 godziny. Ponadto mRNA IL-18BP wydawało się legać ekspresji w komórkach śródbłonka w sposób ciągły. Poziom mRNA IL-18 także analizowano i wykazano lekki wzrost w komórkach traktowanych mieszaniną cytokin. Natomiast mRNA IL-18 nie ulegało ekspresji w niestymulowanych komórkach śródbłonka.

Test ELISA przeprowadzony na supernatantach hodowli komórek nie stymulowanych (pożywka) i HUVEC traktowanych przez 24 godziny ujawnił, że białko IL-18BP było obecne zarówno w pożywce jak i stymulowanych komórkach na poziomie 30x większym po 24 godzinach stymulacji (Fig. 15 B).

Ekspresja białka IL-18BP przez linię komórkową monocytów (THP-1)

Ekspresję IL-18 i IL-18BP analizowano w supernatantach hodowli niestymulowanych i stymulowanych zróżnicowanych komórek THP-1 przy użyciu testu ELISA (Fig. 15 C). Ten eksperyment ujawnił wzrost ekspresji IL-18BP po 48 godzinach stymulacji przez LPS, hIL-1 βμ, hTNFa, hlFNY. Równocześnie po stymulacji zwiększona była sekrecja IL-18 (Fig. 15 C).

Podsumowanie

W niniejszej pracy scharakteryzowano ekspresję i lokalizację IL-18BP w tkance śluzówki uzyskanej od pacjentów z chorobą Crohna i wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy (UC). Stosując półilościową metodę RT-PCR stwierdzono, że w biopsjach śluzówki pacjentów z aktywną postacią choroby Crohna w porównaniu z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy i kontrolnymi pacjentami bez stanu zapalnego zwiększona jest ilość transkryptów mRNA IL-18BP. Analiza immunohistochemiczna biopsji śluzówki zlokalizowała białko IL-18BP wewnątrz komórek śródbłonka i w makrofagach, które naciekają błonę śluzową podczas przebiegu choroby Crohna. Ekspresja IL-18BP przez komórki śródbłonka i zaktywowane makrofagi została potwierdzona na pierwotnych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) i w linii komórkowej monocytów THP1 stymulowanych in vitro. Po stymulacji komórki te wydzielały aktywne biologicznie IL-18BP.

PRZYKŁAD 12

Leczenie inhibitorami IL-18 polepsza stan zdrowia w eksperymentalnym zapaleniu okrężnicy

Materiały i metody

Myszy i wywoływanie zapalenia okrężnicy

Komisja Etyczna Badań na Zwierzętach Uniwersytetu w Amsterdamie, Holandia zaakceptowała wszystkie eksperymenty. Myszy BALB/c otrzymano od Harlan Sprague Dawley Inc. (Horst, Holandia). Myszy hodowano w standardowych warunkach i dostarczano im wodę pitną i pożywienie (AM-II 10 mm, Hope Farms, Woerden, Holandia).

Eksperymenty przeprowadzono na samicach myszy BALB/c w wieku 8 i 10 tygodni. Zapalenie okrężnicy wywołano przez podanie do odbytnicy dwóch dawek (oddzielonych 7-dniową przerwą) w ilości 2 mg kwasu 2,4,6-trójnitrobenzenosulfonowego (TNBS) (Sigma Chemical Co, St Luis, MO, USA) w 40% etanolu (Merck, Darmstadt, Niemcy) używając winylowego cewnika, który był włożony 3 cm od odbytu (10 myszy na grupę). Podczas wkraplania myszy były znieczulone przy użyciu izofluranu (1-chloro-2,2,2-trójfluoroetylo-izofurano-difluorometyloeteru, Abbot Laboratories Ltd., Queenborough, Kent, UK) i po wkropleniu były trzymane pionowo przez 60 sekund. Myszy kontrolne przeszły identyczną procedurę, lecz wkroplono im sól fizjologiczną. Wszystkie myszy uśmiercono po 9 dniach od pierwszego podania TNBS (tj. 48 godzin po drugiej dawce TNBS).

Myszy traktowano dootrzewnowo ludzkim IL-18BP w 500 μl 0,9% roztworu soli fizjologicznej. hIL-18BP jest znakowanym 6 resztami histydyny ludzkim rekombinowanym białkiem produkowanym w systemie ekspresji CHO. ML-18BP było biologicznie aktywne i hamowało wytwarzanie IFNy w l inii komórkowej KG-1 oraz zmniejszało wytwarzanie IFNy przez mysie komórki śledziony (Kim i wsp., 2000).

Oszacowanie zapalenia

Masę ciała mierzono codziennie. Po uśmierceniu pobierano śledziony, ogonowe więzły chłonne i okrężnice. Okrężnice usunięto poprzez środkowe nacięcie i otwarto podłużnie. Po usunięciu kału zarejestrowano masę dystalnych 6 cm i użyto jako wskaźnika związanego z chorobą pogrubienia ściany jelita. Następnie okrężnice podłużnie podzielono na dwie części, jedną z nich użyto do oceny histologicznej.

Analiza histologiczna

Podłużnie rozcięte okrężnice zwijano, utrwalano w 4% formalinie i zatapiano w parafinie do rutynowej histologii. Dwóch badaczy, którzy byli niewtajemniczeni w podział na grupy leczenia oceniało

PL 206 549 B1 następujące parametry: 1) procent powierzchni objętej zapaleniem, 2) wzrost liczby skupisk grudek chłonnych, 3) obrzęk, 4) erozję/owrzodzenie, 5) utratę krypt i 6) naciek komórek jedno- i wielojądrzastych. Procent powierzchni objętej zapaleniem i utrata krypt była punktowana w skali od 0 do 4 jak następuje: 0, stan normalny; 1 mniej niż 10%; 2, 10%; 3, 10 do 50%; 4, więcej niż 50%. Erozje zdefiniowano jako 0, jeżeli nabłonek był nienaruszony, 1 w przypadku objęcia zapaleniem blaszki właściwej, 2 owrzodzenia obejmujące warstwę śródbłonka i 3 jeżeli owrzodzenia były przezścienne. Natężenie pozostałych parametrów punktowano w skali 0 do 3 jak następuje: 0, brak, 1 słaby; 2, umiarkowany; 3, ciężki. Ta punktacja waha się od 0 do maksymalnie 26 punktów.

Homogenaty okrężnie

Okrężnice pobierano i homogenizowano w homogenizatorze tkankowym w 9 objętościach buforu lizującego Greenburger (300 mM NaCl, 15 mM Tris, 2mM MgCl, 2 mM Triton (X-100), Peptstatyna A, Leupeptyna, Aprotynina (wszystkie 20 ng/ml), pH 7.4). Tkankę poddawano lizie przez 30 minut w lodzie, a następnie wirowano dwa razy (10 min., 14000 g). Homogenaty do chwili użycia były przechowywane w -20°C.

Hodowla komórkowa i test ELISA pod kątem cytokin

W celu przygotowania zawiesiny komórek śledziony i ogonowych węzłów chłonnych użyto filtratorów komórkowych (Becton/Dickinson Labware, New Jersey, USA). Komórki zawieszono w pożywce RPMI 1640 (BioWhittaker-Boehringer, Verviers, Belgia) zawierającej 10% FCS i cyproksynę (10 μg/ml) (Sigma Chemical Co., St. Luis, MO, USA). Komórki śledziony wirowano w sterylnym Fikolu (Pharmacia, Uppsala, Szwecja), komórki jednojądrzaste przeniesiono do RPMI i policzono gęstości komórek. Całkowita liczbę 1 x 10⁵ komórek na mysz inkubowano w potrójnych studzienkach, w 200 μl RPMI (BioWittaker Europę, A Cambrex Company, Verviers, Belgia) zawierającego antybiotyki i 10% płodowej surowicy cielęcej. Komórki stymulowano przez wstępne opłaszczenie przeciwciałami anty-CD3 (stężenie 1:30; klon 145.2C11) i rozpuszczalnym przeciwciałem anty-CD28 (stężenie 1:1000; Pharmingen). Supernatanty usunięto po 48 godzinach zmierzono testem ELISA stężenia IFN-γ (Pharmingen) i TNF-α (R&D systems, Abingdon, Wielka Brytania).

Cytometria przepływowa

Wyizolowane komórki śledziony płukano w buforze Facs (PBS zawierający 0,5% BSA, 0,3 mmol/L EDTA i 0,01% azydek sodu) i trzymano w lodzie przez pozostałą część procedury. 2 x 10⁵ komórek na studzienkę (96-studzienkowa mikroszalka o kształcie v, Greiner B.V. labor techniek, Alphen aan de Rijn, Holandia) inkubowano z następującymi przeciwciałami (mAbs): szczurze antymysie CD4 sprzężone z Cy-chromem (klon RM4-5), szczurze antymysie CD69 sprzężone z Fitc i szczurze antymysie CD25 sprzężone z Fitc (Pharmingen, San Diego, CA). Limfocyty sczytywano poprzez podłużne i boczne rozproszenie wiązki światła używając cytometru przepływowego FACScan wraz z oprogramowaniem Facscan (Becton Dickinson, Mountain View, USA) i zliczono 5000 komórek. Wyniki podano jako procent policzonych komórek dodatnich pod względem użytego mAb.

Analiza statystyczna

Wartości podano jako średnią i błąd standardowy średniej dla każdej badanej grupy. Różnice pomiędzy grupami analizowano używając nieparametrycznego testu U Mann-Whitney'a. Zmiany masy w czasie analizowano stosując jednoczynnikową analizę wariancji. Jako istotne uważano P<0,05. Do wszystkich analiz użyto oprogramowania statystycznego SPSS (SPSS inc, Chicago USA)

Wyniki

IL-18BP chroni przed utratą wagi w mysim modelu zapalenia okrężnicy

Aby zbadać rolę IL-18 w eksperymentalnym zapaleniu okrężnicy i w szczególności ochronny wpływ białka wiążącego IL-18 (IL-18BP), w myszach BALB/c wywołano zapalenie okrężnicy przy użyciu TNBS. Model ten obejmuje lokalną ekspozycję na kwas trójnitrobenzenosulfonowy (TNBS) w 40% etanolu. Wzbudza to opóźniony typ reakcji hiperwrażliwości na własny Antygen modyfikowany haptenem (trójnitrofenyl), a odpowiedź jest typu Th1 ze zwiększoną produkcją prozapalnych cytokin.

Myszy leczono ludzkim IL-18BP lub kontrolą podawaną dootrzewnowo (ip) w dziennych dawkach.

Dzienne dawki dootrzewnowe wahające się od 12,5 μg do 50 μg WL-18BP nie wpływały na nasilenie objawów chorobowych (dane nie pokazane). Jednakże zastosowana dawka 200 μg WL-18BP dziennie podawana dootrzewnowo była efektywna w zmniejszaniu utraty masy ciała związanej z pojawieniem się choroby.

Jak oczekiwano, wewnątrzodbytnicze wkraplanie TNBS powodowało biegunkę i wychudzenie. Jak pokazano na Fig. 16 zwierzęta w obydwu leczonych grupach tracą 15% podstawowej masy ciała w dniu 3. Jednakże, w przeciwieństwie do myszy kontrolnych zaczynając od dnia 4 po wkropleniu

PL 206 549 B1

TNBS, myszy leczone IL-18BP szybko odzyskiwały początkowo utraconą masę ciała powracając do podstawowej masy ciała w dniu 8. U myszy kontrolnych drugie podanie TNBS w dniu 8 ponownie skutkowało znaczną utratą masy ciała, przed którą znacząco chroniło podawanie IL-18BP. Podawanie ML-18BP w myszach traktowanych solą fizjologiczną nie wywoływało żadnego efektu (dane niepokazane). Tak więc podawanie ML-18BP znacząco wpływało na utratę masy ciała związaną z zapaleniem okrężnicy wywołanym TNBS (p<0,05).

Wpływ na parametry zapalenia

Dziesiątego dnia myszy uśmiercono i oznaczono masę ostatnich 6 centymetrów okrężnicy (Fig. 17 A). W zapaleniu okrężnicy wywołanym TNBS masa okrężnicy wzrosła w porównaniu z myszami traktowanymi solą fizjologiczną. Ten wzrost masy był istotnie mniejszy u myszy leczonych ML-18BP (181,6 mg ± 11,4 w porównaniu do 268 mg ± 27,3 u myszy leczonych solą fizjologiczną (p<0,05)). Wcześniej stwierdzono, że zapalenie okrężnicy wywołane TNBS jest związane ze zwiększonym napływem komórek do ogonowych węzłów chłonnych (Camoglio i wsp., 2000). Leczenie z użyciem IL-18BP zmniejszało liczbę komórek migrujących do ogonowego węzła chłonnego w porównaniu z liczbą komórek w ogonowym węźle chłonnym myszy traktowanych TNBS i leczonych solą fizjologiczną (Fig. 17 B).

Przy użyciu analizy Facscan oznaczono zmianę ekspresji CD69, które jest wskaźnikiem wczesnej aktywacji limfocytów T (Fig. 17 C). Procent komórek śledziony CD4⁺ z ekspresją CD69 wynosił 11,4% u myszy traktowanych TNBS, ale u myszy traktowanych TNBS i leczonych hIL-18BP procent komórek CD4⁺/CD69⁺ wynosił 7,3% (P<0,05).

Wytwarzanie cytokin w śledzionie, ogonowych węzłach chłonnych i homogenatach okrężnicy

W celu zbadania wpływu ML-18BP na zdolność limfocytów T do wytwarzania prozapalnych cytokin po aktywacji receptora komórek T, wyizolowano komórki z ogonowego węzła chłonnego oraz śledziony i stymulowano je przez 48 godzin przeciwciałami anty-CD3/CD28. W supernatantach zmierzono produkcję IFNy i TNFa (Fig. 18). Nie zaobserwowano żadnych istotnych różnic pomiędzy produkcją cytokin u myszy leczonych IL-18BP i myszy kontrolnych. Tak więc, neutralizacja IL-18 przez IL-18BP nie powodowała ogólnego zmniejszenia zdolności limfocytów T do odpowiedzi na aktywację receptora komórek T.

Homogenaty okrężnicy analizowano pod kątem poziomów cytokin mierząc lokalną produkcję cytokin (Fig. 19). Nie wykryto żadnych różnic w poziomach IFNy w homogenatach okrężnie myszy traktowanych TNBS i myszy traktowanych TNBS i leczonych hIL-18BP (odpowiednio 134 pg/ml ± 7,8 i 139 pg/ml ± 23. Jednakże poziomy TNFa były istotnie niższe i homogenatach okrężnie myszy leczonych ML-18BP ze 110 pg/ml ± 3 u myszy traktowanych TNBS do 59 pg/ml ± 2,7 u myszy traktowanych TNBS leczonych ML-18BP.

Wyniki badań histologicznych

W celu zbadania, czy zmniejszenie parametrów zapalenia za pośrednictwem hlL-18BP wpływa także na wyniki badań histologicznych, wykonano histopatologię na skrawkach parafinowych. Ogólny stopień zapalenia w obrazie histologicznym był istotnie obniżony u myszy leczonych hIL-18BP w porównaniu z myszami kontrolnymi (15,9 ±1,1 u nie leczonych myszy do 9,8 ± 1,3 u myszy leczonych WL-18BP) (nie pokazane), głównie jako wynik zmniejszenia liczby leukocytów naciekających błonę śluzową (p<0,05). Znaczącym odkryciem był całkowity brak owrzodzeń błony śluzowej u myszy leczonych IL-18BP (p<0,05). Wyniki są podsumowane w Tabeli 2 poniżej. Całkowita ochrona przed owrzodzeniami myszy leczonych IL-18BP jest szczególnie wyraźna.

T a b e l a 2

Wieloaspektowa ocena zapalenia okrężnicy u myszy traktowanych TNBS i traktowanych solą fizjologiczną lub hIL-18BPa.

	Kontrolne myszy traktowane TNBS	Myszy traktowane TNBS leczone ML-18BP
1	2	3
% powierzchni objętej zmianami	3,4 ± 0,4	3,2 ± 0,5
Skupiska grudek chłonnych	2,0 ± 0,4	1,5 ± 0,4
Obrzęk	2,1 ± 0,3	1,3 ± 0,3
Zwłóknienia	0,85 ± 0,26	0,50 ± 0,2

PL 206 549 B1 cd. tabeli 2

1	2	3
Owrzodzenia	2,0 ± 0,3	0,0 ± 0,0*
Utrata krypt	1,7 ± 0,3	1,0 ± 0,3
Komórki z polimorficznymi jądrami	2,6 ± 0,2	1,3 ± 0,2*
Komórki jednojądrowe	1,1 ± 0,1	0,33 ± 0,21*

Dane są przedstawione jako średnia ± błąd standardowy średniej w skali 0-4, * przedstawia istotną różnicę.

Przeciwciała poliklonalne anty-mIL-18 chronią przed chorobą w mysim modelu zapalenia okrężnicy wywołanego solą sodową siarczanu dekstranu

W tym modelu sól sodową siarczanu dekstranu (DSS), id podawano w wodzie pitnej poczynając od Dnia 0 do uśmiercenia myszy. Poliklonalne przeciwciała anty-IL-18BP podano dootrzewnowo w dniu 0, 4 i 8. Dawki wynosiły 200 i 400 μl surowicy królika. Najwyższa dawka (400 μθ dawała istotne zmniejszenie utraty masy ciała, nasilenia objawów klinicznych, krwawienia odbytniczego i skracania się okrężnicy (nie pokazano). Leczenie króliczym anty-IL-18BP powodowało opóźnienie w pojawieniu się objawów choroby i chroniło przed jej dalszym rozwojem (nie pokazano).

Podsumowanie

Przykład 12 przedstawiony powyżej pokazuje, że neutralizacja IL-18 poprzez podawanie hIL-18BP lub poliklonalnej surowicy odpornościowej przeciwko IL-18 skutecznie zmniejsza natężenie objawów eksperymentalnie wywołanego zapalenia okrężnicy u myszy.

Myszy leczone codziennie hIL-18BP podawanym dootrzewnowo szybko odzyskiwały początkowo utraconą masę ciała w porównaniu do myszy kontrolnych. Pozostałe parametry zapalenia okrężnicy mierzone poprzez masę okrężnicy i napływ komórek do ogonowego węzła chłonnego były zmniejszone u myszy leczonych hIL-18BP. Histopatologię leczonych myszy scharakteryzowano przez zmniejszenie natężenia zniszczenia tkanki (owrzodzenia) a ilość naciekających komórek była znacznie zmniejszona. Wpływ IL-18BP miał podłoże systemowe, jak wykazano poprzez zmniejszoną ekspresję CD69 przez komórki śledziony.

Lokalne wytwarzanie TNFa mierzone w homogenatach było znacząco zmniejszona u myszy traktowanych TNBS leczonych hIL-18BP. To wskazuje, że TNFa odgrywa ważną rolę w progresji choroby. Poziomy IFNy były porównywalne pomiędzy myszami traktowanymi TNBS, a myszami traktowanymi TNBS leczonymi hIL-18BP, co może być wytłumaczone przez dużą siłę bodźca indukującego IFNy.

Podsumowując dane przedstawione powyżej pokazują korzystny wpływ inhibitorów 11-18 w leczeniu chorób związanych z zapaleniem jelit.

Literatura

1. Afford, S. C, i wsp., Distinct patterns ofchemokine expression are associated with leukocyte recruitment in alcoholic hepatitis and alcoholic cirrhosis. J Pathol, 1998. 186(1): 82-9.

2. Anderson, D. M., i wsp., A homologue of the TNF receptor and itsligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function. Nature, 1997.390 (6656): 175-179.

3. Baroni, G. S., i wsp., Hepatic stellate cell activation and liver fibrosis are associated with necroinflammatory injury and Th1-like response in chronic hepatitis C. Liver, 1999.19(3): 212-9.

4. Bird, G. L., i wsp., Increased plasma tumor necrosis factor in severe alcoholic hepatitis. Ann Intern Med, 1990.112 (12): 917-20.

5. Bollon, D. P., i wsp. (1980) J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39-48.

6. Botstein, D., i wsp. (1982) Miami Wint. Symp. 19: 265-274.

7. Broach, J. R., in „The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces: Life Cycle and Inheritance”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 445-470 (1981).

8. Broach, J. R., (1982) Cell 28: 203-204.

9. Byrn R. A. i wsp., 1990, Nature (London) 344: 667-670.

10. Camoglio L, te Velde AA, de Boer A, ten Kate FJ, Kopf M, van Deventer SJ. Hapteninduced colitis associated with maintained Th1 and inflammatory responses in IFN-gamma receptor-deficient mice. Eur J Immunol 2000; 30: 1486 95.

PL 206 549 B1

11. Car, B. D., V. M. Eng, B. Schnyder, L. Ozmen, S. Huang, P. Gallay, D. Heumann, M. Aguet, i B. Ryffel. 1994. Interferon gamma receptor deficient mice are resistant to endotoxic shock. J. Exp. Med. 179: 1437-44 issn: 0022-1007.

12. Chater, K. F. i wsp., „Sixth International Symposium on Actinoenycetates Biology”, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), 45-54.

13. Conti, B., J. W. Jahng, C. Tinti, J. H. Son i T. H. Joh. 1997. Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex. J. Biol. Chem. 272: 2035-2037.

14. Dao, T., K. Ohashi, T. Kayano, M. Kurimoto, H. Okamura. 1996. Interferon gamma-inducing factor, a novel cytokine, enhances Fas ligand-mediated cytotoxicity of murine T helper 1 cells. Cell-Immunol. 173: 230-5 issn: 0008-8749.

15. Dayer, J-M (1999). J. Cin. Inv. 104,1337-1339.

16. Desreumaux P, Brandt E, Gambiez L, Emilie D, Geboes K, Klein 0, Ectors N, Cortot A, Capron M, Colombe JF. Distinct cytokine patterns in early and chronic ileal lesions of Crohn's disease. Gastroenterology 1997; 113: 118-126.

17. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E i Karin, M. (1997), Nature 388, 16514-16517.

18. Elliott, M. J., Maini, R. N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., Woody, J. N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.

19. Engelmann, H., D. Aderka, M. Rubinstein, D. Rotman, D. Wallah. 1989. A tumor necrosis factor-binding protein purified to homogeneity from human urine protects cells from tumor necrosis factor toxicity. J. Biol. Chem. 264: 11974-11980.

20. Engelmann, H., D. Novick, D. Wallah. 1990. Two tumor necrosis factor binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross reactivity with celi surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265: 1531-1536.

21. Fantuzzi, G., i wsp., IL-18 regulation of IFN-g production and celi proliferation as revealed in interleukin-1b converting enzyme-deficient mice. Blood, 1998.91: 2118-2125.

22. Fiore, G., i wsp., Liver tissue expression of CD80 and CD95 antigens in chronić hepatitis C: relationship with biological and histological disease activities. Microbios, 1999.97 (386): 29-38.

23. Galie, P. R., i wsp., Involvement of the CD95 (APO-l/Fas) receptor and ligand in liver damage. J Exp Med, 1995.182 (5): 1223-30.

24. Gracie, A J, Forsey, R J, Chan, W L, Gilmour, A, Leung, B P, Greer, A R, Kennedy, K, Carter, R, Wei, X-Q, Xu, D., Field, M, Foulis, A, Liew, F Y, Mannes, I B. (1999). J. Clin. Inv. 104: 1393-1401.

25. Grantham (1974), Science, 185. 862-864.

26. Grove, J., i wsp., Association of a tumor necrosis factor promoter polymorphism with susceptibility to alcoholic steatohepatitis [patrz komentarze]. Hepatology, 1997. 26 (1): 143-6.

27. Gryczan, T.,”The Molecular Biology of the Bacilli”, Academic Press, NY (1982), 307-329.

28. Gutkind, J. S., i wsp., A novel c-fgr exon utilized in Epstein-Barr virus-infected B lymphcytes but not in mormal monocytes. Molec. Cell. Biol., 1991.11: 1500-1507.

29. Harada, K., i wsp., In situ nucleic acid hybridization ofcytokines in primary biliary cirrhosis: predominance of the Th1 subset. Hepatology, 1997.25 (4): 791-6.

30. Heremans, H., J. Van Damme, C. Dillen, R. Dijkmans, A. Billiau. 1990. Interferon gamma, a mediator of lethal lipopolysaccharide-induced Shwartzman like shock reactions inmice. J. Exp. Med. 171: 1853-69 issn: 0022-1007.

31. Hill, D. B., i wsp., Increased plasma interleukin-6 concentrations in alcoholic hepatitis. J Lab Clin Med, 1992.119 (5): 547-52.

32. Hill, D. B., L. S. Marsano, C. J. McClain, Increased plasma interleukin-8 concentrations in alcoholic hepatitis. Hepatology, 1993.18: 576-580.

33. Hiramatsu, N., i wsp., Immunohistochemical detection of Fas antigen in liver tissue of patients with chronić hepatitis C. Hepatology, 1994.19 (6): 1354-9.

34. Huang, Y. S., i wsp., Serum levels of interleukin-8 in alcoholic liver disease: relationship with disease stage, biochemical parameters and survival. J Hepatol, 1996.24 (4): 377-84.

35. Iio, S., i wsp., Serum levels of soluble Fas antigen in chronic hepatitis C patients. J Hepatol, 1998.29 (4): 517-23.

36. Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742.

37. John, J. F., i wsp. (1986) Rev. Infect. Dis. 8: 693-704.

PL 206 549 B1

38. Kahiwamura, S., Okamura, H. (1998), Nippon. Rinsho. 56, 1798-1806.

39. Kendall, K. J. i wsp. (1987) J. Bacteriol. 169: 4177-4183.

40. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: 1190-1195.

41. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, i wsp., Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric antiTNF antibody. Mol Immunol., 1993 Lis. 30: 16 1443-53.

42. Konno, K., J. Kataoka, T. Ohtsuki, Y. Suemoto, I. Okamoto, M. Usui, M. Ikeda, M. Kurimoto.

1997. IFN-gamma-inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Th1 but not Th2 cells and exerts its effect independently of I L-12. J. Immunol. 158: 1541-1550.

43. Lee, M., i wsp., Expression of Th1 and Th2 typecytokines responding to HBsAg and HBxAg in chronic hepatitis B patients. J Korean Med Sci, 1999.14 (2): 175-81.

44. Lukkari, T. A., i wsp., Short-term ethanol exposure increases the expression of Kupffer cell CD 14 receptor and lipopolysaccharide binding protein in rat liver.Alcohol Alcohol, 1999.34 (3): 311-9.

45. Luo, K. X., i wsp., In situ investigation of Fas/FasL expression in chronic hepatitis B infection and related liver diseases. J Viral Hepat, 1997.4 (5): 303-7.

46. Maliszewski, C. R., T. A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S. K. Dower, J. Slack, M. P. Beckmann, K. H. Grabstein. 1990. Cytokine receptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1-and IL-4- induced B celi activities in vitro. J. Immunol. 144: 3028 -3033.

47. Maniatis, T., in”Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3: Gene Expression”, Academic Press, NY, 563-608 (1980).

48. Maniatis i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982.

49. Martinez, F., i wsp., Ethanol and cytokine secretion. Alcohol, 1992.9 (6): 455-8.

50. McClain, C. J., i wsp., Tumor necrosis factor and alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res, 1998.22 (Dodatek 5): 248S-252S.

51. McClain, C. J. i D. A. Cohen, Increased tumor necrosis factor production by monocytes in alcoholic hepatitis. Hepatology, 1989.9 (3): 349-51.

52. Micallef, M. J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, M. Kurimoto. 1996. Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production. Eur-J-Immunol 26: 1647-51 issn: 0014-2980.

53. Mizushima, S. i Nagata, S. (1990) pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acid Res. 18: 5322-5328.

54. Monteleone G, Trapasso F, Parrello T, Biancone L, Stella A, luliano R, Luzza F, Fusco A, Pallone F. Bioactive IL-18 expression is up-regulated in Crohn's disease. J Immunol 1999; 163: 143-147.

55. Muhl H, Kampfer H, Bosmann M, Frank S, Radeke H, Pfeilschifter J. Interferon gamma mediates gene expression of IL-18 binding protein innonleukocytic cells. Biochem Biophys Res Commun 2000; 267: 960-963.

56. Nakamura, K., H. Okamura, M. Wada, K. Nagata, i T. Tamura. 1989. Endotoxin-induced serum factor that stimulates gamma interferon production. Infect-immun 57: 590-5 issn: 0019-9567.

57. Nanji, A. A., i wsp., Activation of nuclear factor K B and cytokine imbalance in experimental alcoholic liver disease in the rat. Hepatology, 1999.30 (4): 934-43.

58. Nishimura, T. i A. Ohta, A critical role for antigen-specific Th1 cells in acute liver injury in mice. J. Immunol, 1999.162: 6503-6509.

59. Novick, D., B. Cohen, M. Rubinstein. 1994. The Human Interferon alpha/beta ReceptorCharacterization and Molecular Cloning. Cell 77: 391-400.

60. Novick, D., B. Cohen, M. Rubinstein. 1992. Soluble Interferon-alpha Receptor Molecules Are Present in Body Fluids. FEBS Lett 314: 445-448.

61. Novick, D., H. Engelmann, D. Wallah, M. Rubinstein. 1989. Soluble cytokine receptors are present in normal human urine. J. Exp. Med. 170: 1409-1414.

62. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.

PL 206 549 B1

63. Ohlinger, W., i wsp., Immunohistochemical detection of tumor necrosis factor-α, other cytokines and adhesion molecules in human livers with atcohoficr hepatitis. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol, 1993.423 (3): 169-76.

64. Okamura, H., H. Tsutsui, T. Komatsu, M. Yutsudo, A. Hakura, T. Tanimoto, K. Torigoe, T. Okura, Y. Nukada, K. Hattori, K. Akita, M. Namba, F. Tanabe, K. Konishi, S. Fukuda, M. Kurimoto.

1995. Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells. Nature 378: 88-91.

65. Okamoto, T., i wsp., Induction of Fas ligand and Fas antigen mRNA expressions in interferon-y transgenic mouse liver. Jpn J Pharmacol, 1998.78 (2): 233-5.

66. Okazaki, M., i wsp., Hepatic Fas antigen expression before and after interferon therapy in patients with chronic hepatitis C. Dig Dis Sci, 1996.41 (12): 2453-8.

67. Okamoto, T., K. Yamamura, O. Hino, The mouse interferon-ytransgene chronic hepatitis model (Review). Int J Mol Med, 1999.3 (5): 517-20.

68. Olee T, Hashimoto S, Quach J, Lotz M. (1999). J Immunol 162: 2 1096-100.

69. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271, 3967-3970.

70. Plater-Zyberk C, Bonnefoy JY. Marked amelioration of established collagen induced arthritis by treatment with antibodies to CD23 in vivo. Nat Med 1995; 1: 781-785.

71. Pizarro TT, Michie MH, Bentz M, Woraratanadharm J, Smith MF, Jr., Foley E, Moskaluk CA, Bickston SJ, Cominelli F. IL-18, a novel immunoregulatory cytokine, is up-regulated in Crohn's disease: expression and localization in intestinal mucosal cells. J Immunol 1999; 162: 6829-6835.

72. Reimund JM, Wittersheim C, Dumont S, Muller CD, Baumann R, Poindron P, Duclos B. Mucosal inflammatory cytokine production by intestinal biopsies in patients with ulcerative colitis and Crohn's disease. J Clin Immunol 1996; 16: 144-150.

73. Rothe, H., N. A. Jenkins, N. G. Copeland, H. Kolb. 1997. Active stage of autoimmune diabetes is associated with the expression of a novelcytokine, IGIF, which is located near Idd2. J-Clin-lnves. t 99: 469-74 issn: 0021-9738.

74. Saha N, Moldovan F, Tardif G, Pelletier JP, Cloutier JM, Martel-Pelletier J. (1999). Arthritis Rheum 42: 8 1577-87.

75. Sambrook, J., E. F. Fritsch, M. T., Molecular Cloning: A laboratory manual. 2nd wyd. 1989, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

76. Simonet, W. S., i wsp., Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell, 1997.89 (2): 309-319.

77. Sheron, N., i wsp., Elevated plasma interleukin-6 and increased severity and mortality in alcoholic hepatitis. Clin Exp Immunol, 1991.84 (3): 449-53.

78. Sompayrac, L. H. i K. L. Danna, Efficient infection of monkey cells with DNA of simian virus 40. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1981.78: 7575-7578.

79. Sparks, C. A., i wsp., Assignment of the nuclear mitotic apparatus protein NuMA gene to human chromosome 11q13. Genomics, 1993.17: 222-224.

80. Su, G. L., i wsp., CD 14 and lipopolysaccharide binding protein expression in a rat model of alcoholic liver disease. Am J Pathol, 1998.152 (3): 841-9.

81. Taieb, J., i wsp., Raised plasma soluble Fas and Fas-ligand in alcoholic liver disease [list]. Lancet, 1998.351 (9120): 1930-1.

82. Triantaphyllopoulos, K A, Williams, R, Tailor, H, Chernakovsky, Y (1999). Arthritis and Rheumatism 42,90-99.

83. Tsutsui, H., K. Nakanishi, K. Matsui, K. Higashino, H. Okamura, Y. Miyazawa, K. Kaneda.

1996. IFN-gamma-inducing factor up-regulates Fas ligand mediated cytotoxic activity of murine natural killer celi clones. J. Immunol. 157: 3967-73 issn: 0022-1767.

84. Tsuij, H., Mukaida, N., Harada A., Kaneko, S., Matsushita, E., Nakanuma, Y., Tsutsui, H., Okamura, H., Nakanishi, K., Tagawa, m Y, Iwakura, Y., Kobayashi, K., Matsuschima, K. (1999), J. Immunol. 162, 1049-1055.

85. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J. Y., Dayer, J. M., Zubler, R. H., 1992, J. Immunol. 148, 2778-2784.

86. Ushio, S., M. Namba, T. Okura, K. Hattori, Y. Nukada, K. Akita, F. Tanabe, K. Konishi, M. Micallef, M. Fujii, K. Torigoe, T. Tanimoto, S. Fukuda, M. Ikeda, H. Okamura, M. Kurimoto. 1996. Cloning of thecDNA for human IFN-gamma inducing factor, expression in Escherichia coli, and studies on the biologie activities of the protein. J. Immunol. 156: 4274-4279.34. Okayama, H. i Berg, P. (1983)

PL 206 549 B1

A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 3:280-289.

87. Williams RO, Mason LJ, Feldmann M, Maini RN. Synergy between anti-CD4 and anti-tumor necrosis factor in the amelioration of established collagen-induced arthritis. Proc Natl Acad Sci USA, 1994 Mar 29 91:7 2762-6.

88. Yasuda, H., i wsp., Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro. Endocrinology,

1998. 139: 1329-1337.

89. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S i Nakanishi, K (1998), J. immunol. 161, 3400-3407.

Claims (116)

1. Zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania uszkodzeniu wątroby.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że uszkodzenie wątroby jest ostre.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że uszkodzenie wątroby jest przewlekłe.

4. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1 do 3, znamienne tym, że uszkodzenie wątroby jest alkoholowym zapaleniem wątroby, wirusowym zapaleniem wątroby, immunizacyjnym zapaleniem wątroby, piorunującym zapaleniem wątroby, marskością wątroby i pierwotną żółciową marskością wątroby.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że uszkodzenie wątroby jest piorunującym zapaleniem wątroby.

6. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1 do 5, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest wybrany z inhibitorów kaspazy-1 (ICE), przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18, inhibitorów szlaku sygnalizacji IL-18, antagonistów IL-18, współzawodniczących z IL-18 i blokujących receptor IL-18, oraz białek wiążących IL-18, ich izoform, mutein, białek fuzyjnych, pochodnych funkcjonalnych, frakcji aktywnych albo ich kołowo permutowanych pochodnych o zasadniczo takiej samej aktywności jak białka wiążące IL-18.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest przeciwciałem przeciwko IL-18.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko IL-18 jest humanizowanym przeciwciałem wobec IL-18.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko IL-18 jest ludzkim przeciwciałem wobec IL-18.

10. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest białkiem wiążącym IL-18, albo jego izoformą, muteina białkiem fuzyjnym, pochodną funkcjonalną, frakcją aktywną albo ich kołowo permutowaną pochodną, które wykazują zasadniczo taką samą aktywność jak białko wiążące IL-18.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że białko wiążące IL-18 jest modyfikowane PEG.

12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest białkiem fuzyjnym zawierającym całość albo część białka wiążącego IL-18 w formie fuzji z całością albo częścią immunoglobuliny, przy czym białko fuzyjne wiąże IL-18.

13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że białko fuzyjne zawiera cały region stały immunoglobuliny albo jego część.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że immunoglobulina jest izotypu IgG1 albo IgG2.

15. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-14, znamienne tym, że lek ponadto zawiera interferon.

16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że interferon jest interferonem-β.

17. Zastosowanie według zastrz. 15 albo 16, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany z interferonem równocześnie, kolejno albo oddzielnie.

18. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-17, znamienne tym, że lek ponadto zawiera antagonistę czynnika martwicy nowotworów (TNF).

PL 206 549 B1

19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że antagonistą TNF jest rozpuszczalny receptor I TNF (TBPI) i/albo rozpuszczalny receptor II TNF (TBPII).

20. Zastosowanie według zastrz. 18 albo 19, znamienne tym, że inhibitor IL-18 i/albo interferon jest stosowany z antagonistą TNF równocześnie, kolejno albo oddzielnie.

21. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-20, znamienne tym, że lek zawiera ponadto inhibitor COX.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że inhibitorem COX jest inhibitor COX-2.

23. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-22, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała, albo około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała albo około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała albo około 1 do 2 mg/kg masy ciała.

24. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-23, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,1 do 1000 μg/kg masy ciała, albo około 1 do 100 μg/kg masy ciała albo około 10 do 50 μg/kg masy ciała.

25. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-24, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany podskórnie.

26. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-24, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany domięśniowo.

27. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-26, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany codziennie.

28. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-26, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany co drugi dzień.

29. Zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania zapaleniu stawów.

30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że zapalenie stawów jest zapaleniem stawów o podłożu zapalnym.

31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że zapalne zapalenie stawów jest reumatoidalnym zapaleniem stawów.

32. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 29 do 31, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest wybrany z inhibitorów kaspazy-1 (ICE), przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18, inhibitorów szlaku sygnalizacji IL-18, antagonistów IL-18, współzawodniczących z IL-18 i blokujących receptor IL-18, oraz białek wiążących IL-18, ich izoform, mutein, białek fuzyjnych, pochodnych funkcjonalnych, frakcji aktywnych albo ich kołowo permutowanych pochodnych o zasadniczo takiej samej aktywności jak białka wiążące IL-18.

33. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest przeciwciałem przeciwko IL-18.

34. Zastosowanie według zastrz. 33, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko IL-18 jest humanizowanym przeciwciałem wobec IL-18.

35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko IL-18 jest ludzkim przeciwciałem wobec IL-18.

36. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest białkiem wiążącym IL-18, albo jego izoformą, muteina, białkiem fuzyjnym, pochodną funkcjonalną, frakcją aktywną albo ich kołowo permutowaną pochodną które wykazują zasadniczo taką samą aktywność jak białko wiążące IL-18.

37. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że białko wiążące IL-18 jest modyfikowane PEG.

38. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest białkiem fuzyjnym zawierającym całość albo część białka wiążącego IL-18 w formie fuzji z całością albo częścią immunoglobuliny, przy czym białko fuzyjne wiąże IL-18.

39. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że białko fuzyjne zawiera cały region stały immunoglobuliny albo jego część.

40. Zastosowanie według zastrz. 39, znamienne tym, że immunoglobulina jest izotypu IgG1 albo IgG2.

41. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 29-40, znamienne tym, że lek ponadto zawiera interferon.

42. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że interferon jest interferonem-β.

PL 206 549 B1

43. Zastosowanie według zastrz. 41 albo 42, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany z interferonem równocześnie, kolejno albo oddzielnie.

44. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 29-43, znamienne tym, że lek ponadto zawiera antagonistę czynnika martwicy nowotworów (TNF).

45. Zastosowanie według zastrz. 44, znamienne tym, że antagonistą TNF jest rozpuszczalny receptor I TNF (TBPI) i/albo rozpuszczalny receptor II TNF (TBPII).

46. Zastosowanie według zastrz. 44 albo 45, znamienne tym, że inhibitor IL-18 i/albo interferon jest stosowany z antagonistą TNF równocześnie, kolejno albo oddzielnie.

47. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 29-46, znamienne tym, że lek zawiera ponadto inhibitor COX.

48. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że inhibitorem COX jest inhibitor COX-2.

49. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 29-48, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała, albo około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała albo około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała albo około 1 do 2 mg/kg masy ciała.

50. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 29-49, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,1 do 1000 ug/kg masy ciała, albo około 1 do 100 ug/kg masy ciała albo około 10 do 50 ug/kg masy ciała.

51. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 29-50, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany podskórnie.

52. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 29-50, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany domięśniowo.

53. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 29-52, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany codziennie.

54. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 29-52, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany co drugi dzień.

55. Zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania zniszczeniu chrząstki.

56. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 55, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest wybrany z inhibitorów kaspazy-1 (ICE), przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18, inhibitorów szlaku sygnalizacji IL-18, antagonistów IL-18, współzawodniczących z IL-18 i blokujących receptor IL-18, oraz białek wiążących IL-18, ich izoform, mutein, białek fuzyjnych, pochodnych funkcjonalnych, frakcji aktywnych albo ich kołowo permutowanych pochodnych o zasadniczo takiej samej aktywności jak białka wiążące IL-18.

57. Zastosowanie według zastrz. 56, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest przeciwciałem przeciwko IL-18.

58. Zastosowanie według zastrz. 57, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko IL-18 jest humanizowanym przeciwciałem wobec IL-18.

59. Zastosowanie według zastrz. 58, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko IL-18 jest ludzkim przeciwciałem wobec IL-18.

60. Zastosowanie według zastrz. 56, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest białkiem wiążącym IL-18, albo jego izoformą muteina białkiem fuzyjnym, pochodną funkcjonalną, frakcją aktywną albo ich kołowo permutowaną pochodną, które wykazują zasadniczo taką samą aktywność jak białko wiążące IL-18.

61. Zastosowanie według zastrz. 60, znamienne tym, że białko wiążące IL-18 jest modyfikowane PEG.

62. Zastosowanie według zastrz. 60, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest białkiem fuzyjnym zawierającym całość albo część białka wiążącego IL-18 w formie fuzji z całością albo częścią immunoglobuliny, przy czym białko fuzyjne wiąże IL-18.

63. Zastosowanie według zastrz. 62, znamienne tym, że białko fuzyjne zawiera cały region stały immunoglobuliny albo jego część.

64. Zastosowanie według zastrz. 62, znamienne tym, że immunoglobulina jest izotypu IgG1 albo IgG2.

65. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 55-64, znamienne tym, że lek ponadto zawiera interferon.

66. Zastosowanie według zastrz. 65, znamienne tym, że interferon jest interferonem-β.

PL 206 549 B1

67. Zastosowanie według zastrz. 65 albo 66, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany z interferonem równocześnie, kolejno albo oddzielnie.

68. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 55-67, znamienne tym, że lek ponadto zawiera antagonistę czynnika martwicy nowotworów (TNF).

69. Zastosowanie według zastrz. 68, znamienne tym, że antagonistą TNF jest rozpuszczalny receptor I TNF (TBPI) i/albo rozpuszczalny receptor II TNF (TBPII).

70. Zastosowanie według zastrz. 68 albo 69, znamienne tym, że inhibitor IL-18 i/albo interferon jest stosowany z antagonistą TNF równocześnie, kolejno albo oddzielnie.

71. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 55-70, znamienne tym, że lek zawiera ponadto inhibitor COX.

72. Zastosowanie według zastrz. 71, znamienne tym, że inhibitorem COX jest inhibitor COX-2.

73. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 55-72, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała, albo około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała albo około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała albo około 1 do 2 mg/kg masy ciała.

74. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 55-73, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,1 do 1000 μg/kg masy ciała, albo około 1 do 100 μg/kg masy ciała albo około 10 do 50 μg/kg masy ciała.

75. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 55-74, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany podskórnie.

76. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 55-74, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany domięśniowo.

77. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 55-76, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany codziennie.

78. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 55-76, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany co drugi dzień.

79. Zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania zapalnej chorobie jelit.

80. Zastosowanie według zastrz. 79, znamienne tym, że zapalna choroba jelit jest chorobą Crohna.

81. Zastosowanie według zastrz. 79, znamienne tym, że zapalna choroba jelit jest wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy.

82. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 79 do 81, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest wybrany z inhibitorów kaspazy-1 (ICE), przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18, inhibitorów szlaku sygnalizacji IL-18, antagonistów IL-18, współzawodniczących z IL-18 i blokujących receptor IL-18, oraz białek wiążących IL-18, ich izoform, mutein, białek fuzyjnych, pochodnych funkcjonalnych, frakcji aktywnych albo ich kołowo permutowanych pochodnych o zasadniczo takiej samej aktywności jak białka wiążące IL-18.

83. Zastosowanie według zastrz. 82, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest przeciwciałem przeciwko IL-18.

84. Zastosowanie według zastrz. 83, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko IL-18 jest humanizowanym przeciwciałem wobec IL-18.

85. Zastosowanie według zastrz. 84, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko IL-18 jest ludzkim przeciwciałem wobec IL-18.

86. Zastosowanie według zastrz. 82, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest białkiem wiążącym IL-18, albo jego izoformą, muteina, białkiem fuzyjnym, pochodną funkcjonalną frakcją aktywną albo ich kołowo permutowaną pochodną, które wykazują zasadniczo taką samą aktywność jak białko wiążące IL-18.

87. Zastosowanie według zastrz. 86, znamienne tym, że białko wiążące IL-18 jest modyfikowane PEG.

88. Zastosowanie według zastrz. 86, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest białkiem fuzyjnym zawierającym całość albo część białka wiążącego IL-18 w formie fuzji z całością albo częścią immunoglobuliny, przy czym białko fuzyjne wiąże IL-18.

89. Zastosowanie według zastrz. 88, znamienne tym, że białko fuzyjne zawiera cały region stały immunoglobuliny albo jego część.

90. Zastosowanie według zastrz. 89, znamienne tym, że immunoglobulina jest izotypu IgG1 albo IgG2.

PL 206 549 B1

91. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 79-90, znamienne tym, że lek ponadto zawiera interferon.

92. Zastosowanie według zastrz. 91, znamienne tym, że interferon jest interferonem-β.

93. Zastosowanie według zastrz. 91 albo 92, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany z interferonem równocześnie, kolejno albo oddzielnie.

94. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 79-93, znamienne tym, że lek ponadto zawiera antagonistę czynnika martwicy nowotworów (TNF).

95. Zastosowanie według zastrz. 94, znamienne tym, że antagonistą TNF jest rozpuszczalny receptor I TNF (TBPI) i/albo rozpuszczalny receptor II TNF (TBPII).

96. Zastosowanie według zastrz. 94 albo 95, znamienne tym, że inhibitor IL-18 i/albo interferon jest stosowany z antagonistą TNF równocześnie, kolejno albo oddzielnie.

97. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 79-96, znamienne tym, że lek zawiera ponadto inhibitor COX.

98. Zastosowanie według zastrz. 97, znamienne tym, że inhibitorem COX jest inhibitor COX-2.

99. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 79-98, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała, albo około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała albo około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała albo około 1 do 2 mg/kg masy ciała.

100. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 79-99, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,1 do 1000 μg/kg masy ciała, albo około 1 do 100 μg/kg masy ciała albo około 10 do 50 μg/kg masy ciała.

101. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 79-100, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany podskórnie.

102. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 79-100, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany domięśniowo.

103. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 79-102, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany codziennie.

104. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 79-102, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany co drugi dzień.

105. Zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania uszkodzeniu wątroby.

106. Zastosowanie według zastrz. 105 do terapii genowej.

107. Zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania zapaleniu stawów.

108. Zastosowanie według zastrz. 107 do terapii genowej.

109. Zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania chorobie zapalnej jelit.

110. Zastosowanie według zastrz. 109 do terapii genowej.

111. Zastosowanie wektora do wywoływania i/albo wzmacniania endogennej produkcji inhibitora IL-18 w komórce do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania uszkodzeniu wątroby.

112. Zastosowanie wektora do wywoływania i/albo wzmacniania endogennej produkcji inhibitora IL-18 w komórce do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania zapaleniu stawów.

113. Zastosowanie wektora do wywoływania i/albo wzmacniania endogennej produkcji inhibitora IL-18 w komórce do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania zapalnej chorobie jelit.

114. Zastosowanie genetycznie zmodyfikowanej do wytwarzania inhibitora IL-18 komórki do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania uszkodzeniu wątroby.

115. Zastosowanie genetycznie zmodyfikowanej do wytwarzania inhibitora IL-18 komórki do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania zapaleniu stawów.

116. Zastosowanie genetycznie zmodyfikowanej do wytwarzania inhibitora IL-18 komórki do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania zapalnej chorobie jelit.