BG108256A - Интерферон-гама полипептидни разновидности - Google Patents

Интерферон-гама полипептидни разновидности Download PDF

Info

Publication number
BG108256A
BG108256A BG108256A BG10825603A BG108256A BG 108256 A BG108256 A BG 108256A BG 108256 A BG108256 A BG 108256A BG 10825603 A BG10825603 A BG 10825603A BG 108256 A BG108256 A BG 108256A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
polypeptide
interferon
gamma
seq
amino acid
Prior art date
Application number
BG108256A
Other languages
English (en)
Inventor
Anne Jensen
Original Assignee
Maxygen Holdings Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Maxygen Holdings Ltd. filed Critical Maxygen Holdings Ltd.
Publication of BG108256A publication Critical patent/BG108256A/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до нови интерферон-гама полипептидни разновидности, проявяващи активност като на интерферон-гама (IFNG), до методи за тяхното получаване, до фармацевтични състави, които ги съдържат, и до приложението им при лечение на различни болести, в частност интерстициални белодробни заболявания, като идиопатична пулмонарна фиброза. Новите полипептидни разновидности включват заместване S99T в аминокиселинната последователност на човешки интерферон-гама или негови фрагменти. При провеждане на тази мутация природносъществуващите места за N-гликозилиране в позиция 97 се използват по-добре. Предпочита се полипептидните разновидности да включват и други модификации, например, за да се повиши AUC на тези разновидности, когато се администрират подкожно. а

Description

Настоящото изобретение се отнася до нови интерферон гама полипептидни разновидности, проявяващи активност като на интерферон гама (IFNG), до методи за тяхното получаване, до фармацевтични състави, които съдържат полипептидните разновидности и до приложението им при лечение на различни болести, в частност, лечение на интерстициални белодробни заболявания, като идиопатична пулмонарна фиброза.
Предшестващо състояние на техниката
Интерферон-гама (IFNG) е цитокин, продуциран от Т-лимфоцити и природни хищни клетки и съществува като хомодимер на две нековалентно свързани полипептидни НбДзЬЪна. * Завършената· форма на всеки димер включва 143 аминокиселинни остатъка (показани в SEQ ID N0:17), а тяхната предшестваща форма включва последователност от 166 аминокиселинни остатъка (показани в SEQ ID N0:18).
Всяко подзвено притежава две потенциални N-гликосилирани места (Aggarwal et al., Human Cytokines, Blackwell Scientific Publications, 1992) в позиции 25 и 97. В зависимост от степента на гликосилиране, молекулното тегло на интерферон-гама в димерната форма е 34-50 kDa (Farrar et al., Ann. Rev. Immunol., 1993,11: 571-611).
Началната последователност на необлагороден човешки интерферон© гама (hulFNG) е описана от Gray et al. (Nature 298: 859-863, 1982), Taya et al.
(EMBO J. 1: 953-958, 1982), Devos et al. (Nucleic Acids Res. 10: 2487-2501, 1982) и Rinderknecht et al. (J. Biol. Chem. 259: 6790-6797, 1984) и в EP 77670, EP 89676 и EP 110044. 3D структурата на човешкия интерферон-гама е описана от Ealick et al. (Science 252: 698-702, 1991).
Описани са различни природно-съществуващи или мутирали форми на полипептиди с интерферон-гама подзвено, включващо една Cys-Tyr-Cys Nкрайна аминокиселинна последователност (позиции (-3)-(-1), свързани със SEQ ID N0:17), една, включваща последователност с N-краен метионин (позиция -1, © свързана със SEQ ID N0:17), и различни С-крайни съкратени форми, включващи 127-134 аминокиселинни остатъка. Известно е, че от 1 до 15 аминокиселинни остатъка могат да бъдат заличени от С-края без да се унищожи интерферон-гама активността на молекулата. Още повече, хетерогенностга на С-края на човешкия интерферон-гама е описана от Pan et al. (Eur. J. Biochem. 166: 145-149,1987).
Мутанти на човешкия интерферон-гама (hulFNG) са описани от Slodowski et al. (Eur. J. Biochem. 202: 1133-1140, 1991), Luk et al. (J. Biol. Chem. 265: 1331413319, 1990), Seelig et al. (Biochemistry 27: 1981-1987, 1988), Trousdale et al. (Invest.
* · · * ·· ·»···· ···· ···♦ ·· · • · · ··· ··· • · · · ······ ·
Ophthalmol. Vis. Sci. 26: 1244-1251, 1985) й‘в EF” 146354. Природният вариант на човешкия интерферон-гама е описан от Nishi et al. (J. Biochem. 97: 153-159, 1985).
B US 6,046,034 са описани варианти на термостабилен рекомбинантен човешки интерферон-гама (rhulFNG) с въведени до 4 двойки цистеинови остатъци за да се осигури получаването на дисулфиден мост и, оттук, стабилизиране на интерферон-гама варианта в хомодимерна форма.
Във WO 92/08737 са описани интерферон-гама варианти, включващи прибавен метионин в N-края на пълната (остатъци 1-143) или частична (остатъци 1-132) аминокиселинна последователност на необлагородения човешки интерферон-гама (hulFNG). В ЕР 219 781 са описани частични последователности на човешкия интерферон-гама, включващи аминокиселинни остатъци 3-124 (на SEQ ID N0:17). В US 4,832,959 са описани частични последователности на човешкия интерферон-гама, включващи остатъци 1-127,
5-146 и 5-127 на аминокиселинна последователност, която, сравнена със SEQ ID N0:17, притежава три допълнителни N-крайни аминокиселинни остатъци (CysTyr-Cys). В US 5,004,689 е описана последователност на деоксирибонуклеинова киселина, кодираща човешкия интерферон-гама (hulFNG) без 3 N-крайните аминокиселинни остатъци (Cys-Tyr-Cys) и нейното проявление в Е.соИ. В ЕР 446582 е описан продуциран от Е.соН рекомбинантен човешки интерферонгама, свободен от N-краен метионин. В US 6,120,762 е описан пептиден фрагмент от човешки интерферон-гама, включващ негови остатъци 95-134 (по отношение на SEQ ID N0:18).
От Wang et al. (Sci. Sin. B 24: 1076-1084, 1994) е описано силното проявление на рекомбинантния човешки интерферон-гама.
От Curling et al. (Biochem. J. 272: 333-337, 1990) и Hooker et al. (J. of Interferon and Cytokine Research, 1998, 18: 287-295) е описан гликосилиран вариант на рекомбинантния човешки интерферон-гама.
От Kita et al. (Drug ώε.’ΌθΙϊνΤΒ’πδϊ-ίβ?,* *1990), и в EP 236987, и в US 5,109,120 е описана полимерна модификация на рекомбинантния човешки интерферон-гама.
Във WO 92/22310 са описани азиалогликопротеинови спрегнати производни на интерферони, сред тях и човешки интерферон-гама.
Описани са и кондензирани протеини на човешкия интерферон-гама. Например, в ЕР 0237019 е описан полипептид с единична верига, притежаващ област, показваща интерферон β активност, и една област, показваща интерферон-гама активност.
В ЕР 0158198 е описан полипептид с единична верига, притежаващ област, показваща интерферон активност и област, показваща IL-2 активност. В няколко съобщения са описани протеини с единична верига на димерен интерферон-гама, например, Landaretal. (J. Mol. Biol., 2000, 299: 169-179).
Във WO 99/02710 са описани полипептиди с единична верига, като един пример за тях е интерферон-гама.
Във WO 99/03887 са описани полиетиленгликилирани варианти на полипептиди, принадлежащи към семейството на растежния хормон, кьдето несъществен аминокиселинен остатък, локализиран в специфична област на полипептида, е заменен с цистеинов остатък. Интерферон-гама се споменава като един пример на член на семейството на растежния хормон, но неговата модификация не е дискутирана в детайли.
Интерферон-гама се предлага за лечение на интерстициални белодробни заболявания (известни също като интерстициална белодробна фиброза (IPF) (Ziesche et al. (N. Engl. J. Med. 341: 1264-1269, 1999 и Chest 110: Suppl: 25S, 1996) и EP 795332), за която цел интерферон-гама може да бъде прилаган в комбинация с преднизолон. С интерферон-гама, освен интерстициална белодробна фиброза, могат да бъдат лекувани още и грануломатозни болести (Bolinger et al., Clinical Pharmacy, 1992, 11: 834-850), някои микобактериални инфекции (N. Engl. J. Med. 330: 1348-1355, 1994), рак на бъбрека (J. Urol. 152: 841-845,* 1994), obYedrtopodd (N.’Engl. J. Med. 332: 1594-1599, 1995), склеродерма (J. Rheumatol. 23: 654-658, 1996), хепатит B (Hepatogastroenterology 45: 2282-2294, 1998), хепатит C (Int. Hepatol. Communic. 6: 264-273, 1997), септичен шок (Nature Medicine 3: 678-681, 1997) и ревматоиден артрит.
Рекомбинантният интерферон-гама се използва с известен успех като фармацевтично съединение, преди всичко, против някои вирусни инфекции и тумори. Рекомбинантният интерферон-гама обикновено се прилага парентерално, за предпочитане, подкожно инжектиране. Максимална концентрация в серума е установена след седем часа, полуживотът в плазмата е 30 минути след интравенозно администриране. По тази причина ефикасното лечение с рекомбинантен интерферон-гама включва често инжектиране. Основни странични ефекти са треска, простуда, изпотяване, главоболие, миалгия и сънливост. Тези ефекти се свързват с инжектирането на рекомбинантен интерферон-гама и се наблюдават в първите часове след инжектирането. Редки странични ефекти са локална болка и еритема, повишаване на чернодробните ензими, обратими грануло- и тромбопения и кардиотоксичност.
Във WO 01/36001 са описани нови спретнати съединения на интерферонгама, включващи непептидна част, свързана с полипептида на интерферонгама, която се модифицира чрез въвеждане и/или заличаване на прикачени места за такива непептидни части, например, полиетиленгликолови и гликосилирани места.
Известно е, че, когато N-гликосилирани молекули, като интерферон-гама, се продуцират в гликосилиращ домакин, не се използват всички потенциални места за N-гликосилиране. Това означава, че твърде често се получава смес на протеини с променлива степен на in vivo N-гликосилиране, което води до извода, че е необходимо следващо пречистване. Още повече, често се консумира време и е трудно отделянето на идентични протеини с променлива * ·· · ·♦ · ···· ·· · · ···· · · , • · · ··· ··· • · · · ······ · ··· ··· ···· степен на гликосилиране.*Изй£над££Сцс5’е усТйнсЯЗено, че при заместване на един или повече аминокиселинни остатъци, локализирани близо до in vivo мястото за N-гликосилиране (независимо от това, дали споменатото място за N-гликосилиране е природно съществуващо в интерферон-гама, или дали in vivo мястото за N-гликосилиране е въведено, както е описано в WO 01/36001) е възможно да се получи по-голяма фракция на напълно гликосилирани молекули на интерферон-гама. В частност, установено е, че променяйки природно съществуващото място за N-гликосилиране N-Y-S в позиции 97, 98 и 99 на човешкия интерферон-гама в N-Y-T драматично се повишава фракцията на напълно гликосилираните молекули на интерферон-гама.
Техническа същност на изобретението
Следователно, първият аспект на настоящото изобретение се отнася до интерферон-гама полипептидна разновидност, проявяваща интерферон-гама активност и, притежаваща аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID ΝΟ.Ί ([S99T]hulFNG) или неин фрагмент, проявяващ интерферон-гама активност.
В друг аспект, настоящото изобретение се отнася до разновидност на SEQ ID N0:1, включващ разновидност на фрагменти на SEQ ID ΝΟ.Ί (като SEQ ID N0:2-16), като споменатата разновидност включва поне една модификация и показва интерферон-гама активност.
В други аспекти, настоящото изобретение се отнася до нуклеотидна последователност, кодираща полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение.
В други аспекти, настоящото изобретение се отнася до вектор на изразяване на нуклеотидната последователност, съгласно настоящото изобретение, и до гликосилираща приемна клетка, включваща нуклеотидната • ·· · ·♦ · ···» ·· · · ······ е • · · ··· ··· • · · · ······ · ··· · · · · · · · последователност, съгласно *настдй£цд1о изобретение, или вектора на изразяване, съгласно настоящото изобретение.
Настоящото изобретение се отнася също и до фармацевтичен състав, включващ полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, полипептидна разновидност, съгласно настоящото изобретение, или до фармацевтичния състав, съгласно настоящото изобретение, който се използва като медикамент.
В други аспекти, настоящото изобретение се отнася до приложението на полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, или до приложението на фармацевтичния състав, съгласно настоящото изобретение, за производство на медикамент за лечение на интерстициални белодробни болести.
Аналогично, настоящото изобретение се отнася и до метод за лечение или превенция на интерстициални белодробни болести, характеризиращ се с това, че споменатият метод включва администриране върху бозайник, в частност, човек, на ефективно количество от полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, или от фармацевтичния състав, съгласно настоящото изобретение.
Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до популация от интерферон-гама полипептидни разновидности, или до състав, включващ популация от интерферон-гама полипептидни разновидности, като споменатата популация включва поне 70% от интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение.
В друг аспект, настоящото изобретение се отнася до метод за повишаване на степента на до in vivo N-гликосилирането на изходен интерферон-гама полипептид, което включва поне едно място за in vivo Nгликосилиране с аминокиселинната последователност N-X-S, където X е аминокиселинен остатък, с изключение на пролин, характеризиращ се с това, че споменатият метод включва заместване на остатъка серин в споменатата • · ·· • · • · • · · ··· ···· аминокиселинна последовЬТегМост КГ-Х-$*с остатъка треонин, за получаване на интерферон-гама разновидност.
В друг аспект, настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, характеризиращ се с това, че споменатият метод включва (а) отглеждане на гликосилираща приемна клетка, включваща нуклеотидна последователност, която кодира интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, при условия за изразяване на полипептидната разновидност;
(б) възможно in vitro взаимодействие на споменатата полипептидна разновидност с неполипептидна част при условия, при които протича конюгация; и (в) възстановяване на полипептидната разновидност.
От описанието, дадено по-долу, ще станат ясни и други аспекти на настоящото изобретение.
Описание на приложените фигури
На Фигура 1 е изобразен Western blot на оптимизирани гликосилирани разновидности на рекомбинантен човешки интерферон-гама.
Western blot отляво: Ред 1: стандарт, Ред 2: Actimmune®, Ред 3: рекомбинантен човешки интерферон-гама, Ред 4: [E38N] рекомбинантен човешки интерферонгама. Western blot в средата: Ред 1: стандарт, Ред 2: рекомбинантен човешки интерферон-гама, Ред 3: [E38N+S40T] рекомбинантен човешки интерферонгама. Western blot отдясно: Ред 1: стандарт, Ред 2: рекомбинантен човешки интерферон-гама, Ред 3: [S99T] рекомбинантен човешки интерферон-гама, Ред
4: [E38N+S40T+S99T] рекомбинантен човешки интерферон-гама.
На Фигура 2 е показана крива ’на акТивйбст на интерферон-гама по отношение на серумно време след подкожно администриране в плъхове.
·: Actimmune®, □: рекомбинантен човешки интерферон-гама,
V: [E38N+S40T+S99T] рекомбинантен човешки интерферон-гама.
Всички съединения се администрират в една и съща доза (1.15х107
AU/kg).
На Фигура 3 е показана крива на активност на интерферон-гама по отношение на серумно време след подкожно администриране в плъхове.
·: [N16C+S99T] рекомбинантен човешки интерферон-гама (5 kDa свързан mPEG);
□: [N16C+S99T] рекомбинантен човешки интерферон-гама (10 kDa свързан mPEG);
V: [E38N+S40T+S99T] рекомбинантен човешки интерферон-гама.
Разновидността [E38N+S40T+S99T] се администрира в доза 4.6x10®
AU/kg.
Подробно описание на изобретението
Определения
В настоящото изобретение са използвани следните определения:
Терминът “спрегнато съединение” (или равнозначния “спрегнат полипептид” или “спрегната разновидност”) означава хетерогенна (в смисъл на композит или химерно съединение) молекула, получена при ковалентно свързване на един или повече полипептидни разновидности към една или повече неполипептидни части.
Терминът “ковалентно свързване” означава, че полипептидната разновидност и неполипептидната част са или директно свързани към един друг, или други са индиректно ковалентно свързани към друг през напречна част или части, като мост, спейсер или свързваща част или части. Предпочита се, спрегнатото съединение да е разтворимо в съответни концентрации и • ·· · ·· · ···· ·· · · ···· · · · • · · ··· ··· • · · · ······ · условия, т.е. разтворимо във*физиологични флуиди* като кръв. Примерите за спрегнати полипептидни разновидности, съгласно настоящото изобретение, включват гликосилирани и/или полиетиленгликилирани полипептидни разновидности. Терминът “неспрегната полипептидна разновидност” може да бъде използван за полипептидната част на спрегнатата полипептидна разновидност.
Терминът “неполипептидна част” означава молекула, която е способна да се спрегне със закачена група към интерферон-гама полипептидна разновидност. Предпочитаните примери за такива молекули включват полимерни молекули, липофилни съединения, захарни остатъци или органични производни. Трябва да се разбира, че неполипептидната част е свързана с полипептидната през закачена група на полипептидната разновидност. Освен когато броят на неполипептидните части, като полимерни молекули, свързани с полипептидната разновидност на интерферон-гама, е изрично показан, всяко споменаване на “неполипептидна част”, свързана с полипептидна разновидност на интерферон-гама, или другаде в настоящото изобретение, ще се отнася до една или повече неполипептидни части, свързани с полипептидната разновидност на интерферон-гама.
Терминът “полимерна молекула” означава молекула, получена чрез ковалентно свързване на два или три мономера, при което никой от мономерите не е аминокиселинен остатък. Терминът “полимер” може да се използва взаимно заменяемо с термина “полимерна молекула”.
Терминът “захарен остатък” означава въглехидратна молекула, свързана чрез in vivo или in vitro гликосилиране, като N- или О-гликосилиране.
“Място за N-гликосилиране” има последователността N-X-S/T/C”, където X е аминокиселинен остатък, с изключение на пролин, N е аспарагин и S/T/C е серии, треонин или цистеин, за предпочитане, серин или треонин, като наймного се предпочита, треонин. “Място за О-гликосилиране” е хидроксилната група на серин или треонин.
• · · · · · ····
Терминът “закачена*група” означ^Ьа аМйно*йиселинен остатък, способен да се свърже със съответна неполипептидна част, като полимерна молекула или захарен остатък. В дадената по-долу таблица са показани полезни прикачени групи или техни съответстващи полипептидни части.
Закачена група Аминоки- селина Примери за неполипептидна част Метод за спрягане/ Активиране на PEG Литература
-МНг N-краен, Полимер, mPEG-SPA Shearwater Inc.
Lys напр. PEG Тресилиран Delgado et al.,
mPEG critical reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems,
9(3,4):249-304(1992)
-СООН С-краен, Полимер, mPEG-Hz Shearwater Inc.
Asp, Glu напр. PEG Захарен Свързване
остатък in vitro
-SH Cys Полимер, PEG-винилсулфон Shearwater Inc.
напр. PEG PEG-малеимид Delgado et al., critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,
9(3,4):249-304(1992)
Захарен Свързване
остатък in vitro
-ОН Ser, Thr, Захарен О-свързано
OH-, Lys остатък гликосилиране in vivo
-conh2 Asn като Захарен Гликосилиране
част от остатък in vivo
място за
N-глико-
силиране
Ароматен Phe, Туг, Захарен Свързване
остатък Тгр остатък in vitro
• ·· · ·· ·♦ · · ·· · · • ···· • 9 ·
-CONHg Gin _· · · » · · Захарен ..... остатък Свързване in vitro Yan and Wold, Biochemistry, 1984, Jul 31; 23(16): 3759-3765
Алдехид Окислен Полимер, Полиетилен- Andresz et al., 1973,
Кетон въглехидрат напр. PEG PEG-хидразид гликилиране Makromol. Chem. 179:301; WO 92/16555 WO 00/23114
Гуанидино Arg Захарен Свързване Lundblad and
остатък in vitro Noyes, Chimical Reagents for Protein
Modification, CRC
Press Inc. Boca
Raton, FL
Имидазолов His Захарен Свързване Както за
пръстен остатък in vitro гуанидино
За in vivo N-гликосилирането, терминът “прикачена група се използва в неконвенциален начин за индикиране на аминокиселинни остатъци, определящи мястото за N-гликосилиране (с последователността N-X-S/T/C, кьдето X е аминокиселинен остатък, с изключение на пролин, N е аспарагин и S/Т/С е серин, треонин или цистеин, за предпочитане, серин или треонин като най-вече се предпочита, треонин). Въпреки че аспарагиновият остатък на мястото за N-гликосилиране е място, кьдето по време на гликосилирането се закача захарен остатък, такова закачане не може да се осъществи, ако не съществуват други аминокиселинни остатъци на мястото за N-гликосилиране. Следователно, когато неполипептидната част е захарен остатък и спрягането се осъществява посредством N-гликосилиране, терминът ‘‘аминокиселинен остатък, включващ прикачена група за неполипептидната част”, използван във връзка с промените на аминокиселинния последователността на полипептидния интерферон-гама, трябва да се разбира като един, два или всичките аминокиселинни остатъци, съставящи мястото за N-гликосилиране се
999 • 9 ·9 •999
9 · 99
99»· • 999
променя(т) по такъв начин, *че* или функЦйонаМчо 1Яясто за N-гликосилиране се въвежда в аминокиселинната последователност, отделена от споменатата последователност, или функционално място за N-гликосилиране се оставя в аминокиселинната последователност (например, чрез заместване на остатъка серин, който вече съставлява част на място за N-гликосилиране, с остатъка треонин, и обратно).
В настоящото изобретение, наименованията на аминокиселините и наименованията на атомите (например, СА, СВ, CD, CG, SG, NZ, N, О, С и т.н.) се използват, както е описано в Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org), базирайки се на номенклатурата на IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (наименования на остатъкци, наименования на атоми и т.н.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984), заедно с техните корекции в Eur. J. Biochem, 152, 1 (1985). СА понякога означава Cm а СВ означава Ср. Терминът “аминокиселинен остатък” означава аминокиселинен остатък, включен в група, състояща се от остатъците аланин (Ala или А), цистеин (Cys или С), аспартинова киселина (Asp или D), глутаминова киселина (Glu или Е), фенилаланин (Phe или F), глицин (Gly или G), хистидин (His или Н), изолеуцин (Не или I), лизин (Lys или К), леуцин (Leu или L), метионин (Met или М), аспарагин (Asn или N), пролин (Pro или Р), глугамин (Gin или Q), аргинин (Arg или R), серин (Ser или S), треонин (Thr или Т), валин (Vai или V), триптофан (Тгр или W) и тирозин (Туг или Y).
Номерирането на аминокиселинните остатъци, съгласно настоящия документ, е от N-края на [S99T] човешкия интерферон-гама без сигнален лептид (т.е. SEQ ID N0:1) или, когато е уместно, от N-края на човешкия интерферон гама(т.е. SEQIDN0:17).
Използваната за идентифициране на аминокиселинните позиции/замествания терминология е следната: G18 означава позиция 18, заета от глицин в аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:17. G18N означава, че глициновият остатък от позиция 18 е заменен с Asn. Множествените замествания се означават с например, • · · · • · · • · · ·
G18N+S20T означава ’амйнокиселинна последователност, която включва
заместване на глициновия остатък в позиция 18 с аспарагин и заместване на сериновия остатък в позиция 20 с треонин. Алтернативните замествания са означени с Например, G18S/T покрива следните отделни замествания: G18S и G18T. Заличаването е означено със звездичка. Например, G18* показва, че глициновият остатък в позиция 18 е заличен. Вмъкванията се означават по следния начин: Вмъкване на допълнителен остатък серин след глицин, който е в позиция 18, се означава като G18GS. Смесени замествания и вмъквания се означават по следния начин: Заместване на глициновия остатък в позиция 18 със серин и вмъкване на Ala след аминокиселинния остатък в позиция 18, се означава като G18SA.
Терминът ‘нуклеотидна последователност” означава последователно удължаване на две или повече нуклеотидни молекули Нуклеотидната последователност може да бъде от геномен произход, от cDNA, RNA, полусинтетичен или синтетичен произход или от смесен произход.
Терминът “реакция на веригата на полимеразата” или “PCR” най-общо се отнася до метод за удължаване на желана нуклеотидна последователност in vitro, както е описан, например, в US 4,683,195. Най-общо, методът “реакция на веригата на полимеразата” включва последователни цикли на първична синтеза за удължаване при използване на олигонуклеотидни зародиши, способни да се хибридизират преференциално към шаблонна нуклеинова киселина.
“Клетка”, “клетка домакин”, “клетъчна линия” и “клетъчна култура” се използват в настоящото изобретение взаимозаменяемо и трябва да се разбира, че всички тези термини включват потомство в резултат на растежа или отглеждането на клетката.
“Трансформиране” или “трансфекция” се използват взаимозаменяемо за описване на процеса на въвеждане на деоксирибонуклеинова киселина в клетката.
• ·
J5 е · ···· • · · • · · · ·
нуклеотидни последователности посредством ензимна лигатура или другояче, в такава конфигурация, че да се осъществи нормална функция на последователностите. Например, нуклеотидна последователност, кодираща предварителна последователност или секреторен лидер, е действащо свързана към нуклеотидна последователност за полипептид, ако е изразена като предпротеин, който участва в отделянето на полипептида: промотор или подобрител са действащо свързани към кодираща последователност, ако действа на копиране на последователността; рибозомно свързващо място е действащо свързано към към кодираща последователност, ако е позиционирано така, че да улеснява преобразуването. Най-общо, “действащо свързан” означава, че свързаните нуклеотидни последователности са в съседство и, в случай на секреторен лидер, са съседни и във фазата на прочитане. Свързването се осъществява посредством лигатура на подходящи ограничителни места. Ако не съществуват такива места, се използват синтетични олигонуклеотидни адаптери или свързващи вещества, в съответствие със стандартните методи за рекомбинантна деоксирибонуклеинова киселина.
Използваният в настоящото изобретение термин “модификация” покрива заместване, вмъкване и заличаване.
Термините “мутиране” и “заместване” се използват взаимозаменяемо.
Терминът “въвеждане” означава, преди всичко, заместване на съществуващ аминокиселинен остатък, но може да означава, също така, вмъкване на допълнителен аминокиселинен остатък.
Терминът “отстраняване” означава, преди всичко, заместване на аминокиселинен остатък, който прави място за друг аминокиселинен остатък, но може да означава, също така, заличаване (без заместване) на аминокиселинния остатък, който се остранява.
. .. · ·46 ......
·· · · ·· · 1 II.
... · · · · · · ···· ······ !
·· * · · ·
Терминът аминокиселинен ‘остатък, включващ прикачена група за неполипептидната част” означава, че аминокиселинният остатък е този, към който се свързва неполипептидната част (в случай на въвеждане на аминокиселинен остатък) или ще бъде свързана (в случай на отстраняване на аминокиселинен остатък).
Терминът ‘ една разлика” или “различава се от”, използван във връзка със специфичнте модификации, позволява добавянето на разлики, присъстващиотделно от специфичната аминокиселинна разлика. Следователно, в допълнение към промените на описаните в настоящото изобретение аминокиселинни остатъци, с цел оптимизиране на приложението на местата за гликосилиране или отстраняване и/или въвеждане на аминокиселинни остатъци, включващи прикачена група за неполипептидна част, полипептидната разновидност на интерферон-гама може, ако се желае, да включва и други модификации, които не са свързани с тези промени. Те могат, например, да включват окастряне на С-края с един или повече аминокиселинни остатъци, прибавяне на един или повече допълнителни аминокиселинни остатъци на Ν- и/или С-края, например, прибавяне на Met остатък в N-края, прибавяне на аминокиселинната последователност Cys-TyrCys в N-края, както и “консервативни замествания на аминокиселини”, те. замествания, извършвани вътре в групите на аминокиселини със същите характеристики, например, малки аминокиселини, киселинни аминокиселини, полярни аминокиселини, базични аминокиселини, хидрофобни аминокиселини и ароматни аминокиселини. Примерите за консервативни замествания, съгласно настоящото изобретение, в частност, се подбират между показаните по-долу в Таблицата групи.
• • · • • _____ . _ - . __· ,, « · J ? ·· ··»· ·· · · · · ·· · ·· ······ ; Z....... · • · · · · · · · ·
I 1 I Аланин (Α) ie ··· --Ί j Глицин (G) Серин (S) Треонин (Т) 1
! п Аспартинова j Глутаминова i
| киселина (D) киселина (Е) 1 1
! 3 ί Аспарагин (N) Глутамин (Q) 1 1 1 ;
i > Λ ί Η ί Аргинин (R) ί Хистидин (Н) Лизин(К) Г - -------1 1 ί
j 5 ί . , ... Изолеуцн (1) Леуцин (L) Метионин (М) Валин (V) \
1 6 ί -J фенилаланин (F) Тирозин (Υ) Триптофан (W) i 1
Терминът “поне един”, използван за неполипептидна част, аминокиселинен остатък, заместване и т.н. означава един или повече.
Терминът “AUCsc” или “Area Under the Curve when administered subcutaneously” (Област под кривата след подкожно администриране”) се използва в обичайното си значение, т.е. като област под кривата интерферонгама активност серум-време, където интерферон-гама полипептидната разновидност се администрира подкожно, в частност, когато се администрира подкожно на плъхове. Веднъж определени, експерименталните точки на кривата интерферон активност - време, AUCsc може лесно да се изчисли с компютърна програма, като GraphPad Prism 3 01.
Терминът “функционален in vivo полуживот” е използван в обичайното му значение, т.е. времето, за което все още съществува 50% от биологичната активност на полипептида в тялото/атакувания орган, или времето, за което активността на полипептида е 50% от първоначалната стойност.
Като алтернатива на определянето на функционалния in vivo полуживот. може да се определи серумен полуживот , т.е. времето, за което 50% от полипептида циркулира в плазмата или кръвния поток, преди да бъде изчистен. Определянето на серумния полуживот често е по-просто от определянето н? функционалния in vivo полуживот, а величината на серумния полуживот обикновено е добра индикация за величината на функционалния in vivo полуживот. Алтернативните термини за серумен полуживот включват плазмен полуживот”, .18
циркулационен полуживот”, • · · » ·· • · · · “серумно изчистване”, “плазмено изчистване” и “полуживот на изчистване” Серумният полуживот може удобно да бъде определен при плъхове, виж главата Материали и методи. Важно е да се отбележи, че терминът “серумен полуживот”, използван в настоящото изобретение, за дадена полипептидна разновидност на интерферон-гама трябва да се определя за проба, която е администрирана интравенозно.
Терминът “серум” се използва в обичайното си значение, т.е. той се отнася до кръвна плазма без фибриноген и други фактори за съсирване
Полипептидът обикновено се изчиства под въздействие на една или
повече от ретикулоендотелиалните системи (RES), бъбреците, далака или черния дроб или посредством специфична или неспецифична протеолиза. Терминът “ренално изчистване” се използва в обичайното си значение, за индикиране на изчистване с помощта на бъбреците, например, чрез гломеруларна филтрация, тубуларна екскреция или тубуларна елиминация. Обикновено, реналното изчистване зависи от физичните характеристики на полипептида, включително молекулно тегло, размер (по отношение на клапана за гломеруларно филтриране), симетрия, форма/твърдост, зареждане.
закачени въглехидратни вериги и наличие на клетъчни рецептори за полипептида. Молекулно тегло около 67 kDa е нормално за стойността на клапана за ренално изчистване. Реналното изчистване може да бъде измерено с помощта на някой подходящ анализ, например, установен in vivo анализ. Например, реналното изчистване може да бъде определено чрез администриране на маркиран (например, радиационно маркиран или флуоресцентно маркиран) спрегнат полипептид върху пациент и измерване на активността на малкера в урина, събрана от пациента. Пониженото ренално изчистване се определя по отношение на сравнителна молекула, като човешки интерферон-гама, [S99T] човешки интерферон-гама. или Actimmune®. функционалността, която се задържа, обикновено се подбира между
антивирусна, антипролиферативна, имуномодулаторна или интерферон-гама рецепторна свързваща активност.
Терминът “повишен’', използван за функционалния т vivo полуживот или за серумния полуживот, се прилага да покаже, че съответният полуживот на интерферон-гама разновидността е статистически значително повишен по отношение на този на сравнителна молекула, като гликосилиран човешки интерферон-гама (SEQ ID N0:17), гликосилиран [S99T] човешки интерферонгама (SEQ ID N0:1) или Actimmune® (SEQ ID N0’34 - продуциран в Е cob) когато се администрират интравенозно и, когато се определят при сравнителни условия. Следователно, интересните интерферон-гама полипептидни разновидности са тези разновидности, които притежават повишен функционален in vivo полуживот или повишен серумен полуживот в сравнение с някоя от гореспоменатите сравнителни молекули.
По-специално, интересните интерферон-гама полипептидни разновидности са тези разновидности, при които съотношението между серумния полуживот (или функционалния in vpo полуживот) на споменатата разновидност и серумния полуживот (или функционалния in vivo полуживот) на човешки интерферон-гама или [S99T] човешки интерферон гама в техните гликосилирани форми, е поне 1.25, за предпочитане, поне 1.50, като поне 1.75. например, поне 2, повече се предпочита, поне 3, поне 4, например, поне 5, когато се администрират интравенозно. по-специално, когато се администрират интравенозно върху плъхове.
Други примери за интересни интерферон-гама полипептидни разновидности са тези разновидности, при които съотношението между серумния полуживот (или функционалния in vivo полуживот) на споменатата разновидност и серумния полуживот (или функционалния т vivo полуживот) на Actimmune® (SEQ ID N0:34 - продуциран в Е cob) е поне 2, повече се предпочита, поне 3, като поне 4, например, поне 5, още повече се предпочита, поне 6, като поне 7, например, поне 8, а най-много се предпочита, поне 9, като
···· ······ · • · · ······ • · · · ······ · • · · ·· · · * ·,, поне 10, когато се администрират ’интравенозно, по-специално, когато се администрират интравенозно върху плъхове
Терминът “повишен”, когато се използва за AUCsc, се използва за да покаже, че Area Under the Curve when administered subcutaneously (Област под кривата след подкожно администриране) на интерферон-гама разновидността, съгласно настоящото изобретение, когато се администрира подкожно, статистически значително повишен по отношение на този на сравнителна молекула, като гликосилиран човешки интерферон-гама (SEQ ID N0:17), гликосилиран [S99T] човешки интерферон-гама (SEQ ID N0:1) или Actimmune® (SEQ ID N0:34 - продуциран в Е соА), определени при сравнителни условия. Следователно, предпочитаните интерферон-гама разновидности са тези разновидности, които имат повишен AUCsc в сравнение с някоя от горепосочените сравнителни молекули. Очевидно, същото количество интерферон-гама и сравнителна молекула трябва да бъде администрирано за разновидността на интерферон-гама, съгласно изобретението. Следователно, за да се направи директно сравнение между различни интерферон-гама молекули, стойностите на AUCsc трябва да се нормализират, т.е. те трябва да бъдат изразени като AUCsc/администрирана доза.
Особено предпочитани интерферон-гама полипептидни разновидности са тези разновидности, при които съотношението между AUCsc на споменатата разновидност и AUCsc на гликосилиран човешки интерферон-гама или гликосилиран [S99T] човешки интерферон-гама е поне 1.25, като поне 1.5, например, поне 2, повече се предпочита, поне 3, като поне 4, например, поне 5, още повече се предпочита, поне 7, като поне 8, например, поне 9 или поне 10, а най-много се предпочита, поне 12, като поне 14, например, поне 16 или поне 20, особено, когато се администрират подкожно върху плъхове.
Други примери за особено интересни интерферон-гама полипептидни разновидности са тези разновидности, при които съотношението между AUCsc на споменатата разновидност и AUCsc на Actimmune® е поне 100, повече се
« ·· • · · • · • · • · • · • • · • ..21 • · • · • · • · • · ···· • · · • · · • · · · • · · · • · · ·
предпочита, поне 150, • · · · · като поне ’200, например. поне 250, още повече се
предпочита, поне 300, като поне 400, например, поне 500, а най много се
предпочита, поне 750, като поне 1000, например, поне 1500 или поне 2000.
особено, когато се администрират подкожно върху плъхове.
Терминът “Tmax,sc” се използва за времето за активност на интерферонгама в кривата серум - време, когато се наблюдава най-висока активност на интерферон-гама в серума. Предпочитаните интерферон-гама полипептидни разновидности са тези разновидности, които притежават повишен Tma<sc в сравнение с Actimmune® и/или в сравнение с гликосилиран човешки интерферон-гама. По-специално, тези предпочитани разновидности имат Tmax.sc (когато е определен след подкожно администриране върху плъхове) поне 200 минути, като поне 250 минути, например, поне 300 минути, повече се предпочита, поне 350 минути, като поне 400 минути.
Терминът “редуцирана имуногенност” показва, че интерферон-гама полипептидната разновидност повишава измеримо по-ниската имунна реакция по отношение на сравнителната молекула, например, човешки интерферонгама или Actimmune®, определена при сравнителни условия. Имунната реакция може да бъде реакция на клетка или антитяло (виж, например, Roitt: Essentia! Immunology (8th Edition, Blackwell) за по-нататъшно определяне на имуногенността). Обикновено понижената реактивоспособност на антитялото е индикация за понижена имуногенност Понижената имуногенност може да бъде определена при използване на известен на специалистите метод, например, in vivo или in vitro.
В контекста на настоящото изобретение, термините “повишено гликосилиране”, “повишена степен на in vivo N-гликосилиране” или “повишена степен на N гликосилиране” означават повишени нива на свързани въглехидратни молекули, обикновено получени като следствие на повишено (или по-добро) използване на местата за гликосилиране. Известно е, (Hooker et al., 1998, J. Interferon and Cytokine Res. 18, 287-295; Sarenva et al., 1995, Biochem ·· ··· · ·· · ♦ ······ ♦ :: : . : : : . : : ’· : : : .. · · ·#<· ·,.·
J., 308, 9-14), че, когато*в CAO клетки се изразява човешки интерферон-гама, само около 50% от молекулите на интерферон-гама използват и двете места за гликосилиране, около 40% използват едно място за гликосилиране (1N) и около 10% не са гликосилирани (0N). Повишената степен на in vivo N-гликосилиране може да бъде определена по известен на специалистите метод, например, посредством SDS-PAGE. Един удобен анализ за определяне на повишеното гликосилиране е метод, описан в раздела “Определяне на повишено гликосилиране” в Материали и методи.
Използваният в настоящото изобретение термин “популация на интерферон-гама полипептидни разновидности” или “състав, включващ популация на интерферон-гама полипептидни разновидности се отнася до състав, съдържащ поне два интерферон-гама полипептиди, гликосилирани в различна степен. Както трябва да се разбира, настоящето изобретение се отнася до методи за получаване на популация на интерферон-гама полипептиди, при които повишено количество интерферон-гама молекули, присъстващи в популацията, са напълно гликосилирани.
Следователно, настоящото изобретение се отнася и до хомогенна популация на интерферон гама полипептиди, съгласно настоящото изобретение (те. популация, при която повечето от интерферон-гама полипептидите са напълно гликосилирани) или до състав, включващ хомогенна популация от интерферон-гама полипептиди, съгласно настоящото изобретение. Например, популацията от интерферон-гама полипептиди може да включва поне 70% интерферон-гама полипептид, съгласно настоящото изобретение, за предпочитане, поне 75%, като поне 80%, например, поне 85%, повече се предпочита, поне 90%, като поне 95%, например, поне 96%, още повече се предпочита, поне 97%, като поне 98%, например, поне 99%.
Терминът показваш активност като интерферон-гама’ означава, че полипептидната разновидност притежава една или повече от функциите на природния човешки интерферон-гама или на рекомбинантния човешки • ·· * ·· ···· ·· · · ·· · · ··· • · · · · ® · ·· • · * · ····** * ··« ··· 4 · ·· интерферон-гама, включва‘щи способност за свързване с рецептор на интерферон гама и причиняване на трансдукция на сигнала, трансдуциран от свързването човешкия интерферон-гама с неговия рецептор, както е определено /л i/zfro или in vivo (т.е. in vitro или in vivo биоактивност). Рецепторът на интерферон-гама е описан от Aguet et al. (Cell 55:273-280, 1988) и Calderon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4837-4841, 1988). Подходящ анализ за изследване на активността на интерферон-гама е анализът, наречен “Първичен анализ”, описан в настоящото изобретение. Когато се използва описаният в настоящото изобретение първичен анализ, полипептидната разновидност, “проявяваща интерферон-гама активност”, притежава специфична активност от поне % в Ό сравнение с тази на рекомбинантния човешки интерферон-гама. Трябва да се разбере, че в зависимост от това, какви модификации са провеждани, например, дали разномидностга е полиетиленгликолирана или не, може да се достигне активност в широки граници. Следователно, примерите за специфична активност могат да варират от 5% до 150%, в сравнение с рекомбинантния човешки интерферон-гама. Например, специфичната активност може да бъде поне 10% (например. 10-125%), като поне 15% (например, 15-125%), например, поне 20% (като 20-125%), поне 25% (например, 25-125%). поне 30% (например. 30-125%), поне 35% (например, 35-125%), поне 40% (например, 40-125%), поне 45% (например, 45-125%), поне 50% (например, 50-125%), поне 55% (например, 55-125%), поне 60% (например, 60-125%), поне 65% (например, 65-125%), поне 70% (например, 70-125%), поне 75% (например, 75-125%), поне 80% (например, 80-125%) или поне 90% (например, 90 110%), в сравнениеу със специфичната активност на рекомбинантния човешки интерферон-гама.
“Интерферон-гама полипептид” представлява полипептид, показващ активността на интерферон-гама, т.е. терминът “Интерферон-гама полипептид” се използва за всяка молекула интерферон-гама (независимо дали тази молекула е човешки интерферон-гама, негова форма или негова разновидност) толкова дълго,
..24 • · • · • · · • · колкоТд* Споменатата
молекула интерферон-гама показва интерферон-гама активност, както е дефинирана в настоящото изобретение Терминът “Интерферон-гама полипептид” се използва в настоящото изобретение като полипептид в мономерна или димерна форма, както е подходящо. Например, когато се определят специфичните замествания те обикновено се определят по отношение на мономера на полипептида на човешкия интерферон-гама. Когато се прави сравнение с молекулата на интерферон-гама, съгласно настоящото изобретение, тя обикновено е в димерна форма (и, оттук, например, съдържа два мономера на интерферон-
гама полипептида, модифицирани, както е описано). Димерната форма на интерферон-гама полипептидите може да бъде получена при обикновено асоцииране на два мономера или да бъде под форма на димерен интерферонгама полипептид с единична верига
Терминът изходен интерферон-гама” означава интерферон-гама полипептид, притежаващ място за гликосилиране, подобрено, съгласно настоящото изобретение. Въпреки че изходният полипептид модифициран, съгласно настоящото изобретение, може да бъде всеки полипептид с интерферон-гама активност, и, оттук, да бъде с всякакъв произход, например, не от човек, предпочита се, изходният полипептид да бъде човешки интерферон-гама с аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:17 или неин фрагмент.
“Фрагмент” е част от завършена по дължина последователност на интерферон-гама полипептид (например, фрагмент на човешки интерферснгама полипептид с пълна верига, показан в SEQ ID N0:17 или фрагмент на [S99T] човешки интерферон-гама полипептидна разновидност с пълна верига, показан в SEQ ID N0:1), показващ интерферон-гама активност, например, негов С-краен или N-краен пресечен вариант. Специфичните примери за фрагменти на интерферон-гама полипептидна разновидност включват [S39T] човешки интерферон-гама полипептидна разновидност, в С-края намалена с 1-
аминокиселинни остатъка, например, 1*ам*инокиселинен остатък (SEQ iD N0:2), 2 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:3), 3 аминокиселинни остатъка (SEO ID N0:4). 4 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:5), 5 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:6), 6 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:7), 7 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:8), 8 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:9), 9 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:10), 10 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:11), 11 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:12), 12 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:13), аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:14), 14 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:15) или 15 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:16) и/или в N края намалена с 13 аминокиселинни © остатъка. Специфичните примери за фрагменти на човешки интерферон-гама включват човешки интерферон гама, който в С-края е намален с 1 15 аминокиселинни остатъка, например, 1 аминокиселинен остатък (SEQ ID N0:19), 2 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:20), 3 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:21), 4 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:22), 5 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0 23), 6 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:24), 7 аминокиселинни остатъка (SEQ Ю N0:25), 8 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:26), 9 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:27), 10 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:28), 11 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:29). 12 © аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:30), аминокиселинни остатъка (SEQ ID
N0:31), 14 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:32) или 15 аминокиселинни остатъка (SEQ ID N0:33) и/или в N-края намален с 1-3 аминокиселинни остатъка.
Както е показано по-горе, интерферон-гама полипептидната разновидност може да включва и поне една модификация в допълнение на S99T заместването, докато споменатият вариант показва интерферон-гама активност, т.е. разновидността може да бъде [S99T] човешки интерферон-гама полипептидна разновидност или разновидност на фрагмент на [S99T] човешки интерферон-гама полипептидна разновидност. Специфични примери за такива
• · · ··· ···· '·· ·· ··· ·· ·· ·· разновидности са разновидности, притежаващи въведени и/или отстранени аминокиселинни остатъци, включващи прикачена група към неполипептидната част. Други примери за [S99T] човешки интерферон-гама полипептидна разновидност (или нейни фрагменти) са разновидностите, описани в “Предшестващо състояние на техниката”, по-горе в настоящото изобретение, които включват, например, [S99T] човешки интерферон-гама полипептидна разновидност с добавяне в N-края на Cys-Tyr-Cys или Met, и модифицирани с цистеин разновидности, описани в US 6,046,034.
Обикновено разновидностите, съгласно настоящото изобретение, са кодирани с нуклеотидна последователност, която, в сравнение с нуклеотидната последователност, кодираща изходния интерферон-гама полипептид, е модифицирана, съгласно настоящото изобретение.
Това, обаче, не винаги става така, тъй като полипептидната разновидност може да бъде подложена на С- или N-крайно скъсяване през време на обработването след преместването, например чрез С- или N-крайно разцепване от протеази в клетката, в средата на изразяване, през време на пречистване и т.н., така че, получената полипептидна разновидност е скъсена версия на първоначално получената полипептидна разновидност (например, въпреки че най-напред се получава разновидност с пълна дължина, може да се получи скъсена в С-края полипептидна разновидност, в зависимост от обработването след преместването на полипептидната разновидност с пълна дължина). В този случаи, изходен’ може да означава скъсена форма, която се модифицира, съгласно настоящото изобретение.
Терминът “разновидност’’ означава полипептид, който се различава с един или повече аминокиселинни остатъци от изходния полипептид (обикновено SEQ ID N0:17 или някоя друга нейна скъсена форма, показана в SEQ ID N0:19-33), обикновено с 1-15 аминокиселинни остатъка (като с 1, 2. 3, 4. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокиселинни остатъка), например, с 1-10
а · ·>27 a <. ··♦· ·· · · ·· · · · · · ···· ······ · • · · ·· · ·»»*·>·* аминокиселинни остатъка** с *1**5 аминокиселинни остатъка или с 1-3 аминокиселинни остатъка.
Терминът функционално място означава един или повече аминокиселинни остатъка, които са от голямо значение за включване във функцията или изявата на интерферон-гама Тези аминокиселинни остатъци са поставени” на функционалното място. Функционалното място може да бъде определено по известни на специалистите методи, за предпочитане, чрез анализ на структурата на полипептида, свързан комплексно със съответния рецептор, като рецептора на интерферон-гама.
Терминът “човешки интерферон-гама” означава развитата форма на необлагороден вид човешки интерферон-гама, притежаващ аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:17.
Терминът “рекомбинантен човешки интерферон-гама” означава развитата форма на необлагороден вид човешки интерферон-гама, притежаващ аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:17, която е получена по рекомбинантен метод.
Терминът “[899Т]човешки интерферон-гама” означава развитата форма на необлагороден вид човешки интерферон-гама, в която остатъкът серин в позиция 99 е заменен с остатъка треонин (показан в SEQ ID N0:1).
Използваният в настоящото изобретение термин “гликосилиран човешки интерферон-гама” означава, че човешкият интерферон гама полипептид се продуцира в клетка, способна да гликосилира полипептида и, следователно, човешкият интерферон-гама полипептид е гликосилиран в неговите природни места за N-гликосилиране (позиции 25 и 97 на SEQ ID N0:17)
По същия начин, терминът “гликосилирана разновидност на човешки интерферон-гама” означава, че интерферон-гама полипептидната разновидност се продуцира в клетка, способна да гликосилира полипептидната разновидност.
• ·· · ·· · · ·· · • · · · · е• · · • · · ··»·
Използваният • · · · · »·· ·· ··· в настоящото • · . · · · · изобретение термин ‘Actimmune® се отнася до 140 аминокиселинна форма (Actimmune® е скъсен в С края с 4 аминокиселинни остатъка и включва един N-краен остатък Met) на интерферонгама (показан в SEQ ID N0:34), получена при ферментация на създадената посредством генно инженерство бактерия £ cob. Повече информация за
Actimmune® може да се намери в www,actimmune.com.
ИНТЕРФЕРОН-ГАМА ПОЛИПЕПТИДНА РАЗНОВИДНОСТ, СЪГЛАСНО
НАСТЯЩОТО ИЗОБРЕНИЕ
Интерферон-гама разновидност съгласно настоящото с оптимизирани т vivo гликосилирани места
Както е показано по-горе. изненадващо е установено, че гликосилирането на природно съществуващото място за N-гликосилиране в позиция 97 на човешкия интерферон-гама може да бъде усилено, т.е. може да бъде получена усилена фракция на напълно или почти напълно гликосилирани молекули на интерферон-гама, посредством заменяне на остатъка серин в позиция 99 на човешкия интерферон гама (или на негови фрагменти) с треонин. При разглеждането на фигура 1 се вижда, че може да се постигне значително повишаване на степента на напълно гликосилиран интерферон-гама полипептид. За [899Т]човешки интерферон-гама (SEQ ID N0:1) полипептидната разновидност може да се види, че напълно се гликосилират две места за Nгликосилиране в около 90% от полипептидните разновидности, присъстващи е отглежданите в културна среда, докато само около 60% рекомбинантни човешки интерферон-гама полипептиди, присъстващи в културната среда, се гликосилират напълно.
Следователно, в своя първи аспект, настоящото изобретение се отнася до интерферон-гама полипептидна разновидност, проявяваща интерферонгама активност и притежаващи аминокиселинната последователност, показана
···· ······ · • · · ··· ·· · · в SEQ ID N0:1 (т.е. [SlfelT човешки интерферон-гама) или неин фрагмент, проявяващ интерферон-гама активност
Както вече е дискутирано по-горе, известно е, че С-крайно скъсените форми на човешкия интерферон-гама остават активни и, в някои случаи, даже имат повишена активност, в сравнение с човешкия интерферон-гама. Следователно, един интересен аспект на настоящото изобретение се отнася до интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, която е фрагмент на SEQ ID N0:1, С-крайно скъсен с 1-15 аминокиселинни остатъка, обикновено, С-крайно скъсен с 1-10 аминокиселинни остатъка. Специфични примери за такива скъсени форми на SEQ ID N0:1 са описани в SEQ ID N0:2-16. Интерферон-гама полипептицният фрагмент, съгласно този аспект на настоящото изобретение, проявява интерферон-гама активност.
Трябва да се разбере, че гликосилираните интерферон-гама лолипептидни разновидности, съгласно този аспект на настоящото изобретение, трябва да се изразяват рекомбинантно в гпикосилиращите приемни клетки, за предпочитане, в приемни клетки на бозайник, като някои, описани в раздела “Свързване към захарен остатък”.
Както беше обяснено по-горе, само около 50-60% от цялата популация на изразени интерферон-гама полипептиди са напълно гликосилирани, когато в СНО клетките се изразява рекомбинантен човешки интерферон-гама. Следователно, едно от главните предимства на интерферон-гама полипептидните разновидности, съгласно настоящото изобретение, е по голямото приложение на позиция 97 на мястото за /л vivo N-гликосилиране, което води до получаване на по-хомогенна популация, в сравнение с човешкия интерферон-гама. Поради по-хомогенната популация, съставите (например, културна среда), включващи такава популация от интерферон-гама лолипептидни разновидности, не се изисква тежко и време-отнемащо пречистване, както при рекомбинантния човешки интерферон-гама.
··«·
Следователно, друг аспект на* настоящото изобретение се отнася до популация на интерферон-гама полипептидни разновидности, или до състави, включващи популация на интерферон-гама полипептидни разновидности, характеризиращи се с това, че споменатата популация включва поне около 70% от интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение. Предпочита се, съставът да включва поне 75%, повече се предпочита, поне 80%, още повече се предпочита, поне 85%, като около 90% от интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение.
По-специално, настоящото изобретение се отнася до популация чз интерферон-гама полипептидни разновидности, или до състави, включващи популация на интерферон-гама полипептидни разновидности, характеризиращи се с това, че споменатата популация включва поне около 70%, за предпочитане, поне 75%, повече се предпочита, поне 80%, още повече се предпочита, поне 85%, като около 90% от интерферон-гама полипептидната разновидност, притежаваща аминокиселинната последователност показана в SEQ ID N0:1.
Аналогично, настоящото изобретение се отнася и до популация на интерферон-гама полипептидни разновидности, или до състави, включващи популация на интерферон-гама полипептидни разновидности, характеризиращи се с това, че споменатата популация включва поне около 70%, за предпочитане, поне 75%, повече се предпочита, поне 80%, още повече се предпочита, поне 85%, като около 90% от интерферон-гама полипептидната разновидност, притежаваща аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID N0:1. SEQ ID N0:2, SEQ iD N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15 и SEQ ID N0:16.
ф<31 ··<·· « « · ·<
• · · ·· « · · · ·· • · ·· · · ·«·'·· · ·· ·· ♦· ··
В допълнение към вече споменатата S99T мутация, необходима за оптимизиране на мястото за in vivo N-гликосилиране в позиция 97 в рекомбинантния човешки интерферон-гама, могат да бъдат оптимизирани и други места за in vivo гликосилиране, които са въведени в SEQ ID N0:1 или негови фрагменти (например, за да се повиши серумният полуживот и/или да се повиши AUCsc)· Обикновено, мястото за in vivo гликосилиране е място за in vivo N-гликосилиране, но също и място за О-гликосилиране, съгласно настоящото изобретение. Това оптимизиране може да бъде постигнато чрез извършване на модификация, за предпочитане, заместване, в позиция, локализирана близо до мястото за гликосилиране, по-специално, близо до мястото за in vivo N-гликосилиране. Обикновено, такова място за in vivo Nгликосилиране е въведено място за in vivo N-гликосилиране. Специфични примери за подходящи позиции за въвеждане на места за in vivo Nгликосилиране са описани в W0 01/36001 и по-долу в настоящото изобретение.
Аминокиселинен остатък “локализиран близо до” място за гликосилиране, обикновено е в позиция -4, -3, -2, -1, +1, +2, +3 или +4 по отношение на аминокиселинния остатък на мястото за гликосилиране, към което се закача въглехидрат, за предпочитане в позиция -1, +1 или +3, в частност, в позиция +1 или +3. Следователно, аминокиселинният остатък, локализиран близо до мястото за in vivo N-гликосилиране (с последователност N-X-S/T/C), може да бъде в позиция -4, -3, -2, -1, +1, +2, +3 или +4, по отношение на N-остатька.
Когато позиция +2, по отношение на N-остатька, се модифицира, трябва да се разбере, че са възможни само ограничен брой модификации, тъй като, за да се поддържа/въвежда място за in vivo N-гликосилиране, аминокиселинният остатък в споменатата позиция може да бъде Ser, Thr или Cys.
Особено предпочитан аспект на настоящото изобретение се отнася до модификация на аминокиселинния остатък в позиция +2, по отношение на мястото за in vivo N-гликосилиране, която е заместване, когато въпросният
,.. · ·· 32 * ···· .: . * ·: : : :: .· • : :
аминокиселинен ocTaftk ‘de замени с thr остатък. Ако. от друга страна, споменатият аминокиселинен остатък вече е Thr остатък, нормално е да не се предпочита или да е необходимо някакво заместване в тази позиция. Когато X е модифициран, X не трябва да бъде Pro и, за предпочитане, да не бъде Тгр, Asp, Glu и Leu. Още повече, аминокиселинният остатък, който се въвежда, за предпочитане, се подбира от групата, състояща се от Phe, Asn, Gin, Tyr, Vai, Ala, Met, He, Lys, Gly, Arg, Thr, His, Cys и Ser, като повече се предпочитат, Ala, Met, lie, Lys, Gly, Arg, Thr, His, Cys и Ser, по-специално, Ala или Ser.
Когато позиция +3. по отношение на N-остатька, се модифицира, аминокиселинният остатък, който се въвежда, за предпочитане, се подбира от групата, състояща се от His, Asp, Ala, Met, Asn, Thr, Arg, Ser и Cys, като повече се предпочитат, Thr, Arg, Ser и Cys. Тези модификации са съществени, ако X остатъкът е Ser.
Следователно, по отношение на природно съществуващото in vivo Nгликосилиране, се вижда, че мястото за N-гликосилиране в позиция 97, трябва да бъде оптимизирано чрез провеждане на модификация, като заместване, в позиция, подбрана от групата, състояща се от Е93, К94, L95, Т96, Y98, V100 и Т101 (т.е. в позиции -4, -3, -2, -1, +1, +2, +3 или +4, по отношение на N97). Специфични примери за замествания в позиция 98 на SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти) включват Y98F, Y98N, Y98Q, Y98V, Y98A, Y98M, Y98I, Y98K, Y98G, Y98R, Y98T, Y98H, Y98C и Y98S, за предпочитане, Y98A, Y98M, Y98I, Y98K, Y98G, Y98R, Y98T, Y98H, Y98C и Y98S, по-специално, Y98S. Специфични примери за замествания в позиция 100 на SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти) включват V100H, V100D, V100A, V100M, V100N, V100T, V100R V100S и V100C, по-специално, V100T, V100R V100S и V100C.
По същия начин, по отношение на мястото за in vivo N-гликосилиране в позиция 25, се вижда, че това място може да бъде оптимизирано чрез провеждане на модификация, като заместване, в позиция, подбрана от групата, състояща се от D21, V22, А23, D24, G26, L28 и F29 (т.е. в позиции -4, -3, ·· •» •· •9
..33 « · • · • · · • · ··«· •· • · •· • ·· «·
2. -1, +1, +2, +3 или *4*4,* по отношение*на N25). Специфични примери за замествания в позиция 25 на SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти) включват
G26F, G26N, G26Y, G26Q, G26V, G26A, G26M, G26I, G26K, G26R. G26T, G26H, G26C и G26S, за предпочитане, G26A, G26M, G26I, G26K, G26R, G26T, G26H, G26C и G26S, като повече се предпочитат, G26A и G26S, по-специално, G26A. Специфични примери за замествания в позиция 28 на SEQ ID N0:1 (или неини фрагменти) включват G28H, G28D, G28A, G28M, G28N, G28T, G28R, G28S или G28C, по-специално, G28A, G28T, G28R, G28S или G28C.
Очевидно, всяка от модификациите, спомената във връзка с
оптимизиране на гликосилирането в позиция 97, може да бъде комбинирана в всяка от гореспоменатите модификации, провеждани във връзка с оптимизиране на гликосилирането в позиция 25.
Интерферон-гама разновидности, съгласно настоящото изобретение,____с повишени AUCsc и/или серумен полуживот
Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до интерферонгама полипептидна разновидност. притежаваща аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:1, където споменатата разновидност проявява интерферон-гама активност.
Още повече, настоящото изобретение се отнася и до интерферон-гама полипептиден фрагмент, притежаващ аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15 и SEQ ID N0:16, където споменатата разновидност проявява интерферон-гама активност.
Следователно, такава разновидност включва поне една модификация, по отношение на SEQ ID N0:1-16.
• «ί --···· .
За да се избегнетвърде гояямотб П(ЗекЪЪвДне на структурата и функцията на [S99T] човешки интерферон-гама полипептидна разновидност (или нейни фрагменти), общият брой аминокиселинни остатъци, които се променят, съгласно настоящото изобретение, обикновено не надвишава 15. Обикновено, интерферон-гама полипептидната разновидност включва 1-10 модификации по отношение на аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:1, като 1-8, 2-8, 1-5, 1-3 или 2-5 модификации по отношение на аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:1. Предпочита се, модификацията(иите) да е(са) заместване. Трябва да се разбира, че това се отнася за разновидности на фрагменти от интерферон-гама полипептидна разновидност, притежаваща аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:1. Следователно, когато разновидността е разновидност на някоя от последователностите, описани в SEQ ID N0:2-16, такава разновидност обикновено включва по-малко от 15 модификации, обикновено 1-10 модификации, по отношение на аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:2-16, като 1-8, 2-8, 1-5, 1-3 или 2-5 модификации по отношение на аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:216. Предпочита се, модификацията(иите) да е(са) заместване.
Следователно, такава интерферон-гама полипептидна разновидност (т.е. разновидност, включваща поне една модификация в допълнение към S99T заместването) съдържа аминокиселинна последователност, която се различава от аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти) с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокиселинни остатъка.
В предпочитания аспект на настоящото изобретение, интерферон-гама разновидността включва и поне един въведен и/или поне един отделен аминокиселинен остатък, включват прикачена група за неполипептидната част.
Чрез отстраняване или въвеждане на аминокиселинен остатък, съдържащ прикачена група към неполипептидната част, възможно е, ·· β ··♦ · · полипептидът специфичпо да се ттрйопосд&Т, Чака че молекулата да стане поподатлива на спрягане с избраната неполипептидна част и да се оптимизира спрягането (например, да се осигури оптимално разпределение на неполипептидните части върху повърхността на интерферон-гама полипептидната разновидност) и, следователно, да се получи нова спрегната молекула, която показва интерферон-гама активност и, в допълнение, едно или повече подобрени свойства в сравнение с познатите днес молекули на базата на човешки интерферон-гама или на рекомбинантен човешки интерферон-гама. Например, при въвеждане на прикачени групи, интерферон-гама полипептидната разновидност се уголемява или по друг начин се променя по съдържание на специфични аминокиселинни остатъци, към които се свързва съответната неполипептидна част, при което се постига по-ефикасно, поспецифично и/или по-широко спрягане. Чрез отстраняване на една или повече прикачени групи е възможно да се избегне спрягане с неполипептидната част в части на полипептида, в които такова спрягане не е желателно, например, с аминокиселинен остатък, локализиран във или близо до функционалното място на полипептида (тъй като спрягането в такова място води до инактивиране или понижаване на интерферон-гама активността на получения спрегнат полипептид, което се дължи на повредено рецепторно разпознаване). Още повече, предимство е отделянето на прикачена група, локализирана близо до друга прикачена група за да се избегне хетерогенното спрягане на тези групи. В предпочитаните аспекти, повече от един аминокиселинен остатък на интерферон-гама полипептида се променя, например, промяната обхваща отделяне, както и въвеждане на аминокиселинни остатъци, включващи места за закачане, за избраната неполипептидна част. Този аспект е от голям интерес, тъй като е възможно интерферон-гама полипептидната разновидност специфично да се конструира, така че да се получи оптимално спрягане с неполипептидната част.
·· · ** · * * * · · ···· ••i ······ .
: : : · *·
В допълнение къТй· отделянето· «и/или· въвеждането на аминокиселинни остатъци, полипептидната разновидност може да включва и други модификации, например, замествания, които не се отнасят до отделяне и/или въвеждане на аминокиселинни остатъци, включващи прикачени групи към неполипептидната част. Примерите за такива модификации включват консервативни аминокиселинни замествания и/или въвеждане на Cys-Tyr-Cys ими Met в N-края.
Точният брой прикачени групи, участващи в спрягането и налични в интерферон-гама полипептидната разновидност в димерна форма зависи от ефекта, който се желае да се постигне при спрягането. Полученият ефект, например, е зависим от природата и степента на спрягането (например, идентичността на неполипептидната част, броя на неполипептидните части, които се желае и, които е възможно да бъдат свързани с лолипептида, къде трябва да бъдат свързани или къде свързването трябва да се избегне, и т.н.).
Трябва да се разбере, че аминокиселинният остатък, включващ закачена група за неполипептидната част, било отстранена, или въведена, се подбира на база на природата на избраната неполипептидна част и, в повечето случаи, на база на използвания метод на конюгация. Например, когато неполипептидната част е полимерна молекула, като получен от полиетиленгликол или полиалкиленоксид аминокиселинен остатък, способен да функционира като закачена група, може да се подбира от групата, състояща се от цистеин, лизин, аспартинова киселина, глутаминова киселина и аргинин. По-специално, предпочита се цистеин. Когато неполипептидната част е захарен остатък, прикачената група е, например, място за in vivo гликосилиране, за предпочитане, място за N-гликосилиране.
Когато и да бъде въведена във или отделена от интерферон-гама полипептида, притежаващ аминокиселинна последователност, показана като SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти), прикачена група за неполипептидната е· · · ·· • · • * • ♦ част, позицията на полйггегтгида, «оятв’се *м0йкф14цира, се подбира по следния начин:
Предпочита се позицията да е локализирана на повърхността на интерферон-гама полипептида, а повече се предпочита, да бъде заета от аминокиселинен остатък, на който повече от 25% от страничната му верига е изложена на разтворителя, за предпочитане, повече от 50% от страничната му верига е изложена на разтворителя, определено на базата на 3D структурата или модел на интерферон-гама в димерната му форма, като структурата или моделът могат да включват една или две интерферон-гама рецепторни молекули. Тези позиции са представени в Пример 1, по-долу в настоящото изобретение.
Интерес представлява, също така, модифициране на някои от 23 Скрайни аминокиселинни остатъци на изходен интерферон-гама (по-специално, чрез въвеждане на аминокиселинни остатъци, включващи прикачена група за неполипептидната част, като цистеинови остатъци), тъй като се счита, че тези остатъци са локализирани на повърхността на интерферон-гама полипептида.
В допълнение, интересно би било да се модифицират един или повече аминокиселинни остатъци, локализирани в районите с бримки на интерферонгама полипептида, тъй като повечето аминокиселинни остатъци, локализирани в районите с бримки, са изложени към повърхността и локализирани в голяма степен далече от функционалните места, така че неполипептидни части, като полимерни молекули, по-специално молекули на полиетиленгликол и/или места за N-гликосилиране, могат да бъдат въведени, без да се накърни функцията на молекулата. Тези области с бримки могат да бъдат идентифицирани с очакване за тридименсионална структура на човешкия интерферон-гама. Аминокиселинните остатъци, съставящи споменатите бримки, са остатъци N16К37 (“А-В бримка”), F60-S65 (‘В-С бримка”), N83-S84 (‘ С-D бримка”) Y98-L103 (“DЕ бримка”).
··· · · · ·
Аминокиселинни*ге остатъци, ·състав^Фдд’ мястото за интерферон-гама рецепторно свързване, са Q1, D2, Y4, V5, Е9, U12, G18, Н19, S20, D21, V22, А23, D24, N25, G26, Т27, L30, К34, К37, К108, Н111, Е112, 1114, Q115, А118, Е119 (виж също, Пример 2, по-долу). Най-общо, предпочита се, прикачените групи към неполипептидната част (като допълнителни места за N-гликосилиране и/или цистеинови остатъци) да не бъдат въведени на това място на молекулата.
За да се определи оптималното разпределение на прикачените групи, разстоянието между аминокиселинните остатъци, локализирани на повърхността на интерферон-гама полипептида, се изчеслява на базата на 3D структурата на интерферон-гама димерния полипептид. По-специално, определя се разстоянието между СВ на аминокиселинните остатъци, включващи тези прикачени групи, или разстоянието между функционалната група (NZ за лизин, CG за аспартинова киселина, CD за глутаминова киселина, SG за цистеин) на един и СВ на друг аминокиселинен остатък, включващ прикачена група. В случай на глицин, СА се използва вместо СВ. В интерферонгама полипептидната част на спрегнатото съединение, съгласно настоящото изобретение, предпочита се, някои от споменатите разстояния да са повече от 8 А, по-специално, повече от 10 А, за да се избегне или редуцира хетерогенното спрягане.
Също така, аминокиселинната последователност на интерферон-гама полипептида може да се различава от тази на SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти) по това, че един или повече аминокиселинни остатъка, съставящи част от епитопа са отделени, за предпочитане, чрез заместване на аминокиселинен остатък, включващ прикачена група, с неполипептидна част, така че епитопът да се разруши или инакгивира. Епитопите на [S99T] човешкия интерферон-гама, човешкия интерферон-гама или на рекомбинантния човешки интерферон-гама могат да бъдат идентифицирани по известни на специалистите методи, известни също като картографиране на епитопа, виж, Romagnoli et al., Biol. Chem., 1999, 380 (5): 553-9, DeLisser HM, Methods Mol. Biol., • · · * l : : · · · ·
1999, 96:11-20. Van de Water et al.,*GliR«1mrhur1(5k.lYnmunopathol.. 1997, 85 (3): 229 35, Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119 (1): 77-81 и Lane DP, Stephen CW, Curr Opin. Immunol., 1993, 5 (2): 268-71. По един метод се наблюдава библиотека от статистически олигопептиди от, например, девет аминокиселинни остатъка. lgG1 антителата от специфични антисера по отношение на [S99T] човешки интерферон-гама, човешки интерферон-гама или на рекомбинантен човешки интерферон-гама, се пречистват посредством имуноутаяване и реактивните фаги се идентифицират посредством имуномаркиране. При установяване на последователността на деоксирибонуклеиновата киселина на пречистените реактивни фаги, може да бъде определена последователността на олигопептида, последвано от локализиране на последователността върху 3D структурата на интерферон-гама. Така идентифицираният регион върху структурата съдържа епитоп, като след това може да бъде избран като желан регион за въвеждане на прикачена група за неполипептидната част.
Функционалният In vivo полуживот и серумният полуживот са, например, зависими от молекулното тегло на полипептидната разновидност и броят на прикачените групи, необходим за удължаване на полуживота, следователно, зависи от молекулното тегло на неполипептидната част. В един аспект, интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, има молекулно тегло поне 67 kDa, в частност, поне 70 kDa, измерен посредством SDS-PAGE, съгласно Laemmli, U.K., Nature, Vol. 227 (1970), p. 680-85. Интерферон-гама има молекулно тегло в интервала 34-50 kDa и, следователно, допълнително около 20-40 kDa се изисква за да се получи желания ефект Това може да се постигне, например, с 2-4 10 kDa молекули полиетиленгликол или чрез комбиниране на допълнителни места за in vivo гликосилиране и допълнителни молекули полиетиленгликол, или по друг начин.
Предпочита се, спрегнатата интерферон-гама полипептидна разновидност, съгласно настоящото изобретение, да включва МО (допълнителни) неполипептидни части, като 1-8, 2-8, 1-5 13 или 2-5
(допълнителни) неполипептидни части* ОбикТчЪвбно спрегнатата разновидност включва 1-3 (допълнителни) неполипептидни части, като 1, 2 или 3 (допълнителни) неполипептидни части.
Както е отбелязано по-горе, във физиологични условия човешкият интерферон-гама съществува като димерен полипептид. Полипептидът обикновено е в хомодимерна форма (например, получена при асоцииране на две интерферон-гама полипептидни молекули, получени, както е описано в настоящото изобретение). Обаче, ако се желае, интерферон-гама полипептидната разновидност може да бъде получена под формата на единична верига, кьдето два интерферон-гама полипептидни мономера се свързват през пептидна връзка или пептиден спейсер. Получаването на интерферон-гама полипептидната разновидност под формата на единична верига има това предимство, че двата съставни интерферон-гама полипептида могат да бъдат различни, което е предимство, например, когато се извършва асиметрична мутагенеза на полипептидите. Например, местата за свързване с полиетиленгликол могат да бъдат премахнати от мястото за рецепторно свързване от единия от мономерите, но да останат в другия. По този начин, след свързването с полиетиленгликол, единият мономер притежава непокътнато място за рецепторно свързване, докато другият може да бъде напълно свързан с полиетиленгликола (и оттук, значително повишаване на молекулното тегло).
Интерферон-гама разновидности, съгласно настоящото изобретение, в които неполипептидната част е захарен остатък
В един предпочитан аспект на настоящото изобретение, интерферонгама разновидността на SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти) включва поне едно въведено място за гликосилиране и/или поне едно отстранено място за гликосилиране. Предпочита се, мястото за гликосилиране за бъде място за за in vivo N-гликосилиране, т.е. неполипептидната част да е захарен остатък.
*·· ··· ·. · например, 0-свързан ЙИи ^-свързан· захарен «остатък, за предпочитане, N свързан захарен остатък.
В един интересен аспект на настоящото изобретение, споменатата разновидност включва поне едно въведено място за гликосилиране, поспециално, въведено място за in vivo N-гликосилиране. Предпочита се. въведеното място за гликосилиране да се въвежда чрез заместване.
Например, място за in vivo N-гликосилиране се въвежда в позиция на интерферон-гама полипептида на SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти), включваща аминокиселинен остатък върху повърхността. Предпочита се, споменатият аминокиселинен остатък върху повърхността да има поне 25% от страничната верига, обърната към повърхността, по-специално, поне 50% от страничната верига да е обърната към повърхността. Подробности, отнасящи се до определяне на тези позиции, може да се намерят в Пример 1 по-долу.
Мястото за N-гликосилиране се въвежда по такъв начин, че N-остатъкът на споменатото място се локализира в споменатата позиция. Аналогично, мястото за О-гликосилиране се въвежда по такъв начин, че S или Т остатъкът се локализира в споменатата позиция. Трябва да се разбира, че, когато терминът “поне 25% (или 50% от неговата странична верига, изложена към повърхността’’ се използва във връзка с въвеждане на място за /л vivo Nгликосилиране, този термин се отнася до повърхностната достижимост на страничната верига на аминокиселината в позицията където е възможно закачането на захарния остатък. В много случаи е необходимо да се въведе серин или треонин в позиция +2, по отношение на аспарагиновия остатък, към който действително е закачен захарен остатък, и тези позиции, в които са въведени серин или треонин, е възможно да се скрият, т.е. по-малко от 25% (или 50%) от техните странични вериги да бъдат изложени към повърхността на молекулата.
Още повече, за да се постигне ефективно гликосилиране, предпочита се, мястото за in vivo гликосилиране, по-специално N-остатъкът на мястото за N42 ··· ;····» · гликосилиране или S или·! остйфькьТ нЗ.МЯРхото за О-гликосилиране, да се локализира в 118 N крайните аминокиселинни остатъци на интерферон гама полипептида, за предпочитане, е 97 N-крайните аминокиселинни остатъци. Още повече се предпочита, мястото за in vivo гликосилиране да се въвежда в позиция, където само една мутация е необходима за създаване на мястото (т.е. където кои да са други аминокиселинни остатъци, необходими за създаване на функционално място за гликосилиране, вече присъстват в молекулата).
Например, заместванията, които водят до въвеждане на допълнително място за N-гликосилиране в позиции на повърхността на интерферон-гама полипептида, заети от аминокиселинни остатъци, притежаващи повече от 25% странични вериги в контакт с повърхността (в структура с рецепторна молекула) включват:
Q1N + P3S/T, P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, E9N + L11S/T, K12S/T, K13N + F15S/T. Y14N + N16S/T, Q18S/T, Q18N, Q18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N + L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37S/T, K37N + E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N + D41S/T, S40N + R42S/T, K55N + F57S/T. K58N + F60S/T, K61S/T, K61N + D63S/T, D62N+Q64S/T, D63N, D63N+S65T, Q64N + I66S/T,
S65N+Q67S/T, Q67N, Q67N + S69T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, T72N+K74S/T, K74N+D76S/T, E75N + M77S/T, K80S/T, W9N + F81S/T. K80N + F82S/T N85S/T. S84N + K86S/T, K87S/T, K86N + K88S/T, K87N + R89S/T, D90N+F92S/T,
E93N + L95S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N + L103S/T,
D102N + N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, E119N, E119N+S121T,
P122N + A124S/T, A123N + K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N + G127S/T,
T126N + K128S/T. G127N + R129S/T, K128N + K130S/T, R129N + R13IS/T. K130N. K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T,
M134N + F136S/T, L135N + R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T
G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N и R140N+S142T. като заместването е по отношение на [399Т]човешкия интерферон-гама с аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:1 (или по отношение на неин • * · ·«. · · фрагмент, притежаващ’аминокиселинната* лбблейователност, показана в SEQ Ю N0:2-16). S./T означава заместване със серин или треонин, за предпочитане, треонин.
Заместванията, които водят до въвеждане на допълнително място за N гликосилиране в позиции на повърхността на интерферон-гама полипептида, притежаващи повече от 50% странични вериги в контакт с повърхността (в структура с рецепторна молекула) включват:
P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, K12S/T, K13N + F15S/T, Q18S/T, D21N+A23S/T, G26N + L28S/T, G31N + L33S/T, K34N+W36S/T. K37N + E39S/T. E38N, E38N+S40T. E39N+D41S/T, K55N + F57S/T, K58N + F60S/T, K61S/T, D62N+Q64S/T, Q64N + I66S/T, S65N+Q67S/T, K68N + V70S/T, E71N + I73S/T. E75N+M77S/T. N85S/T, S84N+K86S/T, K86N + K88S/T, K87N + R89S/T K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N + N104S/T, L103N + V105S/T, Q106S/T.
P122N+A124S/T, А123N + К125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T,
T126N + K128S/T, G127N + R129S/T, K128N + K130S/T, R129N + R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T S132N + M134S/T, Q133N + L135S/T,
M134N + F136S/T, L135N + RI37S/T, F136N + G138S/T, R137N + R139S/T.
G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N и R140N+S142T, като заместването е по отношение на [899Т]човешкия интерферон-гама с аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:1 (или по отношение на неин фрагмент, притежаващ аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:2-16). S/Т означава заместване със серин или треонин, за предпочитане, треонин.
Заместванията, когато се изисква само едно аминокиселинно заместване за въвеждане на място за N-гликосилиране, включват K12S/T, G18S/T, G18N, K37S/T, E38N, M45N, I49N, K61S/T, D63N, Q67N, V70N, K80S/T F82N, N85S/T, K87S/T, K94N, S99N, Q106S/T, E119N, A124N, K130N и R140N, поспециално, K12S/T, G18S/T, G18N, K37S/T, E38N, K61S/T, D63N, Q67N, K80S/T, N85S/T. K94N, S99N, Q106S/T, A124N. K130N и R140N (позиции, където повече от • · ♦ « ··«· : : · · · • · · « · • · · · « · ·· • · · • · • · ·
25% от страничните ВЕрйГи саг‘в*«м0нтЛкт* ^.повърхността в структура без рецепторна молекула), или най вече, G18N, E38N, D63N, Q67N, K94N, S99N,
Ai24N, KI SON и R140N (позиции, в които повече от 50% от страничните вериги са в контакт с повърхността в структура без рецепторна молекула).
Обикновено не се предпочита въвеждане на места за N-гликосилиране в областите, съставящи рецепторното свързващо място (освен в специални случаи, виж, раздела “Разновидности с понижен рецепторен афинитет”)
Следователно, мутациите Q1N + P3S/T, E9N + UIS/T, G18N, G18N+S20T,
H19N + D21S/T, D21N+A23S/T G26N + L28S/T. K34N + W36S/T, K37N + E39S/T.
E119N и E119N+S121T обикновено не се провеждат, ако не се желае понижен рецепторен афинитет.
Особено предпочитаните разновидности, съгласно настоящото изобретение, включват разновидност на SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти, притежаващи аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:216), характеризираща се с това, че споменатата разновидност проявява интерферон-гама активност и с това, че включва поне едно заместване, подбрано от групата, състояща се от K12S, К12Т. G18S, G18T. Ε38Ν. E38N+S40T. K61S, К61Т, N85S, Ν85Τ, Κ94Ν, Q106S и Q106T, за предпочитан©, подбрано от групата състояща се от К12Т, GI8T, E38N+S40T, К61Т, Ν85Τ, Κ94Ν и Q106T, като повече се предпочита, подбрано от групата, състояща се ст ΚΙ2Τ, G13T, E38N + S40T, К61Т и Ν85Τ, по-специално, E38N + S40T.
В друг интересен аспект на настоящото изобретение, разновидността на SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти, притежаващи аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:2-16) включва поне две въведени места за гликосилиране, по-специално, поне две въведени места за Nгликосилиране. Модификациите, по-специално, заместванията, които са поне две, водят до въвеждане на поне две въведени места за N-гликосилиране, и могат да бъдат подбрани от групата, състояща се от K12S, К12Т, G18S, G18T, E3SN, E38N + S40T, K61S, К61Т, N85S, N85T, K94N, Q106S и Q106T, за
• · · · · ί * · * · предпочитане, подбра^’of групата, ‘състояф^Ле от К12Т, G18T, E38N+S40T, К61Т, N85T, K94N и Q106T, като повече се предпочита, подбрано от групата, състояща се от К12Т, G18T, E38N+S40T, К61Т и N85T Специфични примери за такива замествания, които водят до получаване на разновидност, включваща поне две допълнителни места за N-гликосилиране. включват· K12T+G18T. K12T+E38N+S40T, К12Т+К61Т, K12T+N85T, G18T+E38N+S40T, G18T+K61T, G18T+N85T, E38N+S40T+K61T, E38N + S40T+N85T и K61T+N85T.
От горния списък на заместванията, за предпочитане се избират такива, локализирани при 118 N-крайни аминокиселинни остатъци, по-специално, при 97 N-крайни аминокиселинни остатъци.
Интерферон-гама гюлипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, може да съдържа единично място за in vivo гликосилиране (в сравнение с SEQ ID N0:1 или нейни фрагменти). Обаче, за да се постигне достатъчно удължен серумен полуживот, често е необходимо полипептидът да включва повече от едно места за in vivo N-гликосилиране, по-специално, 2 7 или 2-5 допълнителни места за tn vivo N-гликосилиране, като 2, 3, 4 или 5 места за tn vivo N-гликосилиране. Такива места за in vivo N-гликосилиране. за предпочитане, се въвеждат чрез едно или повече от горепосочените s списъка замествания.
Разновидности на интерферон-гама, съгласно настоящото изобретение, в които неполипептидната част е молекула, притежаваща цистеин като прикачена група
В друг предпочитан аспект на настоящото изобретение, интерферон гама разновидността на SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти) включва поне един въведен цистеинов остатък Например, цистеинов остатък може да бъде въведен в позиция на интерферон-гама полипептид на SEQ ID N0:1 (или неини фрагменти), включваща аминокиселинен остатък, изложен към повърхността. Предпочита се, споменатият аминокиселинен остатък, изложен към ··· ·· * · повърхността да притежава и®не»»*5%..0Тра*Нични вериги, изложени към повърхността, по-специално, поне 50% странични вериги, изложени към повърхността. Подробности, отнасящи се до определянето на тези позиции, могат да се намерят в Пример 1 на настоящото изобретение.
Например, заместванията, които водят до въвеждане на цистеинов остатък в позиции, изложени към повърхността на интерферон-гама полипептида, окупирани от аминокиселинен остатък, притежаващ поне 25% странични вериги, изложени към повърхността (в структура с рецепторна молекула), включват: Q1C, D2C, РЗС, К6С, Е9С, N10C, К13С, Y14C, N1SC. G18C. Н19С, D21C, N25C, G26C, G31C, К34С, N35C, К37С, Е38С, Е39С, S40C, К55С, К58С, N59C, К61С. D62C, D63C. Q64C, S65C, Q67C, К68С, Е71С. Т72С, К74С, Е75С, N78C,
V79C, К80С, N83C, S84C, N85C, К86С, К87С, D90C, Е93С, К94С, Т101С, D102C, L103C, N104C и Е119С, като заместванията се отнасят до [S99T] човешки интерферон-гама с аминокиселинната последователност, показана в SEQ iD N0:1 (или до неин съответен фрагмент, притежаващ аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:2-16).
Заместванията, които водят до въвеждане на цистеинов остатък в позиции, обърнати към повърхността на интерферон-гама полипептида и окупирани от аминокиселинен остатък, поне 50% странични вериги, изложени към повърхността (в структура с рецепторна молекула), включват; РЗС, К6С, N10C, К13С. N16D, D21C, N25C, G26C, G31C, К34С, К37С, Е38С, Е39С, К55С, К58С, N59C, D62C, Q64C, S65C, К68С, Е71С, Е75С, N83C, S84C, К86С, К87С, К94С, N97C, S99C, Т101С, D102C, L103C и N104C, като заместванията се отнасят до [S99T] човешки интерферон-гама с аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:1 (или до неин съответен фрагмент, притежаващ аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:2 16).
Обикновено не се предпочита въвеждане на цистеинов остатък (и последващо закачане на цистеиновия остатък към неполипептидната част) в областите, съставящи рецепторното свързващо място (освен в специални
J · · ····..
• J J* ··»«·· » случаи, например, виж· раздел^· *ШзнбайД«с£ти с понижена рецепторна активност”). Следователно, мутациите QIC, Е9С, G18C. Н19С, D21C G26C, К34С, К37С и Е119С обикновено не трябва да се провеждат, ако не се желае понижаване на рецепторната активност.
По-специално, споменатият цистеинов остатък се въвежда при заместване, подбрано от групата, състояща се от N10C, N16C, Е38С, N59C, N83C, К94С, N104C И А124С.
В друг интересен аспект на настоящото изобретение, разновидността с SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти, притежаващи аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0:2-16) притежава поне два въведени © цистеинови остатъка. Тези поне две модифкации, за предпочитане, замествания, водещи до въвеждане на поне два цистеинови остатъка, за предпочитане, се подбират от групата, състояща се от N10C, N16C, Е38С, N59C, N83C, К94С, N104C и А124С. Специфичните примери за тези замествания удължаващи разновидността, включваща поне два въведени цистеинови остатъка, включват N10C+N16C, N10C+E38C, N10C+N59C, N10C+N83C,
N10C+K94C, N10C+N104C, N10C+A124C, N16C+E38C, N16C+N59C,
N16C+N83C, N16C+K94C, N16C+N104C, N16C+A124C, E38C+N59C, E38C+N83C, Е38С+К94С, E38C+N104C. Е38С+А124С. N59C+N83C, N59C+K94C, © N59C+N104C, N59C+A124C, N83C+K94C, N83C+N104C, N83C+A124C,
K94C+N104C, К94С+А124С и N104C+A124C.
Трябва да се разбере, че въведеният цистеинов остатъц(ци) воже да се свърже към неполимерна част, например, полиетиленгликол или, за предпочитане, mPEG. Конюгацията между цистеин-съдържащата полипептидна разновидност и полимерната молекула може да се осъществи по някакъв подходящ начин, например, както е описано в раздела “Свързване към полимерна молекула, например, при използване на едноетапен или многоетапен метод. Предпочитаният метод за свързване на интерферон-гама полипептидна разновидност с полиетиленгликол е ковалентно свързване на гюлиетиленгликола • · > w · <
··цистеиноеи
*.©ЬТа.тъци, при използване на реактивоспособни към цистеин полиетиленгликоли Редица високо специфични реактивоспособни към цистеин полиетиленгликоли с различни гр\/пи
(например, орто -пиридил дисулфидни, малеимидни и виниг.сулфонови) и полиетиленгликоли с различна молекулна маса (2-20 kDa, като 5 kDa 10 kDa, 12 kDa или 15 kDa) се намират в търговската мрежа, например, производство на Shearwater Polymers Inc. Huntsville, AL, USA).
Трябва да се разбере, че гогеспоменатите модификации могат да бъдат комбинирани с някоя друга модификация, описана в раздела Интерферонгама разновидности, съгласно настоящото изобретение, с оптимизирани in vivo гликосилирани места”, по-специално, със заместването G26A.
Интерферон-гама разновидности, съгласно настоящото изобретение, в които първата неполипептидна част е захарен остатък, а втората неполипептидна част е молекула, която притежава цистеин като закачена група
В друг предпочитан аспект на настоящото изобретение, интерферонгама разновидността с SEQ ID N0:1 (или неини фрагменти) включва поне едно въведено място за N-гликосилиране и поне един въведен цистеинов остатък Тези варианти могат да бъдат получени чрез подбиране на остатъците описани в двата предишни раздела, с подходящи позиции за въвеждане, съответно, на места за N-гликосилиране и цистеинови остатъци. Обаче, в предпочитан аспект на настоящото изобретение, интерферон-гама разновидността включва замествания, подбрани от групата, състояща се от K12T+N16C, К12Т+Е38С, K12T+N59C, K12T+N83C, К12Т+К94С, K12T+N104C, К12Т+А124С. GI8T+NWC, G18T+E38C, G18T+N59C, G18T+N83C. G18T+K94C, G18T+N104C, G18T+A124C, E38N+S40T+N10C, E38N + $4ПТ+М16С.
E38N+S40T+N59C, E38N+S40T+N83C, E38N+S40T+K94C. E38N+S40T+N104C, E38N+S40T+A124C, KS1T+N10C, K61T+N16C, К61Т+Е38С, K61T+N83C,
К61Т+К94С, K61T+N104C, К61Т+А124С. N85T+N10C, N85T+N16C, N85T+E38C, : : : · ·.
N85T+N59C. N85T+K9«fe, Н85ТШ1ШС. М85ЧЧД124С,
K94N + N10C. K94N + N16C.
K94N + E38C, K94N + N59C, K94N + N83C, K94N + N104C, K94N+A124C,
Q106T+N10C, Q106T+N16C, Q106T+E38C, Q106T+N59C. Q106T+N83C.
Q106T+K94C и Q106T+A124C, повече се предпочитат замествания, подбрани от групата, състояща се от E38N+S40T+N10C. E38N + S40T+N16C, E38N+S40T+N59C, E38N+S40T+N83C, E38N+S40T+K94Cn E38N+S40T+N104C.
Трябва да се разбере, че въведеният цистеинов остатък може, за предпочитане, да бъде свързан с неполипептидна част, например, полиетиленгликол или, за предпочитане, mPEG. Конюгацията между цистеин съдържащата полипептидна разновидност и полимерната молекула може да се
осъществи по някакъв подходящ начин, например, както е описано в раздела “Свързване към полимерна молекула”, например, при използване на едноетапен или многоетапен метод. Предпочитан полимер е VS mPEG или OPSS-mPEG.
Трябва да се разбере, че гогеспоменатите модификации могат да бъдат комбинирани с някоя друга модификация, описана в раздела Интерферонгама разновидности, съгласно настоящото изобретение, с оптимизирани т wg гликосилирани места”, по-специално, със заместването G26A.
Интерферон-гама разновидности с понижен рецепторен афинитет
Един начин за удължаване на серумния полуживот на интерферон-гама полипептида е понижаване на управляваната от рецептора имтернализация, при което се понижава управляваното от рецептора изчистване. Управляваната от рецептора интернализация зависи от афинитета на ди*«ера на интерферон-гама спрямо интерферон-гама рецепторния комплекс и, следователно, очаква се придаването на нови свойства на интерферон-гама разновидност с понижен афинитет спрямо интерферон-гама рецепторния комплекс, и оттук, изчистване до по-ниска степен.
Афинитетът на дйМера на гмтерфер©н‘-1*аъ{а спрямо неговия рецепторен комплекс може да бъде понижен чрез провеждане на една или повече модификации, по-специално, замествания, на рецепторното свързващо място на интерферон-гама полипептида. Аминокиселинните остатъци, които съставят рецепторното свързващо място, са дефинирани в Пример 2 в настоящото изобретение. Един клас замествания, които може да бъдат проведени, са консервативни аминокиселинни замествания В друг аспект, проведената модификация повишава въвеждането на място за N-гликосилиране.
Следователно, в друг особено предпочитан аспект на настоящото изобретение, интерферон-гама разновидността е SEQ ID N0:1 (или нейни фрагменти) включва поне една модификация, по-специално, заместване, в мястото за рецепторно свързване (както е описано в настоящото изобретение). По-специално, интерферон гама полипептидът включва поне една модификация, по-специално, заместване, при което се създава място за in vivo N-гликосилиране, в споменатото място за рецепторно свързване. Например, тези замествания могат ца бъдат подбрани от групата състояща се от Q1N+P3S/T. D2N+Y4S/T, Y4N + K6S/T, V5N + E7S/T. E9N + L11S/T. KI2N+Y14S/T. G18N, G18N + S20T, H19N+D21S/T. S20N+V22S/T, D21N +A23S./T, V22N f D24S/T, D24N+G26S/T, G26N + L28S/T, L30N + I32S/T, K34N+W36S/T, K37N + E39S/T, K108N + I110S/T, Н111N + L113S/T, Е112N +1114S/T, 1114N+V116S/t,
Q115N + M117S/T, А118N + L120S/T, E119N и E119N + S121T, за предпочитане, тези замествания да бъдат подбрани от групата, състояща се от Q1N+P3S/Т, D2N+Y4S/T, E9N + L11S/T, K12N+Y14S/T, G18N, G18N + S20T, H19N + D21S/T, S20N+V22S/T, D21N+A23S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T. Н111N + L.113S/T. Q115N + M117S/T, А118N + L120S/T, EII9N и E119N+S121T (въвеждане на места за N-гликосилиране в позиции, включващи аминокиселинен остатък притежаващ поне 25% странични вериги, обърнати към повърхността), повече се предпочита, тези замествания да бъдат подбрани от групата, състояща се от Q1N + P3S/T, D2N+Y4S/T, E9N + L11S/T, G18N. G18N + S20T. H19N + D21S/T, ···· • ·· * ·· : : <
S20N+V22S/T. D21N +A29S/T. КЗЖ +М&б8лТ ΊΚ37Ν + E39S/T. Q115Ν + Μ117S/T.
A118N + L120S/T, Ε119Ν и E119N + S121T (въвеждане на места за М-
гликосилиране в позиции, включващи аминокиселинен остатък, притежаващ поне 50% странични вериги, обърнати към повърхността), повече се предпочита, тези замествания да бъдат подбрани от групата, състояща се от Q1N + P3S/T, D2N+Y4S/T, E9N + L11S/T. G18N + S20T, H19N + D21S/T, S20N+V22S/T, D21N+A23S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, Q115N+M117S/T, A118N+L120S/T и Е119N+S121T най-много се предпочита, тези замествания да бъдат подбрани от групата, състояща се от Q1N+P3S/T, H19N + D21S/T. D21N+A23S/T и E119N + S121T, по-специално, D21N+A23S/T
Тези разновидности показват понижен рецепторен афинитет, в сравнение с човешкия интерферон-гама или Actimmune®. Рецепторният афинитет може да бъде измерен посредством някакъв подходящ анализ и е известен на специалистите в областта. Пример за подходящ анализ за определяне на рецепторния свързващ афинитет е BIAcore® анализ, описан от Michiels et al., Int. J. Biochem., Cell Biol., 30’ 505-516 (1998). При използване на гореспоменатия анализ, интерферон-гама разновидностите, считани полезни за целите на настоящото изобретение, са такива интерферон гама разновидности, при които свързващият афинитет (Kd) е 1-95% от стойността на свързващият афинитет (Kd) за гликосилиран [Б99Т]човешки интерферон гама или Actimmune®. Например, стойността на свързващият афинитет (К,;) за интерферон-гама гюлипептид може да бъде 1-75% или 1-50%, като 1-25%, например, 1-20 и даже 1-15%, 1-10% или 1-5% от стойността на свързващият афинитет (Kd) за гликосилиран [899Т]човешки интерферон-гама или Actimmune®.
Обикновено тези интерферон-гама разновидности, притежаващи понижен рецепторен афинитет, показват понижена интерферон-гама активност, например при прилагане на описания в настоящото изобретение Първичен анализ”. Например, интерферон-гама полипептидната ·· •· •« * ·* ··♦· «
• · « • · · ♦ · · · t ί · · * · разновидност може да’Показва 1·95% спйцйфиЯна активност 33. AC-ih ГнииЛвчу или рекомбинантен човешки интерферон-гама, например 1-75%, като 1-50%, например 1-20% или 1-10% специфична активност на Actimmune® или рекомбинантен човешки интерферон гама.
Както е описано по-горе, тези интерферон-гама разновидности се счита.
че притежават повишен серумен полуживот, което се дължи на понижено, управлявано от рецептора, изчистване. Следователно, интерферон-гама полипептидните разновидности, съгласно аспекта на настоящото изобретение,
покривет изискванията по отношение на повишен серумен полуживот, описани преди във връзка с дефиницията на повишения серумен полуживот
Очевидно, някои от гореспоменатите модификации, повишаващи рецепторния свързващ афинитет, могат да се комбинират с други модификации описани в настоящото изобретение, по-специално, модификации, споменатит в разделите “Интерферон-гама разновидности, съгласно настоящото изобретение, с оптимизирани места за N-гликосилиране'’, Интерферон-гама разновидности, съгласно настоящото изобретение, в които неполипептидната част е захарен остатък”. Интерферон-гама разновидности, съгласно настоящото изобретение, в които неполипептидната част е молекула, притежаваща цистеин като прикачена група и “Интерферон-гама разновидности, съгласно настоящото изобретение, в които първата неполипептидна част е захарен остатък, а втората неполипептидна част е молекула, притежаваща цистеин като прикачена група”, като G26A, E38N+S40T и техни комбинации.
МЕТОДИ ЗАКОНЮГАЦИЯ
Неполипептидна част
Както е споменато по горе, неполипептидната част, за предпочитане се подбира от групата, състояща се от полимерна молекула, пипофилно съединение, .: .: .··. .·*···· *»:* ······ .
захарен еотаяък (rt&njiMlUe^.tipiaJ m vivo N-гликосилиране) и производно органично съединение Всички тези средства могат да придават желани свойства на интерфеоон-гама полипептидната разновидност, по специално, повишен AUCsc, удължен серумен лолуживот и/или понижена имуногенност. Полипептидната разновидност обикновено се свързва само с един тип неполипептидна част, но може да се свърже и с два или повече различни типа неполипептидни части, например, към полимерна молекула и захарен остатък, към липофилна група и захарен остатък, към производно органично вещество и захарен остатък, към липофилна група и полимерна молекула и т.н. Когато е свързана към два различни типа неполипептидни части, те са, за предпочитане, захарен остатък и полимерна част Конюгацията на две или повече различни неполипептидни части може да бъде проведена едновременно или последователно
В следващите раздели, Свързване с липофилно съединение/ Свързване с полимерна молекула”, “Свързване със захарен остатък’' и “Свързване с производно органично вещество/ е описано свързването към специфични видове неполипептидни части.
Свързване с липофилно съединение
Полипептидната разновидност и липофилното съединение могат да се свържат един с друг или директно или с помощта на свързващо вещество. Липофилното съединение може да бъде природно съединение като наситена или ненаситена мастна киселина, дикетон на мастна киселина, терпен, простагландин, витамин, каротеноид или стероид, или синтетично съединение, като въглена киселина, алкохол, амин и сулфонова киселина с един или повече алкил-, а.рилапкзнил- или други многофункционални чеиаситени съединения. Свързването между полипептидната разновидност и липофилното съединение през свързващо вещество може да се извърши по известни на специалистите ···· ·: : ···* ‘ * J·· · · методи, например, кактО* 6 бнисаие*отво02и**52!куъ Peptide Synthesis, John Wiley,
New York, 1976 и в WO 96/12505.
Свързване c полимерна молекула
Полимерната молекула, която се свързва с полипептидната разновидност, може да бъде коя да е подходяща полимерна молекула, като природен или синтетичен хомополимер или хетерополимер, обикновено с молекулна тегло в границите 300-100,000 Da или 1000-50,000 Da, ка в границите на 2000-40,000 Da или 2000-30,000 Da, например, в границите 2000-20.000 Da, 2000-10,000 или 1000-5000 Da. По-специално, полимерна моликула, като полиетиленгликол. в частност, mPEG, с молекулна тегло около 5 kDa, 10 kDa. 12 kDa, 15 kDa или 20 kDa.
Думата “около”, когато се използва в настоящото изобретение за полимерна молекула, означава приблизително еднаква молекулна маса и отразява фактът, че е нормално да бъде с молекулно-масово разпределение за даденото полимерно получаване.
Примерите за хомополимери включват полиол (т.е. поли-ОН), полиамин (т.е. поли NH2) и поликарбонова киселина (т.е. поли-СООН). Хетерополимерът представлява полимер, който включва една или повече различни куплиращи групи, като например, хидроксилна група или аминогрупа.
Примерите за подходящи полимерни молекули включват полимерни молекули, подбрани от групата, състояща се от полиалкиленоксид (гмсц, включващ полиалкиленгликол (PAG) като полиетилена г.икол (DEG) н полипропиленгликол (PPG), разклонени полиетиленгликоли, поливинилов алкохол (PVA). поликарбоксилат, поли(винилпиролидон), съполимер на полиетилен и малеинов анхидрид, съполимер на полистирен и анхидрид на ябълчната киселина, декстран, включващ карбоксиметилдекстран или някои друг биополимер, подходящ за понижаване на имуногенността и/или за удължаване на функционалния in vivo полуживот и/или серумния пслуживст.
» ·· · ·· ·: : : ·: : : ··. ···: : : ; · ·.
Друг пример за полимерна* молекула» *е ФгвЬЩкй албумин или друг плазмен протеин в голямо количество, Най-общо, получените от полиалкиленгликол полимери са биосьвмесгими, нетоксични неантигенни, неимуногенни, притежават различна разтворимост във вода и лесно се отделят от живите организми.
Предпочитана полимерна молекула, която се използва, е полиетиленгликола, тъй като той притежава малко реакционноспособни групи, способни да се омрежват, в сравнение с, например, полизахариди като декстран и други. В частност, монофункционалният полиетиленгликол. например, монометоксиполиетиленгпикол (mPEG) представлява интерес, тъй като свързващата химия е относително проста (само една реакционноспособна група е налице за свързване с прикачените групи на полипептида). Следователно, рискът от омрежване е елиминиран, получените полипептидни спретнати съединения са по-хомогенни и взаимодействието между полимерните молекули с полипептида по-лесно се контролира.
За да се осъществи ковалентно свързване на полимерна молекула(и) с полипептидната разновидност, крайните хидроксилни групи на полимерната молекула трябва да бъдат в активна форма, т.е с реакционноспособни
функционални групи ^примерите за тях включват първични аминогрупи, хидразид (HZ), тиол, сукцинат (SUC), сукцинимидилсукцинат (SS), сукцинимидилсукцинамид (SSA), сукцинимидилпроприонат (SPA) сукцинимидилкарбоксиметилат (SCM), бензотриазолкарбонат (BTC), Nхидроксисукцинимид (NHS), алдехид, нитрофенилкарбонат (NPC) и тресилат (TRES)) В търговската мрежа са наливни подходящо активирани полимерни молекули, например, от Snear/vatsi rorymers.
Huntsville, Al. USA. Или пък, полимерните молекули могат да бъдат активирани по известни на специалистите конвенционални методи, например, както е описано във WO
90/13540. Специфични примери за активирани линейни или разклонени полимерни молекули, които могат да се използват, съгласно настоящото ·>♦· ·: ·**· .: .··. .· . :::* ··:·:: *· изобретение, са описани 6· Shemwdrte'r Inc., 1997 и 2000 Catalogs (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and Pharmaceuticals
Polyethylene Glycol and Derivatives дадено за сравнение). Специфичните примери за активирани полиетиленгликоли включват следните линеини полиетиленгликоли: NHS-PEG (например. SPA-PEG, SSPA PEG, SRA-PEG, SS PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG и SCM-PEG) и NOR-PEG). BTC-PEG. EPOX-PEG NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG и MAL
PEG. и разклонени полиетиленгликоли като PEG2-NHS и такива, описани в US
5,932,462 и US 5,643,575. дадени и двата за сравнение. Още повече, в средващите публикации, дадени за сравнение, са описани приложими
полимерни молекули и/или методи за взаимодействия с полиетиленгликоли:
5,281,698, US 5,122,614. US 5.219,564 WO 92/16555 WO 94/04193 WO 94/14758
WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO
95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837,
WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791 WO 98/32466, WO
95/06058, ЕР 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312. ЕР 921 131. US
5,736,625, WO 98/05363, ЕР 809 996, US 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, US
6,4/3,034, US 5,516,673, ЕР 605 963, US 5.382,657, ЕР 310 356, ЕР 400 472, ЕР 183 503 иЕР 154 316.
Специфичните примери за активирани полиетиленгликолови полимери, предпочитани за свързване с цистеинови остатъци, включват следните линеини полиетиленгликола: винилсулфон-полиетиленгликол (VS-PEG), за предпочитане, винилсулфон-mPEG (VS-mPEG); малеимид-полиетиленгпикол (MAL-PEG), за предпочитане, малеимид-mPEG (MAL-mPEG); и ортопиридил-дисулфидполиетиленгпикол (OPSS-PEG), за предпочитане, ортопиридил дисулфид mPEG lOPSS-mPEG); обикновено, тези полиетиленгликолови или mPEG полимери имат молекулна маса около 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa или 20 kDa.
• · · ·
Свързването на полйпвптидйЯтг? · • · · · раЗйовМдност активираните полимерни молекули се провежда по кой да е конвенционален метод, например, както е описано в литературата (където се описват, също така, подходящи методи за активиране на полимерните молекули). Harris, Zalipsky, eds., Polyethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC. Washington: R.F. Taylor, (1991), Protein immobilisation. Fundamental and applications , Marcei Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), “Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”, CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), “Immobilized Affinity Ligand Techniques’, Academic Press, N.Y.). За свързването на полиетиленгликол c цистеинови остатъци (виж по-горе), интерферон-гама
разновидността обикновено се третира с редуциращ агент, като дитиотреитол (DDT) преди свързването с полиетиленгликол. Редуциращият агент след това се отстранява по някакъв конвенционален метод, като обезсолване Свързваното на полиетиленгликол с цистеинов остатък обикновено протича в подходящ буфер при pH 6-9 при температура между 4 и 25°С в продължение на до 16 часа.
Специалистите в областта ще разберат, че методът за активиране и/или за свързване, който ще се използва, зависи от прикачените групи в интерферон-гама полипептидната разновидност, както и от функционалните групи на полимера (например, амино, хидроксил, карбоксил. алдехид или сулфидрил). Свързването с полиетиленгликол може да се осъществи чрез директно свързване с всички налични прикачени групи на полипептидната разновидност (т.е. с тези прикачени групи, които са обърнати към повърхността на полипептида) или свързването да е насочено към специфични прикачени групи, например N-крайна аминогрупа (US 5,985.265) Още повече свързването може да се осъществи едноетапно или през много етапи (например, както е описано в WO 99/55377)
Ще се разбере, че свързването с полиетиленгликол е насочено към получаване на оптимална молекула по отношение на броя на закачените молекули полиетиленгликол, на размера и формата (например, дали са • ·· · ·· ····«· ···· ·· · · ··· ··· ··· · ·♦ ···· ···♦··· линейни или разклонени) ·№.’·тези *1вюЛБкули,· и*· къде в полипег.тидната разновидност се закачат тези молекули. Например, молекулното тегло на използвания полимер може да се избира ма базата на желания ефект, който трябва да бъде постигнат. Например, ако главната цел на свързването е да се получи спретнато съединение с високо молекулно тегло (например, за понижаване на реналното изчистване), обикновено се желае свързване на полимерни молекули с колкото може по-високо молекулно тегло за да се получи желаното молекулно тегло. Когато е необходима защита на епитопа в голяма степен, това може да се постигне при използване на значително голям брой полимери с ниско молекулно тегло (например с молекулно тегло около 5,000 Da) за ефективно защитаване на всички или на повечето епитопи на полипептида. Например, могат да се използват 2-8, като 3 6 такива полимера.
Във връзка със свързването само към една прикачена група на протеина (както е описано в US 5,985,265), предимство е, полимерната молекула, която може да бъде линейна или разклонена, да има високо молекулно тегло, например, около 20 kDa
Обикновено, полимерното свързване се провежда при условия, които позволяват всички налични в полимер прикачени групи да взаимодействат с полимерните молекули. Най-често, моларното съотношение на активираните полимерни молекули към полипептидната разновидност е 1000.1, по специално, 200:1 например, 100:1, като 10:1 или 5:1 за да се получи оптимално взаимодействие. Могат да се използват, обаче, и еквимолни съотношения.
Съгласно настоящото изобретение, възможно е свързване на полимерните молекули към пептидната разновидност и посредством свързващо вещество. На специалистите в областта са известни подходящи свързващи вещества. Предпочитан пример е цианурхлорида (Abuchowski et al, (1977), J.Biol.Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Snater et al, (1986). J Polym.Sci. Polym.Chem.Ed., 24, 375-378.
кяюд иБорЗВанеЮ,
Ct папалите* активирани ‘полимерни молекули се блокират по известни ча специалистите методи, например посредством прибавяме към реакционната смес на първичен амин и получените инактивирани полимерни молекули се отделят чрез подходящ метод.
Свързване със захарен остатък
Свързването със захарен остатък се провежда in vivo или in vitro. За да се осъществи in vitro гликосилиране на полипептид с интерферон-гама активност, той трябва да бъде модифициран ката, че да се въведат едно или повече места за in vitro гликосилиране (виж раздел “Интерферон-гама разновидности, съгласно настоящото изобретение, в които неполипептидната част е захарен остатък”), като нуклеотидна последователност, кодираща полипептидната част, трябва да бъде въведена в гликосилиращия евкариотен проявяващ се домакин. Клетките за проявление на домакина могат да се подбират между клетки на фунги (влакнести или дрожди), клетки от насекоми или животни, или трансгенни растителни клетки. Още повече, гликосилирането може да се ооъщесгви в човешкото тяло, когато се използва нуклеотидна последователност, кодираща полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, при генна терапия. В един аспект, клетката-домакин е клетка на бозайник, като СНО клетка, ВНК или НЕК клетка, например, НЕК293, или клетка на насекомо, като SF9 клетка, или клетка на дрожди, например, Sacchatomyces cerevistae, Ptchta pastons, или някакъв друг подходящ гликосилиращ домакин, например, описания по-долу. Възможно е, захарните остатъци, свързани към интерферон-гама полипептидната разновидност посредством /л vitro гликосилиране. след това да бъдат модифицирани при използване на гликосилтрансферази, например, при използване на glycoAdvance^’ технология на Neose. Horsham, PA. USA. При това, възможно е, например, да се повиши силирането на гликосилираната интерферон-гама • » · · ···♦ • · · ·· • · · ·· е · · · ·· ··· ··· ·· · · полипептидна разновидност,· следващечтроявлЗйиеТЪ и in vitro гликссилирането посредством СНО клетки
Може да се използва ковалентно in vitro свързване на гликозиди с аминскиселинни остатъци на интерферон гама полирепгиди за модифицирана или повишаване на броя или профила на въглехидратните заместители. В
зависимост от начина на свързване, захарите могат да се свържат с а) аргинин и хистидин, б) свободни карбоксилни групи, в) свободни сулфхидрилни групи, като цистеин, г) свободни хидроксилни групи, като серии, треонин, тирозин или хидроксипролин, д) ароматни остатъци, като фенилаланин или триптофан или о) амидната група на глутамина. Тези аминокиселинни остатъци са примери за прикачени групи за захарната част, които могат да бъдат въведени и/или премахнати в интерферон-гама полипептида. Описани са подходящи методи за in vitro свързване, например, в WO 87/05330 и в Αίρΐπ et al, CRC Grit Rev Biochern., pp. 259-306, 1981. in vitro свързването на захарни остатъци или полиетиленгликол към протеин- и пептидно-свързани Gln-остатьци може дд бъде проведено, също така, посредством трансглутаминази ((gases,». например, както е описано от Sato et al.. 1996. Biochemistry, 35. 13072-13080 или в EP 725145.
Свързване с производно органично вещество
Ковалентното модифициране на интерферон-гама полипептидната разновидност може да се проведе при взаимодействие на прикачена група на полипептидната разновидност с производно органично вещество. На специалистите са известни подходящи производни органични вещества и методи. Например, цистеинилоеите остатъци най-често взаимодействат с ахалоацетати (и съответни амини), като хлороцетна киселина или хлорацетамид до получаване на карбоксиметипови или карбоксиамидометилови производни. Цистеинилоеите остатъци се получават, също така, при взаимодействие с бромтрифлуорацетон. а-бром-р-(4-имидозоил)пропионова киселина.
хл орацетилфосфа г.
М-алкиЛСйиТ0имиДй? 3’нитро-2-пйридилдлсулфид, метил 2 пиридилдисулфид, р-хлормеркурибензоат, 2-хлормеркури-4-нитрафенся или хлор-7-нитробензо-2-окса-1 3-диазол Хистидиловите остатъци се получават посредством взаимодействие с диетилпирокарбонатеат pH 5.5-7.0, тъй като това вещество е относително специфично за хистидиловата странична верига.
Използваем е също и р-бромфенацетилбромидьт, пред почита се взаимодействието да се извърши в 0.1М натриев какодилат при pH 6.0.
Пизиниловите и крайните амино-остатъци взаимодействат с анхидриди на сукциновата или други карбонови киселини. Производните на тези вещества действат за обръщане на заряда на пизиниловите остатъци. Други подходящи
реагенти за получаване на производни на α-аминосъдържащите остатъци са имидоестери, като метилпикслинимидат; пиридоксалфосфат; пиридоксая; хлорборхидрид: тринитробензенсулфомова киселина: 0-метилизокарбамид:
2,4-пентатдион; и катализирано от трансаминаза взаимодействие с глиоксилат. Аргиниловите остатъци се модифицират при взаимодействие с едно ипи няколко конвенционални вещества, сред тях, Фенипгпиоксал, 2,3-6утандион, 1.2циклохександион и нинхидрин. При получаването на производни на аргининови остатъци, реакцията стрябва да се провежда в алкални условия поради високата рКа на гуанидиновата функционална група. Още повече, тези вещества могат да взаимодействат с групите на лизина, както и с аргининовата гуанидинова група. Страничните карбоксилни групи (аспартил и глутамип) селективно се модифицират при реакция с карбодиимиди (R-N=C=N-R), където R и R’ са различни алкилови групи, като 1-циклохексил-З-(2-морфолини~-
4-етил )карбодиимид или 1 -етил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Още повече, аспартиловите и глутамилови остатъци се превръщат в аспарагинилови и глутаминилови при взаимодействие с амониеви йони.
·· • · ···· ···· ·· · · · · · ··· ··· · · · ···· ······ · ··· ··· ····
Блокиране на функционалното* м*ясто
Известно е. че прекалетето полимерно спрягане може да доведе до загуба на активност на полипептида, към който е свързан полимерът. Този проблем може да бъде елиминиран, например, чрез отделяне на прикачени групи, локализирани на бункционалното място или чрез блокиране на функционалното място преди спрягането. Последния метод представлява понататъшен аспект на настоящото изобретение, като първият мс^од е
представен по-горе, например, чрез отделяне на лизинови остатъци, които могат да се локализират близо до функционалното място и/или чрез въвеждане на цистеинови остатъци и/или места за in vivo гликосилиран© в позиции, които ме се различават от функционалните места
По-специално, съгласно втория метод, спрягането на полипептидната
разновидност с неполипептидната част се провежда при условия, при които функционалното място на интерферон-гама полипептидната разновидност се блокира от помощна молекула, способна да се свърже към функционалното място на полипептидната разновидност. Предпочита се, помощната молекула да е такава, която специфично разпознава функционалното място на полипептидната разновидност, като рецептор. Или пък, помощната молекула може да бъде антитяло, по-специално, моноклонално антитяло, разпознаващо полипептидната разновидност. По специално, помощната молекула може да бъде неутрализиращо моноклонално антитяло
Полипептидната разновидност може да взаимодейства с помощната молекула преди да започне спрягането. Това дава възможност на функционалното място на полипептидната разновидност да се предпази или защити и след това да не участва в получаване на производни от неполипептидната част, например, полимер. След отделянето й от помощната молекула, спрегнатото съединение между неполипептидната част и полипептидната разновидност може да се възстанови с частично защитенз функционално място.
·· ·· ···· • · · · • · · · • · · · · птиднага разновидност с блокирано функционално място към полимер, липофилно съединение, захарен остатък, производно органично вещество или друго съединение се провежда по обичайния начин, например, както е описано по-горе в разделите “Свързване с
В друг аспект, помощната молекула най-напред ковалентно се свързва с твърда фаза, като материали за пълнене на колони, например Сефадекс или зърна агароза, или към повърхност например реаюдилнем съд След товз полипептидната разновидност се въвежда в колонния материал, носещ помощната молекула и спрягането протича съгласно известни на специалистите методи, например, както е описано по-горе в разделите Свързване с Този метод позволява на спрегнатата полипептидна разновидност да се отдели от помощната молекула посредством елуиране. Спрегнатата полипептидна разновидност се елуира по конвенциални методи при такива физикохимични условия, които не водят до следващо разрушаване на спрегнатата полипептидна разновидност Течната фаза, съдържаща спренатата полипептидна разновидност, се отделя от твърдата фаза, към което помощната молекула остава ковалентно свързана. Отделянето може да се осъществи по два начина: Например, помощната молекула може да бьде получена с втора молекула (например, биотин), която може да бьде разпозна га от специфично свързващо вещество (например, стрептавидин). Специфичното свързващо вещество може да се свърже към твърда фаза, при което се осъществява отделянето на спрегнатата полипептидна разновидност от комплекса помощна молекула-втора молекула чрез преминаване над втора помощна твърда фаза в колоната, която оставя, след следващото елуиране. комплекса помощна молекула втора молекула, но не и спрегнатата полипептидна разновидност. Спрегнатата полипептидна разновидност може да се отдели от помощната молекула по подходящ начин. Премахването на защитата може да се осъществи при условия, в които помощната молекула се • · ·· • φ· · ··· ·· · · ·· · ·· • · · · · ·· ·· ·· ····· • · · · · ·· дисоциира от функционалнУ/о * мЯст0*’нА* интерферон-гама полипептидната разновидност, с което е свързана. Например, комплекс между антитяло, към което е свързан полимер, и анти-идиотипично антитяло може да бъпе дисоцииран посредством регулиране на pH към киселинно или алкално pH.
Свързване на белязан полипептид
В един възможен аспект, интерферон-гама полипептидната разновидност се проявява, като кондензиран протеин с маркер, т е като аминокиселинна последователност или пептидно удължаване, изградено обикновено от 1-30, например, 1-20 аминокиселинни остатъци Освен че възможно бързо и лесно пречистване, маркерът е удобно средство за да се получи спрягане между маркираната интерферсн гама полипептидна разновидност и неполипептидната част По-специално, маркерът може па се използва за да се получи спрягане в микротитьрни плочки или в други носители, като парамагнитни зърна, към които маркираният полипептид може да се имобилизира през маркера Свързването към маркираниата интерферон-гама полипептидна разновидност в. например, микротитьрни плочки, има предимството, че маркираната полипептидна разновидност можа да се имобилизира в микротитърните плочки директно от културната среда (по принцип без пречистване) и се подлага на спрягане. При това, общияг брои етапи на процеса (от проявлението до спрягането) могат да бъдат намалени. Още повече, маркерът може да функционира като удължител на молекула, осигуряваща подобрена съвместимост с имобилизираната полипептидна разновидност, към която е свързана. Спрягането използващо маокиоаня полипептидна разновидност, може да бъде с всяка от описаните в настоящото изобретение непопипептидни части, например, с полимерна молекула, като полиетиленгликол.
Идентичността на използвания специфичен маркер не от значение, гьн като маркерът е способен на проявление с полипептидната разновидност и е
• ·· · ·· 444444
4 4 4 ···· · ··
4 4 4 4 4··· ···· 4 4 4 4 4 4· ··· ··· 4 · 4· uiivGuoert да се имооигдщира върху подходяща повърхност или носещ материал. 5 търговската мрежа са познати редица подходящи маркери, например, от Dnizvme Laboratories. Denmark. Например, маркерът може да бъде една от следните последователности:
His-His-His-His-His-His (SEQ ID N0:35).
Met-Lys-His-His-His-His-His-His (SEQ ID N0:36),
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-GIn-His-His (SEQ ID N0:37), Met-Lys-His-Gln-His-Gin-His-Gln-His-Gln-His-G!n-His-G*n (SEQ ID N0^8) (всички от Unizyme Laboratories. Denmark) ипи някой от следните:
EQKLI SEEDL (SEQ ID N0:39), (С-краен маркер, описан в Moi. Ceil. Βίοι , 5: 361016, 1985)
DYKDDDDK (SEQ ID N0:40), (C- или N-краен маркер)
YPVDVPDYA (SEQ ID N0:41).
Антителата за горепосочените маркери се намират в търговската мрежа, например, от ADI, Aves Lab and Research Diagnostics
Следващо отцепване на маркера от полипептида може да се осъществи при използване на ензими, намиращи се в търговската мрежа.
Методи за получаване на интерферон-гама полипептидна разновидност, съгласно настоящото изобретение
Интерферон-гама полипептидната разновидност, може да бъда получена по някой от известните на специалистите подходящи методи. Тези методи пключват конструиране на нуклеотидна последователност, кодираща полипептидната разновидност и проявяване на последователността в подходящ трансформиран домакин. Обаче, полипептидните разновидности, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат получени, макар и по-слабо ефективно, посредством химичен синтез или комбинация от химичен синтез и рекомбинантна DNA технология.
·· · ·· ·* ···· • ···· · · · • · · · · ♦ · ·· ······ · • ··· ····
Нуклеотидната последователност’ съгласно ‘настоящото изобретение, кодираща интерферон-гама полипептидната разновидност (като мон-омар :ст·’ като единична верига) може да бъде конструирана посоепством изолиоане или синтезиране на нуклеотидна последователност, интерферон-гама, като човешки интерферон-гама. с аминокиселинната
последователност SEQ ID N0:17 или нен фрагмент, и след това промяна на нуклеотидната пс-следсвателност така, че да се задейства въвеждането (т.е. вмъкване или заместване) или заличаването (т.е. отделяне или заместване) на сьответен(ни) аминокиселинен(ни) остатък(ци).
Нуклеотидната последователност удобно се модифицира посредством насочена към мястото мутагенеза, съгласно известни методи, виж, например. Mark et al., “Sits specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene”, Proc Natl. Acad. Sci. USA. 81 pp 5662-66 (1984): и US 4,588.585.
Или пък, нуклеотидната последователност се получава посредством химичен синтез, например, при използване на олигонуклеотиди, конструирани на базата на аминокиселинната последователност на желаната полипептидна разновидност и. за предпочитане, избиране на тези колони, които са предпочитани в клетката-домакин, в която ще се продуцира рекомбинантмата полипептидна разновидност. Например, могат да се синтезират някои малки олигонуклеотиди, кодирани за части на желаната полипептидна разновидност и да се свържат с PCR, лигатура или верижна реакция на лигггура (LCR). Отделните олигонуклеотиди обикновено съдържат 5 или 3' свободно висящи елементи за допълнително свързване.
Веднъж свързана (посредством синтез, насочена към мястото мутагенеза или друг метод), нуклеотидната последователност, кодираща полипептида, се вмъква в рекомбинантен вектор и се свързва о ко^рса^'· последователности, необходими за проявлението на интерферон-гама полипептидната разновидност в желаната трансформирана клетка -домакин.
Трябва, разбира се, Да’се разоере.’ че не всички вектори и проявени контролни последователности функционират еднакво добре за ·:->
нуклеотидната последователност, кодираща описания в настоящото изобретение интерферон-гама лолипептиднзта разновидност. Нито всички домакини ще функционират еднакво добре със същата система на проявление. Обаче, специалистът в областта може да направи избор между тези вектори, последователности за контрол на проявлението и домакини експериментиране. Например, при избора на вектор, домакинът трябва да бъде разпознат, тъй като векторът трябва да направи реплика върху него или да е способен да се интегрира в хромозома Броят на копираните сектори. способността да се контролира броя на копията и проявлението на други протеини, кодирани от вектора, като аигибистикови маркери, трябва също да бъдат взети под внимание. При избора на последователност за контрол на проявлението, редица фактори също трябва да бъдат взети под внимание Те включват, например, относителната дължина на последователността, нейната контролируемост и нейната съвместимост с нуклеотидната последователност кодираща полипептидната разновидност, особено по отношение на потенциалните вторични структури Домакините трябва да бъдат подбрани като се взима под внимание тяхната съвместимост с избрания вектор, токсичността на продукта, кодиран за нуклеотидната последователност, техните отделителни характеристики, тяхната способност правилно да дублират полипептида. тяхната ферментация или изискванията на културата и дали продуктите кодирани за нуклеотидната последователност, лесно се пречистват.
Рекомбинантният вектор може да бъде самостоятелно дублиращ вектор, т.е. вектор, който съществува като екстрахромозомна единица, дублирането на която е независимо от хромозомното дублиране, например, плазмид. Или пък, векторът е такъв, коиго. когато е въведен в клетка-домакин се интегрира в генома на клетката-домакин и се дублира заедно с хромозсйлд(ите), в който е бил интегриран.
68 • ·· · *· · ···· ···· ·· · · · « · ··· · · · ··· • · · · ······ · ··· · · · · · · · лта се аектЬ*|ЗъТ* да ”е ‘вектор на проявление, в който
1 нуклеотидната последователност, кодираща интерферон-гама полипептидната
разновидност, се свързва с допълнителни сегменти необходими за
транскрибция на нуклеотидната последователност. Векторът обикновено се
получава от плазмид или вирусна деоксирибонуклеинова киселина. Редица подходящи изразни вектори за проявление в споменатите клетки-домакин могат да бъдат намерени в търговската мрежа спи в литературата.
Приложимите вектори на проявление за евкариотни домакини включват например, вектори, включващи контролни последователности на проявлението
от SV40, волски папилома вирус, аденовирус и цитомегаловирус. Специфични вектори са. например. pCDNA3.1(+)\Hyg (invitrogen. Carisoaa. GA, USA) и pGineo (Stratagene, La Jola, CA, USA). Приложимите вектори на проявление за бактериални домакини включват известни бактериални плазмиди като плазмиди от Е colt, включващи pBR322, рЕТЗа и рЕТ12а (и двата от Novagen
Inc., Wl, USA), плазмиди c по-широк обхват на домакини, като RP4, фаг на деоксирибонуклеинови киселини, например, редица производни на Фаг ламбда. например, NM9S9 и други фаги на деоксирибонуклеинови киселини, като М13 и фибрилни единично усукани фаги на деоксирибонуклеинови киселини. I |риложимите вектори на проявление за дрождени клетки включват
2μ плазмид и негови производни, РОТ1 вектор описан в Okkels. Ann New York Acad. Sci. 782, 202-207 1996 и pPICZ А, В или C dnvitrogen). Приложимите вектори на проявление за клетки на насекоми включват pVL941, pBG3ll (Cate et а!.. “Isolation of the Bovine and Human Genes ♦or Mullerian inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Ceils, Cell. 45, pp. 885-98 (1986). pBluebac 4.5 и pMelbac (и двата производство на Invitrogen)
Други вектори за използване в настоящото изобретение включват такива, които позволяват нуклеотидната последователност, кодираща интерферон-гама полипептидната разновидност, да се удължава 'ю.тс с® ом ·· · ·· · ···· • · ······· ·· ······ ··· ··»···· ·· · · · · · · · f · ·»· · · »··· • · копирз.. Тнкивй копиращи Ьокторй сз.
включват, например, вектори, способни да се удължават посредством 'удължаване с DHFR (виж, например, Kaufman. Sharp, Construction ot a Modular
Dihydrafolate Reductase cDNA Gene. Analysis of Signa’s Uti’izsd for ETfk±:.·.’.
Expression”, Mol.Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)) и удължаване c глутамин синтетаза (GS) (виж, например, US 5,122,464 и EP 338,841).
Рекомоинантният вектор може да включва също и последователност от
деоксирибонуклеинова киселина, която позволява векторът да се дублира във въпросната клетка-домакин. Пример за такава последователност (когато клетката домакин <= клетка на бозайник) е SV40 произход на дублирането Когато клетката-домакин е дрождена клетка, подходящи последователности, даващи възможност на вектора да се дублира, са дублиращите гени REP 1 3 на дрожден плазмид 2μ и произхода на дублирането.
Векторът може да включва и избираем маркер, например. ген Iюодук ‘ъΐ на който добавя дефект в клетката-домакин, като гена, кодиращ за дихидрофолатредуктазата (DHFR) или гена Schizosaccharomyces pombe ΤΡΙ (описан от Р. R. Russell, Gene 40, 1985. pp. 125-130), или такъв, които придава
резистентност към лекарство, например, ампицилин, канамицин тетрациклин хлорамфеникол, неомицин, хидромицин или метотрексат. За фибрилни фунги, избираемите маркери включват amdS, pyrG, arcB, niaD, sC.
Терминът “контролни последователности”, използван в настоящото изобретение, включва всички компоненти, които са необходими и с предимства за проявлението на интерферон-гама полипептидната разновидност. Всяка контролна последователност може да бъде близка или чужда на последователността от нуклеинови киселини, кодирала полипептидната разновидност Такидл контролни последователности включват, но без да е ограничение, водеща последователност, полиаденилирана последователност, пропаптидна последователност, промотор, удължител или повишаваща се активираща последователмоет ~ | * ri ,.· π Μ 2 Π 9 ПТИ Π Η 3 последователност и трансфйбйраща*’завършваща’ последователност.
Като минимум контролните последователности вкгиочзат промотор
В настоящото изобретение е използвано голямо разнообразие от контролни последователности на последователности на проявлението включват контролни последователности на проявлението, свързани със структурни гени на гореспоменатите вектори на проявлението, както и всяка последователност, известна, че контролира проявлението на гените на прокариотните и евкариотните клетки или техните
вируси, и различни комбинации от тях.
Примерите за подходящи контролни последователности за директно въвеждане в клетки на бозаиници включват ранни и късни промотори на SV40 и промотор на
МТ 1 (металотионеин ген), непосредствено ранен генен промотор на човешки цитомегаловирус (CMV), промотор на човешки удължаващ фактор Ь (EF-1a),
промотор на протеин 70 на Drosophila, промотор на Rous Sarcorra Virus (RSV). промотор на човешки убмкуитин С (UbC), завършваща последователност на човешки растежен хормон, полиаденилирани сигнали на ооластта на SV40 или аденовирус Elb и последователност на Kozak ((Kozak, М. J. Mol Bio.., 1987, Aug 20: 196 (4): 947-50).
За да се подобри проявлението в клетки на бозайник, в 5’ нелреместена област на нуклеотидната последователност кодираща интерферон-гама полипептидната разновидност, може да се вмъкне синтетичен интрон. Примео за синтетичен интрон з синтетичен интрон от плазмид pCI-пео (на Ргсгпеда Corporation, Wl, USA).
Примерите за подходящи контролни последователности за директно въвеждане в клетки на насекоми включват полихедрин промотор, Р10 промотор, базов протеинов промотор на Autographa caifornfca полихедрозен вирус, непосредствено ранен генен 1 промотор на бакуловирус и задържано a ·· • a · a • · · • · · · • a · bJuHcH ΓβΗβΗ ПрОМОТОр ha
Hu a« a
a a
a a a бакул ови рус • · · ♦· a a ♦ • « a a a · a a a a ** 39K и полиаденилирана последователност на SV40.
Примерите за подходящи контролни последователности за приложение в дрождени клетки домакин, включват промоюри на дрождена а свързана система, промотор на дрождената триоза фосфатизсмераза (TPI) преметени от дрождени гликолитни гени или гени на алкохолната дехидрогеназа, ADH2-4C и индуцируем GAL промотор.
Примерите за подходящи контролни последователности за приложение в фибрилни гьбични клетки-домакин включват ADH3 и завършваща
последователност, като промоторът е получен от гените, кодиращи Aspergillus oryzae ТАКА амилаза триоза фосфатизомераза или алкална протеаза, A ntger амилаза, .A. Лдег или nidulans глюкоамилаза, A. ddulans ацетамидаза,
Rhizomucor mtehei аспартинова протеиназз или липаза. ТРИ завършваща последователност и ADH3 завършваща последователност.
Примерите за подходящи контролни последователности за приложение в бактериални клетки-домакин включват промотори на lac система, Тф система ТДС или TRC система и основни промоторни области на фага ламода.
Нукпеотидната плепецователност, съгласно настоящото изобретение, получена или посредством насочена към мястото мутагенеза, синтез или по други методи, м-з-же да включва или може да не ъютючва нуюпеотидна последователност която кодира сигналния пептид. Сигналният пептид присъства, косато полипепгидът се отделя от клетките, в които се проявява Такъв сигнален пептид, ако присъства, трябва да бъде расг.гзнат от кльглата, избрана за проявление на полипептидната разновидност. Сигналният пептид може да бъде хомолежек (например, които ооикновено се свързва с човешки интерферон-гама) ипс хетеролежен различен от човешки интерферон-гама* на полипептида или мо**- бъде хомолог или хегеролог на клетката-домакин,
Т и
пептид, обичайно изразен от клетката-домакин или такъв, който необичайно се • · · r · · ·*·♦♦· ·«·« · · · · · ·· ··· ♦ · · · ·· ···· ······· ··· ··· · · « ♦ __......···/*· Λ ~ ·· it..- ,кчАрА-иЯВА OT КЛАТКАТА-ДОМАКИН. ч^ЛОДОВДТВЛНО, СИГНАЛНИЯТ ПВПГИД MG/KS ДА СЪДА рс-кариотен например, получен от бактерия, като Е сой, или евкарнстом например, получен от клетка на бозайник, насекомо или от дрождена клетка
Присъствието или отсъствието на сигнален пептид ще зависи, например от проявлението на клетката домакин, използвана за получаван® «п полипептидната разновидност, от проявения протеин (дали е зътрешноклетъчен протеин) и дали е необходимо да се прояви секреция. За използване във влакнести фунги, сигналният пептид може удобно да бъде добит от ген. кодиращ Aspergillus sp. амилаза или глюкоамилаза. ген, кодиращ Rhizomucor miehei липаза или протеаза, или Humicola lanuginosa липт?-* Предпочита се сигналният пептид да се добива от ген, кодиращ A. oryzae ТАКА амилаза, A. niger неутрална a-амилаза, A. niger киселиноустойчива амилаза или A. niger глюкоамилаза. За използване в клетки на насекоми, сигналният пептид може удобно да бьде добит от ген на насекомо щ». «νϋ »0/м5/S3), каго лепидоптеран
МГI i ЧИ *'s jr* pL -w p- ν'·* *
5,023,328) пчелен мелитин Hnvitrogenj, екдистероид ϋ!> глюкозил-трансферазз.
(egt) (Murphy et al.. Protein Expression and Purification. 4. 349-35 Г (.393} или човешка панкреатична липаза (hpl) (Methods in Enzymology, 234,
pp. 262-272 W97).
Предпочитаният сигналният пептид за използване в клетки НА 0ОЗ.-А*.; се получава от човешки интерферон-гама или от murine !g kappa light chain сигнален пептид (Coloma, Μ. (1992/ a. imm. Methods, 152. 89-104). За използване дрождени подходящи сигнални пептид с ^-Фактор от S.
''θ^νια^θ tcf. US 4.870,008) г><4гм?»ион парти” ОТ слюнчена амилаза при мишки щ1. С. hagenwucnle et a:.
Nature. 289. ί t , ρρ.
643-646), сигнален пептид ма модифицирана карбоксипептидаза (cf. LA. Valls at al., Ceil. 48. 1987 op. 887-897) сигнален пептид от дрожди BAR) (cf WO 87/02«70t и сигнален пептид от дрождена аспартинова протеаза 3 (YAP3) (cf. М. Egel Mitani eta!., Yeast6, 1990, pp. 127-137.
• ·· ·· · ··»· ···· ·· » · ·· · ··· ··· ··· ···· ··«··· · ··· · · · ···»·
За продуциране на *йь1тЬ*рферок-гама полипептидната разновидност може да бъде използван всеки подходящ домакин, включващ клетки :-ю оактерии фунги (вкпчително дрожди), растения, насекоми бозаиниии или друти подходящи животински клетки или клетъчни линии, както и трансгенни животни или растения. Примерите за бактериални клетки-домакин включват грамположителни бактерии, като щамове на Bacillus, наример, В. brevis или ь.
subtife, Pseudomonas или Streptomyces, или грамотрицателни бактерии, като щамове на t сой. Въвеждането на вектор в бактериална клетка-домакин може, например, да се въздейства от трансформиране на протопласт (виж. например, Chang and Cohen, 1979. Molecular General Genetics 168' 111 115), при използване на устойчиви клетки (виж, например, Young and Spizizen 196*. Journal of Bacteriology, 81: 823-829, или Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), електропорация (виж например Shigekawa and Dower, 1988, btotechniques 6. 742-751), или спрягане (виж, например, Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology, 169: 5771-5278).
Примерите за подходящи влакнести фунгзлни клетки-домакин включват щамове на Aspergillus, например. A oryzae, А. гйдег или А /жАнать. Fusanum или
Trichoderma. фунгалните клетки могат да бъдат трансформирани по метод, включващ формиране на протопласт. трансформиране на лрогоплаегите и регенериране на клетъчната стена по извее ген начин. > юдхидящи ма гиди wu трансформиране на Aspergillus клетките-домакин са описан!-* т ЕР 238 028 ” U9 6,879,543. Подходящи методи за трансформиране на Fusaaum видове са описани от Malardier et ak да бъдат трансформирани при използване на методи, описани от Keener ana Guarente, in Abelson. J. N. and Simon, Μ. 1.. editors. Guide to Yeast Genetics anu Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187. Academic Press, inc., New York, ito et al, 1983, Journal of Bacteriology, 153: 163: Hinnen et al. 1976 Frcceedings of the National Academy of Sciences USA ΐΰ. 1920.
римерите за подходящи*Дрс»кденй^етки-демакин включват щамове на
Saccharomyces. например, S cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kfuyvernmycas,
Hchta, като P. pastons или P. metnanoiica, Hansenuia, като H. Poiymofoha или
Yarrowia. Методите за трансформиране на дрсждз.чи клетки деоксирибонуклеинова киселина и получаването на хетероложни полипептид·/' от нея, са дадени от Clontech Laboratories, inc. Palo Alto, СА, USA (в протокол на продукта за Yeastmaker™ Yeast Transformation System Kft) и от Reeves -~t a*.,
FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198, Manivasakam and Sehiest·. Nucleic
Acids Research, 1993, Vol. 21, No. 18, pp. 4414-4415, Gar.eva st ai.. fTMS Microbiology Letters 121 (1994) 159-164.
Примерите за подходящи клетки-домакин на насекоми включват клетъчна линия Lepidvpiaa, като Spodoptera frugiperda (Sf9 или S121) или Ttichoplustoa rv клетки (High Five) (US 5.077,214). Трансформирането на клетките на насекомите и продуцирането в тях на хетероложни полипептиди могат да бъдат осъществени, както е описано, посредством Invitrogen.
Примерите за подходящи клетки-домакин на бозайници включват клетъчни линии от яичници на Китайски хамстер (СНО) (например. СНО Κί, ATCC CCL 61), клетъчни линии от Green Monkey (COS) (например, COS 1 (ATCC GRL-1650). COS 7 (ATCC CRL-1651)), клетки от мишка (например, NS/O). клетъчни линии от бъбрек на новороден хамстер (ВНК) (например, ATCC CRL1632 или ATCC CCL-10) и човешки клетки (например, НЕК 293 (ATCC CRL-1573)), както и растителни клетки в гьканна култура. На специалистите са известни и други допълнителни клетъчни линии, които се доставят от обществени депозитори, като American Type Culture Collection. Rockville. Maryland Съшо така, клетки от бозайник, като СНО клетки, могат да бъдат модифицирани за да се прояви сиаяилтрансфераза, например, 1,6-сиалилтрансфераза, например, както е описано в US 5.047.335. за да се постигне подобрено гликосилиране на интерферон-гама полипептидната разновидност.
• ·· · ·· ······ ···· · · ♦ · ·· β
J·· ··· ··· • · · ·····>· методите За въвеждане ЛаеАдСк‘Ог*п& Д8оксг?ри0онуклеино&«1 кнселино 3 клетки-домакин на бозайници включват зависеща ст калциев фосфп’ трансфекция електропорация, зависеща от DEAE-декстран трансФекима зависеща от липозом трансфекция, вирусни вектори и метод за трансфекция, описан от Life Technologies Ltd, Paisley, UK при използване на Lipofectamin 2000 Тези ме юди са известни на специалистите и са описани, например, от Ausbei et al., (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nsv.· York, USA. Култивирането на клетките от бозайник се провежда съгласно установени методи, например, както е описано в (Animal Cell Biotechnology. Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc , Totowa,, New Jersey, USA and Harrison MA and Rae IF, General Techniques it Cell Culture, Cambridge University Press 1997).
За да се продуцира гликосилиран полипептид. предпочита се използването на евкариотна клетка-домакин, например, от вида, споменат по горе.
При метода за получаване, съгласно настоящото изобретение, клетките се отглеждат в хранителна среда, подходяща за получаване на полипелтидната
разновидност, при използване на. известни ча специалистите мтгти Например, клетката може да бъде отгледана в колба при разклащане, при някакъв вид ферментация (включваща непрекъсната, в маса, в хранигелна маса, или твърдофазна ферментация) в лабораторни или промишлени ферментатори, провеждана в подходяща среда и при условия, които позволяват проявление на полипелтидната
Отглеждането се провежда в подходяща хранителна среда, включваща източници на въглерод и азот и неорганични соли, при използване на известни на специалистите методи Подходящи среди се намират в търговската мрежа или могат да се приготвят, съгласно публикувани оецепти (напримео в каталозите на American Type Culture Collection). Акс пелиг.еж.гид.щ.й разновидност се отдали в хранителната среда, полипелтидната разновидност може директно от средата *да ’бъде’възстановена?* Ако полипептидната разновидност не се отделя, тя може да бъде възстановена от кпвтъ пизати
Получената полипептиднд разновидност може да бъде възстановена пр.; използване на известни на специалистите методи. Например полипептидната разновидност може да бъде възстановена от храни1елната среда по конвенционални методи, включващи, но без да е ограничение, центрофугиране,
филтруване, екстрахираме. пулверизиране, изпаряване или утаяване i юлипептидните разновидности могат да оъдат пречистени по редица известни на специалистите методи, включващи, но без да g ограничение, хроматография (напоимер, йонен обмен афинитет хипрофобност, хроматофокусиране и в зависимост от размера}, електрофорези*; методи (например, препаративно изоелектрично фокусиране), разделна разтворимост «например, утаяване с амониев сулфат), SDS-PAGE или екстрахирано (виж, например, Protein Purification, J. 0. Janson an cl Lars Ry J~r.
New York, 1989) Специфични методи за пречистване на полипептиди, показващи интерферон-гама активност, са описани в ЕР 110044 и Japanese petent application No ί96995/84.
Биологичната активност на интерферон-гама полипептидната разновидност може да бъде изследвана при използване на известни на специалистите методи. Тези анализи включват неутрализиране на антитяло с антивирусна активност, въвеждане на протеинкиназа, активност на •щщгоаде.чилат 2,5 А синтстззз или фосфсдиестераза, както е описано в ЕР 41313 В1. Тези анализи включват и имуномодулаторни анализи (виж. например,
US 4.753.735). анализи за подтискане на растежа и оценка на свързването към клетките, които представляват рецептори на интерферон. Специфичните анализи са описани в раздела, описващ материалите и методите, съгласно настоящето изобретение.
• · ·· ···· • · · · • · · · * · · · · • · • · ···* ---WWW ·
Фармацевтичнй*състави жтяхновУярйдекение
Още повече, настоящото изобретение се отнася до подобрени методи за лечение или превенция, по-специално, на възпаления, например, интерстициални белодробни заболявания, като идиопатична пулмонарна фиброза, но също и на грануломатозни болести; рак, по-специално, рак на яйчниците; инфекции, като белодробни атипични микобактериални инфекции; нарушения в костите (например, нарушение на костния метаболизъм, като злокачествена остеопороза); автоимунни заболявания, като ревматоиден артрит, както и други болести, ко мултирезистентна туберкулоза; криптококален менингит; цистична фиброза и чернодробна фиброза, поспециално, чернодробна фиброза, вследствие на хепатит С, като споменатият метод включва администриране върху бозайник, в частност, човек, който има нужда, на ефективно количество полипептидна разновидност, съгласно настоящото изобретение, или състав, съгласно настоящото изобретение; като ключовите предимства са по-рядко и/или по-малко интрузивно администриране при по-ефективно лечение, и по възможност, по-нисък риск от имунни реакции с терапевтично активното(ите) съединение(я).
Молекулата, съгласно настоящото изобретение, за предпочитане, се администрира под формата на състав, включващ фармацевтично приемлив носител или ексципиент. “фармацевтично приемлив” означава носител или ексципиент, които не причиняват неблагоприятни ефекти при пациентите, на които са администрирани. Такива фармацевтично приемливи носители и ексципиенти са известни на специалистите (Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18ifl edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).
Молекулите, съгласно настоящото ^80оретемие*.«Логат да се използват каквито са и/или под форма на тяхна сол. Подходящите соли включват, но без да е ограничение, соли на алкални метали или на алкалоземни метали, като натрий, калий, калций и магнезий, както и цинкови соли. Тези соли или комплекси могат да съществуват като кристална и/или аморфна структура.
Разновидността, съгласно настоящото изобретение, се администрира в доза, приблизително същата, като използваната при лечение с известни състави на интерферон-гама, като Actimmune® или като описаните в ЕР 795332. Точната доза за администриране зависи от обстоятелствата. Обикновено дозата е такава, че да може да предпази или да понижи тежестта или разпространението на състоянието или индикацията, които се лекуват. На специалистите е ясно, че ефективното количество от разновидността или състава, съгласно настоящото изобретение, зависи от заболяването, дозата, режима на администриране, дали полипептидната разновидност или съставът се администрират самостоятелно или в комбинация с други терапевтични средства, серумния полуживот на съставите и общото здравословно състояние на пациента.
Настоящото изобретение се отнася също и до интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, или до фармацевтичния състав, съгласно настоящото изобретение, които се използват като медикамент.
Още повече, настоящото изобретение се отнася, също така, до приложението на а) интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, или б) фармацевтичен състав, съгласно настоящото изобретение, предназначен за получаване на медикамент, фармацевтичен състав или набор от части за лечение на възпаления, например, интерстициални белодробни заболявания, като идиопатична пулмонарна фиброза, рак, по-специално, рак на яйчниците, инфекции, като белодробни атипични микобактериални инфекции: нарушения в костите (например, • · · · · · • · · • · · • · · нарушение на • · · • · · · • · · • · · · w 9 · костния метаболизъм, кате* злокачествена остеопороза):
грануломатозни заболявания; автоимунни заболявания, като ревматоиден артрит, както и други болести, ко мултирезистентна туберкулоза;
криптококален менингит; цистична фиброза и чернодробна фиброза, по специално, чернодробна фиброза, вследствие на хепатит С. Най предпочитаната болест за лечение е интерстициална белодробна болест, по специално, идиопатична пулмонарна фиброза.
Описани са, също така, подобрени начини за доставяне на молекулите на съставите, като е възможно допълнително да се използват
глюкокортикоиди.
Предпочитаната доза е 1-4, повече се предпочита, 2-3 микрограма на килограм телесно тегло на пациента на полипептидния компонент за доза. Предпочитаната доза е 100-350, повече се предпочита, 100-150 микрограма глюкокортикоид на килограм телесно тегло на пациент за доза.
Настоящото изобретение се отнася и до комплект от части, подходящи за лечение на интерстициални белодробни заболявания, включващ първи фармацевтичен състав, съдържащ активните компоненти а) или б). споменати по-горе, и втори фармацевтичен състав, съдържащ поне един глюкокортикоид. всеки заедно с фармацевтично приемлив носител и/или ексципиент.
Полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, се формулира във фармацевтични състави по известни методи. Подходящи състави са описани в Remington s Pharmaceutical Sciences от Е. W. Martin и US 5,183,746.
Фармацевтичният състав може да се приготви под различни форми, включващи течност, гел, лиофилизирана форма, прах, пресовано твърдо вещество или друга подходяща форма. Предпочитаната форма зависи от отделното заболяване, което ще се лекува и се разбира от специалистите.
Фармацевтичният състав може да бъде администриран орално, подкожно, интравенозно, интрацеребрално, интранасално, трансдермално, «· · ··· тааперитонеално. мускулно.
етнтрапулменарие? ‘««вагинално, ректално.
снтраокулярно или по друг подходящ начин, например, при използване на PowderJect или ProLease технологиите. Съставите могат да бъдат администрирани непрекъснато посредством инфузия, въпреки че е приемлива и болусна инжекция, при използване на известни на специалистите техники, като помпи или импланти. В някои случаи, съставите могат директно да се прилагат под формата на разтвор или аерозол. Предпочитаният начин на администриране зависи от отделното заболяване, което ще се лекува и се разбира от специалистите.
Фармацевтичният състав, съгласно настоящото изобретение, може да бъде администриран заедно с други терапевтични средства. Тези средства могат да бъдат въведени като съставна част на същия фармацевтичен състав или могат да се администрират отделно от полипептидната разновидност,
съгласно настоящото изобретение, или конкурентно, или съгласно друг приемлив режим на лечение. Още повече, полипептидната разновидност или фармацевтичният състав, съгласно настоящото изобретение, може да се използва като допълнение на друго лечение. По-специално, приемливи са комбинации с глюкокортикоиди, както е описано в ЕР 795332.
В друг аспект, настоящото изобретение се отнася до метод за лечение на бозайници, притежаващи циркулиращи антитела спрямо човешки интерферон гама или рекомбинантен човешки интерферон-гама, характеризиращ се с това, че включва администриране на интерферон-гама разновидност, притежаваща биоактивностга на интерферон-гама, и която не взаимодейства със споменатите антитела. Предпочита се, съединението да е разновидност, описана в настоящото изобретение, а бозайникът да е, за предпочитане, човек. Бозайниците, които ще се лекуват, могат да страдат от някоя от болестите, изредени по-горе, за които лечението с интерферон-гама е ефикасно. Още повече, настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на фармацевтичен продукт за приложени© при лечението на бозаиници.
• - - · ·· · · ···· ···· ···» ,, , ··· ......
• · · · ······ ф притежаващи циркулиращи антитела спрямо’ човешки‘интерферон-гама или рекомбинантен човешки интерферон-гама, характеризиращ се с това, че интерферон-гама разновидност, притежаваща биоактивността на интерферонгама, и която не взаимодейства със споменатите антитела, се формулира в енжектируем или под някаква друга форма подходящ състав. Терминът циркулиращи антитела’' означава автоантитела, получени в бозайник, в отговор на лечение с някакъв състав на интерферон-гама, наличен в търговската мрежа.
Настоящото изобретение се отнася и до приложение на нуклеотидна последователност, кодираща интерферон гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, в генна терапия. По-специално, интерес представлява използването на нуклеотидна последователност, кодираща интерферон-гама полипептидната разновидност, описана в раздела Интерферон-гама разновидности, съгласно настоящото изобретение, в които неполипептидната част е захарен остатък” по-горе. Гликосилирането на полипептидната разновидност, следователно, се постига през време на курса на генна терапия, т.е. след изразяване на нуклеотидната последователност в човешкото тяло.
Генната терапия включва лечение на тези болести, при които се очаква, полипептидната разновидност да осигури ефективна терапия.
Локалното прилагане на генна терапия с помощта на интерферон-гама разновидност, води до насочване на терапевтичния агент към точната област, като се избягват потенциални токсични проблеми, свързани с неспецифичното администриране.
Прилага се и in vitro, и in vivo генна терапия.
Известни са различни методи за пренасяне на потенциално терапевтични гени до определени клетъчни популации. За сравнение, виж, например, Mulligan, “The Basic Science Of Gene Therapy”, Science, 260, pp. 92631 (1993). Тези методи включват:
• ·· · · * ·· ···· ···· ·♦ · · · · · ··· · · · · · 0
Директен генен трансфер,· например.* «описан *в’«Wolff et al.. Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle In vivo”. Science, 247, pp. 1465-68 (1990);
Управляван от липозоми DNA трансфер, например, описан в Calpen et al., 'Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis”, Nature Med., 3, pp. 39-46 (1995); Crystal. “The Gene As A Drug”, Nature Med., 1, pp. 15-17 (1995); Gao and Huang, “A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection of Mammalian Cells”, Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, pp. 280-85 (1991);
Управляван от ретровирус DNA трансфер, например, описан в Kay et al.. “In vivo Gene Therapy og Hemophilia B; Sustained Partial Correction In Factor IXDeficient Dogs”, Science, 256, pp. 808-13 (1992);
Управляван от DNA вирус DNA трансфер. Тези DNA вируси включват аденовируси (за предпочитане, вектори на базата на Ad-2 или Ad-5), вируси на херпеса (за предпочитане, вектори на базата на вируса на херпес симплекс) или парвовируси (за предпочитане, вектори на базата на “дефектни” или неавтономни парвовируси, повече се предпочита, вектори на базата на вирус, свързан с адено, като най-предпочитани са векторите на базата на AAV-2). Виж, например, Alt et al., “The Use Of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy”, Gene Therapy, 1, pp. 367-84 (1994); US 4,797,368; US 5,139,941.
фармацевтични състави за парентерално администриране
Пример за фармацевтичен състав е разтвор, предназначен за парентерално администриране. Въпреки че в много случаи фармацевтичните състави под формата на разтвор се получават в течно състояние, подходяща за своевременна употреба, тези състави за парентерално администриране могат да бъдат и замразени или в лиофилизирана форма. В първия случай, съставът трябва да бъде стопен преди употреба. Втората форма често се използва за подобряване на стабилността на активното съединение, съдържащо се в състава при голямо разнообразие от условия на съхранение, както е известно
на специалистите в областта, 1ге,л’йО*филлЬиранит&съЪт1ви обикновено са пс стабилни от техните течни аналози. Такива лиофилизирани състави се разтварят преди употреба чрез прибавяне на един или повече подходящи, фармацевтично приемливи разтворители, като стерилна вода за инжектиране или стерилен физиологичен разтвор на салин.
В случая, когато съставът ще се прилага парентерално, те се получават като лиофилизирани състави за съхранение или водни разтвори посредством смесване, ако е подходящо, на полипептидна разновидност, притежаваща желана степен на чистота с един или повече фармацевтично приемливи носители, ексципиенти или стабилизатори, обикновено използвани в практиката (всички са наречени “ексципиенти”), например буферни средства, стабилизатори, консерванти, изотоници, нейоногенни повърхностно активни вещества, антиоксиданти и/или други разнообразни добавки.
Буферните средства помагат да се поддържа pH в граници, които се доближават приблизително до физиологичните условия. Те обикновено присъстват в концентрации от около 2 тМ до около 50 тМ Подходящите буфери, използвани съгласно настоящото изобретение, включват органични и неорганични киселини и техни соли, като цитратни буфери (например, смес мононатриев цитрат - динатриев цитрат, смес лимонета киселина - тринатриев цитрат, смес лимонета киселина - мононатриев цитрат и т.н.), сукцинатни буфери (например, смес сукцинова киселина - мононатриев сукцинат, смес сукцинова киселина - натриев хидроксид, смес сукцинова киселина - динатриев сукцинат и т.н.), тартаратни буфери (например, смес винена киселина - натриев тартарат, смес винена киселина - калиев тартарат, смес винена киселина натриев хидроксид и т.н.), фумаратни буфери (например, смес фумарова киселина - мононатриев фумарат, смес фумарова киселина - динатриев фумарат, смес мононатриев фумарат - динатриев фумарат и т.н ), глюконатни буфери (например, смес глюконова киселина - натриев глюконат, смес глюконова киселина - натриев хидроксид, смес глюконова киселина - калиев
S4
глюконат и т.н.). оксалатни буфери (например.’·®μ’θο ’ оксалова киселина натриев оксалат, смес оксалова киселина - натриев хидроксид, смес оксалова киселина - калиев оксалат и т.н.), лактатни буфери (например, смес млечна киселина натриев лактат, смес млечна киселина - натриев хидроксид, смес млечна киселина - калиев лактат и т.н.) и ацетатни буфери (например, смес оцетна киселина - натриев ацетат, смес оцетна киселина - натриев хидроксид и т.н.). Други възможности са фосфатни буфери, хистидинови буфери и триметиламино соли, като Tris.
Консервантите се прибавят за задържане на микробния растеж и обикновено се прибавят в количество около 0.2% - 1% (тегл./об.). Подходящите за приложение, съгласно настоящото изобретение, консерванти включват фенол, бензилов алкохол, метакрезол, метилпарабен, пропилпарабен, октадецилдиметилбензиламониев хлорид, бензалкониеви халогениди (например, бензалкониев хлорид, бромид или йодид), хексаметониев хлорид, алкилпарабени, като метил- или пропилпарабен. катехол. резорцинол, циклохексанол и 3-пентанол.
Изотониците се прибавят за да се осигури изотоничност на течните състави и включват поливалентни захарни алкохоли, за предпочитане, тривалентни или по-висши захарни алкохоли, като глицерин, еритритол, арабитол, ксилитол, сорбитол и манитол. Поливалентните алкохоли могат да присъстват в количество между 0.1 и 25 тегл.%, обикновено, от 1 до 5 тегл.%, като се взимат под внимание съответните количества на другите ингредиенти
Стабилизаторите се отнасят към голяма група ексципиенти, които могат да варират в действието си от обемни пълнители до добавки, които солюбилизират терапевтичното средство или помагат да се предотврати денатурацията или залепването към стената на контейнера. Типични стабилизатори могат да бъдат поливалентни захарни алкохоли (изредени погоре); аминокиселини като аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, хистидин, аланин. омитин. L-леуцин, 2-фенилаланин. глутаминова киселина.
* · · · · · ·· 9 9 треонин и т.н., органични зЗКарй илет· захарни алкохоли, като лактоза, трехалоза, стахиоза, манитол, сорбитол, ксилитол, рибитол, миоинизитол, галактитол, глицерол и други, включващи циклитоли. като инозитол; лолиетиленгликол; полимери на аминокиселини; сяросъдържащи редукционни агенти, като карбамид, глутатион, тиоктинова киселина, натриев тиогликолат, тиоглицерол, α-монотиоглицерол и натриев тиосулфат, полипептиди с ниско молекулно тегло (например, с по-малко от 10 остатъка); протеини, като човешки серумен албумин, волски серумен албумин, желатин или имуноглобулини; хидрофилни полимери, като поливинилпиролидон; монозахариди, като ксилоза, маноза, фруктоза и глюкоза; дизахариди, като лактоза, малтоза и сукроза; тризахариди, като рафиноза и полизахариди, като декстран. Стабилизаторите обикновено присъстват в количества от 0.1 до 10,000 тегловни части по отношение на теглото на активния протеин.
Нейоногенните повърхностно-активни вещества или детергенти (известни също като “омогрящи агенти”) помагат за солюбилизиране на терапевтичния агент, както и защитава терапевтичния полипептид от агрегиране. индуциране от разбъркването, като позволява излагането на повърхността на напрежение без да се предизвиква денатуриране на полипептида Подходящите нейоногенни повърхностно-активни вещества включват полисорбати (20, 80 и т.н.), полиоксамери (184, 188 и г.н.), PlurcnicG полиоли, полиоксиетиленсорбитан моноетери (Tween®-20, Tween©-80 и т и )
Другите допълнителни ексципиенти включват обемни пълнители или пълнители (например, нишесте), хелатиращи средства (например, EDTA), антиоксиданти (например, аскорбинова киселина, метионин, витамин Е) и съразтворители.
Активният ингредиент може също да бъде включен в получените микрокапсули, например, посредством коацерватни техники или полимеризация на границата на фазите, например, микдокалеули ог хидроксиметилцелулоза, желатин или полиметллметакрилат. в колоидни системи, доставящи лекарството (например··* липозоми, албуминови микросфери, микроемул^ии, наночастици и нанокапсули), или в микроемулсии. Тези техники са описани в Remington s Pharmaceutical Sciences, suora
Съставите, предназначени за парентерално приложение, използвани за in vivo администриране, трябва да бъдат стерилни. Това се постига лесно, например, посредством филтруване през стерилни филтрационни мембрани.
В предпочитан аспект на настоящото изобретение, споменатият фармацевтичен състав включва а) интерферон-гама разновидността, съгласно настоящото изобретение, б) буфериращо средство, по-специално, сол на органична киселина, способно да поддържа pH между 5.0 и 6.5, в) стабилизатор, по-специално, органична захар или захарен алкохол, г) нейоногенно повърхностно-активно вещество, и д) стерилна вода. В частност, буфериращото средство се подбира от групата, състояща се от ацетат, сукцинат и цитрат, стабилизатооът е манитол или сорбитол, неионогенното повърхностно-активно вещество е Tween®-20 или Tween®-80. Предпочита се, фармацевтичният състав да не включва никакви консерванти
Състави със задържано освобождаване
Подходящите примери за състави със задържано освобождаване включват полупропускливи матрици от твърди хидрофобни полимери, съдържащи полипептидната разновидност, като матриците притежават подходяща форма, като филм или микрокапсули. Примерите за матрици със задържано освобождаване включват полиестери, хидрогели (например, поли(2-хидроксиетил-метакрилат) или поливинилов алкохол)), полилактиди, съполимери на б-глутаминовата киселина и етил-б-глутамат, неразградим етиленвинилацетат, разградими съполимери на млечна киселина и гликолова киселина, като ProLease® или биргоп Depot® (инжектируеми микросфери, съставени от съполимер на млечна киселина и гликолова киселина, и леупролидацетат) и поли D-(-) 3 хидроксибугирова киселина Покато полимери • ♦* · ·· ·· · · ·· ·· · · ·· · · · · · ···· * · * · · · като етиленвинилацетат и сьпояимер на лмечиа киеелима и гликолова киселина позволяват освобождаване на молекули в продължение ча дълги периоди от време, като до или повече от 100 дни, някои хидрогели освобождават прогеини в продължение на по кратки периоди от време. Когато капсулираните полипептиди остават з тялото в продължение на дълъг период от време, те
могат да се денагурират или да се агрегират в резултат на контакт с влага при 37°С, което води до загуба на биологична активност и възможни промени в имуногенността. Може да бъде изобретена рационална стратегия за стабилизиране в зависимост от включения механизъм. Например, ако е установено, че механизмът на агрегиране е междумолекулно образуване на S S връзка през тиодисулфид, стабилизиране може да се постигне чрез модифициране на сулфхидрилни остатъци, лиофилизиращи се от киселинни разтвори, контролиращи влагосъдържанието, при използване на подходящи добавки и разработване на специфични състави за полимерните матрици.
Орално администриране
За орално администриране, фармацевтичните състави могат да бъдат твърди или течни, например, под формата на капсула, таблетка, суспензия емулсия или разтвор. Предпочита се, фармацевтичният състав да се получи под формата на дозична единица, съдържаща дадено количество активен ингредиент. Подходящата дневна доза за човек или друг бозайник варира широко в зависимост от състоянието на пациента и други фактори, но не може да се определи от специалистите в областта при използване ма рутинни методи.
Твърдите дозични форми за орално администриране включват капсули, таблетки, свещички, прахове и гранули. В тези твърди дозични форми активното съединение може да бъде смесено с поне един инертен разредител, като сукроза, лактоза или нишесте. Тези дозични форми могат, също така, да съдържат, както е в обичайната практика, допълнителни вещества, например.
* -* · ·· ···· ί ί : ί · ! ’ j····· · лубриканти, като магнезиев стеарат. «случаите‘йа* капсули, таблетки и □счета, дози«яите форми могат, също така да съдържат буфери. Таблетките и хапчетата могат още да бъдат получени и с покрития.
Полипептидните разновидности могат да бъдат смесени с добавки като
лактоза, сукроза, нишесте на прах, целулозни естери на алканови киселини, стеаринова киселина, талк, магнезиев стеарат, магнезиев оксид, натриеви и калциеви соли на фосфорна и сярна киселини, акация, желатин, натриев алгинат, поливинилпиролидин и/или поливинилов алкохол, и да бъдат таблетирани или капсулирани за конвенциално администриране. Или пък, те могат да бъдат разтворени в салин, вода, полиетиленгликол, пропиленгликол. етанол, масла (като царевично масло, фъстъчено масло, памучно масло или сусамово масло), трагакант и/или различни буфери. На специалистите във фармацевтичната област са известни и други добавки и начини на администриране. Носителят или разредителят може да включва материал, който се забавя с времето, като глицерилмоностеарат са-мостоятелно или с восък или други материали, известни на специалистите.
Фармацевтичните състави могат да бъдат подложени на конвенционални фармацевтични операции, като стерилизиране и/или могат да включват конвенционални добавки, като консерванти, стабилизатори, омокращи агенти, емулгатори, буфери, пълнители и т.н., както е описано в настоящото изобретение.
Течните дозични форми за орално администриране включват фармацевтично приемливи емулсии, разтвори, суспензии, сиропи и еликсири, съдържащи инертни разредители, които обикновено се използват от специалистите, като вода. Тези състави могат също да съдържат добавки като омокрящи агенти, подсладители, средства за подобряване на вкуса и ароматизиращи средства.
j ίϋΚαΑίΐΰ cttjitfLihUCii ipUpciiiiJ
Съставите, подходящи за локално администриране, включват течни или полутечни състави, подходящи за проникване през кожата (например оедки мехлеми, лосиони, мехлеми, кремове или пасти) и капки, подходящи за администриране в очите, ушите или носа.
Пулмонално администриране
Съставите, подходящи за приложение с пулверизатор, или с впръскване или ултразвуков, обикновено съдържат полипептидни разновидности, разтворени във вода в концентрация, например, от около 0 01 до 25 mg полипептидна разновидност за mL, за предпочитане, от около 0 1 до 10 mg/mL. Съставът може да включва, също така, буфер и обикновена захар (например, за стабилизиране на протеина и регулиране на осмотичното налягане) и/или човешки серумен албумин в граници на концентрацията от 0.1 до 10 mg/mL. Примери за буферите, които могат да се използват, са натриев ацетат, цитрат и глицин. Предпочита се, буферът да е с такъв състав и моларност, че да установява pH на разтвора от 3 до 9. Най-общо, буферна моларност от 1 гпМ до 50 тМ е подходяща за тази цел. Примери за захарите, които могат да се използват са лактоза малтоза, мачитол, сорбитол, трехалоза и ксилоза, обикновено от 1% до 10% по отношение на теглото на състава.
Аерозолният състав може, също така, да съдържа повърхностно-активно вещество за понижаване или предотвратяване на агрегирането на повърхностите на протеина, причинено от атомизиране на разтвора при получаване на аерозола. Могат да се използват различни конвенционални повърхностно активни вещества, като естери и алкохоли на полиоксиетилен и мастни киселини, и естери на полиоксиетиленсорбитан и мастни киселини Количеството обикновено варира между 0 001% и 4% па отношение ма теглото на състава. Особено предпочитано повърхностно-активно вещество за целите на настоящото изобретение, е полиоксиетиленсорбитан моноолеат.
• · · ···
Специфични състави и за получаваме не· подходящи дисперсии ча течните частици, съгласно настоящото изобретение, са описани във WO 94/20069, US 5,915,378, US 5,960,792, US 5,957,124, US 5,934,272, US 5,915,378. U-S 5,355,564, US 5,826,570 и US 5,522,385, дадени в настоящото изобретено за сравнение.
Съставите, предназначени за използване в дозичен инхалатор, обикновено съдържат фин прах. Този прах може да бъде получен посредством лиофилизиране и следващо смилане на течния състав на полипептидната разновидност и. може също да съдържа стабилизатор, като човешки серумен албумин (HSA) Обикновено се прибавят повече от 0.5% (тегл./тегл) човешки серумен албумин (HSA). Още повече, ако е необходимо, към състава могат да бъдат добавени един или повече захари или захарни алкохоли. Примерите включват лактоза, малтоза, манитол, сорбитол, сорбитоза. трехалоза, ксилитол и ксилоза. Количеството, прибавено към състава, може да варира от 0.01 до 200% (тегл./тегл.), за предпочитане, от около 1 до 50% спрегнато съединение. Тези състави след това се пиофипизират и се смилат до частици с желан размер.
Частиците с подходящ размер след това се суспендират в реактивно вещество (пропелант) с помощта на повърхностно-активно вещество. Пропелант може да бъде всяко конвенционално вещество, използвано за таци цел, като хлорфлуорвъглерод, хидрохлорфлуорвъглерод. хидрофлуорвъгперод. или въглеводород, включващи трихлорфлуорметан, дихлордифлуорметан. дихлортетрафлуоретанол и 1,1,1,2-тетрафлуоретан, или техни смеси. Подходящите повърхностно-активни вещества включват сорбитантриолеат и соев лецитин. Олеиновата киселина също може да се използва за повърхностно активно вещество След това тази смес се въвежда в устройството за администриране. Пример за наличен в търговската мрежа дозичен инхалатор за използване в настоящото изобретение, е инхалатор за определена доза Ventolin, п рогаводство· wa* «Glaxo· inc·.· Research
Triangle Park.
Съставите за прахообразни инхалатори включват фин сух поах съдържащ полипептидната разновидност и могат, също така, да съдържат и обемен пълнител, като лактоза, сорбитол, сукроза или манитол в количество което улеснява разпръскването на праха от устройството, например, от 50% до 90% по отношение на теглото на състава. Частиците на праха трябва да имат аеродинамични свойства в белия дроб, съответстващи на частици с плътност около 1 д/стг, притежаващи среден диаметър, по-малък от 10 микрометра, за предпочитане, между 0.5 и 5 микрометра, и най-вече, между 45 и 3.5 микрометра Пример за прахов инхалатор, подходящ за приложение съгласно настоящото изобретение, е Spinhaler прахов инхалатор, производство на Fisons Corp., Bedford, Mass.
Праховете за тези устройства могат да бъдат получени по методи, описани в US 5,997,848, US 5,993,783, US 5,985,248, US 5,976,574, US 5,922,354, US 5,785 049 и US 5 654,007
Механичните устройства, конструирани за пулмонарно приложение на терапевтични продукти, включват, но без да е ограничение са пулверизаторите, инхалатори за определена доза и прахови инхалатори, като всички те са известни на специалистите. Специфични примери за налични в търговската мрежа устройства, подходящи за приложението, съгласно настоящото изобретение, са Ultravent пулверизатор, производство на Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; Acorn !! пулверизатор, производство на Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin инхалатор за определена доза, производство на Glaxo inc., Research triangle Park. North Carolina; Spinhaler прахов инхалатор, производство на Fisons Corp., Bedford. Massachusetts; устройство “стоящ облак”, производство на inhale Therapeutic Systems, Inc., San Carlos, California, AIR инхалагор, произведе гво на AMKci'! nsa,
• · · · · · · * * ·
Cambridge, Massachusetts; АЕЯ^сйЬтема^а^улмонарно администриране на лекарство, производство на Aradigm Corporation, Hayward. California.
Примери за изпълнение на изобретението
Настоящото изобретение е описано с помощта на следващите примери.
Примерите по никакъв начин не ограничават описанието на настоящото изобретение и патентните претенции.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Материали
СНО-К1 клетки (получени от American Type Culture Collection (ATCC #CCL81)).
HeLa клетки, (получени от American Type Culture Collection (ATCC #CCL·
2)).
ISRE-Luc. получен от Stratagene. La Jolla, USA.
pCDNA 3.1/хидро получен от Invitrogen, Carlsbad, USA.
Ограничителни ензими и полимерази, получени от New England Biolabs inc., Beverly, USA.
DMEM среда: Dublecco s Modified Eagle Media (DMEM), 10% ембрионален говежди серум и Hygromycin В, получени от Life Technologies A/S, Copenhagen, Denmark.
LucLite субстрат, получен от Packard Biosence, Groningen. The Netherlands.
TopCount луминометър, производство на Packard Biosence. Groningen.
The Netherlands
Биотинилирано поликлонално анти човешки интерферон-гама антитяло,
BAF285, получено от R&D Systems Inc., Minneapolis, USA.
·· · ···· • · · · « • · · · · • · ♦ · е · ·· • · • · • · · ··· *··'·;» i
Horse Radish пероксидазЯ - tkbpsdtta със стрептавидин. P0397, получена от DAKO, Copenhagen, Denmark.
ТМ8 маркиращ реактив, получен от KEM-EN-itC. Copenhagen, Denmark
Методи
Анализ за интерферон
Вече е публикувано, че интерферон-гама взаимодейства със и активира интерферон-гама рецепторите върху HeLa клетките. Като следствие, копирането се активира при промотори. съдържащи елемент, стимулиран от интерферон (ISRE). Следователно, възможно е изследване за агонисти на рецепторите на интерферон при използване на елемент, стимулиран от интерферон, куплиран с луцифераза ген-репортер (ISRE luc), поставен в HeLa клетките.
Първичен анализ
HeLa клетките се трансформират заедно с елемент, стимулиран от интерферон. куплиран с луцифераза ген-репортер (ISRE-luc) и pCDNA 3.1/хидрс. и, при избиране в DMEM среда, съдържаща Hydromycin В, се създават foci (клетъчни двойници). Клетъчните двойници се изследват за активност на луциферазата в присъствие или отсъствие на интерферон-гама. Онези двойници, които показват най-високо съотношение на стимулирана към нестимулирана активност на луциферазата, се използват в следващите анализи.
За да се изследват полипептидни разновидности, 15,000 клетки/гнездо се поставят в плочки за отглеждане на култури с 96 гнезда и се инкубират в продължение на една нощ в DMEM среда. На следващия ден, полипептидните разновидности както и известен страндарт, се прибавят към клетките в различни концентрации. Като “известен стандарт” се използва Actimmune©.
• ·· ·· ·4 • ·4 • · ·4 ампула Aciimmune® се разре5^а**до ··»·
5¾} ембри говежди серум и се съхранява при -80°С до употреба
Плочките се инкубират в продължение на 6 часа при 37°С във въздушна атмосфера с 5% въглероден двуокис и след това, към всяко гнездо се прибавя
LucLite субстрат (Packard Bioscience, Groningen, The Netherlands). Плочките се затварят и луминесценцията се измерва с помощта на TopCount луминомегьр (Packard) при режим броене на единичен фотон (SPC).
Всяка отделна плочка съдържа гнезда, инкубирани с интерферон-гама
като стимулирана контрола и други гнезда, съдържащи нормална среда като нестимулирана контрола. Съотношението между активността на стимулираната и нестимулпраната на луциферазата служи като вътрешен стандарт както за активността на интерферон-гама, така и за вариациите експеримент-къмексперимент За всяка проба интерферон-гама, количеството единици се определят по отношение на Aciimmune® стандарта и се дават като AU.
Определяне на повишена степен на гликосилиране
За определяне на различните степени на гликосилиране на мономерите на интерферон-гама разновидностите, SDS-PAGE гел преминава при стандартни условия и се трансферира до нитроцелулозна мембрана. Western blotting се провежда, съгласно стандартни методи при използване на биотинилирано поликлонално антитяло спрямо анти-човешки интерферон-гама (BAF285 от R & D Systems) като първично антитяло и Horese Radish пероксидаза, свързана с стрептавидин (Р0397 от DAKO) като вторично антитяло, последвано от оцветяване с ТМВ оцветяващ реактив (KEM-EN-TEC, Copenhagen, Denmark). Разпределението на мономерите на интерферон-гама разновидностите с различна степен на гликосилиране на оцветената мембрана, се осъществява визуално.
··»·
X z : ······ · • · · · · · ··· ···* ·?···· ·
Определяне на AUCsc. *’* ** ·:·*··* ’··**··*
AUCsc се определя при едно 200 μ! болусно подкожно администриране : ю равно количество (на активна база) от интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, в плъхове.
За тези експерименти се използват женски Sprag Dawley плъхове с тегло между 220 и 260 грама. Интерферон-гама полипептидът се смесва с натриев сукцинат (720 mg/l), манитол (40 g/Ι), полисорбат 20 (100 mg/?) при pH 6.0.
Преди подкожното администриране, от опашната вена се взима кръвна проба, за да е сигурно, че няма да може да се открие интерферон гама активност След администрирането, от опашната вена се взимат кръвни проби след 10 минути, 20 минути, 40 минути, 60 минути, 120 минути, 240 минути, 480 минути, 720 минути, 1440 минути, 1620 минути, 1920 минути и 2880 минути (понякога и след 3600 минути). Серум се приготвя като се оставя коагулат на кръвна проба в продължение на 20 минути при стайна температура, последвано от центрофугиране при 5000 грама, 20 минути при стайна температура. След това серумът се изолира и съхранява при ~^0сС по
определяне на интерферон-гама активността при използване на описания пзгоре “Първичен анализ”. Трябва да се отбележи, че, когато се определя количеството единици в серумните проби от РК изследванията на плъхове, стандартът Actimmune® се разрежда в DMEM, 5% FBS и 5% серум от плъх.
След това, количеството единици в серума (AU/ml) по отношение но времето (минути) се поставят на графика и се изчислява AUCsc при използване на GraphPad Prism 3.01.
Същите експерименти се извършват с човешки интерферон-гама в неговата гликосилирана форма и/или с Actimmune® за оценка на повишението на AUCsc на интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, в сравнение с човешкия интерферон-гама в неговагя гликосилирана форма и/или с Actimmune®.
9G· · · ··
Серумен полуживот
Серумният полуживот се определя при едно 200 μΙ болусно интравенозно администриране на равно количество (на активна база) от интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, в плъхове.
За тези експерименти се използват женски Sprag-Dawley плъхове с тегло между 220 и 260 грама. Интерферон-гама полипептидът се смесва с натриев сукцинат (720 mg/l), манитол (40 g/Ι), полисорбат 20 (100 mg/l) при pH 6.0.
Преди интравенозното администриране, от опашната вена се взима кръвна проба, за да е сигурно, че няма да може да се открие интерферон-гама активност. След администрирането, от опашната вена се взимат кръвни проби след 5 минути, 10 минути, 20 минути, 40 минути, 60 минути, 120 минути, 240 минути, 480 минути, 720 минути, 1440 минути, 1620 минути, 1920 минути и 2880 минути. Серум се приготвя като се оставя коагулат на кръвна проба в продължение на 20 минути при стайна температура, последвано от центрофугиране при 5000 грама, 20 минути при стайна температура. След това серумът се изолира и съхранява при -80°С до определяне на интерферон-гама активността при използване на описания по-горе “Първичен анализ”. Трябва да се отбележи, че, когато се определя количеството единици в серумните проби от РК изследванията на плъхове, стандартът Actimmune® се разрежда в DMEM, 5% FBS и 5% серум от плъх.
След това, количеството единици в серума (AU/ml) по отношение на времето (минути) се поставят на графика и се изчислява серумният полуживот при използване на WinNonLin Pro 3.3.
Същите експерименти се извършват с човешки интерферон-гама в неговата гликосилирана форма и/или с Actimmune® за оценка на повишението на серумния полуживот на интерферон-гама полипептидната разновидност, съгласно настоящото изобретение, в сравнение с човешкия интерферон-гама в неговата гликосилирана форма и/или с Actimmune®.
• ·· 9ϊ· · · · · ·····. ..
; · · ...
····.· . .1. · · .... ··· ·· ·· ··
Идентифициране на обърнатите към повърхността аминокиселинни остатъци Структури
Експериментални 3D структури на човешки интерферон-гама, определени посредством рентгено-структурна кристалография, са описани от: Ealick et al., Science, 252: 698-702 (1991), който дава С-алфа следа на интерферон-гама хомодимер. Walter et al., Nature 376: 230-235 (1995) описват структурата на интерферон-гама хомодимер в комплекс с две молекули от разтворимата форма на интерферон-гама рецептора. Координатите на тази структура никога не са били достъпни. Thiel et al.. Structure 8: 927-936 (2000) описват структурата на интерферон-гама хомодимер в комплекс с две молекули от разтворимата форма на интерферон-гама рецептора, притежаващ трета молекула на рецептора в структурата, която не взаимодейства с интерферон-гама хомодимера.
Достигната повърхностна площ (ASA)
За изчисляване на достигнатата повърхностна площ (ASA) на отделните атоми в структурата е използвана компютърната програма Access (В. Lee and F. М. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971)) вариант 2 (Copyright (c) 1983 Yale University). Този метод обикновено се използва за размер на отвор 1.4 А и дефинира достигнатата повърхностна площ (ASA) като площ, формирана от центъра на отвора. Преди това изчисление, всички водни молекули, водородни атоми и идруги атоми, които не са директно свързани с протеина, са отделяни от координационната мрежа.
фракционна достигната повърхностна площ (ASA) на страничната верига
Фракционната достигната повърхностна площ (ASA) на атомите на страничната верига се изчислява посредством разделяне на сумата на фракционната достигната повърхностна площ (ASA) на атомите на страничната верига със стойността на фракционната достигната повърхностна площ (ASA) ··· ·· .. ..
на атомите на страничната верига на вида остатък от удължения ALA-x-ALA трипептид. Виж, Hubbard, Campbell & Thornton (1991), J. Mol. Biol. 220: 507-530. За този пример, СА атомът се отнася като част от страничната верига на глициновите остатъци, но не за останалите остатъци. Като стандарт 100% фракционна достигната повърхностна площ (ASA) за страничната верига се използва следната таблица:
Ala 69.23 A2
Arg 200.35 A2
Asn 106.25 A2
Asp 102.06 A2
Cys 96.69 A2
Gin 140.58 A2
Giu 134.61 A2
Gly 32.28 A2
His 147.00 A2
lie 137.91 A2
Leu 140.76A2
Lys 162.50 A2
Met 156.08 A2
Phe 163.90 A2
Pro 119.65 A2
Ser 78.16 A2
Thr 101.67 A2
Trp 210.89 A2
Tyr 176.61 A2
Vai 114.14 A2
Остатъците, които не се откриват в структурата, са дефинирани като имащи 100% проявление, тъй като се счита, че обитават гъвкавите области. Определяне на разстоянията между атомите
Разстоянията между атомите са определени посредством софтуер за молекулни графики, например, Insightll v. 98.0, MSI INC.
95.....
• : :. ·. ···*·*· ···*··* *·«·· * Определяне на рецепторното място за свързване
Рецепторното място за свързване се дефинира, като съдържащо всички остатъци, притежаващи тяхната достигната повърхностна площ, променена при рецепторното свързване. Това се определя посредством на поне две изчисления на достигнатата повърхностна площ; едно на изолирания(ите) лиганд(и) в комплекса лиганд(и)/рецептор(и) и едно на завършения комплекс лиганд(и)/рецептор(и).
ПРИМЕР 1 - Определяне на обърнатите към повърхността аминокиселинни
остатъци
Използваната рентгенографска структура е на интерферон-гама хомодимер в комплекс с две молекули от разтворимата форма на интерферонгама рецептор, притежаващ трета молекула на интерферон-гама рецептора в структурата, която не взаимодейства с интерферон-гама хомодимера, описано от Thiel et al., Structure 8: 927-936 (2000). Структурата се състои от интерферонгама хомодимер, в който две молекули са маркирани с А и В. За целите на конструкцията, допълнителен метионин се поставя преди интерферон-гама последователността, маркиран като МО и последователността е при С-края скъсена с 10 остатъка (Q133 е последен остатък в конструираните молекули). МО се отделя от структурата във всички изчисления на този пример. Структурата на двата интерферон-гама мономера има много малка електронна плътност след остатък 120, а остатъците са само моделирани до остатък Т126. Следователно, остатъците S121-T126 се отделят от структурата преди изчисленията в този пример. Двата рецепторни фрагмента, маркирани като С и D, директно взаимодействат с интерферон-гама хомодимера, а третата рецепторна молекула, маркирана като Е, няма контакт с интерферон-гама хомодимера и не се включва в тези изчисления.
• · · • · · • · · • · · · · Повърхностно проявление
Провеждайки изчисления на фракционната достигната повърхностна площ (ASA) за хомодимера на молекулите А и В, изключвайки МО и S121-T126 в двете молекули, води до получаване на следните остатъци, притежаващи повече от 25% от тяхната странична верига, изложена към повърхността в поне един от мономерите: Q1, D2, РЗ, К6, Е9, N10, К12, К13, Y14, N16, G18, Н19, S20, D21, А23, D24, N25, G26, Т27, G31, К34, N35, К37, Е38, Е39, S40, К55, К58, N59, К61, D62, D63, Q64, S65, Q67, К68, Е71, Т72, К74, Е75, N78, V79, К80, N83, S84, N85, К86, К87, D90, Е93, К94, N97, S99, Т101, D102, L103, N104, Н111, Q115, А118 и Е119.
Следващите остатъци притежават повече от 50% от тяхната странична верига, изложена към повърхността в поне един от мономерите: Q1, D2, РЗ, К6, Е9, N10, К13, N16, G18, Н19, S20, D21, А23, D24, N25, G26, Т27, G31, К34, К37, Е38, Е39, К55, К58, N59, D62, Q64, S65, К68, Е71, Е75, N83, S84, К86, К87, К94, N97, S99, Т101, D102, L103, N104, Q115, А118 и Е119.
Провеждайки изчисления на фракционната достигната повърхностна площ (ASA) за хомодимера на молекулите А и В, изключвайки МО и S121-T126 в двете молекули, и включвайки рецепторните молекули С и D, води до получаване на следните остатъци, притежаващи повече от 25% от тяхната странична верига, изложена към повърхността в поне един от мономерите: Q1, D2, РЗ, К6, Е9, N10, К13, Y14, N16, G18, Н19, D21, N25, G26, G31, К34, N35, К37, Е38, Е39, S40, К55, К58, N59, К61, D62, D63, Q64, S65, Q67, К68, Е71, Т72, К74, Е75, N78, V79, К80, N83, S84, N85, К86, К87, D90, Е93, К94, N97, S99, Т101, D102, L103, N104 и Е119.
Следващите остатъци притежават повече от 50% от тяхната странична верига, изложена към повърхността в поне един от мономерите: РЗ, К6, N10, К13, N16, D21, N25, G26, G31, К34, К37, Е38, Е39, К55, К58, N59, D62, Q64, S65, К68, Е71, Е75, N83, S84, К86, К87, К94, N97, S99, Т101, D102, L103 и N104.
Всяка от горните позиции е мишена за модификация, съгласно настоящото изобретение
103.
• · · · • · · .
• · · · · ........ *..·
Сравняват се резултатите от двата списъка, за К12, S20, А23, D24, Т27, Н111, Q115 и А118, отделени от повече от 25% достигната повърхностна площ (ASA) от страничната верига при рецепторното свързване, и Q1, D2, Е9, G18, Н19, S20, А23, D24, Т27, Q115, А118 и Е119, отделени от повече от 50% достигната повърхностна площ (ASA) от страничната верига при рецепторното свързване.
Остатъците, които не са определени в структурата, се третират като иложени с цялата си повърхност, т.е., остатъци S121, Р122, А123, А124, К125, Τ12Θ, G127, К128, R129, К130, R131, S132, Q133, М134, L135, F136, R137, G138, R139, R140, А141, S142, Q143. Тези остатъци също съдържат отделни мишени за въвеждане на прикачени групи, съгласно настоящото изобретение (или могат да бъдат разглеждани като принадлежащи към групата на обърнатите към повърхността оминокиселинни остатъци, например, притежаващи повече от 25% или повече от 50% обърнати странични вериги).
ПРИМЕР 2: Определяне на мястото за рецепторно свързване
При провеждане на изчисленията на достигнатата повърхностна площ (ASA), както е описано по-горе, се получават остатъци от интерферон-гама молекулата, притежаваща по-малка достигната повърхностна площ в поне единия от мономерите в комплекса, в сравнение с изчисляването на изолирания димер: Q1, D2, Y4, V5, Е9, К12, G18, Н19, S20, D21, V22, А23, D24, N25, G26, Т27, L3, К34, К37, К108, Н111, Е112, 1114, Q115, А118 и Е119.
ПРИМЕР 3: Конструкция на касета за проявление на интерферон-гама с оптимизирано кодонно приложение
DNA последователността с входящ номер Х13274 в GenBank, обхващаща cDNA с пълна дължина, кодираща човешки интерферон-гама с нейния природен сигнален пептид, се модифицира, за да се улесни силното
·*· ·· «· 99 проявление в СНО клетките. Кодони на нуклеотидната последователност на човешки интерферон-гама се модифицират посредством наклон, направен в кодона така, че да е насочен към кодоните, които често се използват в homo sapiens. След това, някои нуклеотиди в последователността се заменят с други за да се въведат места на разпознаване за ограничителните ендонуклеази на деоксирибонуклеиновата киселина. Прекурсорите се конструират така, че генът да може да бъде синтезиран.
Прекурсорите се свързват в синтетичен ген посредством едноетапна PCR при използване на платинов Ях-полимеразен комплект (Life Technologies) и стандартните циклични параметри на триетапната PCR. Полученият ген се удължава при PCR при същите условия и притежава последователността, показана в SEQ ID N0:42. Синтезираният ген се клонира в pcDNA3.1 /hydro (In Vitrogen) между местата BamHI и Xbal, което води до получаване на plGY-22.
plGY-22 се превръща в СНО К1 клетки при използване на Lipofectaim 2000 (Life Technologies) като средство за превръщане. След 24 часа културната среда се обира и се изследва за активност и концентрация на интерферонгама посредством ELISA При използване на описания по-горе Първичен анализ, се получава активност 1.4 х 107 AU/ml.
ПРИМЕР 4: Мутагенеза, насочена към мястото
Получаване на гликосилирани разновидности
За въвеждане на мутации в интерферон-гама, олигонуклеотиди се подреждат по такъв начин, че промените, извършвани при PCR да могат да бъдат въведени в плазмида на проявление (plGY-22) посредством класическа двуетапна PCR.
Два векторни прекурсора се използват заедно със специфични прекурсори на мутация: ADJ013: 5’-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3’ (антисетивен насочен надолу векторен прекурсор) (SEQ ID N0:43) и ADJ014: 5’-
; ; ....... . .
..... aja *··* ·<φ· ·<β·
TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3’ (сетивен насочен наГОРЕ векторен прекурсор) (SEQ ID N0:44).
S99T разновидността се получава при класическа двуетапна PCR, при използване на ADJ013 и ADJ014 като векторни лрекурсори, ADJ093 (5GTTCAGGTCTGTCACGGTGTAATTGGTCAGCTT-3’) (SEQ ID N0:45) и ADJ094: 5AAGCTGACCAATTACACCGTGACAGACCTGAAC-3) (SEQ ID N0:46) като параметри на мутацията, и pIGY 22 като шаблон. Продуктът на реакцията 447 Ьр се подклонира до pcDNA3.1 /hydro (In Vitrogen) при използване на BamHI и Xbal, което води до получаване на плазмид plGY-48.
plGY-48 се превръща в СНО К1 клетки при използване на Lipofectaim 2000 (Life Technologies) като средство за превръщане. След 24 часа културната среда се обира и се изследва за активност на интерферон-гама. При използване на описания по-горе Първичен анализ, се получава активност 5.1 х 106AU/ml.
E38N+S40T+S99T разновидността се получава при класическа двуетапна PCR, при използване на ADJ013 и ADJ014 като векторни прекурсори, ADJ091 (5-CATGATTCTTCCGATCGGTCTCGTTCTTCCAATT-3) (SEQ ID N0:47) и ADJ092: 5’-AATTGGAAGAACGAGACCGATCGGAAGATCATG-3’) (SEQ ID N0:48) като параметри на мутацията, и plGY-48 като шаблон. Продуктът на реакцията 447 Ьр се подклонира до pcDNA3.1 /hydro (In Vitrogen) при използване на BamHI и Xbal, което води до получаване на плазмид plGY-54.
plGY-54 се превръща в СНО К1 клетки при използване на Lipofectaim 2000 (Life Technologies) като средство за превръщане. След 24 часа културната среда се обира и се изследва за активност на интерферон-гама. При използване на описания по-горе Първичен анализ, се получава активност 1.3 х 107AU/ml.
При използване на описаните по-горе стандартни методи се получават редица гликосилирани разновидности на интерферон-гама с пълна верига. Тези разновидности са показани в Таблица 1 по-долу.
·· 104· ···· • · · ·· • · · ·· • · · · ·ф • · ·· · · • · · · · · • · · · · ф
Получаване на скъсени в С-края интерферон-гама разновидности
Скъсени в С-края интерферон-гама разновидности, съдържащи стопиращ кодон, непосредствено насочен надолу към кодон за Leu135, се получават при едноетапна PCR при използване на plGY-22, plGY-48 и plGY-54 като еталони, последвано от подклониране на продуктите на реакцията в pcDNAS.I/hydro (In Vitrogen) при използване на BamHI и Xbal. Прекурсорите, използвани за конструкцията на тези разновидности са: ADJ014 (виж, по-горе, насочен нагоре) и 5’-GAGTCTAGATTACAGCATCTGGCTTCTCTT-3’ (SEQ ID N0:49) (насочен надолу). Получените плазмиди завършват с plGY-72 (необлаюроден интерферон-гама, скъсен след Leu135), plGY-73 (S99T разновидност, скъсена след Leu135) и plGY-74 (E38N+S40T+S99T разновидност, скъсена след Leu135).
Получаване на интерферон-гама разновидности, съдържащи цистеин
Остатъци на интерферон-гама разновидности, съдържащи цистеин, се получават при използване на Stratagene’s QuikChange™XL комплект за мутагенеза, насочена към мястото, съгласно спецификацията на производителя. При използване на plGY-48 като еталон, се получават седем интерферон-гама разновидности, всяка съдържаща един въведен цистеин: N10C+S99T, N16T+S99T, E38N+S99T, N59C+S99T, N83C+S99T. K94C+S99T и S99T+N104C. По същия начин, при използване на plGY-54 като еталон, се получават шест интерферон-гама разновидности, всяка съдържаща един въведен цистеин: N10C+E38N+S40T+S99T, N16T+E38N+S40T+S99T,
E38N + S40T+N59C+S99T, E38N + S40T+N83C+S99T, E38N+S40T+K94C+S99T и E38N+S40T+S99T+ N104С.
ПРИМЕР 5: Свързване на разновидности, съдържащи цистеин. с полиетиленгликол
105.
• · ·· • · ·· • · · ·· • · ·· • ·· ·· • · ·· ·· • · · • · • · · • « ·· ·
Всички буфери се деокисляват преди употреба. Протеиновите концентрации се изчисляват чрез измерване на А280.
Свързване с полиетиленгликол при използване на OPSS куплираща химична реакция
7.2 ml от интерферон-гама разновидността N16C+S99T (пълна дължина) с концентрация 1.3 mg/ml в 5 тМ натриев сукцинат, 4% манитол, 0.01% Tween 20, pH 6.0 се редуцират при инкубиране с 300 μ| 0.5 М DTT в продължение нао 30 минути при стайна температура. Интерферон-гама разновидността се обезсолва чрез преминаване на 3 аликвотни части от по 2.5 ml през NAP25 гел филтрационна колона (Pharmacia) в буфер А (50 тМ натриев фосфат, 1 тМ EDTA, pH 8.1). Всяка аликвотна част се елуира с 3.5 ml.
mPEG-OPSS (10 kDa) се разтваря в буфер А до концентрация 2 mg/ml и се прибавя в равен обем към редуцирана и обезсолена интерферон-гама разновидност, след което се инкубира в продължение на 60 минути при леко разклащане при стайна температура.
ml от реакционната смес се концентрира до 1-6 ml при използване на Vivaspin 20 колона (VivaScience) като оставащият mPEG се отделя чрез гелфилтрация при използване на Sephacryl S-100 колона (Pharmacia), уравновесена с буфер А.
Свързаната с полиетиленгликол интерферон-гама разновидност се диафилтрува в 5 тМ натриев сукцинат, 4% манитол, pH 6.0 при използване на Vivaspin 6 колона (VivaScience) и се прибавя Tween 20 до 0.01%. Пречистената свързана с полиетиленгликол интерферон-гама разновидност притежава специфична активност 1.3 х 10® AU/rng, измерена при описания по-горе Първичен анализ (15% от специфичната активност на съответната несвързана с полиетиленгликол интерферон-гама разновидност).
10§.
• · ·«
·· · · ·· ·**· · : : : · :::.:
......:·.... *..
Свързване с полиетиленгликол при използване на MAL куплираща химична реакция
1.6 ml от интерферон-гама разновидността N59C+S99T (пълна дължина) с концентрация 1.5 mg/ml в 5 тМ натриев сукцинат, 4% манитол, 0.01% Tween 20, pH 6.0 се редуцират при инкубиране с 64 μ| 0.5 М DTT в продължение нао 30 минути при стайна температура. Интерферон-гама разновидността се обезсолва чрез преминаване през ΝΑΡ25 гел филтрационна колона (Pharmacia) в буфер А (50 тМ натриев фосфат, 1 mM EDTA, pH 8.1). Всяка аликвотна част се елуира с 3.5 ml.
mPEG-MAL (5 kDa) се разтваря в буфер А до концентрация 0.5 mg/ml и се прибавя в равен обем към редуцирана и обезсолена интерферон-гама разновидност, след което се инкубира в продължение на 120 минути при леко разклащане при стайна температура.
Прибавя се амониев сулфат до концентрация 0.9 М и свързаната с полиетиленгликол интерферон-гама разновидност се поставя върху 1 ml Resource™ фенилова колона (Pharmacia) в буфер В (20 тМ натриев фосфат, 0.9 М амониев сулфат, pH 6.6). Колоната се промива с 5 колонни обема буфер В преди елуиране на свързаната с полиетиленгликол интерферон-гама разновидност в линеен градиент от 0-50% буфер С (20 тМ натриев фосфат, pH 6.6) над 30 колонни обема. Свързаната с полиетиленгликол интерферон-гама разновидност елуира около 0.6 М амониев сулфан.
Фракциите, съдържащи свързаната с полиетиленгликол интерферонгама разновидност се изливат и диафилтруват в 5 тМ натриев сукцинат, 4% манитол, pH 6.0 при използване на Vivaspin 6 колона (VivaScience) и се прибавя Tween 20 до 0.01%. Пречистената свързана с полиетиленгликол интерферонгама разновидност притежава специфична активност 2.4 х 10б AU/mg, измерена при описания по-горе Първичен анализ (15% от специфичната активност на съответната несвързана с полиетиленгликол интерферон-гама разновидност).
•4
4·
4 ·» ···.
: : :
• е е 4 · • 4 4 4 4 • *•44 ·· фф
ПРИМЕР 6: Изразяване на интерферон-гама и разновидности на интерферон гама в клетки на бозайници
За краткотрайно изразяване на интерферон-гама, клетките растат до 95% сливане в среда (Dulbecco’s MEM/Nut-mix F-12 (Ham) L-глутамин, 15 mM Hepes, пиридоксин-HCI (Life Technologies Cat # 31330-038)), съдържаща 1:10 ембрионален говежди серум (BioWhittaker Cat # 02-701F) и 1:100 пеницилин и стрептомицин (BioWhittaker Cat # 17-602Е), съгласно спецификациите на производителите. Плазмидите, кодиращи интерферон-гама, се пренасят върху клетките при използване на Lipofectamine 2000 (Life Technologies), съгласно спецификациите на производителите. 24 часа след пренасянето, културната среда се отделя и се анализира за интерферон-гама активност. Още повече, за да се определи количествено относителният брой използвани места за гликосилиране, се провежда Western blotting маркиране, при използване на културната среда.
При пренасяне на СНО К1 клетки с плазмиди, кодиращи интерферонгама, се получават стабилни клони, изразяващи интерферон-гама, последвано от инкубиране на клетките в среда, съдържаща 0.36 mg/ml хидромицин. Стабилно свързаните клетки се изолират и се подклонират до ограничено ® разтваряне. Клоните, продуциращи високи нива на интерферон-гама, се идентифицират посредством ELISA
ПРИМЕР 7: Получаване в големи размери
Стабилни клетъчни линии, изразяващи интерферон-гама или негови разновидности нарастват в Dulbecco’s MEM/Nut-mix F-12 (Ham) L-глутамин, 15 mM Hepes, пиридоксин-HCI (Life Technologies Cat # 31330-038), 1:10 ембрионален говежди серум (BioWhittaker Cat # 02-701F), 1:100 пеницилин и стрептомицин (BioWhittaker Cat # 17-602E), в цилиндрични бутилки с вместимост ? ·· ·· ··
1700 cm (Corning, # 431200) до сливане. След това средата се изменя до 300 ml UltraCHO с L-глутамин (BioWhittaker Cat # 12-724Q) чрез прибавяне на 1:500 ЕХ CYTE VLE (Serological Proteins Inc. # 81-129) и 1:100 пеницилин и стрептомицин (BioWhittaker Cat # 17-602Е). След 24 часа растеж, средата се заменя с пресна UltraCHO със същите добавки. След други 24 часа растеж, средата се заменя с Dulbecco’s MEM/Nut.-mix F-12 (Ham) L-глутамин, пиридоксин-HCI (Life Technologies Cat # 21041-025), c прибавяне на 1:100 ITS-A (Gibco/BRL # 51300044), 1:500 EX-CVTE VLE (Serological Proteins Inc. # 81-129) и 1:100 пеницилин и стрептомицин (BioWhittaker Cat # 17-602E). След това, на всеки 24 часа, културната среда се заменя с 300 ml пресна среда, несъдържаща серум, със същите добавки. Отделената среда се филтрува през 0.22 μΙ филтри за отделяне на клетките.
ПРИМЕР 8: Пречистване филтратът се филтрува (0.22 μΙ) преди ултрафилтрация до приблизително 1/15 обем при използване на Millipore TFF система. Със същата система, концентратът се диафилтрува при използване на 10 mM Tris, pH 7.6. Прибавя се амониев сулфат до концентрация 1.7 М и, след разбъркване, утайката се отделя посредством центрофугиране при 8000 оборота за минута в продължение на 25 минути в Sorvall центрофуга при използване на GS3 ротор.
Супернатантът се поставя върху 25 ml Phenyl High Performance (Pharmacia) колона, която предварително е калибрирана с 10 mM Tris, 1.7 М амониев сулфат, pH 7.6. След използване, колоната се промива с 3 колонни обема 10 mM Tris, 1.7 М амониев сулфат, pH 7.6 и свързаната интерферон-гама разновидност се елуира в линеен градиент над 10 колонни обема до 100% 10 mM Tris, pH 7.6. Потокът, преминаващ през колоната и елуираната интерферонгама разновидност се фракционират. Фракциите, обогатени с интерферон-гама разновидност, се изливат и се обменят с буфер посредством диафилтрация над
109
• :::.:: ·
·..··..· mM Tris, pH 9.0, при използване на Vivaflow 200 система (VivaScience) с молекулна маса на отрязания край 10000 Da.
След това интерферон-гама разновидността се поставя върху 18 ml Qсефароза Fast Flow (Pharmacia), колона, която предварително е калибрирана с 10 mM Tris, pH 9.0. След използване, колоната се промива с 3 колонни обема 10 mM Tris, pH 9.0, преди елуирането на свързаната интерферон-гама разновидност с градиент от 0-100% 10 mM Tris, 0.5 М натриев хлорид, pH 9.0, над 15 колонни обема Потокът, преминаващ през колоната и елуираната интерферон-гама разновидност се фракционират. Фракциите, обогатени с интерферон-гама разновидност, се изливат и се обменят с буфер в 10 mM натриев фосфат, pH 7.0, посредством диафилтрация при използване на Vivaspin 20 (VivaScience) колона, с молекулна маса на отрязания край 10000 Da.
След това интерферон-гама разновидността се поставя върху 8 ml СНТ керамична хидроксиапатитна колона (Biorad), която предварително е калибрирана с 10 mM натриев фосфат, pH 7.0. След използване, колоната се промива с 5 колонни обема 10 mM натриев фосфат, pH 7.0, преди елуирането на свързаната интерферон-гама разновидност с градиент от 0-80% 500 mM натриев фосфат, pH 7.0, над 30 колонни обема. Потокът, преминаващ през колоната и елуираната интерферон-гама разновидност се фракционират. Фракциите, обогатени с интерферон-гама разновидност, се изливат и се обменят с буфер в 5 mM натриев сукцинат, 4% манитол, pH 6.0, при използване на Vivaspin 20 (VivaScience) колона и след това се прибавя Tween 20, до концентрация 0.01%. Интерферон-гама разновидността се филтрува стерилно и се съхранява при -80°С.
Или пък, интерферон-гама разновидностите могат да бъдат пречистени, съгласно показаната по-долу схема на пречистване:
Филтратът се филтрува (0.22 μΙ) преди ултрафилтрация до приблизително 1/15 обем при използване на Millipore TFF система. Със същата система, концентратът се диафилтрува при използване на 10 mM Tris, pH 7.6, след което
··· ♦♦ ·· ·· pH се установява 9.0 и утайката се отделя посредством филтруване през микрофилтър.
Пробата се поставя върху 18 ml Q-сефароза Fast Flow (Pharmacia), колона, която предварително е калибрирана с 10 mM Tris, pH 9.0. След използване, колоната се промива с 3 колонни обема 10 mM Tris, pH 9.0, преди елуирането на свързаната интерферон-гама разновидност с градиент от 0-100% 10 mM Tris, 0.5 М натриев хлорид, pH 9.0, над 15 колонни обема. Потокът, преминаващ през колоната и елуираната интерферон-гама разновидност се фракционират. Фракциите, обогатени с интерферон-гама разновидност, се изливат и pH се установява 7.6. Прибавя се амониев сулфат до 1.5 М и, след разбъркване, утайката се отделя чрез центрофугиране.
След това интерферон-гама разновидността се поставя върху Phenyl High Performance (Pharmacia) колона, която предварително е калибрирана с 10 mM Tris, 1.5 М амониев сулфат, pH 7.6. След използване, колоната се промива с 3 колонни обема 10 mM Tris, 1.5 М амониев сулфат, pH 7.6 и свързаната интерферон-гама разновидност се елуира в линеен градиент над 10 колонни обема до 100% 10 mM Tris, pH 7.6. Потокът, преминаващ през колоната и елуираната интерферон-гама разновидност се фракционират. фракциите, обогатени с интерферон-гама разновидност, се изливат и амониевият сулфат се установява до 1.7 М.
След това интерферон-гама разновидността се поставя върху Butyl Sepharose колона, която предварително е калибрирана с 10 mM натриев фосфат, 1.7 М амониев сулфат, pH 7.6. След използване, колоната се промива с 10 mM натриев фосфат, 1.7 М амониев сулфат, pH 7.6, преди елуиране на свързаната интерферон-гама разновидност в етап, при използване на 10 mM натриев фосфат, pH 6.5. Потокът, преминаващ през колоната и елуираната интерферон-гама разновидност се фракционират.
Фракциите, обогатени с интерферон-гама разновидност, се изливат и се поставят върху хидроксиапатитна колона, която предварително е калибрирана ··
9 * * ··· · · · · · · с 10 mM натриев фосфат, pH 6.5. След използване, колоната се промива с 5 колонни обема 10 mM натриев фосфат, pH 6.5, преди елуирането на свързаната интерферон-гама разновидност с линеен градиент 0-100% 500 mM натриев фосфат, pH 6.5, над 30 колонни обема. Потокът, преминаващ през колоната и елуираната интерферон-гама разновидност се фракционират.
Фракциите, обогатени с интерферон-гама разновидност, се изливат и се обменят с буфер в буфер, съдържащ 5 mM натриев сукцинат, 4% манитол, pH 6.0, при използване на Vivaspin 20 (VivaScience) колона и след това се прибавя Tween 20, до концентрация 0.01%. Интерферон-гама разновидността се филтрува стерилно и се съхранява при 80°С.
ПРИМЕР 9: Активност на разновидностите и на свързаните с полиетиленгликол разновидности
При използване на описания по-горе Първичен анализ” са получени следните данни за активността (след краткотрайно пренасяне):
Мутации Активност (AU/ml) % активност на мол.тегло (пълна дължина)
Необлагороден (пълна дължина) 1.4 х 107
S99T (пълна дължина) 5.1 х 10б 36%
E38N (пълна дължина) 1.4 X 107 100%
E38N+S40T (пълна дължина) 9.9 х Ю6 71%
E38N+S40T+S99T (пълна дължина) 1.3 х 107 93%
E38N+K61T (пълна дължина) 1.2 х 107 86%
E38N+K61T+S99T (пълна дължина) 1.4 х 106 10%
N10C+S99T (пълна дължина) 2.5 х 10в 18%
N16C+S99T (пълна дължина) 1.1 х 107 79%
112
E38C+S99T (пълна дължина)
S99T+N104C (пълна дължина)
N10C+E38N+S40T+S99T (пълна дължина)
N16С+E38N+S40T + S99T (пълна дължина)
E38N+S40T+N59C+S99T (пълна дължина)
E38N+S40T+N83C+S99T (пълна дължина)
E38N+S40T+K94C+S99T (пълна дължина)
E38N+S40T+S99T+N104C (пълна дължина)
Необлагороден (скъсен)
S99T (скъсен)
1.0 х 107 71%
5.0x10® 36%
1.5 х 106 11%
3.7 х 106 26%
1.1 х 10' 79%
7.2 X 105 5%
9.4 X 105 7%
2.3 х 10® 16%
6.3 х 10® 45%
3.5 х 106 25%
4.0 X 10® 29%
E38N+S40T+S99T (скъсен)
Таблица 1: Активност на разновидности с пълна дължина и скъсени полипептиди на рекомбинантен човешки интерферон-гама след краткотрайно пренасяне
При използване на описания по-горе ‘Първичен анализ” са получени следните данни за специфичната активност (след пречистване):
Мутации Специфична активност (AU/mg) % активност на мол.тегло (пълна дължина)
Необлагороден (пълна дължина) 2.1 х 107 -
S99T (пълна дължина) 2.2 х 107 105%
E38N+S40T+S99T (пълна дължина) 1,4 х 107 67%
N10C+S99T (пълна дължина) 3.8X106 18%
N16C+S99T (пълна дължина) 2.3х10б 11%
N16C+S99T (пълна дължина+ 10 kDa mPEG) 1.3 х 10® 6%
E38C+S99T (пълна дължина) 3.4 х 10® 16%
··
11β.
···· • · · :::·:· · ..........
” - · · · · « E59C+S99T (пълна дължина) 6.3 х 106 30%
E59C+S99T (пълна дължина+ 2.4 х 10s 11%
5 kDa mPEG)
S99T+N104C (пълна дължина) 3.5 х 106 17%
Таблица 2: Активност на разновидности с пълна дължина полипептиди на рекомбинантен човешки интерферон-гама след пречистване
Активността на редица свързани с полиетиленгликол разновидности се измерва чрез сравняване на активността на свързаните с полиетиленгликол продукти с пробите, които са подложени на същата процедура на свързване с полиетиленгликол (виж Пример 5, по-горе), но без действително прибавяне на полиетиленгликол към реакционната смес. Резултатите са дадени в Таблица 3, по-долу:
Мутации
Активност по отношение на несвързан с полиетиленгликол, подложен на “Свързване с полиетиленгликол” (%)
N10C+S99T (пълна дължина+5 kDa mPEG)
N16C+S99T (пълна дължина+5 kDa mPEG)59
E38C+S99T (пълна дължина+10 kDa mPEG)IJ41
S99T+N104C (пълна дължина+5 kDa mPEG)42
Таблица j: Активност на свързани с полиетиленгликол разновидности на полипептиди с пълна дължина на рекомбинантен човешки интерферон-гама 1' Използвана е ODSS куплираща химична реакция. Използвана е MAL куплираща химична реакция за всички други свързани с полиетиленгликол разновидности.
114• е·· ·· ·*· ♦· «« ..
Трябва да се подчертае, че данните за активността, показани в Таблица 1, отразяват комбинация от специфична активност и ниво на изразяване в СНО-К1 клетките. Следователно, може да се направи заключение, че всички разновидности показват сравними ниво на изразяване/специфична активност по отношениеу на рекомбинантен човешки интерферон-гама.
Както може да се види в Таблица 2, всички цистеинови разновидности показват понижена специфична активност в сравнение с рекомбинантен човешки интерферон-гама, докато при разновидностите, съдържащи E38N. S40T и/или S99T мутации, специфичната активност остава сравнима с рекомбинантния човешки интерферон-гама. Когато цистеиновите разновидности се свързват с полиетиленгликол или с 5 или с 10 kDa, наблюдава се 2-3 пъти по-ниска специфична активност (Таблица 3). Без ограничаване от някоя специфична теория, може да се предположи, че понижаването на специфичната активност може да се дължи на понижено рецепторно свързване, причинено от етерично запречване на свързаните групи на полиетиленгликола.
ПРИМЕР 10: Оценка на използването на местата за N-гликосилиране
За да се определи количествено относителния брой на използваните места за гликосилиране, се прилага Western blotting маркиране на културната среда (фигура 1). За необлагородения рекомбинантен човешки интерферонгама (с пълна дължина) е изчислено, че се използват около 50% и двете места за гликосилиране (2N), около 40% едното място за гликосилиране (1N), и около 10% не са гликосилирани (0N). Тези данни са в съгласие с вече публикувани данни от Hooker et al„ 1998, J. Interferon and Cytokine Res. 18, 287-295; Sarenva et ai., 1995, Biochem. J., 308, 9-14.
Както се вижда от Фигура 1, S99T разновидността (с пълна дължина) използва и двете си места за гликосилиране значително по-ефикасно, в ♦ ··· *·♦ *· ♦ « Μ сравнение със съответствие с необлагородения вид. За S99T разновидността е изчислено, че се използват около 90% и двете места за гликосилиране (2Ν), около 7% едното място за гликосилиране (1Ν), и около 3% не са гликосилирани (0Ν).
Още повече, от фигура 1 се вижда, че въведеното място за гликосилиране в позиция 38 значително по-добре се използва за разновидността E38N+S40T (пълна дължина) в сравнение с неоптимизираната разновидност E38N (пълна дължина)
Тези данни ясно показват, че по-добро използване на местата за гликосилиране, независимо дали тези места природно съществуват или са въведени, се постига чрез въвеждане на треонинов остатък, а не серинов остатък на позиция +2, по отношение на аспарагиновия остатък.
ПРИМЕР 11: Фармакокинетични изследвания
AUC за подкожно администриране (AUCSc) при плъхове се определя, както е описано по-горе в настоящото изобретение, за редица интерферонгама разновидности. Резултатите са представени в Таблица 4 и на фигури 2 и 3.
Разновидност AUCsc/доза (min х g./ml) AUCsc,разновидност AUCsc, Actimmune® AUCsc,разновидност AUCgr пълна дъпж.,м.м. Tmax.SC (min)
Aciimmune® 0.3-0.4 - 0.013-0.027 43
rhulFNG 15-24 37-80 - 362-446
(пълна дължина)
E38N + S40T+S99T1 * 111-192 277-640 4.6-13 308-374
N16C+S99T2' 37 92-123 1.5-2.5 247
N16C+ S99T3) 114 285-380 4.8-7.6 249
.··. .···· ; : : · ·!
Таблица 4 плъхове . ............ ·..··.,· Фармакокинетични данни за подкожно администриране при
' с пълна дължина 2) с пълна дължина, 5 kDa mPEG, свързан с въведен цистеинов остатък 3- с пълна дължина, 10 kDa mPEG, свързан с въведен цистеинов остатък
От Фигури 2 и 3 и Таблица 4 се вижда, че разновидностите (включително разновидностите, свързани с полиетиленгликол) притежават значително повисок AUC, когато администрирането е подкожно, в сравнение с рекомбинантния човешки интерферон-гама и, в частност, в сравнение с наличния в търговската мрежа Actimmune®. От Фигура 3 се вижда, че администрираната доза на двете разновидности, свързани с полиетиленгликол, са понижени 2.5 пъти в сравнение с администрираната доза от [E38N+S40T+S99T] разновидността.
Очевидно се отваря възможност за администриране на по-ниски дози, при което се получават по-малко странични ефекти, и/или по-рядко администриране на активната субстанция, отколкото понастоящем, при което се постига подобрено състояние на пациента.

Claims (37)

1 Интерферон-гама (IFNG) полипептид. притежаващ аминокиселинна последователност, показана в SEQ ID NO;1, или неин фрагмент, характеризиращ се с това, че споменатият интерферон-гама полипептид, или негов фрагмент, показва интерферон-гама активност.
2 Полипептид, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид притежава, аминокиселинна последователност, показана в SEQ ID N0:1.
3 Полипептид, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид е фрагмент на аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0.1, която в С-края е скъсена с 1-15 аминокиселинни остатъка.
4 Полипептид, съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид притежава аминокиселинна последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID N0:2, SEQ ID N0 3. SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15 и SEQ ID N0:16.
5 Полипептид, съгласно коя да е от претенции 1-4, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид е гликосилиран.
6 Полипептидна разновидност на SEQ ID N0:1 или неин фрагмент, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид включва 1-10 модификации, сродни с SEQ ID N0:1 или неин фрагмент и показва интерферонгама активност.
7 Полипептид, съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид включва 1-10 модификации, сродни с фрагмент на SEQ ID N0:1, който в С-края е скъсена с 115 аминокиселинни остатъка.
заместваща страница
118 ···· ····.. *
8 Полипептид, съгласно ‘и^етендия. .7, х^рш^еризиращ се с това, че споменатият полипептид включва 1-10 модификации, сродни с аминокиселинната последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15 и SEQ ID N0:16.
9 Полипептид, съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид включва 1-10 модификации, сродни с аминокиселинната последователност, показана в SEQ ID N0.12.
10 Полипептид, съгласно коя да е от претенции 6-9, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид включва поне един въведен и/или поне един премахнат аминокиселинен остатък, включващ група, която се закача за неполипептидната част.
11 Полипептид, съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид включва поне едно въведено място за гликосилиране.
12 Полипептид, съгласно претенция 11, характеризираш се с това че споменатото място за гликосилиране е място за N-гликосилиране.
13 Полипептид, съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че споменатото място за N-гликосилиране е въведено в позиция, включваща аминокиселинен остатък, на който поне 25% от страничните му вериги са обърнати към повърхността (дефинирано в Пример 1 на настоящото изобретение).
14 Полипептид, съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че споменатото място за N-гликосилиране е въведено в позиция, включваща аминокиселинен остатък, на който поне 50% от страничните му вериги са обърнати към повърхността (дефинирано в Пример 1 на настоящото изобретение).
заместваща страница
119 ···· ·*···· ,
15 Полипептид, сьгласнЬ»Лр^генцв1И’13,иля.)4,*^рактеризиращ се с това, че споменатото място за N-гликосилиране е въведено чрез заместване.
16 Полипептид, съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че споменатото заместване е подбрано от групата, състояща се от K12S, К12Т, G18S, G18T, E38N, E38N+S40T, K61S, К61Т, N85S, N85T, K94N, Q106S и Q106T.
17 Полипептид, съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че споменатото заместване е подбрано от групата, състояща се от К12Т, G18T, E38N+S40T, К61Т, N85T, K94N и Q106T.
18 Полипептид, съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че споменатото заместване е E38N+S40T.
19 Полипептид, съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид включва поне един въведен цистеинов остатък.
20 Полипептид, съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че споменатият цистеинов остатък е въведен в позиция, включваща аминокиселинен остатък, на който поне 25% от страничните му вериги са обърнати към повърхността (дефинирано в Пример 1 на настоящото изобретение).
21 Полипептид, съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че споменатият цистеинов остатък е въведен в позиция, включваща аминокиселинен остатък, на който поне 50% от страничните му вериги са обърнати към повърхността (дефинирано в Пример 1 на настоящото изобретение).
22 Полипептид, съгласно претенции 20 или 21, характеризиращ се с това, че споменатият цистеинов остатък е въведен чрез заместване.
23 Полипептид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че споменатото заместване е подбрано от групата, състояща се от N10C, N16C, Е38С, N59C, N83C, К94С, N1040 и А124С.
заместваща страница
120 * ·· · ·· ······ ···· · · · · ·· ф ··· · · · ···
24 Полипептид, съгласие ‘претенции· 49-23,· Характеризиращ се с това, че споменатият цистеинов остатък е свързан ковалентно с неполипептидната част.
25 Полипептид, съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че споменатата неполипептидна част е полимерна молекула.
26 Полипептид, съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че споменатата полимерна молекула е линеен или разклонен полиетиленгликол.
27 Полипептид, съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че споменатият полипептид включва поне едно въведено място за Nгликосилиране и поне един въведен цистеинов остатък.
28 Полипептид, съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че споменатото място за N-гликосилиране е въведено в позиция, съгласно претенции 13-18, а цистеиновият остатък е въведен, съгласно претенции 20-23.
29 Нуклеотидна последователност, характеризираща се с това, че кодира полипептида, дефиниран съгласно претенции 1-28.
30 Вектор на изразяване, характеризиращ се с това, че включва нуклеотидната последователност, дефинирана съгласно претенция 29.
31 Гликосилираща клетка-домакин, характеризираща се с това, че включва нуклеотидната последователност, дефинирана съгласно претенция 29 или вектора на изразяване, дефиниран съгласно претенция 30.
32 Клетка-домакин, съгласно претенция 31, характеризираща се с това, че представлява СНО клетка или ВНК клетка.
33 Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва полипептид, дефиниран съгласно претенции 1-28, и фармацевтично приемлив разредител, носител или добавка.
34 Полипептид, съгласно претенции 1-28 или фармацевтичен състав, съгласно претенция 33, характеризиращи се с това, че се използват като медикамент.
заместваща страница ··· ··· · · · · ........12Г ·· ··
35 Приложение на полипептид, съгласно претенции 1-28 или фармацевтичен състав, съгласно претенция 33, характеризиращо се с това, че се произвежда медикамент, предназначен за лечение на интерстициални белодробни болести.
36 Приложение, съгласно претенция 35, характеризиращо се с това, че интерстициалната белодробна болест е идиопатична белодробна фиброза.
37 Метод за получаване на интерферон-гама полипептид, дефиниран съгласно претенции 1-28, характеризиращ се с това, че споменатият метод включва:
(а) отглеждане на гликосилираща клетка-домакин, включваща нуклеотидна последователност, която кодира интерферон-гама полипептида, дефиниран съгласно претенции 1-28, при условия за изразяване на полипептида;
(б) възможно in vitro взаимодействие на споменатия полипептид с неполипептидна част при условия, при които протича конюгация; и (в) възстановяване на полипептида.
BG108256A 2001-04-06 2003-10-10 Интерферон-гама полипептидни разновидности BG108256A (bg)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200100579 2001-04-06
DKPA200100714 2001-05-07
DKPA200200198 2002-02-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG108256A true BG108256A (bg) 2004-12-30

Family

ID=27222504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG108256A BG108256A (bg) 2001-04-06 2003-10-10 Интерферон-гама полипептидни разновидности

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP1412382A2 (bg)
JP (1) JP2005518183A (bg)
KR (1) KR20030094336A (bg)
CN (1) CN1257186C (bg)
BG (1) BG108256A (bg)
BR (1) BR0208596A (bg)
CA (1) CA2443277A1 (bg)
HU (1) HUP0303645A3 (bg)
IL (1) IL157896A0 (bg)
MX (1) MXPA03009082A (bg)
NO (1) NO20034432L (bg)
NZ (1) NZ528651A (bg)
PL (1) PL366705A1 (bg)
WO (1) WO2002081507A2 (bg)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101039957A (zh) 2003-05-16 2007-09-19 因特缪恩公司 合成的趋化因子受体配体及其使用方法
JP4707327B2 (ja) * 2004-01-27 2011-06-22 旭化成ファーマ株式会社 ポリペプタイド類の吸着防止剤
CA2576030A1 (en) * 2004-08-09 2006-02-23 Alios Biopharma Inc. Synthetic hyperglycosylated, protease-resistant polypeptide variants, oral formulations and methods of using the same
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
CN103550757A (zh) * 2005-09-20 2014-02-05 纽约大学 用干扰素治疗肺病的方法
US7625555B2 (en) 2007-06-18 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human interferon-like proteins
JP5769142B2 (ja) * 2007-09-04 2015-08-26 独立行政法人酒類総合研究所 ピヒア属酵母において異種タンパク質を高分泌させる方法
EP2039764A1 (en) * 2007-09-19 2009-03-25 Pevion Biotech AG Truncated secretory aspartyl proteinase 2
BG66517B1 (bg) 2008-04-08 2016-02-29 Tigo Gmbh Супресор на ендогенния човешки гама - интерферон
RU2446821C2 (ru) * 2010-07-15 2012-04-10 Олег Ильич Эпштейн Лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний, сопровождающихся нейротоксическими нарушениями, и способ лечения инфекционных заболеваний, сопровождающихся нейротоксическими нарушениями
GB201621728D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl Methods
BG67190B1 (bg) 2017-03-29 2020-11-16 Tigo Gmbh Анти-гама мутантен протеин срещу ендогенния човешки гама интерферон
WO2023182947A1 (en) * 2022-03-22 2023-09-28 Chiang Mai University A modified protein of interferon gamma and its use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
BG52073B2 (en) * 1990-01-24 1996-04-30 Inst Molekuljarna Biolog Method for the preparation of recombinant human noncystein -interferon, free of n-end methionine
DE4036856C1 (bg) * 1990-11-19 1992-05-27 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung Ev, 8000 Muenchen, De

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005518183A (ja) 2005-06-23
NO20034432D0 (no) 2003-10-03
CN1537117A (zh) 2004-10-13
IL157896A0 (en) 2004-03-28
HUP0303645A2 (hu) 2004-01-28
CN1257186C (zh) 2006-05-24
EP1412382A2 (en) 2004-04-28
WO2002081507A2 (en) 2002-10-17
NZ528651A (en) 2006-06-30
HK1069834A1 (en) 2005-06-03
WO2002081507A3 (en) 2004-02-12
BR0208596A (pt) 2004-03-09
MXPA03009082A (es) 2004-11-22
CA2443277A1 (en) 2002-10-17
PL366705A1 (en) 2005-02-07
KR20030094336A (ko) 2003-12-11
HUP0303645A3 (en) 2005-12-28
NO20034432L (no) 2003-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7232562B2 (en) E38N interferon gamma polypeptide variants
US7038015B2 (en) Interferon gamma polypeptide variants
EP1366075A2 (en) New interferon beta-like molecules
EP1257574A1 (en) Improved interleukin 10
BG108256A (bg) Интерферон-гама полипептидни разновидности
US7230081B1 (en) Interferon gamma conjugates
US7390638B2 (en) S99T C-11 Truncated polynucleotides encoding interferon gamma polypeptide variants
US7524931B2 (en) Full-length interferon gamma polypeptide variants
RU2268749C2 (ru) КОНЪЮГАТЫ γ-ИНТЕРФЕРОНА
RU2296130C2 (ru) Варианты полипептида гамма-интерферона
AU2002252971B2 (en) Interferon gamma polypeptide variants
AU782635B2 (en) Interferon gamma conjugates
AU2002252971A1 (en) Interferon gamma polypeptide variants
ZA200308376B (en) Interferon gamma polypeptide variants.
CZ20033016A3 (cs) Varianty polpeptidu interferonu gamma
CN101172160A (zh) 干扰素γ偶联物