BG51337A3 - Метод за реплициране на костен мозък - Google Patents

Метод за реплициране на костен мозък Download PDF

Info

Publication number
BG51337A3
BG51337A3 BG085721A BG8572188A BG51337A3 BG 51337 A3 BG51337 A3 BG 51337A3 BG 085721 A BG085721 A BG 085721A BG 8572188 A BG8572188 A BG 8572188A BG 51337 A3 BG51337 A3 BG 51337A3
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
cells
bone marrow
culture
cultured
fibroblasts
Prior art date
Application number
BG085721A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian Naughton
Gail Naughton
Original Assignee
Marrow-Tech Incorp.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/036,154 external-priority patent/US4721096A/en
Application filed by Marrow-Tech Incorp. filed Critical Marrow-Tech Incorp.
Publication of BG51337A3 publication Critical patent/BG51337A3/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B90/00—Instruments, implements or accessories specially adapted for surgery or diagnosis and not covered by any of the groups A61B1/00 - A61B50/00, e.g. for luxation treatment or for protecting wound edges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Instruments for taking body samples for diagnostic purposes; Other methods or instruments for diagnosis, e.g. for vaccination diagnosis, sex determination or ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/02—Instruments for taking cell samples or for biopsy
    • A61B10/0233—Pointed or sharp biopsy instruments
    • A61B10/025—Pointed or sharp biopsy instruments for taking bone, bone marrow or cartilage samples
    • A61B2010/0258—Marrow samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C12N2502/094—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells keratinocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1394—Bone marrow stromal cells; whole marrow
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Методът е приложим при лечение на злокачествени новообразувания в костния мозък. С него се осигурява подходящ за трансплантация материал, вследствие на което се избягват реакцията присадка-гостоприемник и образуването на емболи и се повишава функционалната способност на костен мозък, неблагоприятно повлиян от химиотерапия или от радиационна терапия. По метода аспириран от здрав пациент костен мозък се култивира в подходяща хранителна среда върху тридименсионална плочка, която позволява съхраняването на култивирания материал в условия на криоконсервация. 18 претенции

Description

Изобретението се отнася до метод за реплициране на костен мозък, приложим при лечение на злокачествени новообразувания в костния мозък.
Известно е, че в случаите на заболяване, разрушаващо здравите клетки на костния мозък или потискащо тяхната функционална пригодност, се прибягва до трансплантиране на костен мозък. Последното обаче е не винаги подходящо за лечение на заболяването, тъй като се проявяват допълнителни неблагоприятни ефекти като отхвърляне на присадката, съдозапушващо заболяване в резултат от образуване на костномозъчни емболи и др.
Недостатъците на известните методи се състоят в това, че в болшинството случаи за присаждане се използва вече заболял костен мозък, чиито клетки са носители на съответното заболяване, поради което и използването му е неефективно.
Задачата на изобретението е да създаде метод за реплициране на костен мозък, чрез който да се създаде подходящ за трансплантация материал, да се избегнат проявата на реакция присадка гостоприемник и образуването на емболи от костен мозък и да се повиши функционалната способност на костен мозък, неблагоприятно повлиян от химиотерапия или от радиационна терапия.
Задачата се решава с метод, съгласно който малко количество от костния мозък на здрав пациент се аспирира по подходящ начин и полученият материал се реплицира ин витро за получаване на такова количество клетки, при което да са възможни автоложната реинфузия и охлаждане и замразяването им, с цел последваща инфузия на заболял пациент. Методът се осъществява с помощта на тридименсионална плочка за култивиране на клетките в клетъчната култура. Растежът на клетките се осъществява в културална среда на протеини, гликопротеини, гликозоаминогликани, клетъчен матрикс и други, които да служат за тяхна опора или за покриване на плочката. Използването на тридименсионалната плочка позволява на клетките да растат в повече слоеве, като по този начин съгласно изобретението се създава триизмерна култура. Триизмерната плочка може да се използва за създаване на триизмерна култура от кожа, черен дроб и много други типове клетъчни култури.
За предпочитане тридименсионалната плочка се изготвя във форма на мрежа. Плочките могат да се съхраняват за по-нататъшна употреба във вид на тридименсионална, физиологична и клетъчно-културална система.
Мрежата съгласно изобретението е показана на приложената фигура, където е с позиция 10. Тя съдържа основни влакна 12 и вътъчни влакна 13. Клетките на стромата 14 растат върху влакната.
Предимствата на метода са че се предлага ефикасно средство за трансплантация при лечение на заболявания или състояния, които разрушават здравите клетки на костния мозък или потискат тяхната функционална пригодност, че изготвеният клетъчен материал е подходящ също и при третиране на хематологични злокачествени заболявания с метастази в костния мозък, а репликационният материал е подходящ и за третиране на пациенти, чийто костен мозък е неблагоприятно повлиян от химиотерапия и/или радиационна терапия, наложена поради заболяване, което не засяга непосредствено костния мозък.
Изобретението се пояснява със следващите примери.
Пример 1. От 10 до 15 см3 суспензия костен мозък /периферна кръв се аспирира от илиачната кост на донора. Резултатите са оптимални, ако по това време индивидът е на възраст под 40 год и не е болен. Аспирирането на костен мозък от донора се осъществява по известни методи /1,2/. Пробата може да се използва за реплициране веднага или да се съхранява чрез замразяване се подходящо криотехнологично съоръжение.
С цел съхраняване на пробата за бъдещо реплициране, суспензията костен мозък /кръв се разделя на еднакви количества в стерилни епруветки на Нунк и се поставя в чаша с начупен лед, докато криозащитната камера достигне подходящата температура /4°С/. Непосредствено преди вкарване в камерата към всяка епруветка на Нунк се добавя разтвор по стерилна методика, така, че криозащитните вещества диметилсулфоксид и глицерин да са в концентрация съответно от 7% и 5%. Програмата за замразяване се включва веднага след внасяне на пробния образец (използва се замразяваща програма №1 върху КриоМед Модел №1010 контролно устройство).
По тази методика клетъчната жизнеспособност след замразяване и бързо стопяване във водна баня при 80 С надхвърля 90% по метода на изпитване с трипан блу. Могат да бъдат образувани и повече от 80% колонийобразуващи единици в изходната колония.Криоконсервацията на пробата също се осъществява по известни методи /3,4/. За предпочитане, клетките от костен мозък се съхраняват в среда на течен азот при температура -196°С, при която цялата метаболична дейност е преустановена.
Съгласно изобретението се предвижда реплициране на клетки костен мозък ин витро в система, сравнима с физиологичното състояние. Клетките, реплицирани по тази система, включват всички налични клетки на нормалния костен мозък, като се приема, че всички типове клетки са били в наличност в оригиналния инокулум костен мозък.
Клетките на костния мозък, получени директно от донора или от съхранявания чрез криоконсервация запас, се разделят най-напред от техния ретикулум чрез физикални средства.
Отглеждат се в ко-култури с компоненти от стромата на нормален костен мозък, които включват фибробласти, макрофаги и ретикуларни и мастни клетки върху тридименсионална плочка. Към културата могат да бъдат добавени и фактори, получени от далачни и/или чернодробни макрофаги или други компоненти на стромата.
Въпреки че когато клетките от костен мозък се култивират самостоятелно са с ограничен растеж, продължителен растеж на тези култури е възможен само ако са налични секреторни продукти от техните клетки на стромата или самите клетки на тази строма /5/.
Чрез метода се максимализира пролиферацията на многопотенциалните кръвотворни базични клетки, които имат способността да репопулират костен мозък, когато последният е бил увреден чрез опосредствано от околната среда заболяване или чрез третиране на такова заболяване с химиотерапевти и/или радиотерапия. Базични клетки, които имат способността да се репопулират, се делят и съществуват в дълготрайни култури от костен мозък. Но базични клетки, кръвотворни изходни клетки и кръвотворни предхождащи изходните клетки се делят и реплицират съгласно метода. По-нататъшната диференциация се осъществява по физиологичен начин. Например еритроиди, миелоидни, лимфоидни, макрофагни и мегакариоцитни колонии могат да възникват непрекъснато в същата система за култивиране.
Репликацията на костномозъчните клетки започва чрез създаване на опоренослой от строма. За целта, суспензии от костен мозък се центрофугират при 3000 хо за 20 мин и се взима белият седимент от клетки, който съдържа макрофат, фибробласти, мастни клатки, мононуклеарни кръвни клетки, ендотелиални клетки и др. Клетките се суспендират в Среда Κοϊλνείΐ Рагк Метопа1 -ΙιιχίίΙιτΙ МеШит/ ΚΡΜΙ /6/, допълнена с 10 % фетален телешки серум /ФЕТ/ 10 % конски серум, хидрокортизонхемосукцинат и подходящи антибиотици.
Количество, равняващо се на 106 от тези клетки, се разстила върху найлонова мрежа ТеГко Согр. в блюда на Петри. Тя е предварително нарязана, за да отговаря на вътрешните размери на пластмасови колби за култури от по 25 мл. Мрежите са с отвор 400 мкм2 и диаметър на влакната от 100 мкм. След това инокулираната мрежа се навива и поставя в колбата за култура, съдържаща 5 мл от средата. Мрежата се развива в колбата и покрива напълно дъното й. Културите се инкубират при 37°С при съдържание на СОг 5% и при относителна влажност повече от 90%. Клетките от стромата, които предимно са фибробласти, растат първи и напълно заобикалят всички найлонови влакна преди да започнат да навлизат в отворите на мрежата. Този процес обхваща 14 до 18 дни. Степента на сливане на клетките на стромата трябва да отговаря на това, което е показано на фигурата преди да протече инокулиранто с хемопоетични клетки.
Суспендирани клетки на стромата могат да се съхраняват по описания начин. За да се съхрани мрежата с напълно закрилите я клетки от стромата, трябва да се навие и постави в епруветки на Нунк, съдържаща среда ΚΡΜΙ 1640, със средства, осигуряващи криопротекция като диметилсулфоксид и глицерин, съответно в концентрация 5% и 15%. Замразяването на културата със строма се осъществява при начални скорости на охлаждане -1иС /мин от +1 до 40°С.Скоростта на охлаждане от -2 до -3°С/мин е оптимална и се използва до достигане на стадийната температура -34°С. Приблизително 20 - 25% от клетките на стромата се откъсват от найлоновата мрежа.
Инокулирането на кръвотворни клетки се осъществява по следния начин. Клетки от костен мозък се суспендират в модифицирана среда на Хишер и на МакКой 5А, допълнена с 5 до 10% фетален телешки серум и 5-10% конски серум, витамини, хормони, хидрокортизон, глутамин и антибиотици. Клетките могат да бъдат или пресни, или получени от предварително съхранявани проби. Инокулират се 2 до 5.10 клетки върху мрежата, покрита изцяло с клетки на стромата в колби от по 25 мм и се инкубират при 33 до 34°С във въздушна среда със съдържание на СО2 5%. Относителната влажност на културите е около 90%. След три дни температурата се повишава до 35-37°С.
Хемопоетичните клетки растат в естествено образуваните джобове на стромалните клетки, покрили мрежата и прогениторните (предшестващите) клетки остават в адхерентния слой от клетки. Адхерентният слой клетки се образува от клетките, намиращи се непосредствено върху мрежата, или от тези, прикачени към клетки, прикрепени директно върху мрежата. След 4-5 дни се появяват зрели гранулоцити, мононуклеарни клетки и еритроцити в неполепналия слой, което се вижда на цитологични препарати. След 7 до 10 дни могат да бъдат забелязани голям брой хемопоетични колонии в междините на мрежата, които са еднакви морфологично с образуващите колонии единици, смесените колонии и лимфоидните колонии. Мегакариоцитният растеж е ограничен, но също може да бъде наблюдаван в този матрикс. Една средна култура дава около 450 до 950 образуващи колонии единици за седмица.
Култури от клетки на стромата и от кръвотворни клетки, произхождащи от същия индивид /автоложни клетки/, трябва да се захранват два пъти седмично. Култури от костен мозък на пациент, който е бил инокулиран върху мрежа от стромални клетки на друг индивид /и /алогени/, трябва да се захранват три пъти седмично за осигуряване на достатъчна депопулация на зрели имунокомпетентни клетки от неподеления слой.
Първичният лимитиращ фактор за скоростта на растеж на клетките от стромата на костния мозък е ниският митотичен индекс на фибробластите, присъщ на клетките от стромата на костния мозък. Растежът на тези клетки и тяхното отлагане по компонентите на екстрацелуларния матрикс може да бъде ускорен чрез добавяне първо на хидрокортизон хемисукцинат и/или второ саморегулиращи растежни фактори, произхождащи от средата на култивираните фетални фибробласти от човек с висока скорост на клетъчно продуциране.
Растежът и отлагането на клетките може да се повиши също чрез предварително покриване на мрежата със солубилизиран колаген тип Ι-ΠΙ, IV или с използването на мрежа, която е покрита или застлана с колаген, секретираи от фетални човешки фибробласти или чрез зрели фибробласти /посочвани по-нататък като стимулиращи растежа фибробласти/, които са били типизирани по тяхната способност да синтезират някои типове колаген. Стимулиращите растежа фибробласти се повдигат от мрежата чрез слабо трипсинизиране при достигане етапа на пълно покриване на мрежата (от 5 до 7 дни за фетални фибробласти от човек и 14 до 18 дни за зрели фибробласти/, след което могат да бъдат инокулирани с клетки от стромата на костен мозък, за да се съхранят с цел бъдещо използване.
Методите за култивиране, разпределяне и съхраняване чрез криоконсервация на стимулиращи растежа фибробласти са следните:
а/ Култивиране на стимулиращи растежа фибробласти, като фибробластите се култивират в среда ΚΡΜΙ 1640, допълнена с 5 до 10% фетален телешки серум, или 2 до 10% конски серум, която допълнително съдържа 1 мкг/мл хидрокортизон хемисукцинат и 2 мкг/мл гентамицин, пеницилин, стрептомицин и фунгизон. Културите се инкубират във въздушна среда, съдържаща 5% СО2 при 37°С и при относителна влажност на въздуха, по-висока от 90%.
б/ Типизиране на стимулиращи растежа фибробласти, като количество от 5,0.106 фибробласти, получени от белия слой на суспензия костен мозък, кожни фибробласти или фибробласти, получени от черен дроб на трупове, се разстилат върху микротитрационии кладенчета /1мм2/ и се култивират до пълното им сливане. Теди клетки се отстраняват от кладенчетата чрез повтарящи се промивнания, обикновено 42 + пъти, с балансиран разтвор на Ханк без Са и Μβ2+. Матриксът, останал върху плочката, се изследва чрез индиректна имунофлуоресценция, като се използват моноклонални антитела за различните компоненти на матрикса чрез белязане с флуоросцеин изотиоцианат зайчи антимиши имуноглобулин С, за определяне на наличните типове колаген. Суспендираните клетки се обработват с моноклонални антитела, насочени срещу колаген типове 1-ΐν, еластин, тропоеластин и фибронектин за изолиране на субпопулации,способни да продуцират всеки продукт. Клетките се обработват с комплемент от морско свинче, който ще увреди или разруши клетките, към които е прикачено многоклоналното антитяло. Жизнеспособните клетки се разстилат отново върху микротитрационни кладенчета, както е описано, култивират се до сливане и се отстраняват. Ефективността на методиката за изолиране се потвърждава чрез изследване на останалия от тези клетки матрикс посредством моноклонални антитела и индиректна имунофлуоресценция. За оптимален растеж на хемопоетични клетки матриксът трябва да съдържа колаген от типове II, IV и I в съотношение приблизително 6:3:1.
в/ Криоконсервация на стимулиращи растежа фибробласти. Стимулиращите растежа фибробласти могат да бъдат съхранявани чрез криоконсервация при използването на същите матрикси, описани за клетките на стромата.
Подобно на клетките от стромата, някои от клетките също се откачват от мрежата по време на криоконсервацията. Този матрикс обаче все още допринася за полепване на клетки от стромата на костния мозък и поради това намалява времето, необходимо за създаване на матрикс, подходящ за растежа на хемопоетични клетки.
Инокулиране с мононуклеарни клетки.
За повишаване дълготрайността на растежа на култури от костен мозък мононуклеарни клетки от периферна кръв се получават от хепаринизирана суспензия при използване на Фикол-хипак или Перкол. Клетки от периферна кръв и кръвообразуващи клетки от костен мозък се получават от един и същ индивид /аутоложни/ чрез пункция на вената и трябва да се съхраняват чрез криоконсервация по времето, когато се взима материал от костен мозък. Допълнителни клетки от периферна кръв могат да бъдат получени от заболелия пациент, ако това се налага, по време на процедурата по култивирането. Но ако се предполага заболяване с онокологичен характер, материалът трябва първо да бъде подложен на пречистване, както е описано. 5.106 Мононуклеарни клетки /предпочитана е моноцитна субпопулация / се инокулират върху мрежата четири до пет дни след началното инокулиране с кръвотоворни клетки от костен мозък и всеки три седмици след това. Тази процедура повишава кръвообразуването с 10 до 13 % седмично.
Продължително запазване на културите и складиране на прародителски клетки.
Културите от слети клетки от стромата не подкрепят или в най-добрия случай слабо подкрепят кръвообразуването. Продължителен растеж на човешки прародителски клетки е възможен, ако те са снабдени с необходимите произхождащи от стромата растежни регулатори. Например, изходният материал от костен мозък се разделя на известен брой еднакви части, съдържащи приблизително 106 кръвотворни клетки. Всяка от тези части се инокулира в предварително изготвената плочка от клетки на стромата, прорастнали върху найлоновата мрежа.Културите се проследяват чрез директно наблюдение с имерсионен микроскоп и чрез диференциално изброяване на неполепени клетки върху препарат след всяка захранване. Преди достигане на фазата сливане на колониите културите се обработват с колагеназа и се поставят за обработване с ултразвук за около 6 до 10 минути. Кръвотворните и стромални клетки се сепарират по методите за плътностен градиент. Кръвотворните клетки се изброяват с хемоцитометър и приблизително около 50% се съхраняват чрез криоконсервация по описания начин. Останалите 50% се разделят на еднакви части, състоящи се от по около 106 клетки, и се инокулират върху култури, развити върху плочката от мрежа и стромални клетки. Когато последните достигнат етапа сливане на колониите, процедурата започва отначало.
Модулиране на растежа на кръвотворни клетки с клетъчни продукти.
Съгласно съществуващата технология за субкултивиране на различни клетъчни комплекси от костен мозък макрофаги, ретикуларни клетки, мастни клетки и фибробласти могат да бъдат култивирани поотделно и тяхната секреторна активност да бъде модифицирана чрез обработване с разпкчни агенти.
Кръвообразуването в дълготрайни култури от костен мозък на хора върху тридименсионална мрежа може също да бъде модулирано чрез секрети от екстрамедуларни макрофаги /Купферови клетки/, когато бъдат отглеждани по следния начин. Клетките се сепарират от тяхната органна строма след разграждане с протеаза. Проби от тъкан се инкубират за един час в разтвор на проназа /0,2% проназа /Калбихем/ и балансиран солев разтвор на Гей /В55/, като се разклащат леко. рН на разтвора се поддържа на 7,3 до 7,5 с 1-нормална натриева основа. Добавя се дезоксирибонуклеаза /0,5 мг/ на интервали от 30 мин по горната процедура и суспензията от резистентни клетки се филтрира и центрофугира при 350 хо за 10 мин. Сбитата маса се ресуспендира върху В58 на Гей и периферните клетки /макрофаги и ендотелни клетки/ се сепарират от клетъчния отпадък и от зрелите кръвни клетки при използване на Перкол градиент. Резултиращата клетъчна фракция се промива 3x3 мин с модифицирана среда на Дулбекс, обогатена с 10% фетален телешки серум, и се разстила върху пластмасови блюда за култура в обем, съдържащ 3 до 4 х 10б клетки.
След 24-часово инкубиране неполепените клетки се отстраняват чрез промиване със средата за култура, а полепените клетки се поддържат при 33°С в газова смес от 5% СОг в стаен въздух при повече от 80% относителна влажност. Растежната и/или екскреторната активност на тези клетки може да се стимулира: Чрез променяне на съотношението СОг:Ог; 2. Обработване на културите с легла от латекс; 3. Обработване на културите със силиций.; 4. Добавяне на простагландин Е2, Εί или Ег към средата, допълване на средата с интерлевкин 2. Чрез тези агенти могат да се модулират секреторните продукти на макрофага.
Кондиционалната среда със секреторните продукти може да се използва за допълване на отношението еритропоеза /гранулопоеза в дълготрайната култура костен мозък по почти същия начин, както се наблюдава ин виво.
Методът съгласно изобретението намира приложение за проследяване състоянието на пациентите с рак или с други заболявания чрез аспириране на част от неговия костен мозък и изследване на пробата. По този начин може да бъде открита метастаза или възвръщане на процеса, преди това да стане клинично установимо. Методът е приложим и за изследване на пациенти в други състояния, които могат да се проследят чрез вземане на проба от костния им мозък.
Продължителният растеж на клетки от аспирираната проба от костен мозък при използване на систематичния ход на етапите съгласно изобретението повишава вероятността от откриване на клонални метастазни и на кръвотворни клетки с хромозомни недостатъци. Тези клетки може да не се забележат в обикновена намазка от прясно аспириран костен мозък.
Методът съгласно изобретението намира приложение и за изпитване на цитотоксичност на костен мозък спрямо фармацевтични антинеопластични средства, карциногени, хранителни добавки и други вещества.
За целта най-напред се създават стабилни растящи култури от клетки на костен мозък /включително от стомата и костен мозък/, след което културата се подлага на раздействието на различни концентрации от изпитвания агент. След съответна инкубация препаратът се изследва под фазов микроскоп за определяне на оптимално допустимата доза /НТД/ от изпитвания агент, при която се явяват най-ранните морфологични изменения. Изпитването за цитотоксичност може да се осъществи с използването на различни багрила за суправитално оцветяване с цел преценка жизнеспособността на тази тридименсионална система, като се използват известни методики. Определянето на найвисоката допустима доза предлага обхватът концентрация за следващо изпитване.
След като се определи обхватът на изпитване, следва изпитване на изследвания агент за въздействието му върху жизнеспособността, растежа и/илн морфологията на различни клетъчни типове, съставящи културата от костен мозък по известни методики.
В допълнение изобретението дава възможност тридименсионалната опора /плочка/ да се изработи от какъвто и да е друг материал, който позволява клетките да се полепват по него и да растат в повече от един слой, така че да може да бъде използвана за изготвяне на препарати от костен мозък, черен дроб, кожа и много други типове клетки и тъкани. Например, такава тридименсионална плочка от кожа се получава първо, като се оставят фибробластите да растат и да се закрепят върху мрежата 7 до 9 дни, като се отлага слой колаген типове I и И, второ върху получената мрежа се разстилат меланоцити и се оставят да растат 5 дни и трето върху прорастналите до степен на сливане на колониите от меланоцити се инокулират кератоцити.
Дадените само някои конкретни приложения на метода не изчерпват неговото приложение.

Claims (18)

  1. Патентни претенции
    1. Метод за реплициране на клетки от костен мозък,характеризиращ се с това, че тридименсионална плочка, разположена в хранителна среда за отглеждане на клетъчни култури, се инокулира с клетки от стромата на костен мозък, култивира се до степен припокриване на колониите от клетки една с друга, и се инокулира културата от стромални клетки с базични кръвотворни клетки, включващи многопотеициални, прародителски и предшестващи клетки с репродуктивна способност.
  2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че тридименсионалната плочка представлява найлонова мрежа с отво2 ри с големина 400 мкм и диаметър на влакното от 100 мкм, покрита с колаген.
  3. 3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че хранителната среда съдържа фактори, изолирани от културалната среда за макрофаги на далак или черен дроб.
    •
  4. 4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че клетките от стромата на костен мозък включват фибробласти, ретикулни клетки и мастни клетки.
  5. 5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че клетъчните колонии от костен мозък включват еритроидни, миелоидни, лимфоидни и макрофагни колонии и колонии от мегакариоцити.
  6. 6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че стромалниите клетки върху плочка от найлонова мрежа могат да се използват веднага или след съхранение в условията на криоконсервация.
  7. 7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че базичните кръвотворни клетки се култивират при температура от 33 до 34°С през първите три дни след инокулацията и след това се култивират при 35 до 37°С.
  8. 8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че стромалните клетки и основните базични клетки могат да произхождат или от един и същ, или от различен индивид.
  9. 9. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че с цел покриване на мрежата от найлон с колаген, последната се инокулира с фибробласти, секретиращи колаген и/или други екстрацелуларни компоненти на матрикса, култивират се и след това се отделят от тридименсионалната плочка чрез средства, които не въздействат на отложения върху плочката колаген.
  10. 10. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че фибробластите са в соътношекие 6:3:1 и секретират колаген тип 1,111 и IV, а средството за отделянето им от тридименсионалната плочка е трипсин.
  11. 11. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че тридименсионалната плочка се съхранява в условията на криоконсервация след като фибробластите, секретиращи колаген и/или други екструцелуларни компоненти, са отстранени.
  12. 12. Метод съгласно претенции 1 и 7, характеризиращ се с това, че базичните кръвотворни клетки се култивират в присъствие на мононуклеарни клетки от периферна кръв, добавени в културата четири до пет дни след началното инокулиране с кръвотворни клетки и след това на всяка трета седмица.
  13. 13. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че мононуклеарните и кръвотворните клетки произхождат от един и същ индивид, а мононуклеарните клетки са моноцити.
  14. 14. Метод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че екстрамедуларните макрофаги се отглеждат в отделна култура и продуктите на техния метаболизъм се добавят периодично към културалната среда.
  15. 15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че растежната или секреторна активност на екстрамедуларните макрофаги се стимулира чрез променяне на съотношението СОгЮг, при което се осъществява култивирането им.
  16. 16. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че отделната култура от екстрамедуларни макрофаги се обработва с легла от латекс.
  17. 17. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че отделната култура от макрофаги се обработва със силиций.
  18. 18. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че към отделната култура от макрофаги се добавят простагландин Е], Ег или Ег и интерлевкин 1 или интерлевкин 2.
BG085721A 1986-04-18 1988-10-17 Метод за реплициране на костен мозък BG51337A3 (bg)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85356986A 1986-04-18 1986-04-18
US07/036,154 US4721096A (en) 1986-04-18 1987-04-03 Process for replicating bone marrow in vitro and using the same
US3811087A 1987-04-14 1987-04-14
PCT/US1987/000869 WO1987006120A1 (en) 1986-04-18 1987-04-15 Process for replicating bone marrow

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG51337A3 true BG51337A3 (bg) 1993-04-15

Family

ID=27364979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG085721A BG51337A3 (bg) 1986-04-18 1988-10-17 Метод за реплициране на костен мозък

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0309456B1 (bg)
JP (2) JP2857392B2 (bg)
KR (1) KR0142885B1 (bg)
AT (1) ATE127692T1 (bg)
AU (3) AU615414B2 (bg)
BG (1) BG51337A3 (bg)
BR (1) BR8707673A (bg)
DE (1) DE3751519T2 (bg)
DK (1) DK665687D0 (bg)
FI (1) FI100249B (bg)
HU (1) HU202578B (bg)
NO (1) NO179181C (bg)
RO (1) RO106655B1 (bg)
WO (1) WO1987006120A1 (bg)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5902741A (en) * 1986-04-18 1999-05-11 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional cartilage cultures
AU644578B2 (en) * 1986-04-18 1993-12-16 Marrow-Tech Incorporated Three-dimensional cell and tissue culture system
US5567612A (en) * 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
US5804178A (en) * 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
US5736372A (en) * 1986-11-20 1998-04-07 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable synthetic polymeric fibrous matrix containing chondrocyte for in vivo production of a cartilaginous structure
US6309635B1 (en) 1986-11-20 2001-10-30 Children's Medical Center Corp. Seeding parenchymal cells into compression resistant porous scaffold after vascularizing in vivo
WO1993007913A1 (en) * 1991-10-24 1993-04-29 Children's Medical Center Corporation Neomorphogenesis of urological structures in vivo from cell culture
US5436151A (en) * 1992-04-03 1995-07-25 Regents Of The University Of Minnesota Method for culturing human hematopoietic stem cells in vitro
US5460964A (en) * 1992-04-03 1995-10-24 Regents Of The University Of Minnesota Method for culturing hematopoietic cells
US7214654B1 (en) 1994-12-07 2007-05-08 Karlheinz Schmidt Agent for the manufacture of biological parts including an active ingredient complex and carrying materials suitable for the active ingredient complex
US5709854A (en) * 1993-04-30 1998-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo
US6123727A (en) 1995-05-01 2000-09-26 Massachusetts Institute Of Technology Tissue engineered tendons and ligaments
US5855610A (en) 1995-05-19 1999-01-05 Children's Medical Center Corporation Engineering of strong, pliable tissues
US5741685A (en) * 1995-06-07 1998-04-21 Children's Medical Center Corporation Parenchymal cells packaged in immunoprotective tissue for implantation
US5728581A (en) * 1995-06-07 1998-03-17 Systemix, Inc. Method of expanding hematopoietic stem cells, reagents and bioreactors for use therein
JP2002529073A (ja) * 1998-11-12 2002-09-10 セル サイエンス セラピューティックス インコーポレーテッド 三次元装置における造血前駆細胞からのリンパ様組織特異的細胞の生成
WO2000046349A1 (en) * 1999-02-04 2000-08-10 Technion Research & Development Foundation Ltd. Method and apparatus for maintenance and expansion of hemopoietic stem cells and/or progenitor cells
AU2001250018A1 (en) 2000-03-02 2001-09-12 University Of Rochester Ex vivo generation of functional leukemia cells in a three-dimensional bioreactor
DE10203644A1 (de) * 2002-01-30 2003-08-07 Fraunhofer Ges Forschung Kryokonservierung an textilen Geweben
JP5706058B2 (ja) 2004-02-13 2015-04-22 スミス アンド ネフュー オルトペディクス アクチェンゲゼルシャフト 創傷治療組成物
CN101137747B (zh) * 2005-03-01 2013-10-09 国家细胞科学中心 用于产生人工骨髓样环境的组合物及其用途
JP4977854B2 (ja) * 2005-10-21 2012-07-18 国立大学法人名古屋大学 組織形成用複合材料およびその製造方法
WO2010048441A2 (en) * 2008-10-22 2010-04-29 Regenemed, Inc. Culture systems
SG10201805199RA (en) * 2011-06-02 2018-07-30 Harvard College Methods and Uses for Ex Vivo Tissue Culture Systems

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH593339A5 (bg) * 1973-07-02 1977-11-30 Monsanto Co
US4144126A (en) * 1975-05-21 1979-03-13 Beecham Group Limited Cell culture method
JPS51151384A (en) * 1975-06-20 1976-12-25 Olympus Optical Co Ltd Process for cultivating organic tissue or cells automatically
US4024020A (en) * 1975-12-15 1977-05-17 Monsanto Company Method of cell culture on polyacrylonitrile surface
US4184922A (en) * 1977-11-11 1980-01-22 The Government Of The United States Dual circuit, woven artificial capillary bundle for cell culture
US4228243A (en) * 1978-07-13 1980-10-14 Toray Industries, Inc. Cell culture propagation apparatus
MX163953B (es) * 1984-03-27 1992-07-03 Univ New Jersey Med Procedimiento para preparar una matriz biodegradable a base de colageno

Also Published As

Publication number Publication date
EP0309456B1 (en) 1995-09-13
KR0142885B1 (ko) 1998-07-15
ATE127692T1 (de) 1995-09-15
DE3751519T2 (de) 1996-03-28
EP0309456A4 (en) 1989-06-27
NO875286D0 (no) 1987-12-17
HK1007684A1 (en) 1999-04-23
HUT48112A (en) 1989-05-29
KR880701093A (ko) 1988-07-25
JPH10114664A (ja) 1998-05-06
AU615414B2 (en) 1991-10-03
DE3751519D1 (de) 1995-10-19
AU6815990A (en) 1991-03-14
NO179181C (no) 1996-08-21
NO875286L (no) 1987-12-17
FI100249B (fi) 1997-10-31
DK665687A (da) 1987-12-17
FI884783A0 (fi) 1988-10-17
JPH01503195A (ja) 1989-11-02
JP2857392B2 (ja) 1999-02-17
AU7356887A (en) 1987-11-09
WO1987006120A1 (en) 1987-10-22
JP3032492B2 (ja) 2000-04-17
RO106655B1 (ro) 1993-06-30
FI884783L (fi) 1988-10-17
EP0309456A1 (en) 1989-04-05
BR8707673A (pt) 1989-08-15
HU202578B (en) 1991-03-28
AU6816090A (en) 1991-03-14
DK665687D0 (da) 1987-12-17
NO179181B (no) 1996-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4721096A (en) Process for replicating bone marrow in vitro and using the same
AU615414B2 (en) Process for replicating bone marrow
Castro-Malaspina et al. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny
US5599703A (en) In vitro amplification/expansion of CD34+ stem and progenitor cells
Mauch et al. Evidence for structured variation in self-renewal capacity within long-term bone marrow cultures.
Holbrook et al. Phenotypic expression of epidermal cells in vitro: a review
Sandstrom et al. Effects of CD34+ cell selection and perfusion on ex vivo expansion of peripheral blood mononuclear cells
US5695998A (en) Submucosa as a growth substrate for islet cells
Phillips et al. Isolation and characterization of endothelial cells from rat and cow brain white matter
Pavelic et al. Growth of cell colonies in soft agar from biopsies of different human solid tumors
US20040052768A1 (en) Vascularised tissue graft
Sato et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells
JPH09501324A (ja) 細胞保持用の溝を備えた貫流バイオリアクター
AU595813B2 (en) Process for replicating bone marrow in vitro
CN103893831B (zh) 一种器官型人工皮肤、其制备方法及应用
Lanotte et al. Collagen gels as a matrix for haemopoiesis
US6136600A (en) Method for cultivation of hepatocytes
CA2230263A1 (en) Reconstituted skin
Bethel et al. Stromal microenvironment of human fetal hematopoiesis: in vitro morphologic studies
EP0350887A2 (en) Serum-free medium and process for cultivating mammalian cells
US6585969B1 (en) Non-viable keratinocyte cell composition or lysate for promoting wound healing
RU2272638C1 (ru) Биотрансплантат, способ его получения и способ лечения хронического гепатита и цирроза печени (варианты)
CA1310926C (en) Process for replicating bone marrow and other tissues in vitro and using the same
Dorshkind et al. A colony assay system that detects B cell progenitors in fresh and cultured bone marrow
HK1007684B (en) Stromal tissue