BG60322B2 - Нови глюкозоизомеразни ензими и тяхната употреба - Google Patents

Abstract

Новите ензими са приложими в индустриалните процеси, по-специално в конверсията на глюкозата във фруктоза, и при получаването на фруктозни сиропи като високофруктозни зърнени сиропи. Ензимите се получават чрез експресия на ген, кодиращ глюкозоизомеразния ензим, получен от астinорlаnеs мissоuriеnsis. 3 претенции

Description

(54) НОВИ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗНИ ЕНЗИМИ И ТЯХНАТА УПОТРЕБА

Настоящето изобретение се отнася до нови глюкозоизомерази, които са подходящи за прилагане в индустриални процеси, по-специално за конверсия на глюкоза във фруктоза. Изобретението се отнася също до използването на новите ензими за получаване на фруктозни сиропи, по-специално за високофруктозни зърнени сиропи.

Глюкозоизомеразата катализира обратимата изомеризация на глюкоза до фруктоза, която е широко приложима като заместител на захарта вследствие на по-високата сладост в сравнение със захарозата и глюкозата. Известни са много микроорганизми, продуциращи глюкозоизомераза, виж пример и обзора на статиите от Wen-Pin Chen in Process Byochemistry, 15, June/July (1980), 30-41 and August/September (1980) 36-41, в който са изброени много микроорганизми, способни да продуцират глюкозоизомераза.

Някои микроорганизми са прилагани и индустриално. В обзора на статиите от WenPin са описани условията на култивиране на микроорганизмите и методите на възстановяване и пречистване на получената глюкозоизомераза.

Получаването на глюкозоизомераза, който е един екстрацелуларен ензим, е сравнително евтино. Разработени са специални правила за възможната повторимост и продължително използване на ензима. Чрез имобилизация на ензима, обикновено във водонеразтворима форма, той може да се използва и в пакетен, и в продължителни процеси (например пакетни реактори). Един от най-големите недостатъци на имобилизацията на глюкозоизомеразата е същественото намаляване на специфичната активност, вследствие на присъствието на инертни материали. Ситуацията става още по-лоша съгласно описанието, когато глюкозоизомеразата е инактивирана чрез повишаване на температурата. Една необратима загуба на активността ще бъде резултат от температурно увреждане.

Въпреки опитите за получаване на ензимна стабилност се наблюдава съществена загуба на активност при нормални условия на приложение. Ето защо, има непрекъсната нужда от нови ензими като глюкозоизомераза с подобрени свойства, например нейната подобрена термостабилност позволява да се използва това, че равновесието на изомеризацията е изместена към фруктозата при висока температура. Повечето глюкозоизомерази са приложими при pH 7,5, но фруктозата е нестабилна при него. Необходими са глюкозоизомерази, които могат да се прилагат под pH 7,5.

Ензими с подобрени свойства могат да се получат или намерят по няколко начина, например чрез класическия скринингметод, чрез химична модификация на съществуващи протеини или чрез използване на модерни генетични и протеининженерингови техники.

Скрининг на организми или микроорганизми, проявяващи описаната ензимна активност, може да се илюстрира, например, като изолиране и пречистване на ензима от микроорганизма или от културалната супернатанта от същия микроорганизъм, определящ неговите биохимични свойства, и проверяване дали тези биохимични свойства удовлетворяват изискванията за описание.

Ако идентифицираният ензим не може да се получи от природно продуциращият го организъм, рекомбинантната ДНК-техника може да бъде използвана за изолиране на гена, кодиращ ензима, за експресия на гена в друг организъм и за изолиране и пречистване на експресирания ензим и да се провери дали е подходящо за даденото описание.

Модификацията на съществуващите ензими може да се достигне inter alia чрез химична модификация. Вж. например I. Svendsen, Carlsberg Res. Commun. 44 (1976), 237-291. Тези методи също са неспецифични в това, че те модифицират всички достъпни остатъци с общ сайд от веригата или са в зависимост от присъствието на подходящи аминокиселини за модифициране и често те са неспособни да модифицират аминокиселини, които са трудно достъпни, ако ензимната молекула е разгърната.

Ензимна модификация чрез мутагенезис на включения ген е недопустима за посочените неспецифичности, поради което се счита за по-съвършена. Мутагенезисът може да бъде достигнат както чрез случайна мутация, така и чрез сайтнасочена мутация.

Случайната мутация с въздействие на цялостния микроорганизъм с химична мутация или с мутационна радиация може да ре зултира в модифициран ензим, но тогава е необходимо да се спазват строги селекционни правила за получаване на мутанти с търсените свойства. По-висока вероятност за изолиране на търсени мутанти чрез случайна мутагенеза може да се постигне чрез клониране на кодирания ген, генетичната му модификация чрез метация ин витро или ин виво и експресиране на кодирания ензим чрез реклониране на мутирания ген в подходящ клетъчен гостоприемник. В този случай също е необходимо да се води строг селекционен протокол за подбор на търсените мутантни ензими. Тази специфична селекция не се отнася до селекция на ензими, подходящи за приложение при получаването на фруктоза.

Сайтнасочената мутация (SDM) е найспецифичният начин за получаване на модифицирани ензими, даващ възможност за специфично заместване на една или повече аминокиселини с всяка друга търсена аминокиселина.

В един от аспектите на изобретението се осигуряват нови мутанти на глюкозоизомераза, получени чрез експресия на гени, кодиращи този ензим, който е с аминокиселинна последователност, отличаваща се най-малко по една аминокиселина от кореспондиращия природен ензим, и проявяващи подобрени свойства.

Съгласно друг вариант на изобретението е създаден метод за получаване на такива нови мутантни глюкозоизомерази, който се основава на модификации от интер- и интрамолекулярни взаимодействия от кореспондиращия природен (див) тип ензим.

Съгласно още един вариант е създаден метод за селекциониране на мутантни ензими с подобрени свойства по време на индустриалното приложение.

ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1. Кинетиката на топлинната инактивация на свободна от метал глюкозоизомераза от EcoAmi (DSM) GL в 50 мМ MOPS, pH 7,2 при 25°С. Не е добавен метал;

Фигура 2. Същото както на фиг.1, но се добавя 10 мМ Mg²⁺;

Фигура 3. Същото както на фигура 1, но е добавено 10 мМ Со²⁺;

Фигура 4. Диаграма на температурната зависимост при топлинна инактивация от

EcoAmi (DSM) GLb 50 мМ MOPS, pH 7,2, при 25°C;

Фигура 5. pH зависимост на топлинната инактивация на свободен от метал EcoAmi (DSM) GL при 72°С без добавяне на метал. CHES = 2-(циклохексиламино)етан сулфонова киселина;

Фигура 6. Силен йонен ефект върху кинетиката на температурната инактивация на свободен от метал EcoAmi (DSM) GL в 50 мМ MOPS, pH 6,7, 72°С; не е добавян метал;

Фигура 7. Силен йонен ефект върху кинетиката на топлинната инактивация на свободен от метал EcoAmi (DSM) GL в 50 мМ MOPS, pH 6,7, 72°С; не е добавян метал;

Фигура 8. SEC-HPIC на EcoAmi (DSM) GL след пролонгирана инкубация на EcoAmi (DSM) GL в 7М урея при 25°С;

Фигура 9А. SEC-HPIC на EcoAmi (DSM) GL, предварително третиран с цианат при 25°С при отсъствие на урея. Елюиращият буфер е 50 мМ Трие (НС1, pH 8,0, 150 мМ NaCL, 0,02% NaN₃;

Фигура 9В. Натурален PACE от EcoAmi (DSM) GL е третиран с цианат при 25°С в отсъствие на урея.

Фигура 10А. SEC-HPIC от EcoAmi (DSM) GL, предварително третиран с цианат в присъствието на 5М урея при 25°С.

Фигура 10В. Натурален PACE от EcoAmi (DSM) GL, третиран с цианат в присъствието на 5М урея при 25°С.

Фигура 11. Гликация на EcoAmi (DSM) GL в 50 мМ MOPS, pH 7,7, 60°С.

Отворени цикли: не се добавя глюкоза; затворени цикли: +250 мМ глюкоза; триъгълници: инкубация с глюкоза (250 мМ), последвана от екстензивна диализа за тестиране на реверзибилността.

Фигура 12. Кинетика на инактивацията на EcoAmi (DSM) GL-мутант K253Q.

Фигура 13. Кинетика на тетрамер-димерната дисоциация при 25°С в 5М урея на EcoAmi (DSM) GL мутант К 253 Р.

Фигура 14. Кинетика на гликацион-индуцираната инактивация на EcoAmi (DSM) GL мутант К253 Р при 60°С в 12,5 мМ натриев фосфат, pH 7,7.

Фигура 15А. Структура на рМа/с5-8.

В рМа тип вектора нуклеотидът 3409 е изменен от А на G, докато в рМс тип-вектора нуклеотидът 2238 е променен от G на С, създавайки стопкодони в хлорамфеникол ацетил трансферазния ген и в в-лактамазния ген респективно, достигайки посочената генна инактивация (P.Stanssens et al./1987) в: “Oligonucleotid-directed construction of mutations by the gapped duplex DNA method using the pMa/C plasmid vectors”, Manual used at the EMBO laboratory course “Directed Mutagenesis and Protein Engeneering” held at the max Plauck Institut fur Biochemie Martinsreed, July 4-18, 1987.

Последователността, както е показана на фигурата, е на рМа -8.

Фигура 15В. Последователността на промотора ламбда P_R е представена в експресионния вектор рМа /с5Р_К/ чрез заместване на нуклеотидите 3754 на 3769 от рМа /с5-8/.

Фигура 15С. Так-промоторна последователност, както е в експресионния вектор рМа /с5Т/, замествайки нуклеотидите 3754 на 3769 от рМа /с5-8/.

Фигура 16. Цялата генна последователност и получената аминокиселинна последователност от дивия тип Actinoplanes missouriensis глюкозо изомераза.

Фигура 17. Физична карта на глюкозоизомеразната /GI/ експресионна единица за рМа/с-I. Позициите на релевантните рестрикционни сайтове, P_R промотора и протеинкодиращата област са означени. Отбелязаните със звездичка рестрикционни сайтове са представени със сайтнасочена мутагенеза.

Фигура 18. Свойства на глюкозоизомеразния мутант при различни pH.

Ami: Мутантна К253Р глюкозоизомераза, продуцирана от мутантния плазмид рМа - I. K253R.

Означени са различни k_d измервания за Ami WT /[]/ и AmiK253R/o/.

Може да се види, че Ami K253R има подобрена k_d величина в тесен pH интервал.

Фигура 19. Цялата генна последователност и получената аминокиселинна последователност на дивия тип Streptomyces murinus глюкозоизомераза.

Фигура 20. Физична карта на глюкозоизомеразната експресионна единица за рМа/с - GIsmul. Позициите на релевантните рестрикционни сайтове, Так-промотора и протеинкодиращата област са означени.

Фигура 21. Построяване на аминокиселинната последователност на глюкозоизомерази от различни източници. Цялата последователност на Actinoplanes missouriensis глюкозоизо мераза е представена, докато за глюкозоизомеразите от други източници са дадени само аминокиселинните остатъци, отличаващи се от тези за Act. missouriensis. Аминокиселинната последователност на глюкозоизомеразата се отличава от публикуваната последователност /Saari, J. Bacteriol., 169 (1987) 612/ с един остатък - Пролин 177 в публикуваната последователност е намерено, че е Аргинин.

Последователността на Str. thermovulgaris е установена само до аминокиселина 346; недетерминираните остатъци са отбелязани чрез блокиране /./.

Тирето /-/ означава липсата на аминокиселинен остатък в тази позиция, сравнено с всяка друга последователност. Различните видове са отбелязани със следните символи:

Ami: Actinoplanes missouriensis DSM 4643 Amp: Ampullariella species ATCC 31351 Art: Arthrobacter species

Smu: Streptomyces murinus 40091

Svn: Streptomyces violaceoniger CBS 409.73

Svr: Streptomyces violaceoruber LMG 7183 Sth: Streptomyces thermovulgaris 40444 Описание на изобретението

Съгласно изобретението мутантните глюкозоизомеразни ензими могат да бъдат описани на базата на внимателно изследване структурата на дивия тип глюкозоизомерази в комбинация с внимателно биохимично изследване на процесите, водещи до инактивация на оригиналните глюкозоизомерази в условията на приложение, последвано от рационална модификация на дивия тип генна последователност. Екстензивно изследване на описаните мутанти в условията на индустриално приложение води до идентификация на мутанти с подобрени свойства.

Под “подобрени свойства” се разбира висока обратимост на изпълнение и/или подобрена стабилност, специално температурна, съответстваща на кореспондиращия див тип ензими. В допълнение, към термична термостабилност се разбира повишена стабилност при различни стойности на pH, както и в комбинация с увеличена термостабилност.

Изобретението се базира на откритието, че активността на тези ензими е оптимална, когато ензимът е в мултимерна (димерна, тримерна, тетрамерна и др.) форма и така наречената активност може да се намали дори до загубване на взаимодействието между субединиците. Например е намерено, че ензимната активност на глюкозоизомеразата от Actinoplanes missouriensis е уникална за тетрамерната структура и съществено е намалена при дисоциация на нативната тетрамерна структура в димерна.

Поради това съгласно изобретението се предвиждат нови мутантни глюкозоизомерази, в които взаимодействието между субединиците (мономери, димери и т.н.) е увеличено, резултирайки в подобрени свойства на ензимите, по-специално при приложението. Изобретението предвижда също методи за повишаване взаимодействието между глюкозоизомеразните субединици.

Съгласно предпочитан вариант на изобретението тетрамерната структура на глюкозоизомеразата е постигната чрез усилване на взаимодействието между димерите в тетрамери.

Подходящ метод за повишаване стабилността на тетрамерната структура например е въвеждането на йонизационни мостове. Електростатичните ефекти са добре познати като играещи фундаментална роля в ензимната структура и функции (вж. J.A. Matthew et al., CRC Critical Reviews in Biochem., 18 (1985), 91-197). Например те изброяват pH зависимостта на ензимната катализа доколкото pH оптимумът за дадения протеин е определен от присъствието на йонизационни групи заобикалящи активния сайт. Електростатичните взаимодействия, включени в хидрогенните връзки и йонните (солеви) мостове, са важни за стабилизирането на всички протеинови структури (вж A.J. Russell and A.R.Fersht, Nature 36 (1987) 496-500). Съгласно предположението, че дисоциацията на глюкозоизомеразния тетрамер в димери най-вече е отговорна за ензимната денатурация, този процес може да се предотврати чрез въвеждане в интерфазите на допълнителни стабилизиращи взаимодействия, например като суплементарни солеви мостове.

Една възможност за представяне на нови солеви мостове в даден протеин е заместването на два съседни остатъка в противоположно заредени аминокиселини, например Asp и Arg, и след това да се провери чрез изчисления на енергията например, че се е осъществило йонно взаимодействие. Това въвеждане на нови солеви мостове изисква два мутаци онни пункта. Обратно може да се създаде солев мост чрез заместване на остатък в близост до една заредена изолирана аминокиселина, като по този начин се създава една йонизационна двойка чрез самостоятелна точка на мутация.

Друг подходящ метод за повишаване стабилността на тетрамерните структури е въвеждането на дисулфидни мостове. Дисулфидните връзки са обща характерна особеност на много екстрацелуларни протеини. Ролята им се състои главно в стабилизиране на протеините и този ефект е един от най-добре разбраните. То се обяснява с намаляване на ентропията в разгърнато състояние, но някои факти остават необяснени при такова просто описание, т.е. Creighton, Bioessays, 8 (1988), 57-63, посочва, че пертурбацията, предизвикана в природно състояние, също трябва да бъде взета под внимание.

Направени са много опити и са описани в литературата за конструиране на дисулфидни мостове с различен успех. Pantoliano et al., Biochemistry 26 (1987) 2077-2082 чрез въвеждане на два цистеинови остатъка в субтилизин чрез точкова мутация в гена се постига увеличаване на температурата на топене с 3°С. Y.E. Villafranca at al., Biochem. 26 (1987) 21822189 въведен цистеинов остатък чрез точкова мутация в дихидрофолат редуктаза, и използвайки присъствието на свободен цистеин в дивия тип ензим, формират дисулфидни мостове. Тези дисулфидни връзки обаче имат един неочакван ефект, доколкото мутантният ензим няма увеличена устойчивост на термична денатурация, но е повече на денатурация от гуанидинхлорид. В тези два случая мутантните ензими не са така стабилни както е очаквано.

Тези два известни начина са подходящи за правене както на двойна, така и на единична точкова мутация, както е посочено. За мултимерните протеини (ензими), създадени от мономерни единици, свързани чрез симетрични краища, може да съществува трета възможност: създаване на дисулфиден мост чрез единична точкова мутация без каквато и да е потребност от свободен Cys. Този метод успешно е използван от Saueratal, Biochemistry 25 (1986), 5992-5998, в ламбда репресор: получено е 10°С увеличаване на температурата на топене, 60% увеличение на устойчивостта срещу денатурация от урея и на повечето от константите на свързване.

Като предварително изискване за последния метод са необходими симетрични краища между най-малко два мономера. Симетричните краища, които също са ротационни, имат свойството, че разстоянието между една точка и края по време на ротацията е отбелязано. Точката на мутация, въведена в близост до симетричния край на мултимерната структура, ще бъде репродуцирана в близост до тази точка. Този метод предоставя преимуществото от въвеждане на интермономерни дисулфидни мостове чрез единична точкова мутация.

Съгласно друго предпочитано изпълнение на изобретението се увеличава стабилността на тетрамерната структура на глюкозоизомеразата чрез стабилизиране на димерната структура. Това може да бъде представено като денатурация на ензима, който най-малко е частично обратима реакция на тетрамера в димери, последвана от дисоциация на димерите в два мономера всеки. Чрез стабилизиране на димерната структура, денатурацията на димера ще прогресира по-бавно и съответната реасоциация ще се повиши. Заместванията, които редуцират чувствителността на мономерните и/ или димерните структури за химична модификация могат също да имат стабилизиращ ефект, докато те удължават необратимостта на разгъването на протеина.

В друго предпочитано изпълнение тетрамерната структура е стабилизирана индиректно чрез стабилизиране на димерната структура или дори на мономерната структура от глюкозоизомераза чрез специална мутация. Чрез изменение на пакета от мономерна и/или димерна структури конформационната свобода на всяка от частите от тетрамерната структура е намалена, което причинява стабилизационен ефект върху тетрамерите.

Мутациите, стабилизиращи взаимодействията между ензимните субединици, ще бъдат способни да стабилизират взаимодействията между областите вътре в мономерния протеин.

Очевидно е за всеки специалист в областта, че ако е необходимо получаване на глюкозоизомераза с намалена стабилност, стабилизационните сили, както са описани, могат да бъдат отслабени чрез прилагане на аналогични процеси. Мутанти с тези свойства и проце си за получаване на такива мутантни форми също са част от изобретението.

В описанието са използвани едновременно троичен и единичен буквен код за означение на аминокиселините, изложен в следващата таблица 1.

Таблица 1

Аланин	Ala	A	Левцин	Leu	I
Аргинин	Arg	R	Лизин	Lys	K
Аспарагин	Asn	N	Метионин	Met	M
Аспартат	Asp	D	Фенила-
			ланин	Phe	F
Цистеин	Cys	C	Пролин	Pro	P
Глутамат	Glu	E	Серин	Ser	S
Глутамин	Gly	G	Триптофан Тгр	W
Хистидин	H	H	Тирозин	Tyr	Y
Изолевцин	Jle	I	Валии	Vai	V

Съгласно изобретението се осигурява и метод за повишаване на взаимодействието между глюкозоизомеразните субединици, което е основано на схващането за тридименсионалната структура (ЗД) на молекулите. Информацията за тридименсионалната структура на ензима (или ензимният комплекс) е от голямо значение за възможността да се предскажат мутациите, които могат да бъдат предизвикани.

Докладвани са структурни данни за глюкозоизомераза от Streptomyces rubiginosus (Carell et al., J. Biol. Chem. 259 (1984) 32303236), Streptomyces olivochromogenes (Farber at al., Protein Eng. 1, (1987) 459-466 и Arthrobacter) Henrice et al., Protein Eng. 1, (1987) 467-475.

Независимо от това обаче няма на разположение данни относно аминокиселинната последователност на тези ензими и ЗД-структурна хомология с Actinoplanes missouriensis глюкозоизомераза (вж. F.Rey et al., Proteins 4 (1988) 165-172). За да се демонстрира голямата приложимост на метода, включен в изобретението, гените за глюкозоизомераза, изолирани от различни видове, са клонирани и съгласувани в последователност от аминокиселини. Аминокиселинната последователност за глюкозоизомеразите, както са изведени от гените на Streptomyces violaceoruber, Streptomyces murinus, Arthrobacter spec, и

Strept. thermovulgaris, са доказано хомоложни. Публикуваните аминокиселинни последователности за глюкозоизомеразите от Ampulariella (Saari, ibid.) и Streptomyces violaceoniger (Nucl. Acids Res. 16 (1988) 9337), изведени от нуклеотидната последователност на респективните гени, показват тясна хомология с глюкозоизомеразата от Actinoplanes missouriensis. В допълнение, WO 89/01520 разкрива, че аминокиселинната последователност на глюкозоизомераза от Str. rubiginosus е хомоложна на глюкозоизомеразата от Ampullariella sp.

Въпреки че липсват данни за ЗД-структура на повечето глюкозоизомерази, може да се заключи, че всички глюкозоизомерази от Actinomycetales имат аналогична тетрамерна организация.

Съгласно един от аспектите на изобретението йонните мостове могат да се представят по следния начин. Глюкозоизомеразният тетрамер е скриниран с цел откриване на негативно заредени остатъци (Asp и Glu, йонизирани при рН стойност, както е използвано в описаните условия), чиито карбоксилатни части са на разстояние най-малко 8 А от вероятните позитивно заредени атоми (дистални нитрогени на Lys и Arg). Намерени са четиринадесет остатъка, които да задоволяват тези критерии. Между тях са селекционирани остатъци, като ги разделят помежду им и понататък се разполагат интериорно на протеина. Този маниер е въведен с цел да се елиминира възможността за формиране на солеви мостове по повърхността на протеина, тъй като се очаква да има по-малък ефект на цялостната стабилност (незащитените заредени остатъци могат в действителност да бъдат включени в хидрогенните връзки на водните молекули и взаимодействат с изброените йони). Във връзка с това се създават нови солеви мостове, включващи остатъци, комбинирани между две стабилизационни съставки: първо, отстраняване на съществуващите изолирани остатъци и второ, създаване на йонен чифт протектор срещу въздействието на субстрата или разтворителя.

Измежду 14-те негативно заредени и изолирани остатъка в Actinoplanes missouriensisната глюкозоизомераза, 3 са разположени между Asp 146, Glu 221 и Asp 264. Всички те са релативно, респективно, достъпни повърхности в тетрамера: 46,9 и 42 А. В предпочитано изпълнение на изобретението са създадени нови солеви мостове, включващи тези остатъци, като са използвани описаните методи. Подобни мутации могат да бъдат въведени в други глюкозоизомерази, в това число и тези, получени съгласно посочените източници.

Като се използва посочената техника или други подобни, известни на специалистите в областта, могат да се създадат няколко точкови мутации с цел повишаване стабилността на тетрамерната глюкозоизомеразна структура (за данни относно структурата на Actinoplanes missouriensis глюкозоизомераза, вж. F. Rey at al., ibid). Между тях следните мутации са свързани със стабилността на една мономерна субединица:

- заместване на Gly остатък в друг остатък (α-спирала В), с цел намаляване на ентропията в разгърнато състояние

- възбуждане на гъвкава бримка (между α-спирала G и ^-верига Н) за редуциране на хидрофобността на незащитената повърхност

- въвеждане на Pro остатък към края на /?-верига Е (намаляване на ентропията в разгърнато състояние)

- мутация в Phe ( α-спирала G), с цел формиране на ароматна група за влагане на външен елемент за стабилизация на протеиновата структура.

В следващо предпочитано изпълнение на изобретението заместването на аргинин с лизин е представено на глюкозоизомеразната молекула, за която се търси повишаване на стабилността. И двата остатъка са пригодени за ЗД-структура на протеина.

В протеините лизиновите остатъци, но не и аргининовите, са податливи на химична модификация. Например, епсилон аминогрупата в лизина е известно, че реагира с алдехидите и кетоните и генерира Шиф-база, привеждаща и други модификационни продукти, които евентуално резултират в загуба на биологична активност (вж. P.Higgins, H.Bunn,

J.Biol. Chem. 256 (1981) 5204-5208. В частност, в глюкозоизомеразното описание, където присъстват глюкоза и фруктоза във висока концентрация при повишена температура, такива химически модификации са важни фактори за ензимната инактивация. Там където лизиновите остатъци се появяват в пределите на интерфазите между областите и/или субединиците, химична модификация в такова мес тоположение служи да съдейства за дисоциацията на областите или субединиците, и/или да осуети правилната реасоциация на областите, и/или субединиците, които са последователно и необратимо хванати в дисоциираното състояние. Мутациите на лизинови остатъци в аргининови в такива места биха елиминирали химичните модификации, включващи епсилон аминогрупите от лизина.

Чрез заместване на аргининови остатъци със специфични лизинови остатъци в глюкозоизомеразата продължителността на химичната модификация и нейният ефект за ензимната активност и/или стабилност са редуцирани. Съответно, смяната на лизиновите остатъци с аргининови ще подобри стабилността на глюкозоизомеразата по време на приложението.

Освен това в местата, които съгласуват лизиновата в аргининовата мутация, заместването на аргининови остатъци с лизинови резултира още и в увеличаване стабилността на протеините. Поради тази верижна гъвкавост за аргинина, която е по-малка от тази за лизина, вследствие на присъствието на гуанидинови групи мутацията на лизин в аргинин е благоприятна в ентропно отношение. В допълнение гуанидиновата група е способна да формира повече хидрогенни връзки със съседни остатъци в протеина, които също водят до повишаване на стабилността.

В още едно предпочитано изпълнение на изобретението, което по-специално се отнася до повишаване термостабилността на глюкозоизомеразата, най-малко един лизинов остатък, който се явява инициален, по-специално за локацията на типа, дефиниран по-нататък, е променен в аргинин. Заместването на аргинин в лизин би повишило електростатичното взаимодействие, в което заместеният аргининов остатък след това взима участие във взаимодействието между субединиците и/или областите. За да бъде заменен лизиновият остатък трябва да се подчини на следните изисквания по отношение на нагънатата природна протеинова конформация:

1. Трябва директно да бъде включен в електростатични взаимодействия, за предпочитане в пространството между субединиците и/ или областите.

2. Мутациите би трябвало да се срещат в място, благоприятстващо въвеждането на ами нокиселинен остатък.

3. Остатъкът би трябвало да се среща в място, по-малко достъпно за разтворители, за предпочитане да е част от едно взаимодействие между субединици и/или области.

За предпочитане е, изследването за аминокиселинни остатъци в глюкозоизомераза, които удовлетворявайки критериите 1 и 2, да имат най-ниско достъпна област от повърхността (ASA) в протеина, да се провежда, като същевременно се изисква ASA да има степен, по-ниска от средното число, определено за дадените остатъци. В местата, които задоволяват тези предварителни изисквания, аргининът в сравнение с лизина осигурява повишен електростатичен ефект на взаимодействие, вследствие на физико-химичните свойства на неговите странично-верижни гуанидинови групи (вж. D.Wigley et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987), 927-929).

Основно се изисква да се получи съществено количество ензимна активност от мутантните глюкозоизомерази, модифицирани съгласно изобретението. За да се получи такава ензимна активност, аминокиселинните остатъци, които трябва да се заместят, би трябвало да не са тези, които са идентифицирани като каталитични остатъци или като включени в кофакторни връзки.

Ясно е, че специфичното аминокиселинно заместване съгласно изобретението, може да модифицира стабилността на глюкозоизомеразата чрез посоченото комбинирано въздействие като променяне силата на електростатично взаимодействие, изменение броя на водородните връзки със съседни остатъци и на конформационната ентропия на ензима или чрез повлияване на продължителността на химична модификация.

Мутантната глюкозоизомераза съгласно изобретението може да бъде продуцирана по следния основен метод. Извършва се внимателен анализ на механизма или механизмите, включващи глюкозоизомеразната инактивация при условията на провеждане на денатурация. Като се използват познанията, получени от този анализ, по-нататък могат да се идентифицират специфичните аргининови или лизинови остатъци като евентуални кандидати за замяна. Това е възможно чрез внимателно изпитване на ЗД-структура на ензима, определена чрез методи като кристалография (H. Wyckoff (1985), Diffraction Methods for Biological Macromolecules, heth. Enzymol. Vols, 114-115, Acad. Prees) NMR анализ (K. Wuthrich (1986) in “NMR Proteins and Nucleic Acids” J. Wiley & sons) или обратно, от структурни предсказания, основани на анализ на първичната структура (вж. W.Taylor, Protein Engineering 2 (1988) 77) или от структурни източници, основани на свободни ЗД-структури от хомоложни протеини (вж. T.Blundell at al., Nature 326 (1987) 347).

Накрая, заместването на аминокиселинния остатък, локализиран на предпочитано място (сайт), може да бъде постигнато чрез конвенционални методи, по-специално чрез сайтнасочена мутагенеза на ДНК последователността, кодираща глюкозоизомеразата, използвайки примерно вектори и методи, както са описани от Zell and Fritz (EMBO J. 6 (1987) 1809).

Мутациите, които се дискутират, само илюстрират изобретението без да го ограничават. Изобретението се пояснява и със следващите неограничаващи го примери.

Докато в други отношения примерите са специфични, всички методи за получаване и манипулиране на рекомбинантна ДНК са проведени по стандартен начин, описан от Maniatis at al. 1982.

Плазмидите, векторите и бактериалните щамове, използвани или създадени в примерите, са депозирани в Deutsche Sammlung fur Microorganismen, Gottingen при условията на Будапещенския договор или в Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baam, The Netherlands, са следните:

pMc5-8 DSM 4566 pMa5-8 DSM 4567 pECOR 251 DSM 4711 E.coli K527 CBS 471.88 Пример 1. Изолиране и клониране на глюкозоизомеразния ген от Actinoplanes missouriensis (ДМ 43046).

Продуциране на Д-глюкозоизомераза в E.coli.

Д-глюкозоизомеразата (G1) е синонимно използвана за Д-ксилозоизомераза (Д-ксилоза) кетолизомераза, EC 5.3.1.5., един ензим, който превръща Д-ксилозата в Д-ксилулоза. Д-глюкозоизомеразата от Actinoplanes missouriensis, получена от изменена чрез инженерна намеса в щамове E.coli е означена като EcoAmi (DSM) GI. За да бъде отличен гена на Act. missouriensis кодиращ GI от аналогични гени на E.coli xylA, първият ще бъде означаван като GI.

Общата ДНК от Act. missouriensis DSM 43046 бе разединявана на части с рестрикционната ендонуклеаза Sau ЗА. Частите бяха фракционирани до захарозен градиент и фрагментите с дължина между 2 и 7 килобази (kb> бяха свързани в уникалния BgHI сайт на плазмида pECOR251. Ксилозоизомеразният дефицитен щам E.coli АВ 1886 - както е описано в Howard - Flanders (Genetics 53 (1966) 1119) и получен от щам E.coli АВ 1157 (DSM 1563), бе трансформиран чрез свързващо смесване и култивиране върху минимална агарова среда (Miller (1972) в “Experiments in Molecular Genetics” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.J.), допълнена със 100 mg/1 ампицилин и 0,2% (W/V) ксилоза (MMX). Тридесет и седем клона бяха възстановени (означени като рАМП - 137) и култивирани в LB-среда, съдържаща 100 mg/ί ампицилин. Рекомбинантната плазмидна ДНК бе изолирана и анализирана чрез рестрикционен анализ. Бяха разпознати две групи от плазмида, една (рАМ17), съдържаща 2,8 кв инсерция, а другата - (рАМ125), съдържаща 4,9 кв инсерция. Екстензивен рестрикционен анализ показва, че двата типа инсерция имат област от около 2,0 кв общо. Последователното детерминиране на тази област чрез химично разграждане (А. Махам and W.Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 560) разкрива една отворена структура с дължина 1182 нуклеотида, която бе идентифицирана като кодираща област от GI. Нуклеотидната последователност от GI заедно с получената аминокиселинна последователност е показана на фигура 15. Номерирането на аминокиселините се отнася до фиг. 15.

Особено висока експресия на GI може да бъде достигната в E.coli чрез поставяне на гена под транскрибционен контрол, осъществяван от десен промотор (P_R) от бактериофага ламбда както следва. Плазмидът pLK 94 (J. Botterman and М. Zabeau, ДНК 6 (1987) 583 първо се модифицира за елиминиране на Pst I сайта в β -лактамазния ген. Това бе осъществено чрез изолиране на 880 bp EcoRl (Pst I фрагмента от pLK70 - 70р / Botterman and Zabeau/, съдържащ N-крайна част от β-лактамазния ген, и 1700 двойки бази (Ьр) на

ECORI фрагмента на pLK94, съдържащ С-крайна част οτβ -лактамазния ген, така както репликационния вид. Последователното свързване на тези фрагменти довежда до pLK94p.

рАМ17 бе слепена с PstI и сместа от два пречистени фрагмента с около 1800 вр дължина, единият от които съдържа гена GI, бе свързана с PstI сайта от pLK94p. Свързаната смес е използвана за трансформация на щам E.coli АВ 1886. Устойчивите на ампицилин, GI⁺ трансформанти се получават чрез култивиране на ММХ.

Плазмидната ДНК бе изолирана от няколко селекционирани трансформанта и характеризирана чрез рестрикционен анализ. Плазмидът pLK94, приютил фрагмента PstI, съдържащ GI, бе определен като pLK 94GI. Ориентацията на GI е такава, че уникалният ВамН1 сайт е локализиран на около 470 Ьр над GTG иницииращ кодон.

pLK70 - 70р бе слепен с PstI, направен сляп с ДНК полимераза I (кленов фрагмент) и последователно анализиран с Xbal.

pLK94GI бе линеаризиран с ВамН1 и изследван с екзонуклеазата BaL 31. Пробите бяха взети през различно време - реакцията бе прекратена с динатриев етилендиаминтетраацетат (ЕДТА) -слепени с Xbal и анализирани чрез гел електрофореза за детерминиране на средно големите ВамШ - Xbal фрагменти. Фрагментите, достигащи големина от 1350 до 1450 Ьр бяха елюирани от гела. Фрагментите бяха свързани в pLK70 - 70 р. E.coli К514 / C.Cotson et al., Genetics 52 1965, 1043, бе трансформиран със свързваща смес и ампицилинрезистентните трансформанти бяха селекционирани при 37°С. Плазмидната ДНК, изолирана от различни трансформанти, се охарактеризира чрез рестрикционен анализ. Двадесет и четири клона, съдържащи плазмиди с интактни GI, се съхраняват и след това подлагат на тест за продуциране на EcoAmi (DSM) GI. Културите се отглеждат цяла нощ при 37°С, след което тоталният клетъчен екстракт се фракционира с полиакриламидна гел електрофореза (PAGE) върху 12,5% натриев додецилсулфат (SDS) (U. Laemli, Nature 227, 1970, 680). В сравнение с нетрансформирана контролна култура К514 един от клоновете показва високо ниво на синтеза на нов протеин с молекулно тегло 42 килодалтона (kd), идентифициран като EcoAmi (DSM) GI чрез оцветяване по Western, като се използва поликлонален серум срещу пречистен GI от Act. missouriensis. Плазмидът, отнасящ се до високопродуктивен EcoAmi (DSM) GI от E.coli К514, е определен като pLK70CI.

P_R - GI транскрибционната единица може да бъде изразена като EcoRI - Xbal фрагмент, чиято аминокиселинна последователност е дадена на фиг. 16. След елюация от агарозен гел този фрагмент се свързва и с рМа5-8 и с рМс5-8, които се усвояват с EcoRI и Xbal - рестрикционни ендонуклеази, носени съответно от pMa5-GI и pMc5-GI. Установено е, че тези вектори насочват равномерна и ефективна синтеза на EcoAmi (DSM) GI, докато нивото на експресия не се отличава съществено от тази на получения с pLK70CI.

Експресията на GI може да се увеличи по-нататък чрез промяна на GTG инициаторния кодон в ATG триплет. Това се осъществява чрез сайт-насочена мутагенеза както в пример 4, като се използва следният олигонуклеотиден праймер

5'-GGACAGACATGGTTACC - 3’

Дивият тип и мутантният GI ензими се продуцират от щам E.coli К514, култивирани на среда, композирана от 1% триптон, 1% NaCl, 0,5% дрождев екстракт и ампицилин (100 мг/1) за рМа тип вектор или хлорамфеникол (25 мг/1) за рМС тип вектор. Клетките се отглеждат цяла нощ при 37°С и след това се центрофугират. Ензимът EcoAmi (DSM) GI се пречиства както следва. Клетъчната утайка, получена след центрофугирането, се ресуспендира в минимален обем 0,05 М Трие (хидроксиметил) аминометан (Трие (НСО), 0,1 мМ СоС1₂, 10 мМ MgCl₂, 0,2 КС1, 5% глицерол и 5 мМ ЕДТА, pH 8,0 и лизозимът се добавя до крайна концентрация от 1,0 мг/мл. След престояване за 20 мин при температура 0°С, клетките се лизират с “Френска преса”, центрофугират се (30 мин при 23000 g) и супернатантата се залива с еднакъв обем от 5%-ен стрептомицинсулфат. Инкубацията се провежда при 4°С в продължение на 3 часа и се последва от центрофугиране (30 мин при 23000 g). Резултантната супернатанта се нагрява до 70°С (освен за мутантите K253Q и К100Р, които се нагряват само до 50°С) за 30 мин и отново центрофугират. Разтворимата горна фаза се довежда до 80% с амониев сулфат.

Преципитатът, който съдържа повечето от ензимната активност, се събира чрез центрофугиране, след което се разтваря в 0,02 М Трис/НС1, 5 мМ ЕДТА, 0,85 М амониев сулфат. Последващата хроматография включва Фенил-супероза. Сефакрил - 200 HP и накрая Моно - Q HR 10/10. И най-важното - добавянето на 5 мМ ЕДТА за всички буфери за хроматография е необходимо, за да елиминира металните йони. Предимно за използване резултантният ензим се диализира 3 пъти срещу 200 обема от 10 мМ триетаноламин, pH 7,2, съдържащ 10 мМ ЕДТА /крайното pH е около 5,2/ и отново срещу 200 обема от 5 мМ /2-Nморфолино/етаносулфонова киселина/ (IME), pH 6,0, с 3 буферни изменения. Металното съдържимо на крайния ензимен препарат се определя чрез атомна абсорбционна спектрометрия на Varian Spectr АА 30/40 и е установено, че EcoAmi (DSM) е свободен от метал; например, това може да се покаже като кобалтови йони, които обикновено се свързват с ензима с голям афинитет, се наброяват само в количество ± 1 х 10‘⁴ мол за мол от EcoAmi (DSM) GI мономер (когато EDTA е пропуснат в хроматографския буфер, последният се увеличава до 0,5 мол кобалт за мол ензимен мономер) . Чистотата на EcoAmi (DSM) GI се оценява чрез SDS-PAGE и сребърна реакция и също така чрез високо течностна хроматография (HPLC) на Vydac колона.

Ензимната активност на глюкозоизомеразата се изпитва както е описано (1 единица ензимна активност продуцира 1,0 микромола от продукта - Д-ксилулоза или Д-фруктоза за минута; поради което специфичната активност - ра- се изразява като единици за мг от GI ензимите).

Трифенилтетразолиумхлоридна (ТТС) проба най-напред е описана за визуализация на Д-ксилозоизомеразите на дискова електрофореза (K.Yamanaka, Bull. Yamaguchi Med. School 18, (1971) 1). Този метод се основава на реакцията на захари с тетразолиева сол за формиране на формазан при стайна температура, която реакция е специфична за кетоза на стайна температура, като алдозата реагира само при 100°С. Върху гелове, активната ксилозоизомераза може по този начин да се идентифицира като розово-червена ивица. С малки модификации този тест за активност бе адаптиран за използване във Фармация Фаст

Систем. По-специално, следвайки електрофорезата, нативният PAGE гел се пренася във Фаст Систем - оцветяваща камера и се инкубира за 15 мин при 50°С в 20 мМ Трис/НС1, pH 7,2, с 50 мМ ксилоза, 10 мМ MgCl₂, 0,1 мМ СоС1₂- След промиване с деминерализирана вода 0,5 мин при 4°С гелът се потапя за 3 мин при 20°С в трифенил-тетразолиумхлорид, изготвен прясно в IN NaOH. Реакцията се преустановява чрез инкубация на гела в 2N NC1 за 15 мин при 20°С, а финалното промиване става във вода (0,5 мин при 4°С).

GI активността може също да се изпита директно чрез директно измерване на увеличението на абсорбцията при 278 нм на ксилозата, продуцирана при 35°С чрез изомеризация на ксилоза чрез ксилозоизомераза. Това изпитване се осъществява в 50 мМ триетаноламино буфер, pH 7,5, съдържащ 10 мМ MgSO₄, в присъствието на 0,1 М ксилоза. Крайната концентрация на глюкозоизомеразата в пробата е ± 0,01 мг/мл и е точно детерминирана по-рано в пробата от ензим на смес чрез абсорбционна спектроскопия, като се използва екстинционен коефициент от 1,08 при 278 нм за разтвор от ензима от 1,0 мг/мл.

В Д-сорбитол дехидрогеназната двойна проба ензимното определяне на Д-ксилулозата се осъществява при 35°С както е описано (Kersters-Hilderson et al., Enzyme M. Techn. 9, 1987, 145), в 50 мМ триетаноламин, pH 7,5, 10 мМ MgSO₄ и 0,1 М ксилоза, в присъствието на ± 2 х 10 ’ М Д-сорбитол дехидрогеназа (L-идитол: NAD оксидоредуктаза, Е.С 1.1.14), и 0,15 нМ NADH, като освен това инкубационният буфер включва също 1 мМ етиленебис /оксиетиленнитрило/тетраацетат (EDTA). Крайната концентрация на глюкозоизомеразата в тази проба е ± 2,5 х 10'³ мг/мл и е точно определена както е описано.

С глюкоза като субстрат GI активността може да бъде изпитана чрез измерване на Д-фруктозата, продуцирана по време на изомеразната реакция, като се използва цистеинкарбазолният метод (ССМ), основаващ се на реакцията на кетозахарите с карбазол в киселини за получаване на пурпурен продукт (Dische and Boreufreund, 1951).

Пример 2. Кинетика на температурната инактивация на EcoAmi (DSM) GI

Експериментите относно кинетиката на температурната инактивация се осъществяват върху свободна от метал глюкозоизомераза с добавки, специфични за всеки отделен случай. Пречистеният ензим се еквилибрира в описания буфер и разтворът се изтегля в Хамилтонов газонепроницаем шприц с тефлонова игла, която предварително е държана в стъклена мантия, свързана с водна баня (Lauda, RM6) при посочената температура. Предишни експерименти са показали, че температурната еквилибрация на ензимния разтвор от 25 до 85°С е достигната за по-малко от една минута. В подходящо време количествата се въвеждат в епруветки на Епендорф и процесът на температурна денатурация се потиска чрез охлаждане на пробите до 0°С.

В противовес на това големи проби се инкубират като индивидуални количества в Reacti - Vlais (Pierce).

1. Температурна и метална зависимости.

Кинетиката на инактивация чрез загряване на EcoAmi (DSM) GI в 50 мМ /3-/N-Mopфолино/-пропансулфонова киселина/ (MOPS), pH 7,2 при 25°С / рК_а - 7,15 при 25°С; оН /°C - -0,001/, като функция на температурата е илюстрирано на фиг.1 (без добавяне на метал), и на фиг.2 (+10 мМ MgSO₄) и фиг.З (+10 мМ СоС1₂). Всички точки от данните забележително добре посват на теоретичната крива, кореспондираща на първичния процес, независимо от прилаганата температура и от присъствието или природата на металните йони. Данните също демонстрират стабилизационният ефект на магнезиевите и дори на кобалтовите йони.

Ензимната инактивация чрез топлина е необратима, и съответно, загряването индуцира протеинова агрегация. В присъствието на Mg²⁺ се установи, че загубата на ензимна активност много добре корелира с нарастването на преципитацията на протеина.

Фиг.4 сумира данните от фиг. 1,2 и 3 и показва, че в използваните температурни интервали участъкът на Арениус е линеарен, независимо дали има или няма метали.

Тези резултати показват, че термичната денатурация на EcoAmi (DSM) GI се поражда от единично събитие при всички изпитани условия. Не е известно дали същата лимитираща стъпка се преодолява в присъствие или в отсъствие на метали, но линеарността на участъка на Арениус потвърждава схващането, че тази стъпка е уникална при специфичните ек спериментални условия.

2. pH и зависимост от йонната сила.

Афинитетът на GI стабилизиращите метали е в силна зависимост от pH, в частност влиянието се изразява в значително намаляване под pH 6. Поради това влиянието на pH върху термостабилността на EcoAmi (DSM) GI се изследва, като се използват свободни от метал ензими в отсъствие на допълнително добавяни метали.

В pH интервала от 4,7 до 8,3 инактивацията на EcoAmi (DSM) GI при 72°С винаги следва първичната кинетика. Фиг.5 показва, че константата на инактивация К_д остава практически неизменна между pH 5,5 и 6,7, но се увеличава на всяка страна от този pH интервал.

Фиг.6 демонстрира, че кинетиката на топлинна инактивация на ензима при отсъствие на добавен метал е увеличена като функция на йонната сила. Това и данните за pH зависимостта силно индикират, че полярните остатъци са включени в термичната стабилност на EcoAmi (DSM) GI.

Това условие е основано по-нататък на данните от фиг.7, където е показано, че умереното увеличение на pH (т.е. 6,7 до 7,6 при 72°С) забележително усилва дестабилизационния ефект на натриевия хлорид.

3. Ефекти на уреята и цианата.

GI е тетрамер, направен от четири идентични субединици (F. Rey et. al., ibid.).

Влиянието на уреята и цианата се изследва в опит за идентифициране структурните изменения, които могат да се изброят за загубата на ензимна активност като резултат от нагряване, т.е. дисоциацията на субединиците и/или разгъването.

Състоянието на олигомеризация на ензима се анализира чрез високотечностна хроматография (SEC - HPLC) върху Супероза-12 при стайна температура, като се използва елюационен буфер, съдържащ 50 мМ Трис/НС1, pH 8,0 при температура 25°С и 150 мМ NaCl, следвайки пролонгирана инкубация на ензима в 7М урея при стайна температура.

Нативният GI е показан да елюира като тетрамер на SEC-HPLC.

Фиг. 8 показва, че пролонгираната инкубация на урея е необходима да индуцира дисоциацията на нативния EcoAmi (DSM) GI тетрамер в димери.

Докато за цианата е известно, че е получен от урея в разтвор, спекулираше се с това, че химичната модификация на ензима с цианат би могла да бъде подходяща за наблюдаване на дисоциация на субединиците.

За изпитване на тази хипотеза ензимът се инкубира за 16 до 24 дни при стайна температура в 0,2 М борат, pH 8,5 и 150 мМ NaCl, съдържащ концентрация на цианат в интервала от 0 до 200 мМ и този в отсъствие или присъствие на прясно приготвен 5,0 М цианат, свободен от урея (прясно приготвеният разтвор на 10 М урея в Мили-Q вода се прекарва през колона от AC 501-Х8 /Д/ смола /BioRad/ съгласно препоръките на производителя. Това третиране елиминира йонните контаминанти между които цианат).

Направени са следните наблюдения:

1. Третирането с цианат (единствено) не променя елюационният профил на EcoAmi (DSM) GI върху SEC-HPLC (фиг. 9а). Нативният PAGE изявява зависимостта на химическата модификация на ензима от дозата като очевидна от увеличението на негативния заряд (фиг. 9В, горната ивица), но без очевидна загуба на ензимна активност, както е показано чрез ТТС-оцветяване на гела (фиг. 9В, долната ивица).

След 16 дни от инкубацията на EcoAmi (DSM) GI в 5,0 М цианат, свободен от урея, не се изявяват димерни формации чрез SECHPLC (фиг.ЮА). Някои димер-димерни дисоциации обаче са наблюдавани след нативна PAGE (фиг.ЮВ, горната ивица, 0 мМ NaCNO), като се предполага, че при използваната концентрация на урея, 5 молно генерирал цианат, който е индуцирал малка химическа модификация, която същевременно индиректно води до тетрамерна дисоциация, отслабена, димерната асоциация може да доведе по-нататък под влияние на електричното поле, приложено по време на PAGE, до едно удължаване на дисоциацията.

3. Едновременното добавяне на цианат към EcoAmi (DSM) GI в 5,0, доведена с лекота от тетрамер до димерна дисоциация в концентрационно зависима форма. Това е демонстрирано едновременно със SEC-HPLC данни (фиг. 10) и с нативна PAGE (фиг.ЮВ, горна ивица). Задържането в PAGE на димера след инкубация при висока концентрация на цианат е с цел да резултира от едно увеличава що се разгъване на ензима при тези условия. Върху нативна PAGE димерите не показват GI активност след ТТС-оцветяване (фиг.ЮВ, долната ивица). Това предполага, че ензимната активност е загубена при GI-тетрамерната дисоциация в димери и/или вследствие на химичната модификация.

В заключение, присъствието на цианата и на уреята се препоръчва за изследване на EcoAmi (DSM) GI тетрамерната дисоциация в димери. Докато цианата самостоятелно е неефективен, химически модифицираните аминогрупи, включени в стабилизацията на тетрамерната структура на ензима, са недостъпни за разтворители в отсъствие на урея. Вероятно уреята дестабилизира димер/димерното взаимодействие като чрез това се излагат аминокиселините предварително вътре в димер/димерните интерфази. Тези остатъци, носещи едновременно алфа и/или епсилон аминогрупи, по този начин стават подходящи за карбонизация с цианат. Обратно, ковалентно прикачените от цианата за интерсубединиците контактни остатъци стабилизират димерните форми на ензима. Поради това може да се преположи, че дисоциацията на EcoAmi (DSM) GI тетрамерите в димери е може би едно от главните събития при термоденатурацията. В потвърждение на тази хипотеза може да се наблюдава, че висока концентрация на протеин стабилизира ензима срещу термична денатурация (данни не са показани).

4. Гликация.

Показано е, че протеините са подложени на гликация, т.е. неензимна модификация на алфа и епсилон-аминогрупи чрез гликоза на няколко други захари. Предположено беше, че при условията на приложение (висока концентрация на глюкоза, pH 7,5 и пролонгирано използване) гликацията на EcoAmi (DSM) GI трябва да се появи, в частност, ако EcoAmi (DSM) GI тетрамерната дисоциация в димери се осъществи при висока температура, предвижда се същите аминокиселинни остатъци, реагиращи с цианат в присъствието на урея, да бъдат гликирани с контаминанти от дисоциираните тетрамер-димери при вероятна загуба на каталитична активност.

Свободният от метал EcoAmi (DSM) GI се инкубира в отсъствието на Магнезиум при 60°С без или с Д-глюкоза (250 мМ) в 50 мМ МОР, pH 7,7 при 60°С. В подходящо време количествата се изтеглят, охлаждат се до 25°С и се тестуват за остатъчна ензимна активност чрез директна ксилулозна абсорбция при 278 нм.

Фиг.11, ивица А, показва, че присъствието на глюкоза забележимо увеличава степента на термичната инактивация на ензима при 60°С. Този ефект е необратим при широка промяна на буфера срещу 50 мМ ME, pH 6,0, при 4°С, и не може да възстанови каталитичната ефективност на EcoAmi (DSM) GI (триъгълниците на фиг.11, ивица А). Освен това, анализът на реакционните продукти с SECHPLC ясно показва, че както бе предположено, гликацията се съпровожда от тетрамер до димердисоциация, зависеща от времето (фиг.11, ивици С и В), факт, потвърждаващ схващането, че тетрамерните разединявания стават при висока температура. Дисоциираните димери са уловени от ковалентна модификация с глюкоза от реактивните аминогрупи, съжителстващи в интердимерни контакти.

Фиг.11, ивица Д, показва, че нагряването също предизвиква формиране на протеинови агрегати, които имат големината на хексадекамера на EcoAmi (DSM) GI ( ± 700 килодалтона, т.е. четири GI тетрамерни молекули) . Тези агрегати особено се увеличават в присъствие на глюкоза. Не е известно как и дали агрегационните формации се появяват в зависимост от или само съгласувано с GI дисоциацията в димери.

Сходни резултати могат да се получат в различни буферни системи, 12,5 мМ натриев фосфат, pH 7,7 при температура 60°С.

Присъствието на урея е необходимо цианатът да продуцира стабилни GI димери тогава, когато глюкозата проявява същите свойства при висока температура в отсъствие на урея. Ето защо може да се заключи, че и двата случая - урея и нагряване, причиняват дисоциация на EcoAmi (DSM) GI тетрамерите в димери, чрез което се изявяват аминокиселините остатъци, локализирани в интердимерното пространство между тях преди недостъпните аминогрупи стават подходящи да реагират с цианат или глюкоза, като по този начин улавят ензима в димерно състояние.

Пример 3. Идентификация на лизиновите остатъци в пространствата между субединиците на глюкозоизомераза от Actinoplanes missouriensis.

GI е тетрамер, състоящ се от четири идентични субединици (А, В, С и D) (Rey et al., ibid), които могат да бъдат изявени като комбинация от два димера (АВ и CD). Така може да се определят две категории от интерфазни пространства между субединиците - интерфази между мономерите вътре в димера (интрадимерна интерфаза) и интерфазата между два димера (интердимерна интерфаза).

Счита се, че остатъкът взима участие в контактите с интерфазното пространство между субединиците, ако неговата достъпна област от повърхността (ASA_s) (В. Lee and F. Richards, J. Mol. Biol. 55/1971/ 379), предназначена в изолираната субединица, се различава от тези, определени в олигомера. Таблица 2 сумира ASA_s за двадесетте субединици с лизинови остатъци в изолиран мономер и в GI тетрамера.

Таблица 2

К	ASA,	AS Ат
10	65,4	65,4	0,0
42	52,6	52,6	0,0
76	77,1	77,1	0,0
100	142,4	142,4	0,0
100	150,0	0,8	149,2
118	17,9	6,8	11,1
132	147,4	147,4	0,0
149	8,0	0,1	7,9
239	167,0	167,0	0,0
240	19,2	18,1	1,1
253	111,5	1,5	110,0
294	51,5	28,7	22,8
309	93,2	93,2	0,0
319	30,0	30,0	0,0
323	83,0	83,0	0,0
339	78,0	50,3	27,7
344	178,1	125,8	52,3
375	132,0	119,2	12,8
381	114,2	67,7	46,5

Наблюдавано е, че единадесет от тези остатъци взимат участие в интерфазните пространства между субединиците. Само LYS-100 и LYS-253 загиват в екстензивна област (149 А² и 110 А², респективно) в интерфазните субединици и загиват напълно в тетрамера, т.е. и двата остатъка имат ниска способност за разтваряне в тетрамера. Нито един остатък обаче не е причастен в каталитичната активност на EcoAmi (DSM) GI. По-нататък LYS-100 и LYS-253 са включени в електростатично взаимодействие в интерфазните субединици. LYS100 в S-субединица (A-LYS-100) се стабилизира чрез хидрогенно свързване на последното обръщане на малка близка позиция 373 в В-субединицата. LYS-253 в А-субединицата (A-LYS-252), от друга страна, е включена в йонен интердимерно взаимодействие с ASP190 от С-субединицата. Като се използва модела за строителна техника (както са описани в P.Delhaise et. al., J. Mol. Graph. 3, 1984, 116), се изследва, че обкръжението от LYS-100 не е с цел да подпомогне заместването на ARG, където мутацията на LYS-253 до ARG би била възможна, т.к. не се проявиха лоши физични контакти и йонните взаимодействия с ASP-190 остават благоприятни.

Друг лизинов остатък К294, е локализиран при димер-димерната интерфаза, но е само частично елиминиран в тетрамера (достъпна повърхностна област 22,8 А²). Този остатък стриктно е запазен във всички глюкозоизомерази на Actinomycetes (вж. пример 10 и фиг.21), при това К294 взаимодейства само с N247 и Д257 - и двата включени в метална връзка. К294 по този начин ще въздейства на стабилността на глюкозоизомеразата по различни механизми.

Пример 4. Аминокиселинни замествания на специфични лизинови остатъци в глюкозоизомераза от Actinoplanes missouriensis.

Съгласно изобретението заместването на LYS-253 с аргинин би стабилизирало електростатичното взаимодействие през димер-димерната интерфаза и поради това би увеличило стабилността на EcoAmi (DSM) GI срещу термично въздействие. Нещо повече, това заместване би предотвратило химичната модификация (чрез глюкозоцианат) в позиция 253.

За да се оцени важността на електростатичното взаимодействие на A-LYS-253/CASP-190 йонни двойки в термична стабилност на EcoAmi (DSM) GI, LYS-253 се променя в глутамин, за да елиминира йонният характер на лизиновата част от веригата, като тази мутация съществува в други отношения умерено стабилно.

Сайт-насочената мутагенеза е представена съгласно метода на пропуснатите дуп лекси ДНК (gdDHA), като се използват рМа5-8 и рМс5-8 като плазмидни вектори (Р. Stanssens et al., ibid.). Докато методиката за мутагенезата препоръчва използването на уникални рестрикционни сайтове нагоре и надолу от областта да се подлагат на мутагенеза, сега се въвеждат два допълнителни слепващи сайта в GI кодиращата последователност без противопоставяне на кодираната аминокиселинна последователност. Сайтът ΚρηΙ е създаден чрез изменение на нуклеотидните бази от G при позиция 177 в А, като се използва следният олигонуклеотиден праймер:

5-CGAAGGGTACCAGG-3’

Сайтът Xhol е създаден чрез заместване на С за G при позиция 825, като се използва следният олигонуклеотиден праймер:

5-GCCGTTCTCGAGGAGGTCG-3'

Конверсията на GTG в ATG кодон (вж. пример 1) и създаването на Kpnl сайта се завършва в единичен мутагенезисен експеримент, в който релевантните ензимно фосфорилирани олигонуклеотиди се ренатурират в gdДHK, получена от едноверижния pMc5-GI и дългия BamHI-Aatll фрагмент от pMa5-GI.

Xhol сайтът е въведен чрез отделен експеримент. Използваната gdAHK е конструирана от едноверижните pMc5-GI и дългия Sacl-Smal фрагменти на pMa5-GI. Трите мутации са комбинирани в единичен ген чрез съчетаване на подходящи фрагменти от дубълмутанта и Xhol мутанта. Резултантният утроен мутант е обозначен като рМа-1. Комплементарният рМс5-1 е конструиран чрез инсерция на малкия EcoRI-Xbal фрагмент от рМа5-1, съдържащ P_R-GI хибридния ген, между EcoRl и Xbal сайтове на рМс5-8.

рМа5-1 и рМс5-1 са базични вектори, използвани за продуциране на двата вида глюкозоизомерази - дивият и GI. Във всички сайтнасочени мутационни експерименти, описани по-нататък, са използвани gbAHK, създадени от едноверижната форма рМа5-1 и подходящ фрагмент на рМс5-1.

1. Лизин - 253 -----> глутамин

За конструиране на gdflHK са използвани големият Sacl-Xhol фрагмент на рМс5-1 и олигонуклеотидният праймер

5'-CCTGGTCGAACTGCGGGCCG-3'.

Мутантният ензим се експресира добре; специфичната активност, като се използва ксилозата като субстрат, е 96% спрямо дивия тип EcoAmi (DSM) GI (таблица 3).

Температурната инактивация при 72°С в 50 мМ MOPS, pH 7,4 при 72°С, в отсъствието на метал, свързана предимно с кинетиката, показва, че мутацията, провокира увеличаване на константата за денатурация от 1,4.10 ² мин’¹ за дивия тип за K253Q (фиг. 12, ивица А). В присъствието на 10 мМ MgSO4 при 85°С в 50 мМ MOPS, pH 6,5 при 85°С (фиг. 12, ивица В) преди всичко константата на разпадане има стойност от 1,2 мин·¹ за K253Q, около 350 пъти повече от дивия тип ензим (Кд = ЗЛ.Ю^/минг¹).

Анализът на олигомерната структура на K253Q ензима чрез хроматография показва интактен тетрамер. Пролонгираната инкубация в 5 молна, свободна от цианат, урея в 0,2 М борат, pH 8,5, 0,15 М NaCl обаче демонстрира, че K253Q мутантът охотно се дисоциира в димери както на фиг. 13, ивица А и фиг. 13, ивица В, сумиращи данните, показващи прогресиращата крива за димерна формация за дивия и мутантния тип ензими. Данните показват дисоциацията на тетрамерите в димери в мутантния ензим, но не и за дивия тип ензим.

Описаните експерименти демонстрират структурната основа на стабилността на EcoAmi (DSM) GI молекулата. Специфичното противопоставяне на остатъка К253 на глутамина показва температурната чувствителност, а така също и чувствителността към урейна мутация, и последователно идентифицира локуса на важните (есенциални) взаимодействия. Установена е пълна корелация между чувствителността на мутанта към температурна инактивация и размера на тетрамерната дисоциация в димери, получена с урея при стайна температура.

2. Лизин ------> аргинин

За конструиране на gdflHK големият Sacl-Xhol фрагмент на рМс5-1 се съчетава със следния олигонуклеотиден праймер:

5'-CCTGGTCGAACCGCGGGCCG-3'.

Мутантът на EcoAmi (DSM) GI, K253R, се експресира добре и показва ензимна активност 120% спрямо дивия тип при ксилоза за субстрат (табл.З).

Термостабилността на този мутант се тестува в 50 мМ /N-2-хидроксиетилпиперазин-М’-2-етансулфонова киселина/ ЕРР, pH 7,5, 5 мМ MgSO₄, в температурен интервал от 82 до 92°С. Таблица 4 показва времето за редуциране на ензимната активност до 50% за K253R и дивия тип ензими. Резултатите показват, че над този температурен интервал K253R е по-стабилен от дивия тип ензим.

За оценка на стабилността на мутанта К253Р по отношение инактивацията на глюкоза при висока температура двата ензима се инкубират в присъствието на 250 мМ Д-глюкоза при 60°С в 12,5 мМ Na-фосфатен буфер, pH 7,7. Времето за инактивация, показано на фиг. 14, е около 70 часа. Данните ясно демонстрират повишената протективност срещу инактивационната необратима химична модификация, постигната в К253 мутанта.

Като негативен контрол LYS-100 бе изменен в аргинин, като в този случай се очакваше, както е отбелязано, лошото акомодиране на остатъка да намалява стабилността, но без да въздейства на активността.

3. Лизин-100 ---> аргинин

За конструиране на gdAHK са използвани големият KpnI-Aatll фрагмент от рМс5-1 и олигонуклеотидният праймер

5-CCGCCGTCCCGGAACACCGG-3'.

Специфичната активност на K100R GI е 22 единици за мг, като се използва ксилоза за субстрат. Това е сравнимо с активността на дивия тип EcoAmi (DSM) GI (24,5 единици за мг). Температурната инактивация на този мутантен ензим преминава около 100 пъти по-бързо с К_д - 0,3 мин¹, в 50 мМ EPPS, pH 7,5 при 84°С, 5 мМ MgSO₄.

4. Лизин-294---> аргинин

За конструиране на gdДHK са използвани големият Xhol-Smal фрагмент от рМс5-1 и олигонуклеотидният праймер

5'-GGGACGGCCGGTACTCGAAG-3'.

Мутантът на EcoAmi (DSM) GI, K294R, добре се експресира и показва ензимна активност, която е 85% от тази на дивия тип с ксилоза за субстрат (табл.З).

Термостабилността на този мутант се тестува в 50 мМ /N-2-хидроксиетилпиперазин-1Ч’-2-етаносулфонова киселина/ (EPPS), pH 7,5, 5 мМ MgSO₄, в температурен интервал от 82 до 92°С. Времето за редуциране на ензимната активност на 50% е изложена на табл.4. Резултатите посочват, че над този температурен интервал K294R има приблизително същата стабилност както дивия тип ензим.

Таблица 3

Каталитични параметри на дивия тип (WT) и мутантния EcoAmi (DSM) GI с всяка Д-ксилоза (двойна проба) или Д-глюкоза като субстрати

S^ - специфична активност в микромолове от продукта (Д-ксилоза или Д-фруктоза) за минута/ единица, за милиграм от ензима

V_Mx е изразено в единици за мг от ензима

К_м е константата на Михаелис, изразена в мМ

Г4Д - не е определена

	Ксилоза	V max	к»	V tax	Глюкоза κ.
WT-GI	24,5	24,2	4,8	34,8	290
V	30,0	24,6	5,3	27,2	177
κΜ3ο	23,0	15,1	4,4	29,2	210
KiooR	22,2	ВД	ΝΛ	ΝΛ	Nfl
k294r	20,5	13,8	4,5	25,8	187
θ70^’ ^73^ > θ7<Τ	28,0	24,9	5,3	39,2	235

Таблица 4

Инактивация на дивия тип и конструираните мутанти глюкозоизомераза в 50 мМ EPPS, pH 7,5 при 84°С, 5 мМ MgSO₄

Температура 0°С	82	84	86	88	90	92
WT-GI	11,85	3,80	1,07	0,25	0,080	0,032
V	17,65	4,17	1,11	0,32	0,094	0,037
k2Mr	9,39	1,57	0,43	0,14	0,056	ΝΛ
G70S; A,3S; G74T	22,88	4,83	1,21	0,31	0,093	0,032

Пример 5. Стабилизация на глюкозоизомераза чрез мутация вътре в мономера I.

Въпреки че мутациите, които могат да подобрят стабилността на мономерната субединица, с оглед на пример 2 не са особено подходящи да предизвикат тетрамерна стабилност на глюкозоизомеразата, са осъществени някои мутации в тази насока. Три остатъка от спиралата В на 8-верижния /З-ствол на глюкозоизомеразния мономер се подлагат на мутация с цел да се стабилизира тази α-спирала и индиректно да се стабилизира мономерът. Глицин 70 се изменя в Серин, Аланин 73 се изменя в Серин и Глицин 74 - в Треонин.

За конструиране на gdflHK големият KpnI-AatN фрагмент от рМс5-1 се комбинира със следния олигонуклеотиден праймер

5-GOCTTCT’rcAAGGICGGAlBATWAGTCGCGG-3

EcoAmi (DSM) GI-мутантът, G,_o; A₇₃; G₇₄T добре се експресира и неговата специфична активност става 28 единици за мг (115% от дивия тип) с ксилоза като субстрат (табл.З).

Термостабилността на този мутант се тестува в 50 мМ /N-2-хидроксиетилпиперазинN-2-етансулфонова киселина/ EPPS, pH 7,5, 5 мМ MgSO₄, при температурен интервал от 82 до 92°С. Времето за редуциране на ензимната активност до 50% за G₇₀; A₇₃S; G₇₄T са изброени на таблица 4. Резултатите показват, че над тази температура и при използваните условия G₇₀; A_?3S; С₇₄Т са по-стабилни от дивия тип ензим и от мутанта K^R.

Пример 6. Получаване и пречистване на дивия и мутантния тип глюкозоизомераза от A. missouriensis за тестуване.

За получаване на глюкозоизомераза от A. missouriensis чрез използване на E.coli се използва експресионна единица от рМа вектор.

Трансформантите на глюкозоизомеразно дефицитен щам на E.coli (thl, thr, Leu, tonA, LacY, supE, xyLA, г_к м_к ⁺), даващи убежище на глюкозоизомеразния ген от A. missouriensis, кодиращ дивия тип протеин или описания мутантен протеин, се култивират на среда, съдържаща дрождев екстракт (4 g/1), NaCl (10 g/1), Bacto триптон (40 g/1), казамино киселини (4 g/1) и ампицилин (100 мг/1), за 16 часа при 37°С. След центрофугиране клетките се ресуспендират в минимален обем буфер, състоящ се от 20 мМ Трие, 10 мМ ЕДТА, 50 мМ глюкоза, pH 8,0. След това се добавя лизозим до крайна концентрация от 1,5 g/Ι. След инкубация при 37°С за 30 мин суспензията се загрява до 70°С за 30 мин. Суспензията се охлажда до стайна температура и се добавят MgCl₂ и DNasei до крайна концентрация 20 мМ и

1,5 мг/1, респективно, и се инкубира при 37°С още 30 минути. Клетъчните дебри се преципитират чрез центрофугиране и супернатантата се диализира срещу 50 мМ Трие (pH 7,5) за една нощ.

Пример 7. Имобилизиране на дивия и мутантния тип глюкозоизомерази.

Ензимният разтвор може да се имобилизира върху йонно изменена смола. Преди всеки експеримент йонизираната смола се регенерира с 0,5 NaCl (> 10 обема), вода (до pH 8), 10% разтвор на NaCl (10 обема) и вода (20 обема). Смолите Lewatit MP_J00A (Bayer) и Amberlite IPA 904 (Pohtn & Haas) ce избират за глюкозоизомеразна имобилизация. Адсорбцията на ензима върху тази йонно изменена смола протича с висока ефективност. Има линеарна зависимост между адсорбираното количество ензим и активността на използваната колона.

g от анионната смола (С1* форма) се поставя в 50 мл буфер (50 мМ Трие НС1 pH 7,5). Пречистената глюкозоизомераза се добавя и се оставя за свързване за една нощ при 4°С при тотален обем от 100 мл с 50 мМ Трис.НС1 буфер (pH 7,5).

Пример 8. Тестуване за използване на дивия и мутантния тип глюкозоизомераза.

Началната активност и стабилността на имобилизираната глюкозоизомераза и нейните мутанти са определени чрез измерване на степента на изкачване при 45% конверсия като функция от времето съгласно P.Van Tilburg (Thesis. Engineering aspects Biocatalysts in Industrial Starch Conversion Technology, Delftse Universitaire Pers, 1983). От това K и k. могат да бъдат калкулирани. К_о - псевдо-първична реактивна константа е мярка за ензимна активност. k_d - константа на първичното разлагане, е мярка за стабилността на ензима. Калкулацията на к_о е описана само за желатин-имобилизирана глюкозоизомераза. Експерименталните условия са следните: температура 70°С; реактор - дълбочинен тип; субстрат - ЗМ глюкоза, 3 мМ MgSO₄, 3 мМ Na₂SO₃; конверсия - 45% фруктоза; pH 7,5 (измерена при 35°С); Са : < 3 ppm. Резултатите за k_d са показани на табл.5.

Таблица 5

Константи на разлагане за дивия и мутантния тип глюкозоизомераза, имобилизирани върху различни смоли

К /х 10⁶ sec ‘/K /х 10* sec¹/

0

	Lewatit	Amberlit
Див тип	2,7	2,4
K^R	1,0	0,7
k^R	2,8	2,9
K^Q	n.o.	3,7
/G7OS;AhS;G74T/ 2,0	2,1

И дивият и мутантният тип ензими са получени, имобилизирани и пречистени съгласно примери 6 и 7.

От таблица 5 се разбира, че и двата мутанта К_МЗР и С₇₀; А₇₃; С₇₄Т имат аналогична увеличена стабилност при изпитване на 70°С. Тези резултати могат да се приведат с голяма степен на точност към резултатите, които ще бъдат получени, ако тестовете се провеждат при температура, обичайни за индустрията (R. Van Tilburg, ibid.).

Слабото представяне на мутант K_2J30 е индикация за важността на базичните остатъци при позиция 253, както вече е установено в in vitro експеримента от пример 4. Глутаминовият мутант по всяка вероятност не формира никаква хидровръзка, поради което се дестабилизира димер-димерният контакт.

Аналогично, Kj₉₄R мутантът има малко по-ниска стабилност от дивия тип ензим в съгласие с резултатите, получени в експериментите in vitro.

Резултатите показват, че увеличаване на димер-димерния интерфазен контакт в глюкозоизомеразата може да резултира в един ензим със супериорно поведение при индустриално приложение. Става ясно, че други остатъци, включени в интерфазните контакти, могат да се селекционират от всеки специалист. Остатъците, които са чувствителни на химична модификация или не показват оптимално хидрогенно свързване, могат да се заместят с други аминокиселини съгласно изобретението.

Мутациите, които са получени чрез стабилизиране на мономерните субединици, също показват позитивен ефект на тетрамерната стабилизация, както свидетелства к_о, наблюдавано за мутанта G₇₀S:A_7JS:G₇₄T.

Ако се направи опит да се рационализира този резултат, това би се осъществило чрез заместване на глициновите остатъци в една α-спирала, което може да резултира в увеличаване на ентропията на включеното състояние на протеина, поради което протеинът става по-резистентен на деспирализиране и денатурация (Proteins 1, /1986/ 43-46). За да стане това, чувствителността на глюкозоизомеразата към химична модификация (и поради това необратимо модифициран) на (частично) деспирализирания протеин би трябвало да е значително понижен, резултирайки в един термостабилен ензим. В противоположност на това, мутациите, внедрени в мутантите G^SiA^SiG^T, са по-хидрофилни по природа и поради това облагодетелстван от незащитената повърхност на спирала В. Това може също да доведе до повишаване стабилността на мономера срещу обратимо деспирализиране. Както се твърдеше по-рано, това може да понижи чувствителността на тетрамерния протеин срещу необратима денатурация.

Тези мутации могат да се представят по сходен начин във всички α-спирали на глюкозоизомеразата. Спиралните области, както са определени от ЗД структурата на A.missouriensis-ната глюкозоизомераза (F.Pey et al., ibid.), са при позиции: а 1 35-47, а 2 64-80, а 3 108-128,а 4 150-173,а 5 195-206, а 6 227-239, а 7 264-276, а 8 300-328. Заместването на глициновите остатъци, представянето на хидрофобните остатъци и представянето на Пролиновите остатъци на аминокрая на една спирала може да се види.

Конструираните мутации K_2JJR и G_7OS:A_7JS:G₇₄T повишават термичната стабилност спрямо дивия тип глюкозоизомераза. Обаче мутантът K^R проявява по-голяма активност от мутанта G₇₀S:A₇₃S:G₇₄T в теста за изпитване, в противовес на резултатите от in vitro експериментите, описани в пример 4. Това може да се види като рефлектиращо върху факта, че резултатите, получени при лабораторни условия, са само потвърждение за пред ставането на ензима в условията на приложение. Вероятно високата глйокозна концентрация, използвана при условия на приложение и процеса на гликация, които зависят от глюкозната концентрация, са решаващи за този феномен.

Пример 9. Свойства на мутантната глюкозоизомераза при различни pH стойности.

Сравнителните тестове се провеждат с мутанта K_M3R и WT А. missouriensis-на глюкозоизомераза при различни стойности на pH. Получените от K^R и WT ензими се имобилизират върху Lewatit както в пример 7 и се подлагат на изомеризационен тест както в пример 8. Условията са като от R. Van Tilburg (ibid) с глюкозен сироп при различни варианти на pH. Фиг. 18 показва k_d степените от двата ензима като функция на pH. Може да се види, че мутантът К_узР проявява увеличение на к_о при pH под 7,5 до pH 5,8. Измерванията се осъществяват най-малко два пъти. Мутантът K^R показва не само супериорно поведение в индустриални условия при по-висока температура (по-висока степен на конверсия), но и при по-ниско pH (по-добра стабилност на продуцираната фруктоза).

Пример 10. Клониране и подреждане на последователността на глюкозоизомеразните гени от други бактериални щамове.

За да се получи информация за аминокиселинната последователност от различни бактерии, гените, кодиращи глюкозоизомераза, се изолират от хромозоми на респективни бактериални молекули клонирани в E.coli.

Следните бактерии, някои от които са известни като продуценти на индустриално приложими ензими, се селекционират за тази цел:

- Arthrobacter species

- Streptomyces violaceoruber LMG 7183

- Streptomyces thermovulgaris DSM 40444

- Streptomyces murinus DSM 40091

- Ampullariella species ATCC 31351 Хромозомната ДНК за всички видове, които са отбелязани, са изолирани и пречистени както е описано от Hopwood (ibid).

За Arthrobacter, S.violaceoruber и Ampullariella, частично усвоени с рестрикционни ендонуклеази Sau3AI и клонираните резултантни фрагменти в E.coli, са представени точно както е описано за A.missouriensis в пример 1. Хромозомната ДНК от Str. murinus и S.ther movulgaris е усвоена напълно с PstI, последвано от свързване в pECOR^ както в пример 1. Колониите, съдържащи този глюкозоизомеразен ген, се проверяват чрез колонийна хибридизация, като се използва 712 вр MIuI рестрикционен фрагмент от A.missouriensis глюкозоизомеразен ген или 853 вр рестрикционен фрагмент, локализиран вътре в Str.violaceoruber глюкозоизомеразен ген.

Рекомбинантните плазмиди, съдържащи глюкозоизомеразни гени от различни бактерии, след това се охарактеризират чрез рестрикционно картиране както е описано за глюкозоизомеразния ген от A.missouriensis. Анализът на нуклеотидната последователност на протеинкодиращия регион е представен чрез химичен метод, създаден от Махат и Gilbert (ibid).

Клоновете, съдържащи гена на глюкозоизомеразата от Str. thermovulgaris, не е установена - установена е само кодиращата последователност до аминокиселина 346 (еквивалентна на позиция 351 от глюкозоизомеразния ген на A. missouriensis).

Аминокиселинната последователност от Ampullariella sp. глюкозоизомераза се различава от публикуваната последователност по това, че е установено, че пролин 177 от публикуваната последователност е аргинин.

Резултатите от този пример са сумирани на фиг.21 и аминокиселинните последователности, получени от установените нуклеотидни последователности, са построени така, че да покажат максимално общата хомология.

Пример 11. Експресия и мутагецезис на глюкозоизомераза от Ampullariella.

За експресия на глюкозоизомераза от Ampullariella sp. в E.coli са използвани експресионни единици, доказано подходящи за глюкозоизомераза от A.missouriensis. Фактически експресионният вектор на A.missouriensis се изменя, като се използват рестрикционни фрагменти от Ampullariella sp. глюкозоизомеразен ген, покриващ целия нуклеотид и проявяващ аминокиселинни различия в кодиращите региони на два гена - дуплексната молекула е формирана с участието на едноверижна ДНК от рМа-I и 4107 вр фрагмент BstEll/Ncol от рМс-I, от 124 вр BstEll/ApaLI фрагмента и 1059 вр ApaLI/BssHII фрагмент, като последните два фрагмента са получени от Ampullariella sp. глюкозоизомеразен ген. Процесът протича както в пример 1, като се включва възстановената нуклеотидна последователност, детерминираща гена за проверка с цел нежелани включвания. Така е намерен верният плазмид и е наречен рМс-Шамр1.

Сравняването на аминокиселинните последователности показва, че Ampullariella глюкозоизомеразата както и A.missouriensis глюкозоизомераза съдържа лизинов остатък при еднакви позиции 253. Поради това мутантната Ampullariella глюкозоизомераза, където лизин /К/ при позиция 253 се заменя с аргинин /R/, се генерира, като се използва дуплексната молекула, формирана от присъединяването на едноверижната рМс-Шамр1ДНК с BamHI/ Hindlll усвоена pMa-GIaMpl и фосфорилиран мутагенетичен олигонуклеотид 5-AGGTCXrrGGT(XAA(XGCGGGCCGTGCrGG-3'

Процесът след присъединяване, т.е. селекция и анализ на получения мутант, е представен точно както в пример 1.

Пример 12. Експресия и сайт-насочена мутагенезис на глюкозоизомераза от Str. murinus.

Експресията на глюкозоизомеразния ген от Str. murinus се постига чрез поставяне на гена надолу в Тас-промотора на плазмида рМаТ5. рМаТ5 се получава от плазмида рМа5Р_р, в който ламбда-промоторът е заместен от регулаторен Тас-промотор (Н. de Boer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60 /1983/, 21). Структурата на този експресионен вектор е показана на фиг.15а/с.

Рестрикционният фрагмент 1280 вр BstXI/Mlul, съдържащ пълния Streptomyces murinus глюкозоизомеразен ген, се третира с ДНК полимераза I (Кленов фрагмент) за превръщане на свързаните фрагменти в слепи краища и последователно свързани в pLIC₁₉. След това генът се изрязва, като се използват рестрикционните ендонуклеази BamHI и Hindlll, и се включва в BamHI/Hindlll - усвоения рМс5Т. Полученият плазмид е наречен рМсGlsmul. Нуклеотидът и получената аминокиселинна последователност на Str.murinus глюкозоизомераза и структурата на експресионната единица са показани на фиг.19 и 20, респективно.

При това S.murinus глюкозоизомеразата има лизинов остатък в протеиновата последователност при позиция 253, еквивалентна на

К_мз в A.missouriensis. Мутацията, получена в резултат от заместване на лизин 253 /К/ с аргинин /R/ в Strept. murinus глюкозоизомераза, е представена с използването на дуплексна молекула, състояща се от едноверижна рМс-CI м 1 ДНК, BamHI/Hindlll усвоен рМа5Т и фосфорилиран мутагенетичен олигонуклеотид 5’-GGTCCTGGTCGTACCGGATGCCGGACTGG-3'

Процесът, следващ етапа на присъединяване, т.е. селекцията и анализа на получения в резултат мутант, е представен както е описано в пример 1.

Изобретението не трябва да се ограничава до предложените и пояснени мутации. Освен това в някои детайли изобретението е описано чрез илюстрации и примери с цел яснота и разбираемост, като би било нормално в практиката да се направят някои изменения и модификации, които да не излизат от обхвата на приложените претенции.

Claims (13)

1. Патентни претенции

   1. Мутантен глюкозоизомеразен ензим, получен чрез експресия на ген, който го кодира, и притежаващ аминокиселинна последователност, различаваща се най-малко по една аминокиселина от дивия тип глюкозоизомераза, който мутантен глюкозоизомеразен ензим се характеризира с това, че проявява подобрени свойства съгласно описанието.
2. 2. Мутантен глюкозоизомеразен ензим съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че за разлика от природно получената глюкозоизомераза или мутантната, проявяваща същата основна биологична активност, има най-малко един аминокиселинен остатък (заместен аминокиселинен остатък), който е аргинин вместо лизин както в природния продукт или мутантния, или е лизин вместо аргинин в природно добитата глюкозоизомераза или мутантната, в местонахождението на природно добитата глюкозоизомераза, който може буквално да съгласува заместването на аргининовия остатък на мястото на лизиновия или обратно - на лизиновия остатък с аргининов без съществено изменение на биологичните свойства, и който обладава природно получената глюкозоизомераза.
3. 3. Мутантен глюкозоизомеразен ензим съгласно претенции 1 или 2, който е мономе рен ензим, включващ най-малко две области, или олигомерен ензим, включващ най-малко две субединици, част от тях или всички, от които може незадължително да съдържат области, и където посочените области или, ко- 5 гато е подходящо, субединици, включват сайтове за ниска способност към разтваряне, като някои от тези сайтове включват аминокиселинни остатъци, които встъпват в електростатично взаимодействие с други аминокиселинни остатъци от други сайтове, характеризиращ се с това, че този сайт, който съдържа посочения заместен аминокиселинен остатък, съвпада с един от тези сайтове за ниска способност към разтваряне.
4. 4. Мутантен глюкозоизомеразен ензим съгласно която и да е от претенции от 1 до 3, който е получен от Actinoplanes missouriensis.
5. 5. Мутантен глюкозоизомеразен ензим съгласно която и да е от претенции от 1 до 4, в който аминокиселинната последователност на посочената глюкозоизомераза показва най-малко 65% хомология с аминокиселинната последователност на глюкозоизомеразата, получена от дивия щам Actinoplanes missouriensis.
6. 6. Мутантен глюкозоизомеразен ензим съгласно която и да е от претенции от 1 до 5, получен от Actinoplanes missouriensis в който Lys 253 е заместен с Arg 253 и/или Gly 70 от Ser 73 и/или Ala 73 от Ser и/или Gly 74 от Thr.
7. 7. Мутантен глюкозоизомеразен ензим съгласно претенция 6, в който най-малко Lys 253 е заместен от Arg 253.
8. 8. Мутантен глюкозоизомеразен ензим съгласно претенция 6, в който най-малко Gly 35 70, Ala 73 и Gly 74 са заместени със Ser, Ser и Thr, респективно.
9. 9. Мутантен глюкозоизомеразен ензим съгласно която и да е от претенции от 1 до 8, проявяващ повишена термостабилност при стандартните условия по описанието, в сравнение с кореспондиращия див тип ензим (природен ензим).
10. 10. Мутантен глюкозоизомеразен ензим съгласно която и да е от претенции от 1 до 9, проявяващ повишена стабилност при различни pH стойности в сравнение с кореспондиращия див (природен) ензим.
11. 11. Имобилизирана глюкозоизомераза, включваща мутантен глюкозоизомеразен ензим съгласно която и да е от претенции от 1 до 10.
12. 12. Използване на мутантна глюкозоизомераза съгласно която и да е от претенции от 1 до 11 за получаване на фруктозен сироп.
13. 13. Метод за получаване на мутантен глюкозоизомеразен ензим, получен от начална глюкозоизомераза, имаща същият вид биологична активност със съпровождащ модулаторен ефект на стабилност, сравнено с началната глюкозоизомераза, съгласно който началната глюкозоизомераза е избрана между тези, които първоначално обладават лизинов остатък или един аргининов остатък, локализиран при сайта, който може да съгласува заместването на аргининовия остатък с лизинов или обратно, без съществено изменение на биологичната активност на началната глюкозоизомераза, и който метод включва заместване на аргининов остатък за посочения инициален лизинов остатък или обратно на лизинов остатък за посочения инициален аргининов остатък.