JPH03501565A - 蛋白質の安定性を制御する方法及び手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質の安全性を制御する方法及び手段本発明は、蛋白質工学の分野に関係し、 蒼白質工学技術を用いて蛋白質の特定の部位における一以上のアミノ酸置換によ り、好ましくは熱変性及び／又は化学的変性に対する変性された安定性を有する 新規蛋白質を作る方法を提供する。 本発明はまた、この方法により作られた新規な蒼白質／及び関係する遺伝子を提 供する。 発明の背景 蛋白質は、生物学的機能を与えられた化合物である。化学反応を触媒する能力を 持つ蒼白質は、酵素と云われる。 多くの蛋白質、特に微生物源からの酵素は、広い工業分野で大いに使用されてい る。酵素は、純粋に化学的なプロセスに比べて多数の利点を宵する。それらは、 高度に特異的であり、かつ通常は極端な条件たとえば温度、圧力、ｐｎなどを必 要とする反応を効果的に触媒できる。 下記のリストは、特定の例のリストの一部である。これら及び他の工業的酵素の より詳しい取扱いについては、ゴドフレイ（Ｇｏｄｆｒｅｖ）及びライヒエルト （Ｒｅｉｅｈ＠ｌｔ）　、１９８３、を参照されたい。 一アミラーゼ、グルコース　イソメラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ 、インベルターゼ、プルラナーゼなどは、各種の製品の製造に用いられる澱粉転 化技術において使用される（ファン　ベイナム（Ｖａｎ　Ｂｅｙｎｕｍ）及びレ ールズ（Ｒｃｅｌｓ）、１９８５）。 一β−ガラクトシダーゼ、カタラーゼ、チモシン、リパーゼなどは、酪農産業で 用いられる。 −セルラーゼは、廃棄物処理産業で用いられる。 −プロテアーゼは、洗剤、皮革及び製パン産業で用いられる。 −ペクチン酵素は、フルーツジェース産業で用いられる。 −グルコース　オキシダーゼは、醗酵及びワイン製造産業及び一般に食品産業で 酸化防止剤として用いられ、また臨床診断及び分析的アンセイにおいて用いられ る。 工業的目的のためには、微生物細胞全体又は精製酵素のいずれをも用いうる。精 製酵素は高価ではあるが、より少い副反応で一般により多量の基質を転化できる ので好ましい。 工業における酵素の使用及び一般に蒼白質の使用は、多くの場合まだ限定されて いる。最大の技術的困難は、工業的に望ましい条件たとえば温度、ｐＨ，アクチ ベーターの要件及び／又はインヒビターの存在下で安定な適当な蛋白質を見つけ ることである。 −はとんどの工業的酵素は、反応速度を増大させる一方で汚染及び粘度を低減さ せるように、好ましくは高められた温度で用いられる。しかし、工業的に好まし い温度では、蛋白質は失活を受ける。従って、工業的酵素はしばしば、好熱性微 生物から最良に導かれる。 −ｐＨの配慮は、特定の酵素の最適ｐａ１％基質及び生成物の安定性、及び工業 的プロセスにおける上流及び／又は下流の操作により更に謀せられる条件を考慮 に入れねばならない。 −酵素アクチベーター及び助酵素は、それらが付加的コストたとえば下流での処 理における生成物からの除去のためのコストを生じる問題を与える。 −インヒビターは、それらが反応混合物から除去困難でありうる又は反応のため に必須でありうる（たとえば基質阻害の場合に）故に、問題である。インヒビタ ーは種々のメカニズムで働くことができ、その一つは蛋白質の化学的変性である 。 治療分野での蛋白質の使用は、主に組換ＤＮＡ技術の発展の故に、急速に増大し つつある。たとえば、組換組織プラスミノーゲン　アクチベーター、ヒト血清ア ルブミン、ヒト成長ホルモン、インターフ′エロン、及びインスリンは既にこの 点で知られている（ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）　ら、１９８３；ロスカム（Ｒｏ ｓｋａｍ）、１９８７）、他の例は、急性リンパ球白血病の処置に用いられるＬ ・アスパラギナーゼ、及び広い分野での酸化的損傷の処置のために提寡されてい る超酸化物不均化酵素である。 最後に、多種の蛋白質が臨床的又は分析的アッセイのため（ベルグメイヤ−（Ｂ ｅｒｇｍｅｙｅｒ）、１９８３）又は診断として（ドデント（Ｄｏｄｅ　ｔ）、 ｌ　９８７）用いられる。 特定の蛋白質が用いられるこれら用途のすべてにおいて、蛋白質安定性の問題が しばしば生じる。実際に、多くの蛋白質、特に酵素は、その天然の環境から分離 されると不安定になり、失活する。 蛋白質は一般に、アミノ酸と呼ばれる２０の単量体構成プロツタのいくつか又は 全部の組合せより成る。アミノ酸は慣例的に、第１表に示すような３又は１文字 暗号（コード）により示される。 アミノ酸は、ペプチド結合と云われる特別のタイプの共有結合により互に線状に 結合される。そのように結合されたアミノ酸の順序すなわち配列は、蛋白質の一 次構造である。この−次構造は、少くとも三つの理由から重要である。まず、そ れは蛋白質の三次元（３Ｄ）構造を決定する。第二に、それは、望まれる機能性 を満すために適当な化学的物理的特徴を授けられたコンフォメーション構造のた めに必要なアミノ酸の選択によって、−又は二辺上の生物学的機能を三次元コン フォメーションに与える。第三に、ＤＮＡ配列に関し必要な情報が、蛋白質の一 次構造から確かめられうる、又はその逆ができる。 ポリペプチドは、単一のメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）から翻訳されるア ミノ酸鎖であり、ｍＲＮＡは単一の構造遺伝子から転写される。蛋白質は、−以 上のポリペプチド鎖から成る。単量体蛋白質は単一のポリペプチド鎖（及びある 場合たとえばインスリンでは、いくつかの共有結合されたポリペプチド鎖）より 成る。オリゴマー状蛋白質は、別々の生物的機能を必ずしも持つことなく単量体 蛋白質に構造的類似の、サブユニットと呼ばれる二辺上のポリペプチドより成る 。 蛋白質の三次元構造は、その二次、三次及び四次構造より成る。 二次構造とは、−次鎖の隣接するアミノ酸の主鎖原子の関係又は相互作用に関す る構造的要素を云う。三次構造は、ポリペプチド鎖を作るアミノ酸の全原子の空 間的配置である。多くの蛋白質は、スーパーアセンブリー構造に組込まれうる。 そのような多サブユニット蛋白質において、四次構造とは、蛋白質におけるサブ ユニットの配置を云い、四次相互作用は、異るサブユニットに属する原子間に生 じるものである。 二次、三次及び四次構造の故に、多くの複雑な相互作用が、アミノ酸間で（アミ ノ酸配列において接近しているものであれ、はるかに遠いものであれ）起りつる 。 天然の状態で、即ち生物的機能と結びついた状態で、ポリペプチドは一つの又は 少数の良く規定されたコンフォメーションを採る。変性された状態で、蛋白質は 生物的機能を欠く。このいわゆる広げられた（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）状態では、三 次元構造は良く規定されず、ポリペプチド鎖は多数の異るコンフォメーションを 想定する（アンフィンゼン（Ａｎｔ　１ｎｓｅｎ）及びシェラガ（ＳｈｅｒａＨ ａ）、１９７５）。 天然状態は、ｐＨ１温度、イオン強度及び圧力の良（規定された条件下で安定で ある。広げ（変性）が可逆的である場合、天然状態のフリーエネルギーは変性状 態のそれより低いことが証明される。そのような例において、二つの状態間のフ リーエネルギーの差（ΔＧ）は、蛋白質安定性の直接的尺度を与える（ブリバロ フ（Ｐｒｉｖａｌｏｖ）　、１９７９　）　−共有結合相互作用に加えて、天然 コンフォメーションは、種々の力の複雑な干渉からもたらされる。 １、疎水性相互作用、これは、水性環境において、たたまれた状態に好都合な最 重要の寄与であると考えられる（カララマン（Ｋａｎｚ＋５ａｎｎ）　、　１９ ５９　ｉプリバロフ、１９７９）。 ２、鎖エントロピー、即ちコンフォメーシッン状態の数、これは広げられた状態 に好都合な最重要の単一の寄与である。 ３、　たたまれた状態における蛋白質原子間の特異的な非共有結合相互作用、こ れは広げられた状態において溶剤とで生じる類像の相互作用を少くとも補償する 。これらは、水素結合、ファンデル　ワールス相互作用、及び電荷（イオン化さ れた基）及び／又は双極子間の他の静電相互作用である（クレイトン（Ｃｒｅｉ ｇｂＬｏｎ）、１９８３）。 たたみ込みは、天然状態のフォーメーシッンをもたらすプロセスであり、一方、 変性は天然のコンフォメーションから出発して変性（即ち広げられた）状態をも たらすプロセスである。 広げる又はたたみ込むプロセスの動力学は、所与の物理的条件下で、遷移過程の 間に系が出会うエネルギーバリヤーの関数である（クレイトン、１９８３）、そ れは、天然状態と変性状態の間のフリーエネルギーの差の関数ではない。 多サブユニット（オリゴマー状）蛋白質において、個々のサブユニー／　）はし ばしば、最終の四次構造へのアセンブリーに先立つ、かなりの程度のたたみ込み を示す。しかし、単離されたサブユニットの構造は、最終のオリゴマー状態にお いて観察されるそれと全く同じである必要はない。認識及び連想によると、最終 の四次コンフォメーションがその熱力学的に好都合な状態を獲得するように、更 なる構造的調節が実際に起りつる（ジ−ニッケ（Ｊｅａｎｉｃｋｅ）、１９８７ ）。 あるサイズ（約１００のアミノ酸残基）より大きいポリペプチド鎖において、ト メ−インと呼ばれる球状サブ構造の存在が認識されている。多数の蛋白質３Ｄ構 造の分析（ジャニン（Ｊａｎｉｎ）とウォダック（Ｗｏｄａｋ）の総説、１９８ ３）ならびに蛋白質再天然化についての実験データ（ゴルドベルク、１９６９） 、及びそのようなドメインが限定的蛋白質分解により単離できた発見（ポーター （Ｐｏｒｔｅｒ）　、１９７３）に基づいて、ドメインはたたみ込みにおいて重 要な役割を演じていると考えられる（ウェトラウ７　ｙ　−（Ｗｅｔｌａｕｆｅ ｒ）、１９７３）。 構造的ドメインは、ウォダックとジャニン＜１９８１）により記述された手順を 用いて、既知の３Ｄ構造を持つ蛋白質において同定されうる。蛋白質の構造が知 られていないなら、ドメインの表示は限定的蛋白質分解の研究により得られつる （ポーター、１９７３）。 上記の考察から、サブユニット間又はドメイン間の相互作用はたたまれた天然状 態の安定性を増すように貢献すること（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９８７） 、及びたたまれた個々のドメイン又はサブユニットはたたみ込み中間体でありう ることが推論されてきた。従って、蛋白質変性の初期段階がサブユニット又はド メイン間の相互作用の破壊を含むことは、ありうることであるビッツイン（Ｐｔ ｉｔｓｙｎ）、１９８７）。 そのような主張は、天然に生じる蛋白質突然変異体の研究から導かれた多数の研 究の結果として、この分野のエキスパートにより一般に広くかつ大いに受け入れ られている（ペルマツ（Ｐｅｒｕｔｚ）、１９７８；ウォーカー（！１ａｌｋｅ ｒ）ら、１９８０；ムラベト（Ｍｒａｂｅｔ）ら、１９８６）。 酵素は、生物学的反応を触媒する能力を持つ蛋白質である。酵素は、その基質、 ３Ｄ構造の結果及び、基質が結合し化学反応が起る活性部位の物理化学的特性の 結果に極めて特異的である（フェル２ｘ　ト（Ｆｅｒｓｈｔ）　、１９８５）。 酵素活性（又は一般に蛋白質における生物学的活性）の部分的又は全体的損失は 、失活と呼ばれる。上記の考察の結果、酵素の天然コンフォメーションの何らか の変化が酵素活性に影響し、特に失活へと進みうる。 酵素の熱的失活、即ち温度によりもたらされた酵素活性損失は、環境温度へ戻す と合理的時間内に生物学的活性を回復するかどうかに依存して、可逆的でも不可 逆的でもありうる（クリバック（Ｋｌｉｂａｎｏｖ）　、１９８３）　ｏ不可逆 的変性の最も一般的原因は、非共有結合的（安定な不活性コンフォメーションへ の凝集又はたたみ込み）又は共有結合的（ペプチド鎖の共有結合構造の化学的変 化）のいずれかであると考えられる。後者は、リゾチームにおいて支配的である と示されている（アーエルン（Ａｈｅｒｎ）とクリバコフ、１９８５）。多数の 化学的反応が、高温で蛋白質中に起り得（ザール（Ｚａ　ｌｅ）とクリバコフ、 １９８６）、Ｌかし最もしばしば研究されたのは脱アミド化（Ａｓｎ及びＧｌｕ が夫々Ａｓｐ及びＧｌｕに転化される）、加水分解（たとえばＡｓｐ残基に続き 酸に弱いペプチド結合の開裂）、及びメチオニンのスルホキシド形への酸化であ る。 蛋白質構造の共有結合的変化、特に化学的架橋の導入はまた、蛋白質安定性をも 与えうる。実際それは、過去において蛋強（熱）安定性を増すための最も一般的 手段であった（トリチリン（Ｔｏｒｄｒｉｌｉｎ）、１９８３；サダナ（Ｓａｄ ａｎａ）とヘンリー（ｌｌｅｎｌｅｙ）、１９８６；ゴシャーク　（Ｇｏｔｔｓ ｃｈａ　ｌｋ）とジ−ニッケ、１９８７）。 このアプローチの成功はしかし限られていた。その理由は、（１）手法が種々の 長さの架橋剤の徹底的スクリーニング及び／又は化学に依存する。（２）化学反 応が蛋白質の特定のアミノ酸残基に信頼できる程に的を絞ることができず、従っ て不所望の部位たとえば生物学的機能を阻害しつる部位で起ることである。 より最近では、蛋白質工学の出現により、遺伝子の部位指定突然変異生成（ＳＤ Ｍ）によって任意の所望の蛋白質アミノ酸配列を変性し、それにより改善された 特性の酵素を作ることが可能になった（たとえば、ノーレス（ｋｎｏｗ、１ｅｓ ）、１９８７及びディル（Ｄｉｌｌ）　、１９８７の総説）。 初期の例のいくつかでは、蛋白質における非天然ジスルフィド結合を扱うために ＳＤＭが用いられた。しかし、限られた場合においてのみ、このアプローチが成 功している（ベリー（ｐｅｒｒｙ）とウェツェル（Ｗｅｔｚｅｌ）　、１９８． ４　；ウェツェル、１９８５：ザウエル（Ｓａｕｅｒ）　ら、１９８６；ビラフ ラン力　（Ｖｉｌｌａｆｒａｒｃａ）ら、１９８７）。このほどほどの成功の理 由は、ウェツェル（１９８７＞とクレイトン（１９８８）によりレビューされ、 検討されている。 Ｔ４ファージ　リゾチームのより安定な変種もまた、ＧｌｙをＸで置換モしてＸ をＰｒｏで置換して得られており（ここでＸは任意の他のアミノ酸である）、そ の効果を「より硬い」残基の存在の故の、突然変異体のコンフォメーション自由 度の低下に帰している（マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら、１９８７）。 ＳＤＭは、向上した安定性を持つ変種（位置３におけるＩＪｅからＬｅｕへの置 換）をもたらすバタテリオファージＴ４リゾチームの疎水性安定化の研究に最近 用いられた（マツムラら、１９８８）。 ＳＤＭはまた、静電相互作用（水素結合、及び荷電した基間の相互作用）の性質 及びｐＨ依存性へのその影響（ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）ら、１９８７）及びス ブチリシンの酵素動力学パラメータ（ウェルズ（Ｈｅ１ｌｓ　）ら、１９８７） を調べるために用いられた。 しかし、蛋白質安定性へのその影響は、これら手法でまだ調べられておらず、静 電相互作用の特定の調節の結果として、より安定な酵素が作られてもいない。 蛋白質サブユニット及び／又はドメイン間の非共有結合相互作用の役割は、ＳＤ Ｍによりあまり検証されていない、第一の例としてカザル（Ｃａｓａｌ）ら、１ ９８７）は、二量体イースト　トリオセホスファーテ　イソメラーゼにおける位 置７８のアスパラギンをアスパラギン酸で置換してより不安定な蛋白質を作るこ とを示した。この結果は、アスパラギンのアスパラギン酸への脱アミと化が、高 められた温度で蛋白質において起ることが見い出されたことに基づいて、理由づ けられた。第二の例では、位置１４及び７８における同じモデル蛋白質中のアス パラギン残基の、夫々スレオニン及びイソロイシンでの同時置換は、改良された 熱安定性をもたらすことが見い出された（アーエルン（Ａｈｅｒｎ）ら、１９８ ７）　。 突然変異酵素の半減期の倍加はしかし、触媒活性の二倍の低減を伴った。 バタテリオファージＴ４リゾチームにおける温度に敏悪な突然変異は、たたみ込 まれた蛋白質における低い溶媒アクセシビリティの部位において起ることが見い 出された（アルバー（Ａｌｂｅｒ）ら、１９８７）。 １里重に皿 本発明は、リシン残基のアルギニン残基への転換またはアルギニン残基のリシン 残基への転換によって、蛋白質の安定性を、好ましくは化学修飾もしくは熱変性 またはその両方に関して、制御または調節するための方法を提供する。本発明は すなわち、少な（とも１つのりシン類纂のアルギニンへの転換により、蛋白質の 安定性を増すための方法を提供する。そしてこのことは、蛋白質分子の特定の位 置で行われる。 本発明の好ましい１つの実施Ｂｔ６ａにおいては、リシンのアルギニンでの置換 は、安定性が増加されようとするところの蛋白質の３Ｄ構造に、両残基が立体的 に収容される蛋白質の部位で生じる。 そのような部位では、リシン残基のアルギニン残基への転換は、リシンのイプシ ロンアミノ基が関与する化学修飾を除外することを意図しうる。蛋白質において は、リシン残基は、アルギニンではそうでもないが、化学修飾されやすい、この ようにリジンのイプシロンアミノ基はアルデヒドやケトンと反応してシッフ塩基 付加生成物およびさらに修飾された生成物を生じることが知られている。このこ とは、ついには生物学的活性の損失を助長する（ホルムキスト（Ｈｏｌｍｑｕｉ ｓｔ）およびシュローダ−（Ｓｅｈｒｏｅｄｅｒ）、１９６４；フ゛ツクチン（ Ｂｏｏｋｃｈｉｎ　）およびギャロップ（Ｇａ１１．ｏｐ）。 １９６８ｉパン（Ｂｕｎｎ　）　ら、１９７５および１９７８；コーニツヒ（Ｋ ｏｅｎｉｇ　）　ら、１９７７；ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびパン（Ｂｕ ｎｎ　）　、１９８１　）。特に、リシン残基がドメインおよび／またはサブユ ニットの間のインターフェース内に生じる場合では、そのような部位での化学修 飾はドメインまたはサブユニットの解離を助長するか、そして／または、その結 果として解離した状態で不可逆的にトラップされたサブユニットおよび／または ドメインの適切な再結合を阻害するようである。 リシン残基を特約のアルギニン残基で置換することによって、この化学修飾の程 度および蛋白質の活性および／または安定性における影響を押さえることができ る。その結果、リシン残基のアルギニンへの変換が化学修飾に関して蛋白質の安 定性を改善するであろう。 また、リシンのアルギニンへの転換を立体的に収容する部位において、リシン残 基のアルギニン残基での置換はなお、蛋白質の安定性の増加をもたらすであろう 、このことは、グアニジニウム基の存在の故に、アルギニンの側鎖の可撓性がリ ジンの側鎖の可撓性より小さいためであり、従ってリシンのアルギニンへの転換 はエントロピーの立場から好ましい、また、アルギニンのグアニジニウム基は、 蛋白質において、隣接する残基とより多（の水素結合を形成する能力があり、安 定性の改善をもたらす。 本発明の別の好ましい実施Ｂ様においては、とくに熱的安定性の向上が追及され るところでは、初期にそして特に、安定性を増加しようとしている蛋白質におい て後に定義されるタイプの位置で生じる。少なくとも１つのりシン残基がアルギ ニンに変換される。リシンのアルギニンでの置換は、置換アルギニン残基が次に 関係する静電相互作用、特にサブユニットおよび／またはドメインの間のインタ ーフェースの丙での相互作用を改善すると思われる。この実施態様において、置 き換えられるべきリシン残基は、好ましくは以下の必要条件に従い、そしてこの 必要条件は、折り畳まれた（ｆｏｌｃｌｅｄ）　、天然の蛋白質の立体配座につ いてのものである： １、置き換えられるべき残基は、静電相互作用、好ましくはサブユニットおよび ／またはドメインの間のインターフェースにおける相互作用に直接関与しなけれ ばならない。 ２、転換は、誘導されるアミノ酸残基を立体的に収容することができる部位で生 じなければならない。 ３、残基は、低い溶媒アクセシビリティの部位で生じ、好ましくはサブユニット および／またはドメインの間のインターフェースの一部でなければならない。 好ましくは、基準（１）および（２）を満たしながら、蛋白質において最も低い ＡＳＡを有し、同時に、ＡＳＡが、与えられた残基について測定された平均より 低い値を有することが要求されているアミノ酸残基をさがさねばならない、これ らの必要条件を満たす部位において、アルギニンは、リシンに比較して、その側 鎖のグアニジニウム基の物理的および化学的特性に由来する改善された静電相互 作用を提供する（例えばライグリ−（Ｗｉｇｌｅｙ）ら、１９８７年）。 本発明の目的のために、その残基が、ドメイン（またはサブユニット）会合する と溶媒アクセシプルな表面積を失なうときにはいつも、残基はサブユニットまた はドメインの間のインターフェースに位置するといわれる。溶媒アクセシビリテ ィ表面（リー（Ｌｅｅ）およびリチャード（Ｒｅｃｈａｒｄｓ）　、１９７１年 ）は、蛋白質のフォンデルワールスエンベローブに関して溶媒分子の中心の最接 近表面を規定する。与えられた残基の低い溶媒アクセシビリティとは、計算され た（サーボル（ＳＵＲＶＯＬ）アルゴリズム、ブルーゲル（ＢＲｌｌＧＥＬ）の モデル−ビルディングパッケージにおいて）アクセシブル表面積（ＡＳＡ）が、 公知の蛋白質構造の全体におけるその残基について測定された平均より小さいこ とを意味する（ローズ（Ｒｏｓｅ）　ら、１９８５年）。 本発明の目的のために、静電相互作用は、１）荷電した基、例えばカルボキシレ ート、第３級アミン、グアニジニウム基、イミダゾール基または荷電したベテロ 基（例えば金属、ベルンスタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）ら、１９７７年）およ び／または２）極性基、例えばカルボニル、アミノまたはイミノ基、ヒドロキシ ル基、スルフィドリル基、結合水またはマクロ双極子（ホル（Ｈｏｔ）、１９８ ５年）が関与するいかなる相互作用でもありうる。 本発明の目的のために、モデルビルディング法で誘導される新規な分子において 観察される何らかの構造的な歪、例えば短いファンデルワールスコンタクトが、 標準的エネルギー最小化法、例えば「最大傾斜（Ｓｔｅｅｐｅｓｔ　Ｄｓｃｅｎ ｔ）Ｊ　（フレフチ＋　−（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）およびリーブス（Ｒｅｅｖｅｓ ）　、１９６４年）または「共役した勾配（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｇｒａｄｉ ｅｎｔ）」（フレッチャーおよびリーブス、１９６６年）アルゴリズムによって 、軽減され得るなら、置換は立体的に収容されるといわれる。 本発明の目的のために、本発明により製造されるような変性された安定性を有す る蛋白質の生物学的活性の実質的な量を保持することが、通常望ましい。そのよ うな生物学的活性を保持するために、置き換えられるべきアミノ酸残基は好まし くは、触媒的な残基としてまたはコファクター結合（ｃｏｆａｃｔｏｒ　ｂｉｎ ｄｉｎｇ）に実質的に関与するものとして同定されてきたものではない。しかし ながら、生物学的活性の減少は、本発明により達成される安定性の増加により著 しく補償されるなら、許容されつる。特に、突然変異した蛋白質が、野生型蛋白 質が全く活性を全く表さない温度で機能的になるときには、生物活性における著 しい減退が許容される。 本発明はまた、蛋白質の安定性を減少させるための方法を提供する。この方法は 本質的に、上記したりシンのアルギニンへの転換のために要求される条件のいく つかに合う部位で、出発蛋白質に当初に存在するアルギニンのりシンでの置換を 含む。 すなわち、例えば、（１）当該残基が静電相互作用、好ましくはサブユニットお よび／またはドメインの間の相互作用に関与するところの、そして（２）低い溶 媒アクセシビリティを有するところの天然蛋白質における部位で、アルギニンの りシンでの置換がこの静電相互作用の安定性、そして従って蒼白質の安定性を減 少させる。アルギニンのりシンへの置換にとって、新しい残基の立体的収容性に 関しての条件は、限定としてはアプリオリには判らないことは注目され得る。こ のことは、リシン残基のより短いそしてより可撓的な側鎖が、アルギニンによっ て元来占められる部位に良好に収容されるはずであるという事実から生じる。 また、２つの残基のいずれをも立体的に収容する部位でのアルギニンのりシンで の置換は、蛋白質を、アルデヒドおよびケトンによる化学修飾をより受けやすく し、このことはそのような化学修飾を助長する環境における蛋白質の安定性を減 少し／得る。 本発明の特定のアミノ酸置換は、上記した効果的、例えば、静電相互作用の強さ を変化させる、隣接する残基との水素結合の数を変化させる。蛋白質の配座エン トロピーを変化させる、または化学修飾の程度に影響を与える、といった効果の い（つかまたは全てを組み合わせて、蛋白質の安定性を加減することができるこ とは明らかである。 本発明の蛋白質は、以下の一般的手法で、本発明の方法により製造することがで きる。特定のりシンまたはアルギニン残基は・蛋白質の三次元構造の注意深い調 査によつて、置換のための候補として同定されることができ、例えば、結晶学（ ライコツ（Ｗｙｃｋｏｆｆ）ら、１９８５年）、または核磁気共鳴スペクトル学 （ウスリンヒ（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ）　、１９８６年）、または相同蛋白質からの 入手可能な３Ｄ構造に基づく構造派生（例えばブランデル（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ） 　ら、１９８７年）、または一時構造の分析に基づく構造予測（総説として、テ ィラー（Ｔａｙｌｏｒ）　、１９８８年）から可能である。蒼白質の３Ｄ構造の 調査は、専用のコンピュータソフトウェアパッケージ、例えばＢＵＲＵＧＥＬ分 子グラフィックスソフトウェアパッケージ（デルハイス（Ｄｅｌｈａｉｓｅ）　 ら、１９８４年）の使用により行うことができる。適当な残基の別の情報は、特 定の変性する条件の下での蛋白質の不活性化に関与するメカニズムの注意深い分 析によって得ることができる。最後に、好ましい部位に位置したアミノ酸残基の 置換は、慣用の方法によって達成されることができ、特に、例えばベクターおよ びスタンセンズ（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）ら（１９８７年）によって述べられてい る手順及びツエル（Ｚｅｌ＋）およびフリフッ（Ｆｒｉｔｚ）　（１９８７年） によって述べられている面株を用いて蛋白質をコードするＤＮＡ配列の位置指定 突然変異により行うことができる。 本発明はまた、本発明により述べられた方法により得ることができる変性された 安定性ををする新規な蛋白質に関し、そしてこれらの蛋白質をコードするように 突然変異化された遺伝子に関する。 本発明の蛋白質は、適当な表現シグナル、例えば適正なプロモーター配列、分泌 シグナル配列、リボゾーム結合部位、スタートおよびストップコドン、および原 核細胞および真核細胞のための転写終結配列および真核細胞のための適正なポリ アデニル化シグナル、といった表現シグナルに結合した、変性された遺伝子を含 むキメラ遺伝子を組み立てることによって得られる。また、キメラ遺伝子は、原 核細胞または真核細胞のような、それらの表現および／ｌたは複製を可能にする ホスト環境にさらに導入される。 本発明のキメラ遺伝子は、ホスト生物体のプラスミド、ファージまたはゲノムの ようなどんな種類のレプリコンにおいてでも、ホスト環境に存在するように、慣 用の手法により操作できる（ウィンナツカ−（Ｗ　１ｎｎａｃｋｅｒ）、１９８ ７年およびその中の参考文献）。 このことについて本発明はまた、そのようなキメラ遺伝子に関し、これらの変性 された遺伝子を運ぶレプリコンに関し、そしてこれらのレプリコンを、好ましく はこれらの遺伝子が活性に表現されるようなやり方で増殖するホスト環境に関す る。 本発明の蛋白質は、種々の設定において有用である。 増加した安定性および／または化学修飾に対する抵抗性を備え、一方、総括的な 生物学的活性を保持した蛋白質は、好ましくない（過酷な）環境において使用さ れる酵素の工業的な用途において、非常に多くの種類の臨床的なおよび分析的な アッセイのための用途において、そして医約的用途において非常に重要であり得 る。 重要なことに、治療用の蛋白質については、導入された突然変異の保安的な性質 は、得られた生成物において新しい免疫遺伝学的特性を生ずるとは予測されない 。 減少した安定性および／または化学修飾に対する抵抗性を備えた蛋白質は、随意 に蛋白質の生物学的活性を止めることができるかまたは、与えられた治療用の蛋 白質の半減期を減少させることができる蛋白質の多くの用途において重要であり 得る。 また、本発明の部分を形成する異なった選択肢に関して、内容がまたこの開示の 部分であるクレームをここで引用しておく。 本発明による手順は、実施例により述べられよう。これらの実施例が、類似の変 性が他の生物学的に活性な蛋白質においていかに誘発され得るかの例であること はもちろん理解されよう。これらの実施例において、添付した図面（略記につい ては明細書を見よ）について、言及する。 第１図　ｐＨ７，２，２５℃の５０１１１ＭのＭＯＰＳ中におけるＥｃｏＡａ＋ ｉ（ＤＳＭ）ＧＩの金属を含まないグルコースイソメラーゼの熱失活動力学。い かなる金属も添加しなかった。 第２図　第１図と同様。１０ｄのＭｇ２“を添加した。 第３図　第１図と同様。１０１ＭのＣｏ”＋を添加した。 第４図　ｐＨ７，２，２５℃の５０ｍＭのＭＯＰＳ中におけるＥｃｏＡｍｉ（Ｄ ＳＭ）ＧＫの熱失活についての温度依存性のアレニウス（Ａｒｒｈｅｒ＋　１ｕ ｓ）プロット。 第５図　金属の添加なしで、７２℃での金属を含まないＥｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ） ＧＩＯ熱失活のｐｎ依存性。ＣＨＥＳ−２−（シクロヘキシルアミノ）エタンス ルホン酸。 第６図　ＰＩ（６，７，７２℃の５０ｍ１４のＭＯＰＳ中での金属を含まないＥ ｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）Ｇ１の熱失活の動力学におけるイオン強度の影響。いか なる金属も添加しなかった。 第７図　ｐＨ７，６，７２℃の５０ｍＭのＭＯＰＳ中における金属を含まないＥ ｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）ＧＩの熱失活の動力学におけるイオン強度の影響。いか なる金属も添加しなかった。 第８図　７Ｍ尿素中、２５℃での長時間インキュベーション後のＥｃｏＡ−ｉ　 （ＤＳＭ）　Ｇ　１の５ＥＣ−ＨＰＬＣ。 第９図Ａ　尿素を使用せず、２５℃でシアナートで前処理したＥｃｏＡｍｉ　（ ＤＳＭ）ＧＫの５ＥＣ−ＨＰＬＣ０溶出緩衝液は５ＱｌｎＭ）リス／ＨＣ１、ｐ Ｈ８，０，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０２％ＮａＮ５゜ 第９図Ｂ　尿素を使用せず、２５℃でシアナートで処理したＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ ＳＭ）ＧＩの天然のＰＡＧＥ。 第１０１ＤＡ　２５℃で５Ｍの尿素の存在下で、シアナートで前処理したＥｃｏ Ａｍｉ　（ＤＳＭ）Ｇ１の５ＥＣ−ＨＰＴ−Ｃ。 第１０図８　２５℃で５Ｍの尿素の存在下で、シアナートで処理したＥｃｏＡｍ ｉ　（ＤＳＭ）Ｇ１の天然のＰＡＧＥ。 第１１図　ｐｌ（７，７，６０℃の５０ｍＭＭ０ＰＳ中におけるＥｃｏＡｍｉ（ ＤＳＭ）ＧＩのグリケーション（Ｇ　Ｉｙｃａｔ　１ｏｎ）。 Ｏニゲルコースを添加せず。・：２５０ｄグルコース添加、Δ：クルコース（２ ５０ｍＭ）でのインキュベーションの後、徹底的な透析を行って可逆性について の試験をした。 第１２図　ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）ＧＩ突然変異体に２５’３Ｑの熱失活動力 学。 第１３図Ａ　ＥｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）ＧＩ−に２５３Ｑの４量体−２量体解離の ５ＥＣ−ＨＰＬＣ分析。 Ｂ　野生型εｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）　Ｇ　ＩおよびＧｌ突然変異体に２５３Ｒ およびに２５３Ｑの２５℃での、尿素で誘発された４量体−２量体解離の動力学 。 第１４図　ｐＨ７，７で１２．５　ｍＭのリン酸カリウム中、６０℃で、Ｅｃｏ Ａｍｉ　（ＤＳＭ）ＧＩ突然変異体Ｔ、＜　２３５　Ｒのグリケーションで誘発 された失活の動力学。 第１５図　ＥｃｏＡ＋＋＋ｉ　（ＤＳＭ）Ｇ　Ｉのヌク１／オチドおよびアミノ 酸配列。 ｊｌＥ１６図　ｐＭａ５−ＧｌおよびｐＭｃ５−ＧｌにおけるＥＣ０ＲＩ−Ｘｂ ａｌフラグメントとして成るＰ、ｌ−ｇ　ｉ転写単位の完全なヌクレオチド配列 、配列の上の矢印はＡｃｔｉｎｏ　ｌａｎｅｓｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓのＤ ＮＡの始点と終点を示し、１工のスタートおよびストップコドンが同様に示され ている。 第１７図　工土ｃ−ｓｏｄハイブリッド遺伝子のヌクレオチド配列。 アルギニンに変換されたりシン残基を四角で囲んだ、ギャップのあるストランド の調製に使用するユニーク制限部位を示した。 第１８図　ヒトおよびウシのＣｕＺｎ５ＯＤのアミノ酸配列のアラインメント（ ａｌｉｇｎｅ＋５ｅｎｔ）　＊第１９図Ａ　ＣｕＺｎＳ　ＯＤ−ＷＴ　（拳）お よびＣｕＺｎ５ＯＤ−に９Ｒ（０）の熱失活動力学： ＣｕＺｎＳ　ＯＤ　（０，２ｗｅｌａｄ　；イーコリ　（Ｅ、　ｃｏｌｔ）ＷＫ 　６により作られた）を、８５℃で、ｐ！？’７．ｓの２０ｍＭリン酸カリウム 中で、示した時間間隔でインキュベートした。熱失活は、５２．７＋ｅＭ　ＴＣ ＤＡ緩衝液中０．１■／−のカタラーゼの５０〜１００容積の添加前に、０℃に １０分間冷却することにより止められた。Ｏ，ＯＳ−の部分（１００〜２００ｎ ｇ／ｄ、ＣｕＺｎ５ＯＤ最終濃度）を明細書に記載したようなピロガロール酵素 アンセイに使用した。比活性はＣｕＺｎＳ　ＯＤ−ＷＴについて５，０００単位 ／■およびＣｕＺｎ５ＯＤ　Ｋ９Ｒについては５，２００単位／■であった。 Ｂ　ＣｕＺｎ５ＯＤ−ＷＴ　（・）およびＣｕＺｎ５ＯＤ−に９Ｒ（０）の熱失 活動力°学： ＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤ　（０，２＊／　ｄ）を、４℃で１８時間、０．０２５ｍＭ 　Ｃｕ５Ｏａおよび０．０２５ｍＭ　Ｚｎ５Ｏａを含むｐＨ７，８の２０ｍＭリ ン酸カリウム中でインキュベートし、次いで８５℃でインキュベートした。適当 な時間に一部を取出し、第１図の説明で示したように処理した。データは、最終 アッセイ混合物においてＣｕＺｎＳ　ＯＤ　１００ｎｇおよび２００ｎｇの両方 を使用した２回の測定の平均を表す。 第２０図　ｐＭａ／ｃ５−ｇａｐｉのＥｃｏＲＩおよびＸｂａ　１部位の間に挿 入された工ｌｌ−工土り表現モジュールのヌクレオチド配列、１土ｌプロモータ ーおよび１土り遺伝子を含むフラグメントの間のＢａｍＨＩ／ＤｒａＩ結合を矢 印で示す、ＧＡＰＤＨ蛋白質の誘導されたアミノ酸配列をまた示した。グリシン ２８２残基を四角で囲んだ、ギャップのあるストランドの調製に使用する。ユニ ークＣ１ａｌおよび５ｔｙ１部位をまた示した。 第２１図　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　（Ｂｓｕ）およびＢａｃｉｌ ｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅ−υ四重１１リー（ム、Ｑ　ＧＡＰＤＨのアミノ酸 配列のアラインメント。 第２２図　種々の温度での１５分間のインキュベーシツン後の、ＧＡＰＤＨ−Ｗ Ｔ、ＧＡＰＤＨ−０２８２ＲおよびＧＡＰＤＦＩ−Ｇ２８２にの残留活性。 第２３図　１ｍＭ　ＤＮＡ”の存在下で７４．５℃でのＧＡＰＤＨ−Ｇ２８２Ｒ （四角）およびＧＡＰＤＨ−０２８２にの（丸）の熱失活動力学。 蛋白質の３Ｄ構造の分析およびモデリングは、ＢＲＵＧＥＬパッケージを使用し て行った。 部位指定突然変異生成は、ｐ　Ｍ　ａ　／　ｃファミドベクターを用いて、ギ’ ｒンブのある二重ＤＮＡ法（ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｏ ｄ）により行つた（スタンセンズ（５ｔａｎｓｓｅｎｓ　）ら、１９８７年）。 突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト法（ｐｈｏｓｐｈｏ ａｍｉｄｉｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ）（ビニ−ケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカ ルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）　、１９８１年）に従い、アプライド　バイオ システムス３８０Ａ　ＤＮＡ合成機（ＡＰＰＬＩＥＤ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３ ８０Ａ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で合成した。 実施例において特記していなければ、組換えＤＮＡを作り、かつ操作するすべて の手順は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２年）によって述べられ た標準化された手順によって行った。 実施例で使用されたかまたは調製された以下のプラスミド、ベクターおよび菌株 は、ブタペスト条約の規定にしたがって、ドインチュ　サムルング　ヒュア　ミ クロオルガニズメン、ゲッティンゲン、西ドイツ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍ ｌｕｎｇ　ｆｕｒ　Ｎｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　＋Ｇ３ｔｔｉｎｇｅｎ、 　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒ＋ｍａｎｙ　）に寄託された：ｐＭｃ５−８　ＤＳＭ　４５ ６６ ｐＭａ５−ｓ　ＤＳＭ　４５６７ ｐＥｃｏＲ２５１ＤＳＭ　４７１１ 実施例　１ 増大した熱安定性及び化学的変性に対する増大した挺抗性を有する、アクチノプ ラーネス　ミズリーエンシス（Ｄ　Ｓ　Ｍ　４３０４６）からのグルコースイソ メラーゼの突然変異体Ｄ−グルコース　イソメラーゼ（Ｇｌ）は、Ｄ−キシロー スイソメラーゼ（Ｄ−キシロース　ケト−ルーイソメラーゼ、ＥＣＭ、３．１− ５）と同意義に用いられ、Ｄ−キシロースをＤ−キシルロースに転化する酵素で ある。操作したＥ、　ｃｏｌｉ株により作られたアクチノプラーネス　ミズリー エンシス（ｍｔｓｓｏｕｒｉｅｎ−ｓｉｓ）からのＤ−グルコース　イソメラー ゼは、ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）Ｇｌと呼ばれる。ＧＩをコードするアクチ ノブラーネス　ミズリーエンシスをＲ４ＱのＥ、　ｃｏｌｉ　ｘｙｌＡ遺伝子と 区別するために、前者をｇｉと示すことにする。 １、Ａ、Ｇｌ遺伝子の分離とクローニングアクチノブラーネス　ミズリーエンシ スＤ　Ｓ　Ｍ　４３０４６からの全ＤＮＡは、５ａｎ３Ａで部分的に消化された 。−消化生成物は、蔗糖勾配で分画され、２〜７キロ塩基（ｋｂ）の長さの画分 はプラスミドｐＥｃＯＲ２５１のユニークＢｇ１ｍ部位にリゲートされた。 ハワードーフランダースら（１９６６）に記載され、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＡＢ１１５ ７　（ＤＳＭ１５６３）から誘導された、キシロースイソメラーゼ欠損Ｅ、ｃｏ ｌｉ株ＡＢ１８８６は、リゲーション　ミックスにより形質転換され、次に１０ ０■／１アンピシリン及び０．２％（Ｗ／Ｖ）キシロース（ＭＭＸ）を補われた 最小寒天プレート　（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）　、１９７２）上で成長された、 ３７のクローンが回収され（ｐＡＭ１１〜３７と呼ぶ）　、１００ｍｇ／Ｊアン ピシリンを含むＬＢ培地で成長された。組換プラスミドＤＮＡを分離し、制限消 化により分析した。二重のプラスミドを識別でき、１つ（たとえばｐＡＭＩ７） は２．８　ｋｂベインートを含み、他（たとえばｐＡＭＩ２５）は４．０ｋｂイ ンサートを含んだ。広汎な制限分析によると、両タイプのインサートは約２．Ｏ ｋｂの傾斜共通に持った。化学的分解法（マキサム（Ｍａｘａａ＋）とギルバー ト（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、１９８０）によるこの領域の配列決定は、Ｇｌのコーデ ィング領域と同定された１１８２個のヌクレオチド長を持つ読み取り枠を明らか にした。ｇｉのヌクレオチド配列を、誘導されたアミノ酸配列と共に第１５図に 示す。以下ではアミノ酸の番号は第１５図による。 下記のようにバタテリオファージ　ラムダの右側プロモーター（Ｐ、）の転写制 御下に遺伝子を置くことによってＥ、　ｃｏｌｉ中でｇｉの極めて高い表現を達 成できた。 プラスミドｐＬＫ９４　（ボッターフ　７　（Ｂｏｔｔｅｒａａｎ）とザビュー （Ｚａｂｅａｕ）　、１９８７）をまず変性して、−ラクタマーゼ遺伝子中のＰ ｓｔ　１部位を除去した。これは、−ラクタマーゼ遺伝子のＮ末端部を含むｐＬ Ｋ７０−７０ｐ　（ボッターマンとザビュー、１９８７）の８８０ｂｐ　Ｅｃｏ ＲＩ／Ｐｓｔ　１画分及び−ラクタマーゼ遺伝子のＣ末端部を含むｐ　Ｌ　Ｋ　 ９４の１７００塩基対（ｂ　ｐ）ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ　１画分ならびに複製オリ ジンを分離することによって行われた。これらの百分の続くリゲーションはｐＬ Ｋ９４ｐを与えた。 ｐ　Ａ　Ｍ　Ｉ　７　ヲＰｓｔ　Ｉ　テ開Ｈシ、約１８００ｂｐ長の精製された 二つの画分（その一つはＧｌ遺伝子を含む）の混合物をｐＬＫ９４ｐのＰｓｔ　 Ｉ部位ヘリゲートした。このリゲーション混合物は、Ｅ、　ｃｏｌｔ株ＡＢ１８ ８６を形質転換するために用いた。ＭＭＸ上での成長により、アンピシリン抵抗 性のＧｌ”形質転換体が得られた。 いくつかの選ばれた転質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、制限分析により 特徴づけた。ｇｉを含むＰｓｔ　１画分を収容するプラスミドｐＬＫ９４ｐをｐ ＬＫ９４ＧＩと呼ぶ、ｇｉの配位は、ユニークＢａｍＨ１部位がＧＴＧ開始コド ンがら約４７０ｂｐ上流に位置するものである。 ｐＬＫ７０−７０ｐをＰｓｔ　Ｉで開裂し、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ画 分（Ｋｌｅｎｏｗ）によりプラントエンドとし、次にＸｂａ　Ｉで消化した。 ｐＬＫ９４ＧＩをＢａｍＨＩで線形化し、エキソヌクレアーゼＢａＪ３１で消化 した。種々の時点でサンプルを採り（エチレンジアミン四酢酸ニナトウム（ＥＤ ＴＡ）で反応を停止）　、Ｘｂａ　１で開裂し、ゲル電気泳動で分析して、制限 された９ａｍＨ１−Ｘｂａ　１画分の平均サイズを決定した。１３５ｏ〜ｔ４ｓ ｏｂｐのサイズの百分をゲルから溶離した。この画分をｐＬＫ７０−７０ｐにリ ゲートした。リゲーシヲン混合物を用いてＥ、　ｃｏＨＫ５７４　（コルマン（ Ｃｏｌｓｏｎ）　ら、１９６５）を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を ３７℃で選択した。いくつかの形質転換体から分離されたプラスミドＤＮＡを、 ｖＪ限分析により特徴づけた。完全なｇｉを持つプラスミドを含む２４のクロー ンが得られ、ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）の産生をテストした。培養物を３７ ℃で一夜成長させ、次に１２．５％ドデシルｇ酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）上で ポリアクリルアミドゲル電気泳動により全細胞抽出物を分画した（レムリ　（Ｌ ａｅａｕ＋１ｉ）、１９７０）、未形質転換に５１４対照培養物と比べると、ク ローンの一つが５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分子量４２キロダルトン（ｋｄ）の新しい 蛋白質の高レベル合成を指令すると見い出され、これは、純粋なアクチノブラー ネス　ミズリーエンシスＧ１に対して生じたポリクローナル血清を用いてウエス クーン　ブロンドすることによりＥｃｏＡ＋＋＋ｉ　（ＤＳＭ）と同定された。 　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＫＳ　１４上で高いＥｃｏＡｆｆｌｉ　（ＤＳＭ）Ｇ　Ｔ産 生を与えるプラスミドはｐＬＫ７０ＧＩと名付けられた。 Ｐ＠−ｇｉ転写ユニットは、ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ１画分として働かされることが でき、その配列を第１６図に示す。アガロースゲルからの溶出の後に、この画分 は、ＥｃｏＲｌ及びｘｂａＩで消化されたｐＭａ５−８及びｐ　Ｍ　ｉ　５−８ の両者にリゲートされてｐＭＡ５−Ｇ！とｐＭｃ５−ＣＭを夫々与えた。これら ベクターはＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）ＣＩの同じ及び効率的な合成を指示するこ とが見い出され、同時に表現レベルはｐＬＫ７０ＣＩにより得られたそれと有意 に異ならない。 ｇｉの表現は更に、ＧＴＧ開始コドンをＡＴＧ　Ｉ−リブエンドに変えることに より増大できた。これは、下記のオリゴヌクレオチドブライマーを用いて実施例 １．　Ｄ記載のように部位指定突然変異生成により行われた： ５　’　−ＧＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＴＴＡＣＣ−３’野生種及び突然変異のＧ Ｉ酵素は、１％トリプトン、１％ＮａＣ１２，０，５％酵母抽出物及びｐＭＡタ イプベクターのためのアンピシリン（１００ｍｇ／ｆ）又はｐＭＣタイプベクタ ーのためのクロラムフェニコール＜２５ｍｇ／β）より成る培地で成長されたＥ 、　ｃｏｌｉ株に５１４中で作られた。細胞は３７℃で一夜成長され、遠心分離 された。ＥｃｏＡｃｉ　（ＤＳＭ）ＧＩ酵素は下記のように精製できた。細胞ベ レットを０．０５Ｍ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒ　ｉｓ／　 ＨＣｌ　）の最小量、０．１　ｄ　ＣｏＣ１＊、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！＊　、０ ．２Ｍ　ＫＣｌ、５％グリセロール及び５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０中に再懸濁 させ、リゾチームを０．１　ｒａｇ／　ｒｒｈｉｌの最終濃度で加えた。０℃で ２０分間放置後、フレンチプレスを用いて細胞を分解し、遠心分離しく２３．０ ００　ｇで３０分間）、上澄を同量の５％ストレプトマイシン　スルフェートで 希釈した。４℃で３時間インキュベートし、遠心分離（２３，０００ｇで３０分 間）した。得た上澄を７０℃（ただし、突然変異体に２５３Ｑ及びに１００Ｑは ５０℃）に３０分間加熱し、再び遠心分離した。可溶の上相を硫酸アンモニウム で８０％とした。酵素活性のほとんどを含む沈澱物を遠心分離で集め、０．０２ Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１，５ｍＭＥＤＴＡＳＯ，８５Ｍ硫酸アンモニウムに溶解し た。次のクロマトグラフ工程は、フェニル拳スパロース（Ｐｈｅｎｙｌ−３ｕｐ ｅｒｏｓｅ）、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　−２００ＨＲ、最後 にＭｏｎｏ−ＱＨＲｌ　０／１０を含んだ。クロマトグラフィのための総てのバ ッファーへの５ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡの添加は、金属イオンを除去するために必要で あった。使用に先立ち、得た酵素を、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む（最終ｐＨ約５ ．２）　１０ｍＭ　）リエタノールアミン、ｐＨ７，２の２００容に対して３度 、そしてパンファーを３度変えて５＋ｍ１１２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル ホン酸（Ｍ　Ｅ　Ｓ）、ｐＨ６，０の２００容に対して透析した。最終酵素調製 物の金属含量は、Ｖａｒｉａｎ　５ｐｅｃｔｒ　Ａ　Ａ　３０　／　４０での原 子吸光スペクトルにより測定し、ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）ＣＩが金属不合であ ることを示した。 −例として、酵素に極めて高い親和性で結合するコバルトイオンはＥｃｏＡｍｉ 　（ＤＳＭ）ＧＩ七ツマ−１モル当り僅かｌＸｌ０−’モルであることが示され た（クロマトグラフバッファーでＥＤＴＡが省略された場合、この数値は、酵素 モノマー１モル当りコバルト０．５モルに増大した）、ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ ）Ｇ　Ｘの純度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥと銀着色、そしてまたνｙｄａｃ　Ｃ４カ ラムでの逆相高速液体クロマトグラフ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により評価された。 グルコース　イソメラーゼの酵素活性は、下記のようにして評価された（１単位 の酵素活性が１分間当り１．０マイクロモルの生成物Ｄ−キシルロースまたはＤ −フラクトースを作り、従って比活性ｓｐａはＧ！酵素のｍｇ当りの単位として 表わされる）。 Ｇｌ活性は、３５℃でグルコースイソメラーゼによるキシロースの異性化により 作られたキシルロースの２７８ｎｍにおける吸収の増大を測定することにより直 接に評価できた。この評価は、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａ及び０．１Ｍキシロースを 含む５０ｍＭ）リエタノールアミンバンファー、ｐＨ７，５中で行われた。評価 におけるグルコースイソメラーゼ最終濃度°は約０．０１Ｂ／　ｍｌであり、１ ．　ＯＢ７ｍｌの酵素溶液についての２７８ｎｍでの吸光係数１．０８を用いて 吸収スペクトルにより、酵素評価混合物での希釈の前に正確に測定された。 Ｄ−ソルビトール　デバイドロゲナーゼ共役評価において、Ｄ−キシルロースの 酵素的測定は、５０ｄ）リエタノールアミン、ｐＨ７，５、ｌｏｍＭ　ＭｇＳＯ ４及び０．１Ｍキシロース中で２Ｘ１０−＠ＭＤ−ゾルビトール　デバイドロゲ ナーゼ（Ｌ−イディトール：ＮＡＤオキシドリダクターゼ、ＥＣ１，１，１，１ ４，）及び０．１５ｄ　ＮＡＤＨの存在下で既知のように（ケルスターズ（Ｋｅ ｒｓｔｅｒｓ）−ヒルダーソン（Ｈｉｌｄｅｒｓｏｎ）ら、１９８７）３５℃で 行われた。但し、インキュベーション　バッファーは１ｍＭエチレンビス（オキ シエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）　をも含んだ。この評価におけるグル コースイソメラーゼ最終濃度番銅２、５　ｘ　１０−３ｒｎｇ／　ｍｌであり、 上述のように正確に測定された。 紫色の生成物を与える、酸中でのケト糖とカルバゾールの反応に基づくシスティ ン−カルバゾール法（ディツシユ、（Ｄｉｓｃｈｅ）とボレンフロイント（Ｂｏ ｒｅｎｆｒｅｕｎｄ）、１９５１）を用いて異性化反応の間に作られるＤ−フラ クトース量を測定することにより、基質としてグルコースを用いてＧｌ活性を評 価できる。 電気泳動ゲル上でのＤ−キシロースイソメラーゼの可視化は、公知（ヤマナカ、 １９７１）のトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）を用いた。この 着色法は、糖がテトラゾリウム塩き反応して室温で不溶のホルマリンを形成する こきに基づく。 反応は室温でケトースに特異的であり、アルドースは１００ｔ：でのみ反応する 。ゲル上で活性キシロースイソメラーゼは従って桃−赤色の帯として同定されつ る。少しの修正を加えて、この活性テストをＰｈａｒｍａｃ４ａ　Ｐｈａｓｔ　 Ｓｙｓｔｅｍで用いた。簡単に云えば、電気泳動に続いて、陰性−ＰＡＧＥゲル をＰｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ着色室へ移し、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭ　Ｍ ｇＣ１ｘ　、０−１１１１Ｍ　ＣｏＣ１ｘを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ７ 中で５０℃で１５分間インキコベートし、脱イオン水で４℃で０．５分間洗った 後にゲルを、ＩＮ　ＮａＯＨ中で新規に調製した０、１％トリフェニル・テトラ ゾリウム　クロライド中で２０℃で３分間浸漬した。ゲルを２Ｎ　ＥＣ１中で１ ５分間インキュベートすることにより反応を停止し、最後に水で洗った（４℃、 ０．５分間）。 １、Ｂ、ＥｃｏＡｓ＋ｉ　（ＤＳＭ）Ｇｌの熱失活の動力学熱失活動力学実験は 、各場合について述べることに加えて金属不含グルコースイソメラーゼに対して 行われた。簡単に云うと、精製酵素を望むパンファー中で平衡にし、溶液を、指 示された温度に設定した循還水浴（Ｌａｕｄａ　ＲＭ　６　）に連結されたガラ スマントル中に予め挿入されたテフロンニードルを用いてハミルトン気密シリン ジ中に吸入する。予めの実験は、２５℃から８５℃への酵素溶液の温度平衡が１ 分間未満で達成されることを示した。適当な時に、一部分をエラペン　ドルフ　 チェープ中に吸入し、熱変性過程を、０℃にサンプルを冷却することにより停止 した。 あるいは、より大きなサンプルは、Ｒｅａｃｔｉ−Ｖｉａｌｇ　（ピアス（Ｐｉ ｅｒｃｅ）の夫々の分けたものとしてインキユベートされた。 総てのバッファーは、適当な場合には金属汚染を除去するためにＣｈｅｌｅｘ処 理された（Ｃｈｅｌｅｘ　−１００％　Ｂｉｏｒａｄ）、］、　Ｂ、ｌ　温度及 び金属依存性 ５０蒙Ｍ３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨ７， ２中で２５℃におけるＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）Ｇｌの熱失活の動力学 （ｐＫａ”−７，１５，２５℃、ｄＨ／’Ｃ−−０，０１１）を温度の関数とし て第１図（金属を加えず）、第２図（＋１０量Ｍ　ＭｇＳ　Ｏａ）及び第３図（ ＋１０ｍＭ　ＣｏＣｆｆ１ｚ　）に示す、すべてのデータ点は、用いた温度及び 金属イオンの存在及び性質に拘らず一次プロセスに対応する理論減少カーブによ く一致される。 データはまた、マグネシウム及びまたよりコバルトイオンの安定化効果を示す。 熱による酵素失活は不可逆であると見い出され、従って加熱は蛋白質凝集を誘発 することが示された。Ｍｇ！＋の存在下で、我々は酵素活性の損失が蛋白質沈澱 の程度とかなり良く相関することを示すことができた。 第４図は、第１〜３図のデータをまとめて示し、６０〜９５℃の温度範囲で金属 の有無に拘らずアレニウスプロットが直線であることを示す。 これらの結果は、ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）ＧＥの熱変性がテストされた総ての 条件下で単一の事象から生じていることを示す。同じ律速段階が金属存在及び不 存在下で支配的であるかどうかは判らない。しかし、アレニウスプロットの直線 性は、この段階が特定の組合せの実験条件のもとて一つしかないことを支持する 。 １、　Ｂ、２　ｐＨ及びイオン強度依存性安定化金属へのＧｌの親和性は、ｐ旧 こ強く依存する。特に、それはｐ）１６より下でかなり低減する。従って、Ｅｃ ｏＡａ＋ｉ　（ＤＳＭ）ＧＩの熱安定性へのｐＨの影響は、金属を添加せずに金 属不合酵素を用いて研究した。 ４．７〜８．３のＰＨ範囲で、７２℃ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）ＧＩの失活は常 に一次動力学に従う。第５図は、失活速度常数に、がｐＨ５，５〜６．７で事実 １変らず、しかしこのｐ’Ｈ範囲の両側で増大することを示す。 第６図は、添加金属なしての酵素の熱失活の動力学がイオン強度の関数として増 大することを示す。これは、ｐＨ依存性と共に、極性残基がＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ ＳＭ）ＧＩの熱安定性に関係することを示す。 この議論は、第７図のデータにより更に支持され、そこではｐＦ！のおだやかな 増大（すなわち７２℃でｐ）１６．７からｐＨ７，６へ）が塩化ナトリウムの不 安定性化効果を著しく増幅させたことが示されている。 １、　Ｂ、３．尿素及びシアネートの効果ＧＩは、４つの同じサブユニットから 成る４量体である（レイ（Ｒｅｙ）ら、１９８８）。 尿素の影響が、加熱の結果すなわちサブユニット解離及び／又は広がりとして酵 素活性の損失を説明しうる構造的変化を同定するために評価された。 酵素のオリゴマー化状態は、５０ｍＭ　Ｔｉｓ／ＨＣ１、ｐＨ８，０，２５℃及 び１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含む溶離バッファーを用いて室温で５ｕｐｅｒｏｓｅ 　−１２上でサイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により 、続いて室温で７Ｍ尿素中で酵素の長時間インキュベーションにより分析された 。 天然のＧｒは５ＥＣ−ＨＰＬ、Ｃ上で４量体として溶出する。第８図は、尿素中 での長時間インキュベーションが天然）：ｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）ＧＩ　４量体の ２量体への解離を誘発するために必要であることを示す。 シアネートが、溶液中で使用中の尿素から発生されると知られているので、シア ネートによる酵素の化学的変性が、観察されたサブユニット解離の原因であると 予想された。この仮説をテストするために、０〜２００ｍＭの範囲のシアネート 濃度を含む０．２Ｍ硼酸塩、ｐＨ８，５及び１５０ｍＭ　ＮａＣ１中で室温で１ ６〜２４日間酵素をインキニペートシ、新規に調製した５、０Ｍシアネート不含 尿素（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中の１０Ｍ尿素の新規に調製して準備した溶液）の不存 在又は存在下でのこれをメーカーの推奨に従いＡＧ５０１−Ｘ８　（Ｄ）樹脂（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のカラムに通した。この処理は、シアネートを含め夾９ｉ物を 除去する。 下記の観察がなされた。 １、　イソシアネート単独での処理は、５ＥＣ−ＨＰＬＣで（７）ＥｃｏＡｍｉ 　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）の溶出プロフィールを変え得なかった（第９Ａ図）、天然−Ｐ ＡＧＥは、負の電荷の増大により証拠づけられるように酵素の投与量依存的化学 的変性を示しく第９Ｂ図、上方）、シかしゲルのＴＴＣ−着色により示されるよ うに酵素活性の明らかな損失はなかった（第９Ｂ図下方）。 ２、　５．０Ｍシ７ネート不含尿素中テ（７）ＥｃｏＡ＋ａｉ　（ＤＳＭ）　Ｇ 　Ｉ　（Ｄ１６日間インキニベーシ曹ン後に、二量体形成は５ＥＣ−ＨＰＬＣで 見られなかった（第１０Ａ図）。しかし、天然のＰＡＧＥでは少しの二量体−二 量体解離が観察され（第１０Ｂ図上方、ＯｍＭ　ＮａＣＮ０）　、これは用いた 尿素濃度（５モル）では発生したシアネートが少しの化学的変性を誘発し、それ は四量体解離へと直接進まないが解離がＰＡＧＥの間に適用された電場の影響下 で進められ得ない程度に二量体−二量体解離を弱めることを示唆している。ある いは、尿素及び電場の結合した影響が四量体から二量体へのＭｕを引き起したこ とも提藁できる。 ３．５．０Ｍ尿素中のＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　ＳＭ）　ＣＩ　ヘのシアネートの同 時的添加は、濃度依存的に四量体から二量体への解離を容易に起す。これは、５ ＥＣ−ＨＰＬＣ（第１０Ａ図）及び天然ＰＡＧＥ　（第１０Ｂ図上方）の両者に より示めされた。イソシアネート高濃度でのインキュベーション後の二量体のＰ ＡＧＥでの遅延は、これら条件下で酵素が広げられることが増加したことの結果 であるかもしれない。天然ＰＡＧＥでは、二量体はＴＴＣ着色後にＧｌ活性を示 されなかった（第１０Ｂ図下方）。 この知見は、酵素活性が、ＣＩ−四量体の二量体への解離により及び／又は化学 的変性により失われることを示唆する。 結論として、シアネートと尿素の両者の存在は、ＥｅｏＡｗｊ（ＤＳＭ）ＣＩ４ 量体の二量体への解離を観察するために必要である。シアネート単独は効果がな い故に、酵素の四量体構造の安定化に関係する化学的に変性されるアミノ基は、 尿素なしでは溶媒アクセシプルでない。たぶん尿素は二量体／二量体相互作用を 不安定化し、それにより、それまでは二量体／二量体界面内に埋め込まれていた アミノ酸を露出させるのであろう。α及び／又はε−アミノ基を有するこれら残 基は、従ってシアネートによるカルバミル化に利用されうるようになる。そして 、サブユニット間コンタクト残基へのシアネートの共有結合は、酵素の二量体型 を安定化する＊　ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）Ｇ　ｌ四量体の二量体への解離はた ぶん熱変性の主な出来事であると考えつる。この仮説を支持して、高い蛋白質濃 度が熱による変性に対して酵素を安定化することが観察できたくデータ省略）。 １、　Ｂ、　４　グリケージ３ン 蛋白質は、グリケージ３ン、すなわちグルコース及び他の多数の糟によるα−及 びε−アミノ基の非醇素的変性を受けることが示される０通用条件（グルコース 高濃度、ｐＨ７，５及び長時間使用）のもとでＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　 ＣＩのグリケーションが同様に起るであろうことが予想された。特に、もしＥｃ ｏＡＬｌｉ　（ＤＳＭ）　Ｇ　１回置体が高温で二量体に解離するなら、尿素存 在下でシアネートと反応する同じアミノ基残基が四量体−二量体解離を伴ってグ リケージ３ンされて、たぶん触媒活性を失うことが予期される。 金属不含ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）ＣＩを、５０ｍＭ　ＭＯＰＳ、ｐ）１７．７ ．６０℃で、Ｄ−グルコース（２５０ｍＭ）なし又はありで６０℃でマグネシウ ム不存在でインキュベートシた。適当な時点で、少量を取出し、２５℃に冷却し 、２７８ｎｍでの直接キシルロース吸光度評価により残留酵素活性をテストした 。 第１１図Ａは、グルコースの存在が６０℃において酵素の熱失活速度をかなり増 大することを示す。この効果は、５０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６，０，４℃に対する徹 底的バー／　７７−交換がＥｃｏＡｎｉ（ＤＳＭ）ＧＩの触媒有効性を回復でき なかった（第１１図Ａ中の三角形）ので、可逆的でなかった。また、５ＥＣ−Ｈ ＰＬＣによる反応生成物の分析は、予想通りにグリケーションが時間依存的に四 量体−二量体解離を伴うことを明らかに示し、（第１Ｌ図Ｂ及びＣ）、この知見 は四量体開裂が高温で起るという議論を支持する。解離した二量体は、反応性ア ミノ基のグルコースとの共有結合変性によりトラップされ、たぶん二量体間コン タクトに留る。 第１１図りは、加熱が蛋白質凝集物の形成も起すことを示す。 この凝集は、グルコースの存在により大きく促進された。しかし、凝集物形成が Ｇｌの二量体への解離に依存して、又は単にそれに続いて起るのかは判っていな い。極めて似た結果が、別のバッファー系（１２，５ｄリン酸カリウム、ｐＨ７ ，７，６０℃）で再現できた。 尿素の存在はシアネートが安定なＧに量体を作るために必要であり、一方、グル コースは尿素の不存在下で高温で同じ特性を示すことは興味深い。従って、我々 は、尿素及び加熱は共に、ＥｅｏＡｗｊｉ　（ＤＳＭ）ＧＩｌ四量体二量体への 解離を起し、それによって二量体間界面に位置するアミノ基残基を露出すると結 論できる。以前はアクセスできなかったアミノ基がシアネート又はグルコースと の反応に使用できるようになり、モして二量体状態で酵素をトラップする。 １、Ｃ，アクチノブラーネス　ミズリーエンシスのグルコースイソメラーゼのサ ブユニット界面におけるリシン残基の同定Ｇｌは、四つの同じサブユニット（Ａ 、Ｂ、Ｃ，Ｄ）より成る四量体であり（レイら、１９８８）、二つのダイマー（ ＡＢ及びＣＤ）の集りと見ることができる。従って、二つのカテゴリーのサブユ ニット界面、すなわち一つの二量体内の単量体間の界面（二量体内界面）及び二 つの二量体間の界面（二量体間界面）を区別できる。 単離されたサブユニットにおいて計夏されたアクセシブルな表蘭積（ＡＳＡ）（ リー（Ｌｅｅ）とリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）　、１９７１）がオリゴマー 内の測定されたそれと異なるならば、一つの残基がサブユニット界面コンタクト に参加していると云われる。第２表は、単離された単量体内及びＧＩ四装置内の ２０のサブユニー／　）リシン残基についてのＡＳＡをまとめて示す、これら残 基の１１個は、サブユニット界面に参加していると見られる。Ｌｙｓ−１００と Ｌｙｓ−２５３のみがサブユニット界面で大きな面積（夫々１４９Ａ”及びｌｌ ０Ａ”）を埋める四量体中に最も完全に埋め込まれている。換言すれば、これら 残基の両者は、四量体中で低い溶媒アクセシビリティを持つ、また両残基は、Ｅ ｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）Ｇｌの触媒活性に含まれない。また、Ｌｙｓ−１００及び Ｌｙｓ−２５３は、サブユニット界面において静電相互作用に関係する。Ａサブ ユニット中のＬｙｓ−１００（Ａ−Ｌｙｓ−ｉｏｏ＞は、水素結合によりＢサブ ユニット中の位置３７３近傍の小さいラセンの最後の巻きを安定化する。一方、 Ａサブユニット中のＬｙｓ−２５３（Ａ−Ｌｙｓ−２５３）は、Ｃサブユニット のＡｓｐ−１９０とのイオン的二量体間相互作用に関与する。 モデル構築手法（デルハイス（Ｄｅｌｂａｉｓｅ）ら、１９８４、記述のような ）を用いて、Ｌｙｓ−１００の環境はＡｒｇへの置換を収容しそうになく、一方 、Ｌｙｓ−２５３のＡｒｇへの突然変異は、物理的接触がなく、かつＡ！１１１ −１９０とのイオン的相互作用が好都合なまま留る故に、立体的に可能であるこ とが判った。 １、Ｄ、アクチノプラーネス　ミズリーエンシスのグルコースイソメラーゼにお ける特定のりシン残基のアミノ酸置換本発明に従い、アルギニンでのＬｙｓ−２ ５３の置換は、二量体−二量体界面を横切る静電相互作用を安定化させ、それに より熱失活に対するＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）ＣＩの安定性を増す、また、この 置換は、位ｔ２５３での（グルコース又はシアネートでの）化学的変性を妨げる であろう。 ＥｃｏＡｍｉ（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　ＣＩの熱安定性におけるＡ−ＬｙＳ−２５３／Ｃ −Ａｓｐ−１９０イオン対の静電相互作用の重要性を評価するために、Ｌｙｓ− ２５３をグルタミンに突然変異させて、リシン側鎖のイオン性を除去した。この 突然変異は、他の点では合理的に保守的である。 位置指定突然変異生成は、ｐＭａ５−８及びｐＭａ５−８様のファスミドベクタ ー（スタンセンズ（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）ら、１９８７）を用いてギャップされ た二重ＤＮＡ　（ｇｄ　ＤＮＡ）法に従って行われた。突然変異生成戦略が、突 然変異されるべき領域の上流及び下流におけるユニーク制限部位の使用を必要と する故に、二つの追加的開裂部位が、エンコードされるアミノ酸配列を変えずに ＧＩココ−ィング配列に導入された。Ｋｐｎ１部位は、下記のオリゴヌクレオチ ドプライマー ５　’　−ＣＧＡＡＧＧＧＴＡＣＣＡＧＧ−３’を用いて位置１７７のＧをＡと するヌクレオチド塩基交換により作った。 Ｘｈｏ１部位は、下記のオリゴヌクレオチドプライマー５　’　−ＧＣＣＧＴＴ ＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＣＧ　−３’を用いて位置８２５のＧをＣに置き代える ことにより作った。 ＧＴＧのＡＴＣコドンへの転化（実施例１．Ａ参照）及びＫｐｎ１部位の作成は 、一つの突然変異生成実験で達成され、そこでは関係する酵素的にホスホリル化 されたオリゴヌクレオチドが、−重鎮ｐＭｃ５−Ｇｌ、及びｐＭａ５−Ｇｌの大 きなりａａＨＩ　−Ａａｔ　Ｕフラグメントから導かれたｇｄＤＮＡへとアニー リングされた。 Ｘｈｏ１部位は、別の実験で導入された。用いられたｇｄ　ＤＮＡは一重鎖ｐＭ ｃ５−Ｇｌ、及びｐＭａｓ−ｃｔの大きな５ａｃｌ　−Ｓｍａｌフラグメントか ら構成された。二重突然変異体及びＸｈｏｌ突然変異体の適当なフラグメントを 結合することにより、三つの突然変異を一つの遺伝子中にまとめた。得た三重突 然変異体をｐＭａ５−１と呼ぶ、相補的ｐＭｃ５−１は、Ｐ菖−ｇｉハイブリッ ド遺伝子を含むｐＭａ　５−１の少さなＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメント をｐ　Ｍ　ｃ　５−８のＥｃｏＲ１部位とＸｂａ１部位との間に挿入することに より構成された。 ｐＭａ５−１及びｐＭａ５−１は、野生種及び突然変異Ｇｌの両者の製造に用い られる基本的ベクターである。 下記の総ての部位指定突然変異生成実験において、ｐＭａ５−■の一重鎮形及び ｐＭａ５−１の適当なフラグメントから作ったｇｄＤＮＡを用いた。 １、Ｄ、１　リシン−２５３−グルタミンｇ　ｄ　ＤＮＡ（７）構築のために、 ｐＭａ５−１の大きな５ａｃｌ　−Ｘｈｏｌフラグメント及び下記のオリゴヌク レオチドブライマーを用いた。 ５　’　−ＣＣＴＣＧＴＣＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧ−３’突然変異酵素は良 好に表現された。基質としてキシロースを用いた比活性は、野生種ＥｃｏＡａ＋ ｉ　（ＤＳＭ）ＣＩのそれの９６％であった（第３表）。 金属不存在で５０ｍＭ　ＭＯＰ　Ｓ、　ｐＨ７，４，７２℃中での７２℃におけ る熱失活は、−欲動力学に従い、突然変異が変性速度常数の野生種の２．４Ｘ１ ０−”／分からに２５３Ｑの０．９／分へと６０倍の増大を引き起した（第１２ 図、Ａ）。 ５０ｄ　ＭＯＰＳＳｐＨ６，５，８５℃テ（７）１０＠Ｍ　Ｍｇ５Ｃ）４（７） 存在下で、−次減少速度常数はに２５３Ｑでは１．２／分の値を有し、野生種の それ（Ｋ勤−３，４Ｘ１０−３／分）の約３５０倍大きかった。 サイズ排除クロマトグラフィによるに２５３Ｑ酵素のオリゴマー構造の分析は、 完全な四量体を示した。しかし、０．２　Ｍ硼酸塩、ｐｕｓ、ｓ、０．１５　Ｍ 　ＮａＣｊ中のシアネート不合５モル尿素中での長時間インキュページ四ンは、 第１３図式に示すように、Ｋ２５３Ｑ突然変異体が二量体に容易に解離されるこ とを示した。第１３図Ｂは野生種及び突然変異酵素について二量体形成の進捗カ ーブを示すデータをまとめて示す、四量体の二量体への解離は、熱に敏感な突然 変異酵素において起り、野生種酵素では起らない。 上述の実験は、ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）０１分子の安定性の構造的基礎を調べ るものである。残基に２５３のグルタミンへの特定の変更は、温度及びまた尿素 に敏感な突然変異を起し、従って重要な相互作用の場所を同定する。突然変異体 の熱失活の受けやすさと、室温で尿素により起される四量体から二量体への解離 の程度の間に明瞭な関連が確かめられた。 １、Ｄ、２　リシン−２５３−アルギニンｇｄＤＮＡの構築のために、ｐＭａ５ −１の大きなＳａｃ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉフラグメント及び下記のオリゴヌクレオ チドブライマーを用いた。 ５　’　−ＣＣＴＧＧＴＣＧＡＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧ−３’ＥｃｏＡｍｉ　（ ＤＳＭ）ＣＩ突然変異体であるに２５３Ｒは良好に表現され、基質としてのキシ ロースに対して野生種の１２０％の酵素活性を示した（第３表）。 この突然変異体の熱安定性は、８２〜９２℃の温度で、５０ｍＭＮ−２−ヒドロ キシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＥＰＰＳ）　、ｐＨ７， ５、ＳｍＭ　Ｍｇ５Ｏｎ中でテストされた。 第４表は、Ｋ２５３Ｒ及び野生種酵素の半減期（時間）を示す。 結果によると、この温度範囲にわたってに２５３Ｒは常に野生種酵素より安定で ある。 高温でのグルコースによる失活に関し突然変異体に２５３Ｒの安定性を評価する ために、両酵素を１２．５ｍＭリン酸カリウムパンファー、ｐＨ７，７中で６０ ℃で２５０ｍＭＤ−グルコース存在下でインキュベートした。第１４図に約７０ 時間の失活の経過を示す。 データは、半減期が野生種の５倍に増大されたので、Ｋ２５３Ｒ突然変異体にお いて達成された、失活させる不可逆的な化学的変性に対する高められた保護を明 瞭に示す。 従って本発明は、より安定なＧｌをもたらす突然変異を操作するために成功裡に 用いられた。 陰性対照としてＬｙｓ−１００がアルギニンへと突然変異された。この場合、前 述のように新しい残基の不良な立体収容性が、酵素活性に影響することはないが 、安定性の低下をもたらすことが予想された。 １、Ｄ、３　リシン−１００→アルギニンｇｄＤＮＡの構造のために、ｐＭａ５ −１の大きなＫｐｎｌ　−ＡａｔＩＩフラグメント及び下記のオリゴヌクレオチ ドプライマーを用いた。 ５　’　−ＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧ−３’Ｋ１００ＲＧｌＯ 比活性は、基質としてキシロースを用いて２２単位／■であった。従ってこれは 、野生種ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）Ｇ１の活性Ｃ２４，Ｓ単位／■）と同等 である。しがし、この突然変異酵素の熱失活は５０ｍＭ　ＥＰＰＳ、　ｐＨ７， ５，８４℃、５ｍＭＭｇ５Ｏ，ｌ中でＫＤ−０，３／分であり、約１００倍速い 。 実施例　２ 増大した熱安定性及び化学的変性に対する増大した挺抗性を有するヒトＣｕＺｎ スーパーオキシド　ジスムターゼの突然変異体スーパーオキシド　ジスムターゼ （Ｅ、Ｃ，１，１５，１，１）は、下記反応に従いスーパーオキシド残基の過酸 化水素への転化を触媒する酵素である。 スーパーオキシド残基は、直接的又は間接的プロセスで多（の好気性生物学的酸 化（バニスター（Ｂａｎｎｊｓ　ｔｅｒ）ら、１９８７）でいたる所で発生され る。 ＣｕＺｎ５ＯＤは、ホモダイマーとして存在すると報告されている一般に極めて 安定な酵素である。各サブユニットは約１６，０００ダルトンの分子量を持ち、 一つのＣｕ（１１）及び一つのＺｎ（ＩＩ）を含み、そのパートナ−と非共有結 合相互作用により会合している。 従来の研究によると、ＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤ中のアミノ基に関係する化学的変性は 酵素活性の低下を伴う、Ｎ末端アミノ基がアセチル化されるので、リシンのＮ− ε−アミノ基は、そのような変性のための唯一の候補である。スクシニル化した ウシ酵素は活性を僅か１０％保持し、しかしまた０、　１％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上 で単量体へと自発的に解離しくマーモッチ（Ｍａｒｍｏｃｃｈ　ｉ）ら、１９８ ２）、一方、天然蛋白質の大部分は四量体として挙動する（ハーフ（Ｈａｒｔｚ ）ら、１９７２）。シアネートによるカルバミル化はまた、低減された活性を持 つ酵素を作る（ココ（Ｃｏｃｃｏ）ら、１９８２）。 ヒトＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤは同様に、グリケーション、すなわちアミノ基へのグル コースの非酵素的共有結合付着を受け、失活を伴うと見い出されている（アライ ら、１９８７ａ）。グリケートされる８位は、Ｌｙｓ−１２２及びＬｙｓ−１２ ８であると後に同定された（アライ、１９８７ｂ）。 Ｅ、　ｃｏｌｉ中でヒトＣｕＺｎ５ＯＤのｃＤＮＡのクローニングは、ハルウェ ル０１ａ１１ｅｗｅｌｌ）ら、１９８５及びヨーロッパ特許出願明細書Ｅ　Ｐ　 １３８１１１に記載された。ＣｕＺｎ５ＯＤ　ｃＤＮＡをエンコードするＤＮＡ 配列をｓｏｄと呼ぶことにする。 本発明に従い、いくつかのりシン残基をアルギニン残基で置換して、より高い熱 安定的及び／又は化学的変性に対するより高い安定性を持つ突然変異ＣｕＺｎ　 Ｓ　ＯＤ酵素を作ることができた。 ２、Ａ、　ヒトＣｕＺｎ５ＯＤのｃＤＮＡのクローニングｔａｃプロモーター（ デ　ボーア（Ｄｅ　Ｂｏｅｒ）ら、１９８３）に融合されたｓｏｄ遺伝子は、ヨ ーロッパ特許出願Ｅ　Ｐ　１３８１１１に記載されそしてＡＴＣＣにアクセツシ ョン番号３９６７９として寄託された、プラスミドｐｓＯＤ１１を収容するＥ、 　ｃｏｌｉ株Ｄ１２１０から得た。 ｔａｃ−ｓｏｄハイブリット遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、下記のように して分離された。プラスミドｐｓＯＤ１１を、Ａｃｏｌで部分的に消化し、フレ ノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）での処理により制限フラグメントをプラントエンド化し、 ３ａｌＮで消化した。ｔａｃ　−５ｏｄハイブリツド遺伝子を含む１２６０ｂｐ フラグメントを、３＋ｎａｌ及び５ａｌＩで消化されたプラスミドｐＭｃ５−８ の大きなフラグメントにリゲートした。リゲーション混合物を、Ｅ、　ｃｏｌｉ Ｗ　Ｋ　６　’；／　エル（Ｚｅｌｌ）とフリ７７　（Ｆｒｉｔｚ）、１９８７ ）の形質転換に用いた。形質転換体を、２５μｇ／ｒｒｄｌクロラムフェニコー ルを含むＬＢ寒天プレート上で選択し、分離したプラスミドＤＮＡを制限分析で 調べた。ｐＭａ５−８のＥＣｏＲｌ部位と５ａｌＩ部位との間にｔａｃ−ｓｏｄ ハイブリッド遺伝子を含むプラスミドをｐＭｃ　５−５ｏｄ　１１と呼ぶ。ｐＭ ｃ　５−５ｏｄ　１１の１２６０ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌを、ｐＭａ５−８の ＥｃｏＲ１部位とＸｂａｌｌＳ位に移して、ｐＭａ　５−５ｏｄ　１１を得た。 ｐ　Ｍ　ａ　／　ｃベクター中のｔａｃ−ｓｏｄハイブリッド遺伝子の完全さを 、マキサムとギルバー）（１９８０）に従う配列決定により調べた。この遺伝子 の配列を第１７図に示す。 組換Ｃｕ１ｒ＋Ｓ　ＯＤを得るために、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＷＫ６、又は、Ｅ、　 ｃｏｌｉのｓｏｄ　Ａｓｏｄ　Ｂ−株〔内在ＳＯＤ活性を失い（カーリオツ（Ｃ ａｒｌｉｏｚ）とトウアチ　（Ｔｏｕａｔｉ）　、１９８６）　、ｐＭａ　５− ５ｏｄ　１１　（又はｐＭｃ　５−５ｏｄ　１１）を含む〕の−夜培養物を、Ｘ 　ＯＯｐｐｔａ　ＣＩＪＳ○１．０．４６ｐｐｍ　１ｎｓＯｓ及び０．１　ｍｇ ／　ｍｌ　７　：／ピシリンを補われたＴＢ培地（１，２％［１ａｃｔｏ　）リ ブトン、２．４％Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、０．５％グリセロース、２８　ｍＭ　 Ｋ　８２　Ｐ　Ｏ−１？２ｍＭ　Ｋ、ＨＰＯ，）で１００倍に希釈した。細胞を 、ＯＤ　ｉｓｏ　ｎ　ｍ　＝　０．４の密度まで３０℃で振とうして成長させ、 この時点でｓｏｄ遺伝子の表現はＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク ト−ピラノシド、０．２５ｍＭ最終濃度）の添加により誘発された。細胞密度は 、６００ｎｍでの吸光度で測定して１５〜２５０Ｄに達した。細胞を、１６時間 の誘発期間の後に集め、ＰＢＳで洗い、そして凍結及び解凍した。遠心分離後に 、細胞ベレットを、２０ｍＭ　Ｔｉｓ／ＨＣ１！、５％グリセロール、ｐＨ８， ０の最小量に再懸濁して、２００／ｍｆのＯＤ、。。とじた。これらの条件下で 、両クローン、即ちＥ、ｃｏｌｉ　ＷＫ６　（ｐＭａ５−５ｏｄ　１）及びＷＫ ６　（ｐＭｃ　５−５ｏｄ　）は、５ＤＳ−１２，５％ポリアクリルアミドゲル （ラエムリ、１９７０）での（超音波処理により調製された）全細胞抽出物の分 析から明らかなように、可溶な１６ｋＤ蛋白質の効率的合成を指示した。誘導さ れない対照培養物と比べると、誘導された培養物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ蛋白質プロ フィールは、追加的な１６ｋＤ帯を含む。 １６ｋＤ蛋白質は、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＷＫ６　（ｐＭａ　５−５ｏｄ　１）中の 全蛋白質含量の約５〜７％及びＥ、　ｃｏｌｉ　ｓｏｄ　Ａｓｏｄ　Ｂ−（ｐＭ ａ　５−５ｏｄ　ｌ　）株中の１０〜１５％を成すと見積られた可溶液画分中に 存在した。精製は下記のように行われた。細胞懸濁物にリゾチーム（０，５ｍｇ ／ｍ！！、最終濃度）を加え、次に０．１　ｍＭＥＤＴＡとした。氷上で２０分 間インキュベート後に、フレンチプレスを用いて細胞を分解し、得た均質物を遠 心分離で明澄にした。ストレプトマイシン　スルフェート（０，５％）を上澄に 加え、４℃で３時間後に遠心分離で不溶物を除いた。次に得た１計０．０５ｍＭ 　Ｚｎ５Ｏ，及び０．１ｍＭ　Ｃｕ５Ｏ，とし、７０℃で３０分間加熱する前に ２５℃で２〜４時間インキュベートした。遠心分離で不溶物を除去した後に、明 澄な分解物を５０容の１０℃ＭＴｒｉｓ／　ＨＣｌ　、　ｐＨ８，０で４℃で２ 度透析し、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＣｐＨ８，Ｏ中の４０〜２００ｍＭ　Ｃ Ｈ３ＣＯＯＮａの勾配を用いて０−セファロースＦａｓｔ　Ｆｉｏｗ上でクロマ トグラフした。 ＳＯＤ含有画分は、Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅにより、及びＣｏｏｍａｓｓ ｉｐ株及び活性株（ビューチャンブ（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ）とフリドビッチ（Ｐ ｒ　１ｄｏｖ　１ｃｈ）、１９７１）での天然Ｆ　Ａ、　Ｇ　Ｅにより評価され る際に、プールされた。この段階で、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｓｏｄ　Ａｓｏｄ　Ｂ− 中で作られたＣｕＺｎＳ　ＯＤは、５ＤＳ−ＰＡＧＥで評価されたように、すで に高度に純粋であった。後者の酵素を更に５０容の１０ｍＭリン酸カリウム、ｐ Ｈ７，８に対して透析し、そのまま用いた。 Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＷＫ６株により作られた酵素の場合、Ｑ−セファロースからの ＳＯＤプールを１．４Ｍ硫酸アンモニウムとし、２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＣ１， ４Ｍ　（ＮＨＪ＊　ＳＯ４、ｐ）１８．０中で平衡にされたファルマシアフェニ ル　スパロースＨＲ１０／１０カラムでクロマトした。これら条件下で、ＣｕＺ ｎＳ　ＯＤは疎水性樹脂に結合せず、対照的に、硫酸アンモニウム濃度を約０． ７Ｍに下げたときにのみ溶出したＥ、　ｃｏｌｉ内在蛋白質夾雑物に結合した。 ＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤを含んだフェニル・スバロースからのボイドビークを、５０ 容の１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／　ＨＣＩ　５ｐＨ８，０に対して、バッファーを２ 度取換えて４℃で透析した。次に酵素を、２μＭＣｕＳ○４及び２ｎＳＯ４を含 む２０　ｍＭＴｒｉｓ／　ＨＣ１、ｐＨ８，０中でＭｏｎｏ　−ＱＨＲ５／　’ １０ランで濃縮し、０〜１６０ｍＭ　Ｎａ０Ａｃの勾配で溶出した。得た酵素を 最終に、１０ｍＭ’Ｊン酸カリウム、ｐＨ７，８のバッファ２度交換で透析し、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより夾雑物がないことを示した。 内在Ｅ、　ｃａｄｉ　ＳＯＤからのＳＯＤ活性が試料中に残っていないことを示 すことができた。 ウィンターポーン（Ｗｉｎｔｅｒｂｏｕｒｎ）ら、１９７５を少しかえて、ニト ロブルー　テトラゾリウム（ＮＢ、Ｔ）アッセイによりＣｕＺｎ５ＯＤを評価で きた。評価は、マイクロタイタープレートで行った。評価混合物は、５０ｍＭリ ン酸カリウム、ｐ）１８．７．５０μＭ　ＮＢＴ（ヤンセ７　（Ｊａｎｓｓｅｎ ））　、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ１００及び種々 の量のＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤを含んだ。反応は、蛍光ボックス上にセットしたマイ クロタイタープレートに２ｍＭリボフラビン−５′−ホスフェートＣＢｉｏ−Ｒ ａｄ）を加えることにより開始された。プレートをアルミニウム箔で覆い、１２ 分間インキュベートし、５４０ｎｍでの吸光度をＴｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉ ｓｋａｎ　Ｍ　ＣＣプレートリーダーで測定した。 ピロガロール　アッセイは、少しの変更を加えて本質的にマークルンド（Ｍａｒ ｋｌｕｎｄ）　とマークルンド、１９７４、記載の通りであった。簡単に云うと 、ピロガロール自己酸化のＣｕＺｒｒ　Ｓ　ＯＤ抑止は、０．０５ｍｇ／−のカ タラーゼ（メルク社のアスペルギルスニガーから）を含む５２．７＋ｅＭ　ＴＣ ＤＡパンファー中に、５２．７ｍＭ　Ｔｒｉｓ／カコジル酸、１．１　ｍＭジエ チレン　トリアミン四酢酸、ｐ）１Ｂ、２０　（ＴＣＤＡパンファー）及び０． ０５０１ｄの種々の濃度のＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤの０．９０−を含むアッセイ混合 物で行った。２５℃で１０分間のインキュベーシヨンに続いて、混合物を極めて 高速で攪拌して空気平衡を達成し、直ちに１１１Ｍカコジル酸（Ｓｅｒｖａ）中 の４．０ｍＭピロガロール（メルク）の０．０５０−を加えて反応を開始した（ １＋ａＭカコジル酸中のピロガロール貯蔵溶液は４℃で少くとも１日安定である ）０時間の関数として４２０　ｎｍでの吸光度の増大（ピロガロール自己酸化速 度を示す）を２５℃で６分間測定し、この間、直線性が観察された。加えたＣｕ Ｚｎ　Ｓ　ＯＤの関数としてのピロガロール自己酸化の抑止は、２５０〜３００ ｎｇ／−の酵素濃度まで線形であることが見い出された。 アクリルアミド　ゲル上のＳＯＤ活性は、Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ着色チャンバ ーでＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔ　Ｇｅｌの使用のために採用されたように ビューチャンブとフリドビンチ（１９７１）により記載されたアッセイを用いて 可視化できた。電気泳動に続いて、ゲルを最初に２．５ｍＭＮＥＴに５０℃で２ ０分間、次に２８ＢＭ　ＴＥＭＥＤ　（Ｂｉ。 −Ｒａｄ）、２８，１１Ｍリボフラビン−５′−ホスフェート（Ｂｉｏ　−Ｒａ ｄ）、及び０．１１℃Ｍ　ＥＤＴＡを含む３６ｍＭリン酸カリウム中に更に３０ 分間浸漬した０次にゲルを、十分なコントラストが得られるまで（１５〜２０分 間）蛍光ボックスを用いて照射し、次いで１０％エタノール、５％酢酸中に３０ 分間浸漬して固定した。ゲルを乾燥する前に１０％酢酸、１５％グリセロールに ３０分間浸すことにより、ゲルは保存できた。 蛋白質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンでのプラトフォード　アッセイに より測定した。 ２、Ｂ、　残基の同定 ヒトＣｕＺｎ５ＯＤは、三次元構造が高度に判っている（プルンクヘプン　デー タベース　ｐｄｂファイルｐｄｂ　２ｓｏｄ　、クイナ−（Ｔａｉｎｅｒ）ら、 １９８２）ところのウシ（Ｂｉｓ　Ｆａｕｒｕｓ）酵素と約８０％の同一性を示 す（第１８図）、従ってヒ）ＣｕＺｎＳＯＤの構造は、鋳型（テンプレート）と してウシＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤを用いて誘導できる（ハレウェルら、１９８９）。 ウシＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤ結晶構造の検査は、酵素の熱安定性を改善するためにＬ ｙｓ　−９をアルギニンへと突然変異させるための可能性ある候補であることを 示す。 ヒトＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤの検査によると、グリケーションに関係されるＬｙｓ− １２２及びＬｙｓ−１２８（ウシＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤでは夫々Ｌｙｓ　−１２０ とＡｒｇ−１２６）が完全に溶媒アクセシブルであり、電荷不変の故にアルギニ ンでのそれらの置換はＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤ構造中に良好に収容されるはずである 。従って、Ｌｙｓ−１２２及びＬｙｓ　−１２８は、グリコースにより作られる ような化学的変性及びその結果としての失活を除ぐために、アルギニンへと突然 変異された。 ヒトＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤの構造は、下記のようにしてウシＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤの 構造から誘導できる。 ヒトＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤと異りかつ０サブユニツトにおいてＬｙｓ　−９の１０ オングストローム半径内に一以上の原子を持つ総ての残基をヒ）　ＣｕＺｎ　Ｓ 　ＯＤ中の対応する残基で置換することにより、一つのモデル（モデルＩ）が得 られた。追加又は削除は必要とされなかった。下記の置換が行われるべきであっ た：　０−Ｔｈｒ−１７＞　Ｉ　ｌｅ。 （矢印は置換現象を示し、たとえばＯＴｈｒ−３４＞Ｌｙｓは０鎮中の位置３４ のＴｈｒがＬｙｓに置き換ったことを示す。）ヒトＣｕＺｎ５ＯＤと異なりかつ Ｏサブユニット中のＬｙｓ−１２０又はＡｒｇ　−１２６から１０オングストロ ーム半径内に一以上の原子を持つ総ての残基をヒ）ＣｕＺｎＳＯＤ中の対応する 残基で置換して、別のモデル（モデル■）が得られた。追加又は削除は必要なか った。下記の置換が行われるべきであった：ＯＡｓｐ−４０＞Ｌｅｕ　、　ＯＰ ｒｏ−１２１＞Ａｌａ　、ＯＡｒｇ−１２６＞Ｌｙｓ２つのモデルの各々につい て、置換は、水分子の不存在下で上記リストに示した順序で、完全な原子の詳細 さでもって行われた。 主鎖原子は、ウシＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤ鋳型から取られた。側鎖配向は、０〜３６ °間隔で３０のステップにおいて側鎖二面角の各々を変える徹底的なマツプ計算 及び最小エネルギーを持つ配置の選択により決定された。ＯＬｙｓ　−９＞Ｌｙ ｓ　ｉ！倹がまた、エネルギーマツプで行われ、対応するヒトＣｕＺｎ　Ｓ　Ｏ Ｄコンフォメーションを模した。この置換に続いて、結晶水分子をＣｕＺｎ　Ｓ 　ＯＤ構造に加え、モデルを５００ステツプ共役勾配エネルギー最小化に付し、 導入された側鎖のものを除く総ての重い原子を保持した。簡便のために、ヒトの ナンバリングを用いることにする。 モデル■では、Ｌｙｓ　−９残基がＡｒｇに変えられ、モデル■ではＬｙｓ−１ ２２又はＬｙｓ−１２８がアルギニンに変えられた。これら置換の各々について 、上述の同じ手順を行った。 三つのりシン残基の環境及び三つのアルギニン突然変異の環境の分析によると、 これら残基の総てが溶媒に完全に露出され、立体的に収容される（第５表、負の 非結合エネルギー）。 本発明に従い、これら残基のアルギニンへの突然変異は、改善された熱安定性を もたらすことが予期される。第５表がら、５ＯＤ−に９Ｒにおいて蛋白質の０１ ０−０１４ループ領域が安定化されること、及び５ＯＤ−ＷＴ中のＬｙｓ　−９ に比べてＡｒｇ　−９はより多数のかつ一般により強い水素結合に関係すること が判る。 Ｋ１２８Ｒ突然変異の安定性は、ヒ）ＣｕＺｎＳＯＤには存在しない一つの水素 結合の形成（第５表参照）により更に増すであろう。 他方、Ｋ１２２Ｒ突然変異の安定性は、ヒトＣｕＺｎ５ＯＤには存在しない二つ の水素結合の形成（第５表）により更に増すであろう。 また、Ｌｙｓ　−１２２とＬｙｓ　−１２８のアルギニンでの置換は、Ｌｙｓの Ｎ−ε−アミノ基により受けた化学的変性を廃するであろうことが予想される。 ２、　Ｃ部位指定突然変異生成 位置９．１２２及び／又は１２８におけるリシン残基のアルギニンでの置換は、 下記のように構築されたキャブされたＤＮＡ分子を用いた。 −に９Ｒ突然変異のためにニー重鎖ｐＭｃ　５−５ｏｄ　１がら、ｐＭａ　５− ５ｏｄ　１からの大きなＥｃｏＲＩ　−Ｓｔｕ　Ｉフラグメント、及び下記のオ リゴヌクレオチド ５　’　−ＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＣＡＡＡＡＣＡＣ−３’−に１２２Ｒ突然変 異のために゛ニー重鎮ｐＭｃ　５−５ｏｄ　１から、ｐＭａ　５−５ｏｄ　ｌか らの大きなＳ　ｔｕ　Ｉ　−Ｓ　ｔｙ　Ｉフラグメント及び下記のオリゴヌクレ オチド ５’　−ＧＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣ口　−３′−に１ ２８Ｒ突然変異のためにニー重鎮ｐＭｃ　５−５ｏｄ　ｌから、ｐＭａ５−ｓｏ ｄｌからの大きなＳ　ｔｕ　１−　Ｓ　ｔｙ　Ｉフラグメント及び下記のオリゴ ヌクレオチド ５’　−ＣＡＴＴＴＣＣＡＣ口ＧＣＧＧＣＣＣＡＡＧＴＣ−３’二重突然変異５ ＯＤ−に１２２Ｒ／に１２８Ｒは、−重突然変異のどちらか一方を用いて適当な 突然変異生成により作られた。 ２、Ｄ、　ヒトＣｕＺｎＳ　ＯＤのに９Ｒ突然変異体の熱安定性の評価５ＯＤ− ＷＴ及び５ＯＤ−に９Ｒの失活速度は、固定した温度で測定した。即ち、金属の 存在及び不存在の両者で２ｍＭ！Ｊン酸カリウム、ｐＨ７，８中で８５℃でＳＯ Ｄをインキュベートしながら、適当な時間間隔で少量を採り、０℃に冷却した。 ２５℃でピロガロールアッセイを用いて測定した残留酵素活性を第１９図に示す 。 減少は一次動力学に従う。金属不存在及び存在下での５ＯＤ−ＷＴの８５℃での 失活速度常数は、夫々０．０６／分、０．０４／分であった。これは夫々、１２ 分間、１７分間の半減時間に対応する。５ＯＤ−に９Ｒの８５℃での熱失活速度 常数は、夫々０．０１／分、０．００７／分であり、従って半減時間が夫々６５ 分間、９８分間に増大した。 ２、Ｅ、　ヒトＣｕＺｎ５ＯＤ−Ｋｌ　２２Ｒ／Ｋｌ　２８Ｒの評価ＣｕＺｎ５ ＯＤ−Ｋ　１２２　Ｒ／Ｋ　１２８　Ｒ二重突然変異についてグリケーションに 対する、ＬｙｓからＡｒｇへの突然変異の保護効果を評価するために、野生種及 び突然変異酵素の両者を、０．ＩＭα−Ｄ−グルコースの不存在又は存在下で０ ．２　Ｍ　ＩＪン酸カリウム、ｐＨ７，３５中で６０℃でインキュベートした。 適当な時点に少量を取ａし、直ちに０℃に冷却し、ｌｎｇ／ｍｆカタラーゼを含 む５２．７　ｍＭＴＣＤＡの貯蔵溶液で５００倍に希釈し、そしてピロガロール アッセイで酵素活性を測定した。 第７表の結果から、アルギニンによる１、ｙｓ−１２２及びＬｙｓ　−１２８の 置換により、グリケーション誘発失活に対するかなりの保護が実現されることは 明らかである。 また、グルコース不存在の場合でさえ、６０℃でのＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤ−に１２ ２Ｒ／に１２８Ｒの安定性はＣｕ２ｎ５ＯＤ−ＷＴのそれよりかなり高い。 位置９及び１２０にアルギニンを含むようにウシＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤを操作する 。得られる酵素は、野生種ウシＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤより安定である。 本発明は従って、より安定なＣｕＺｎ　Ｓ　ＯＤをもたらす突然変異を操作する ために成功裡に用いられた。 実施例　３ 増大された熱安定性を持つ、バチルス　ズブチリスからのグリ七ルアルテ°ヒト ー３−ホスフェート　テ°ハイドロゲナーゼ（ＧＡ、ＰＤＨ）の突然変異体 グリセルアルデヒド−３−ホスフェート　デバイドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ−Ｅ 、Ｃ，１，２，１，１２）は、解糖において下記の可逆反応を触媒するホモ四量 体酵素である。 グリセルアルデヒド−３−ホスフェ−）＋ＮＡＤ”　＋ＨｓＰＯ。 −ｉ。３−ジホスホグリセラー）＋ＮＡＤＨ＋Ｈ”バチルス　ステアロサーモフ ィルス（Ｂｓｔ）（スカーテンスキー（Ｓｋａｒｚｙｎｓｋ　ｉ）ら、１９８７ ）から及びロブスタ−（モラス（Ｍｏｒａｓ）ら、１９７５；ビーセラカー（Ｂ 　１ｅｃｅｃｋｅｒ）ら、１９７７）からのＧＡＰＤＨの３次元構造は決定され ている。 これら二つのＧＡＰＤＨは、熱安定性においてかなり異り、ＢｓｔＧＡＰＤＨが ロブスタ−ＧＡＰＤＨよりはるかに安定である。これら二つの酵素間の熱安定性 の差は、ロブスタ−酵素にはないＢｓｔ　ＧＡＰＤＨ中のサブユニシト間ブリフ ジの存在から生じていると示唆されていた（ビーセラカーら、１９７７；スカー チンスキーら、１９８７）、Ｌかし、他の熱安定な（たとえばセルムス　アクエ チカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からの）及び熱不安定なＧＡＰ ＤＨ（たとえばブタ、酵母）との比較は、この酵素の熱安定性に一つの因子が原 因しているのではないことを示した。即ち、疎水性相互作用の程度、サブユニッ ト間水素結合及びイオン対における差ならびに表面残差の差が総て、熱安定性の 差を説明するために包含された（ウォーカーら、１９８０、アルゴス（Ａｒｇｏ ｓ）、１９８９）。 バチルス　ズブチリス株ＢＲ１５１においてＧＡＰＤＨをコードする遺伝子（ヤ ングら、１９６９；バチルス遺伝子ストックセンターＮ　ｌＡ４０）（Ｂｓｕ） がクローンされ、配列決定された（ビエーン（ν１ａｅｎｅ）　ら、１９８８； ビエーンとダーセ（Ｄｈａｅｓｅ）、１９Ｂ９）、この遺伝子をｇａｐと呼ぶこ とにする。 ＢｓｕからのＧ　Ａ、　Ｐ　Ｄ　Ｈは極めて不安定であると判った。この酵素の 熱安定性を増すために、本発明に従い我々はＬｙｓ　−２８２又はＡｒｇ−２８ ２へのＧｕｙ−２８２の部位指定突然変異生成により、サブユニット界面を横切 る塩ブリッジを導入した。この二つの突然変異体を夫々ＧＡＰＤＨ−Ｇ２８２Ｋ 及び（、ＡＰＤＨ−Ｇ２８２Ｒと呼ぶ、これら変化のいずれも野生種ＧＡＰＤＨ （ＧＡＰＤＨ−ＷＴ）に比べ熱安定性を著しく増大すると予想できた。また、Ｇ Ａ、ＰＤＨ−Ｇ２８２ＲはＧＡＰＤＨ−Ｇ２８２によりも熱安定であると予想さ れる。 ３．Ａ、バチルス　ズブチリス　ＧＡＰＤＨの単離及びクローンニング 単離された組換プラスミドｐＢｓｇａｐ−１（ビエーンら、１９８８）は、Ｐ、 ダーゼ（ベルギー、Ｒｉｊｋｓｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ　Ｇｅｎｔ）から得ら れた。このプラスミドは、ｐＵｃ１８（ヤニツシエーベロン（Ｙａｎｎ　１ｓｃ ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）ら、１９８５）のＢａｍＨＩ部位に挿入されたｇａｐミルコ ーティング域を含む部分的５ａｕ３Ａフラグメントより戊る。 Ｅ、　ｃｏｌｉ中のＢｓｕ　ＧＡＰＤＨの高レベルでの産生は、ｇａｐ遺伝子を ハイブリッドｔｒｐ　−１ａｃ　（すなわちｔａｃ　）プロモーターの転写制御 下に置くことにより得られる（デ　ボーアら、１９８３）。 表現ベクター構築物は、下記の三つのＤＮＡフラグメントをリゲートすることに よって得られた。 （ａ）　下記のようにして得たｔａｃプロモーター。プラスミドｐＭＴ４１６（ バー）レイ　（Ｈａｒｔｌｅｙ）、１９８８）をＢａｍＨｌで消化した。突出し ている５′末端をフレノウで処理してプラントエンド化した。最後にＤＮＡをＥ ｃｏＲＩで消化した。ｔａｃプロモーター含む小さな（＋／−１’　０７　ｂｐ ）のフラグメントがゲルから単離された。このフラグメント上のｔａｃプロモー ターの配位は、転写がＢａｍＨ１部位の方に進むようなものである。 ら）ｐＭａ５−８の大きな、ゲル精製したＥｃｏＲＩ　−ＸｂａＩ　７ラグメン ト。 （ｃ）　ｇａｐミルコーディングを含むｐＢＳｇａｐ−１の１２５５ｂｐのＤｒ ａｌ−Ｘｂａｌフラグメント。このフラグメントはまた、ｇｅｌから溶離された 。ＤｒａＩ開裂部位は、ＡＴＧ開始コドンから１６ヌクレオチド上流に位置する 。Ｘｂａ１部位は、ｐＵｃ１８多制限部位リンカ−中にある。 ２Ｓμｇ／−クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートで選択してＥ、　ｃ ｏｌｉ　ＷＫ６　（ツェルとフリンジ、１９８７）を形質転換するために、リゲ ーション混合物を用いた。プラスミドＤＮＡを、い（つかの選択された形質転換 体から単離し、制限分析により特徴づけた。望む構造を持つプラスミド、即ちｐ Ｍｃ　５−８のＥｃｏＲ１部位とＸｂａ１部位の間に挿入されたｔａｃ　−ｇａ ｐ　Ａイブリント転写ユニットを同定し、ｐＭａ５−ｇａｐ　１と名付けた。 ｔａｃ−ｇａｐミルハイブリッド子の配列を第２０図に示す。突然変異生成のた めに、このベクターのｐ　Ｍ　ａタイプのものが、ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ　Ｉ　ｔ ａｃ−ｇａｐミル表現モジュールＭａ５−８上へ移すことにより構築された。得 たプラスミドをｐＭａ５−ｇａｐｌと呼ぶ。 Ｂｓｕ　ＧＡＰＤＨの誘発合成のために、ｐＭａ５−ｇａｐ−１又はｐＭａ５− ｇａｌｌを含むＥ、　ｃｏｌｉ　ＷＫ６の一夜培養物を、適当な抗生物質（夫々 １００μｇ／ｗｌアンピシリン又は２５μｇ／−クロラムフェニコール）を含む ＴＢ培地（１，２％Ｂａｃｔｏ　−）リブトファン、２．４％　Ｂａｃｔｏ−ｕ 母抽出物、０．５％グリセロール、２８ｍＭ　ＫＨｚ　Ｐｏｐ　、７２ｍＭ　Ｋ ２　ＨＰＯ４）で１００倍に希釈した。細胞をＯＤｔｈｓｏ−”　１の音度まで ３７℃で振とうして成長させた。この時点でｇａｐ遺伝子の表現は、ＩＰＩＧ（ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、０．１　ｍＭ最終濃度）の添 加により誘発された。約１６時間の誘発期間の後に遠心分離で細胞を集めた。 これらの条件下で二つのクローン、すなわちＥ、　ｃｏｌｉ　ＷＫ　６（ｐＭａ ｓ　−ｇａｐ　１）とＷＫ６　（ｐＭａ５−ｇａｐ　１）は、５ＤＳ−１２，５ ％ポリアクリルアミドゲル（ラエミリ、１９７０）での全細胞抽出物の分析から 明らかなように、可溶性の３５ｋＤ蛋白質の効率的合成を指示する。誘発されな い対照培養物と比べると、誘発された培養物の蛋白質プロフィールは、有望な３ ５ｋＤ帯を含む。 全蛋白質含量の少くとも３０％にのぼると推定される可溶性画分中に、組換蛋白 質が存在した。精製すると、それは、天然及び５ＤＳ−ＰＡＧＥの両者でバチル ス　ズブチリスＢＲ１５１から単離された真正のＧＡＰＤＨと同じに挙動するこ とが見られた。 組換Ｂｓｕ　ＧＡＰＤＨは、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＷＫ６　（ｐＭａ　５−ｇａｐ＞ （上記参照）の誘発された培養物から下記のように精製された。 細胞をＰＢＳで洗い、凍結し、解凍し、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）と ５０１Ｍ　ＥＤＴＡを含む０．１　Ｍ　）リエタノールアミン、ｐＨ７，５中に 再懸濁した（２００００　／ｒｎｌ）。リゾチームを最終濃度ｌｌｌ１ｇ／ｒｎ １に加えた。氷上で２０分間後に、フレンチプレスを用い（２Ｘ）で分解した。 細胞の破片を遠心分離で除いた。ストレプトマイシン　スルフェートを０．５％ の最終濃度で加えた。１時間後に、遠心分離で不溶物を除き、上澄をＮＡＤゝの １ｍＭとし、次に硫酸アンモニアの７５％とした。ＧＡＰＤＨ活性の約９５％が 可溶性画分に残った。上澄を硫酸アンモニウムの１００％とし、４℃で一夜イン キユベートした。次に遠心分離で蛋白質を集め、１ｍＭ　ＤＴＴ、ＬｍＭ　ＥＤ ＴＡ及びｒｍＭ　ＮＡＤ″″を含む０．１Ｍトリエタノールアミン、ｐ）１７． ８に溶解した。残留する硫酸アンモニウムは、同じバッファーで平衡にされたＰ Ｄ−１０（ファルマシア）脱塩カラムに通すことにより除去された。最終生成物 は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより評価すると、少くとも９０％純粋であった。 蛋白質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いてバイオラド法により測定 した。 ３、Ｂ、残基の同定 Ｂｓｕ　ＧＡＰＤＨの３Ｄ（３次元）構造は、モデルビルディングにより既知の Ｂｓｔ　ＧＡＰＤＨ（ブルックヘブンデータベースｐｄｂファイルｐｄｂ１ｇｄ ｌ、スカーチンスキーら、１９８７）から誘導された。Ｂｓｕ及びＢｓｔ　ＧＡ ＰＤＨの一次構造（プランランド（Ｂｒａｎｌａｎｔ）ら、１９８９）からのＢ ｓｔ　ＧＡＰＤＨの配列）の比較は、配列が８０％同じであることを示した（第 ２１図）。 従って、Ｂｓｕ　ＧＡＰＤ８３次元構造は、鋳型としてＢｓｔ酵素の構造を用い て誘導できた。　− Ｂｓｔ　ＧＡＰＤＨの３次元構造の分析は、Ｂｓｔ　ＧＡＰＤＨのＰ及びＱサブ ユニット内のＡｒｇ−２８１残基が、夫々サブユニットＱ及びＰ中のＧｌｕ　− ２０１残基と塩ブリフジを形成することを確認した（スカーチンスキーら、１９ ８７）　、　Ｂｓｕ　Ｃ；ＡＰＤＨ中の対応する残基は、Ｇｌｙ−２８２である 。 各サブユニット中のＡｒｇ　−２８１残基の直近のＢｓｔ　ＧＡＰＤＨの３次元 構造は、これら４つのＡｒｇ−２８１残基の１０オングストロームの範囲内に一 以上の原子を持つ総ての残基を、Ｂｓｕ酵素中の対応する残基で置換することに より変えられた。挿入又は削除は必要ない、下記の置換が行われた。 ＯＬｙｓ−４５＞Ｇｉｎ、ＯＡｒｇ−５２＞Ｌｙｓ、ＯＬｅｕ−１９３＞Ｔｙｒ 。 Ｏ５ｅｒ−２０２＞Ａｓｎ、ＯＶａｌ−２３９＞Ｌｅｕ、ＯＡｒｇ−２８１＞Ｇ ｌｙ。 Ｏ５ｅｒ−２８６＞Ａｓｎ、ＯＴｈｒ−３１５＞Ｓｅｔ、Ｐ　Ｌｙｓ−４５＞Ｇ ｉｎ。 Ｐ　Ａｒｇ−５２＞Ｌｙｓ、Ｐ　５ｅｒ−２０２＞Ａｓｎ、Ｐ　Ｖａｌ−２３９ ＞Ｌｅｕ＋Ｐ　Ａｒｇ−２８１＞Ｇｌｙ、Ｐ　５ｅｒ−２８６＞Ａｓｎ、Ｐ　Ｔ ｈｒ−３１５＞Ｓｅｔ。 Ｑ　Ｌｙｓ−４５＞Ｇｉｎ、Ｑ　Ａｒｇ−５２＞Ｌｙｓ、Ｑ　５ｅｒ−２０２＞ Ａｓｎ。 Ｑ　Ｖａｌ−２３９＞Ｌｅｕ、Ｑ　Ａｒｇ−２８１＞Ｇｌｙ、Ｑ　５ｅｒ−２８ ６＞Ａｓｎ。 Ｑ　Ｔｈｒ−３１５＞Ｓｅｔ＋　ＲＬｙｓ−４５＞Ｇ１ｎ＋　ＲＡｒｇ−５２＞ Ｌｙｓ＋Ｒ５ｅｒ−２０２＞Ａｓｎ、ＲＶａｌ−２３９＞Ｌｅｕ、ＲＡｒｇ−２ ８１＞Ｇｌｙ。 Ｒ５ｅｒ−２８６＞Ａｓｎ、　ＲＴｈｒ−３１５＞Ｓｅｒ。 置換は、実施例２に述べたのと同じ手順に従い、上記リストの順序で行った。主 鎖原子は、Ｂｓｔ　ＧＡＰＤＨ鋳型から取られた。 Ｂｓｕ　ＧＡＰＤＨの得られたモデルされた構造が今や、Ｇ２８２Ｋ及びＧ２８ ２Ｒ突然変異を評価するために用いられうる。簡便のためにＢｓｕ　ＣＡＰＤＨ のアミノ酸番号付けをすべて用いることにする。Ｇｕｙ−２８２残基は、上述と 同じ手順でＬｙｓ又はＡｒｇに変えられた０表６に、Ｌｙｓ−２８２及びＡｒｇ −２Ｂ２残基に関係するサブユニアト間コンタクトを特徴づける計算（Ｐ　−Ｌ ｙｓ　−２８２及びＰ　−Ａｒｇ−２８２について行った）の結果をまとめる。 この結果によると、Ｌｙｓ　−２８２はサブユニット　インターフェース（界面 ）（ＡＳＡｂ　−１１０，４Ａ）内に立体的に収容される）（負の非結合エネル ギー）が、イオン的なサブユニット間相互作用はなされない、唯一の観察される 形成されるサブユニアト間水素結合は、Ｏ−Ｇｉｕ　−２０１，０とであり、こ れはＢ　ｓｕ　ＧＡＰＤＨ−ＷＴに比べての熱安定の１加に対応するであろう。 Ａｒｇ−２８２も、サブユニットインターフェース内に立体的に収容される。　 Ｏ−Ｇｌｕ　−２０１，０との水素結合は、Ｌｙｓについて観察されるものに比 べて、ただ単にはるかに大きくはないが、Ｑ　−Ｇｌｕ　−２０１のカルボキシ レートとの塩ブリフジがまた形成される。従って、サブユニットの間の静電相互 作用が改善されることが予想され、Ｂｓｕ　ＧＡＰＤＨ−Ｇ２８２Ｋに関して熱 安定性の増大をもたらすであろう。 ３、Ｃ，Ｂｓｕ　ＧＡＰＤＨ−ＷＴの部位指定突然変異生成Ｇ１３ｌ−２８２の りシン又はアルギニンへの変換は、−重鎖ｐＭｃ５−ｇａｐ　１　（鋳型鎖）及 びｐＭａ５−ｇａｐ　１　（ギャップされた鎖、第２０図参照）の大きな５ｔｙ ｌ−Ｃ１ａｌフラグメントから構築されたギャップされたＤＮＡ分子、及び下記 のオリゴヌクレオチドを用いた； リシンの導入のためには ５　’　−ＧＴＴＴＣＣＧＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＴＧＧＣ −３’そしてアルギニン突然変異体の構築のためには５　’　−ＣＧＴＴＧＴＡ ＧＴＣＧＣＧＡＧＡＡＡＣＴＡＡＴＧＧ−３’３、Ｄ、ＧＡＰＤＨ−ＷＴと比べ てＧＡＰＤＨ−０２８２Ｋ及びＧＡ、ＰＤＨ−Ｇ２８２Ｒの熱失活の評価３、Ｄ 、１．　酵素的アンセイ 野生種及び突然変異体のＧＡＰＤＨ活性は、刊行物記載（ミセント（Ｍｉｓｓｅ ｔ）　ら、１９８６）の方法を用いて測定した。 アンセイ混合物は、０．１　Ｍ　）リエタノールアミン　パンファー、ｐＨ１， ５中に５．５ｍＭグリセラード−３−ホスフェート、１ｍＭＡＴＰ。 ５ｍＭ　Ｍｇ５Ｏｎ　、１ｍＭ　ＥＤ’ＴＡ、、　１ｍＭ　ＤＴＴ、　０．４２ ｍＭＮＡＤＨ１２５μｇ／−ホスホグリセラード　キナーゼ（酵母から）及び約 ０．３μｇ／ｙＪ　ＧＡＰＤＨを含んだ。総ての試薬はべ一すンガーマンハイム （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ＋ａ）から入手した。 ３４０１ｍでのＮＡＤＨ吸収の消失をモニターすることによって、当初の速度を 測定した。１単位は、２５℃で１分間当り１μモルのＮＡＤＨの消失を起すのに 必要な酵素量と定義する。比活性は、ＧＡＰＤＨ−ＷＴでは４８．４単位／ｍｇ 、　Ｃ；ＡＰＤＨ−２８２Ｒでは５４．２単位／ｍｇ、　ＧＡＰＤＨ２Ｂ　２　 Ｋでは６９単位／ｍｇであると測定された０両突然変異体とも、ＧＡＰＤＨ−Ｗ Ｔに比べて比活性の減少を示さない。 ３、Ｄ、２．熱失活実験 第一の実験では、０．０５−蛋白質サンプルを種々の温度で１５分間インキュベ ートした。インキュベーシツン混合物は、０．１Ｍトリエタノールアミン　パン ファー、ｐ）１７．８中に４０単位／ＩＲＩＧＡＰＤＨ，１ｍＭ　ＤＴＴ、１＋ ｍＭ　ＥＤＴＡ及び　１ｍＭ　ＮＡ、Ｄ”を含んだ、失活進行は、０．１　Ｍ　 ）リエタノールアミン、ｐＨ７，８中に１＋ｇ／−ウシ血清アルブミン、１ｍＭ 　ＤＴＴ、１蒙Ｍ　ＮＡＤ”及び１１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む水冷溶液０．４５Ｍ ＆を加えることにより停止された。残留活性を測定し、第２２図に示す。５０％ 残留活性の温度は、野生種（ＧＡＰＤＨ−ＷＴ）では約　５０℃、ＧＡＰＤＨ− ２８２にでは７２℃、ＧＡＰＤＨ−２８２Ｒ突然変異体では７５℃であった。 第二の実験は、固定した温度でこれら酵素の失活測定を測定することを可能にし た。すなわち７４．５℃でのインキュベーシツン中に、適当な時点でサンプルを 採った。失活進行は、０℃のウシ血清アルブミンを含むＮＡＤ”での１０倍希釈 により停止された。 残留酵素活性を測定し、第２３図に示す。 減少は一次動力学に従う、ＧＡＰＤＨ−０２８２にの７４．５℃での失活速度常 数は０．１５／分であり、これは５分間の半減期に対応する。一方、ＧＡＰＤＨ −Ｇ２８２Ｒの７４．５％での熱失活速度常数は０．０４／分であり、従って半 減期は１８分間である。 ＧＡＰＤＨ−ＷＴＯ熱失活速度は７４．５℃では測定しなかったが、５０℃で１ ９分間の半減期を有した。 ２５＋Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ！、　ｐＨ８，０、Ｏ−２Ｍ　４ｊａ　Ｃｌ中で、 スノ々ロース−１２での５ＥＣ−ＨＰＬＣは、ＧＡＰＤＨ−ＷＴが二量体として 溶出し、一方、ＧＡＰＤＨ−２８２Ｋ及びＧＡＰＤＨ−２８２Ｒは四量体として 溶出することを明らかに示した。この知見は、熱安定性の劇的増大がオリゴマー 蛋白質中のサブユニー／　）開基ブリッジの導入に起因するという議論と明瞭に 一致する。 本発明は、従って、より安定なＧＡＰＤＨをもたらす突然変異を操作するために 成功裡に用いられた。 本発明の記述において上記で引用した文献、及び本文で言及した工程段階のいず れかを行うための公知法の例及び本発明の基礎を成した一般的知識の例のリスト を後に示す。 上記で述べた表を以下に示す。 第　１　表 蛋白質中に一般にある２０のアミノ酸の３文字又は１文字コード 第　２　表 ＣＩ単量体の２０のりシン残基の夫々についてのアクセシブルな表面積（Ａ　Ｓ 　Ａ）。各欄は左から右へ夫々、−次配列中のりシン残基の位置（Ｋ）、分離さ れたサブユニット中のＡＳＡＳ　（ＡＳＡＭ　）　、Ｇ　ＩＶ！Ａ量体中のＡ　 Ｓ　Ａｓ（Ａ　Ｓ　Ａｔ）、及び組立てた四量体においてサブユニットインター フェース内に埋め込まれた面積（Ａｂ　＝　Ａ　Ｓ　ＡＮ　−Ａ　Ｓ　Ａｔ　） 第　３　表 基質としてのＤ−キシロース（カンプルＤ−グルコースによる、野生種（ＷＴ） 及び突然変異体ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）ＧＩの触媒パラメータＳＰＡ＝酵素Ｉ ＩＩ１ｇ当り、１分間当りの生成物（Ｄ−キシルロースまたはＤ−フラクトース ）のミリモル（単位）で示す比活性 Ｖ　ｍａｘは酵素１ｍｇ当りの単位で示す。 Ｋｍ　は、＋ｎＭで示すミバエリス定数である。 ＮＤ−測定せず。 第　４　表 野生種（ＷＴ−Ｇｌ）及び突然変異体 （Ｋ２５３Ｒ）Ｇｌの半減期（時間） 半減期は、全酵素活性が５０％減少するのに要する時間である．用いたパンファ ーは５　０ｍＭ　ＥＰＰＳ，８　４℃でｐＨ７．５、５ｍＭ　ＭｇＳＯ４であっ た。 第　５　表 ウシの構造から誘導されたヒ）ＣｕＺｎＳＯＤの３次元構造の分析（本文参照） 。 ＮＥ−非結合エネルギー。 水素結合の表記はＵ　Ｐ　Ａ　ＣＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎ　（Ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ、　１９７６、（Ｇ、Ｄ、ファストマン［）　、ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　 Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１　：　５９−９０）に従う 。 第　６　表 Ｂｓｔ　ＧＡＰＤＨの構造から誘導されたＢｓｔ　ＧＡＰＤＨの３次元構造の分 析（本文参照）、ＮＥ−非結合エネルギー。 ＡＳＡア及びＡ　Ｓ　Ａ　、４−夫々、四量体と単量体のアクセシブルな表面積 、水素結合の表記はＵ　Ｐ　Ａ　ＣＣｏｎｃｔｅｎｔｉｏｎ（Ｉｎ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ　＋　１９７６　、、　（Ｇ、Ｄ。ファストマンｌ）　、ＣＲＣＣｒｉｔ ｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｆｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ　１　：　５９− ９０　）に従う。 第　７　表 ０．２Ｍリン酸カリウム、ｐｌ（７，３５，６０℃で、グルコース（０，１Ｍ） の不存在又は存在下におけるＳ　ＯＤ−ＷＴ及び５ＯＤ−に１２２Ｒ／に１２８ Ｒの残留活性（％）、酵素は５ｏｄＡｓｏｄ　Ｂ−Ｅ、　ｃｏｌｉから作られた （本文参照）。 スー藍 −ＱＨＥＲＮ　、　Ｔ、　Ｊ、とＫＬＩＢＡＮＯＶ、　Ａ、　Ｍ、　（１９８５ ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２８　：１２８０−１２８４゜ −ＡＨＥＲＮ　、↑、　Ｊ、、　ＣＡＳＡＬ、　Ｊ、　１．、　ＰＥＴＳＫＯ， Ｇ、　Ａ、及びＫＬＩＢＡＮＯＶ、　Ａ、　Ｌ　（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ５．　ｕｓＡ　８４：６７５−６７９゜ −ＡＬＢＥＲ，Ｔ、Ａ、、ＩＣＡＯ−ＰＩＮ、Ｓ、、ＮＹＥ、Ｊ、Ａ、、１つＩ ＪＣＩ（ＭＣＩＲＥ、Ｄ、Ｃ。 及び？ｌＡτＴＨＥＷＳ、　Ｂ、　Ｗ、　（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒ）’　２６　：　３７５４−３７５８゜−ＡＮＦＩＮＳＥＮ、　Ｃ，Ｂ、及び ５）ＩＥＩ？ＡＧＡ、　＋（、Ａ、　（１９７５）　Ａｄｖ、　Ｐｒｏｒ。 Ｃｈｅｗ、２９　：　２０５−２９９゜−ＡＲＡＩ　Ｋ、、　ＩＩＺＵＫＡ　Ｓ 。、　ＴＡＤＡ　Ｙ、、　０ＩＫＡＷＡ　Ｌ　及びＴＡＮＩＧＵＣＢＩ　Ｎ。 （１９８７ａ）　Ｂｉｏｃｈｅ＠、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ、ａ　９２４　 ：　２９２−２９６゜−ＡＲＡＩ　Ｋ、、　ＭＡＧｔｌＣＨＩ　Ｓ、。ＦｔｌＪ ＸＩＳ、、　ｌ５）ＩＩＢ、１ｌＳＨＩ　）１．、０ＩＸＡＷＡ　Ｘ、及びＴＡ ＮＩＧＵＣＢＩ　Ｎ、　（１９８７ｂ）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６ ２　：　１６９６９−１６９７２゜−ＡＲＧＯ５Ｐ、（１９８９）　Ｊ、　Ｍｏ ｌ、　Ｂｉｏｌ、　２０６　＝　３９７−４０６゜−ＢＡＬＤＷＩＮ、Ｒ，Ｌ、 （１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ？、１．’　Ａｃａｄ、　Ｓｏｉ、　Ｉｔｓ＾ 、門：８０６９ＪＯ７２゜ −ＢＡＮＮＩＳＴＥＲＪ、Ｖ、、ＢＡＮＮＩＳＴＥＲＷ、Ｈ，ａｎｄ　ＲＯＴＩ ＬＩＯＧ、（１９８７）ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｒｔｒ、　 ２２　：　１１１−１８０゜−ＢＥＡＵＣＡＧＥ　Ｓ、　Ｊ、及びＣＡＲＵＴＨ ＥＲ３１１，Ｈ，（１９８１）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎｌｅｔｔｅｒｓ　２２ 　：　１８５９−１８６２゜−ＢＥＡＬ］ＣＨＡＩ’ｌＰ　Ｃ，ａｎｄ　ＦＲＩ ＤＯνＩＣＦＩ　Ｎ、（１９７１）　Ａｎａｌ、Ｂｔｏｃｈｅｍ。 ４４　：　２７６−２８７゜ −ＢＥＲＧＭＥＹＥＲ，Ｒ，Ｖ、（１９８３）、　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ”＋νｏｐｓ　Ｉ−χ１１、　Ｖｅｒｌａ ｇＣｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈｅｆ、ＦＲＧ。 −ＢＥＲＮＳＴＥＩＮ、　Ｆ、　Ｃ，ら（１９７７）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ ｌ、ユｕ：　５３２−５４２゜−ＢＩＥＳＥＣＫＥＲＧ、、　）ＩＡＩＩＩ？ｌ Ｓ　Ｊ、夏、、　ＴＨＩＥＲＲＹ　Ｊ、、讐ＡＩＪＥＲＪ、　Ｅ、及びＷＯＮＡ ＣＯＴＴ　Ａ、　Ｊ、（１９７７）　Ｎａｔｕｒｅ　２６６　：　３２Ｂ−３３ ３゜−ＢＬＩＪＮＤＥＬＬ　Ｔ、　Ｌ、ら（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２６ 　：　３４７−３５２゜−ＢＯＴＴＥＲＭＡＮ、　Ｊ、及びＺＡＢＥＡＵ、　Ｍ 、　（１９Ｂ？）　ＤＮＡ　６　：　５Ｂ３−５９１゜−ＢＯＯＫＣ）ＩＩＮ、 　Ｒ，？１．及びＧＡＬＬＯＰ、　Ｐ、　Ｍ、　（１９６８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ 。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｒｎｍｕｎ、　３２　：　８Ｅｉ−９３゜− ＢＲＡＮＬＡＮＴ　Ｃ，、０ＳＴＥＲＴ、及びＢＲＡＮＬＡＮＴ　Ｇ、　（１９ ８９）　Ｇｅｎｅ互：　１４５−１５５゜ −ＢＵＮＮ、　Ｈ，Ｆ、、　）ＩＡＮＥＹ、　Ｄ、　Ｎ、、　ＧＡＢＢＡＹ、　 Ｋ、　Ｎ、及びＧＡＬ、ＬＯＰ。 Ｐ、　Ｍ、　（１９７５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ、　Ｃ ｏｍｍｕｎ、６７　：　１０３−１０９゜−ＢＩＩＮＮ、　Ｈ，Ｆ、、　ＧＡＢ ＢＡＹ、　Ｋ、　Ｎ、及びＧＡＬＬＯＰ、　Ｐ、　Ｍ、　（１９７８）Ｓｃｉｅ ｎｃｅ　２００　：　２１−２７゜−ＣＡｌ’１ＬＩＣＺ　Ａ、及びＴＯＵＡＴ Ｉ　Ｄ、　（１９８６）　Ｅ？ＩＢＯＪ、　５　：　６２３−６３０゜−ＣＡＳ ＡＬ、Ｊ、１．、Ａ）ＩＥＲＮ、Ｔ、Ｊ、、ＤＡＶＥＮＰＯＲＴ、Ｒ，Ｃ，、Ｐ ｆｉＴ５ＫＯ。 −ＣＨｏＴ）ＩＩＡ、　Ｃ，及びＪＡＮＩＮ、　Ｊ、　（１９７６）　Ｎａｔｕ ｒｅ　２５６　：　７０５−７０８゜−ＣＯＣＣＯＤ、、　ＲＯ３ＳＩ　Ｌ、、 　ＢＡＲＲＡ　Ｄ、、　ＢＯ３５Ａ　Ｆ、及びＲＯＴＩＬＩＯＧ。 （１９８２）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１５０　：　３０３−３０６゜−ＣＯＬＳ ＯＮ　Ｃ，、ＣＬＯＶＥＲＳ、　Ｗ、、　ＳＹＭＯＮＳ　Ｎ、及び５ＴＡＣＥＹ 　Ｋ、　（１９６５）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５２　：　１０４３−１０５０゜−Ｃ ＲＥＩＧＨＴＯＮ、　Ｔ、　Ｅ、　（１９８８）　旧ｏＡｓｓａｙｓ　８　：　 ５７−６３゜−ＣＲＥＩＧｆｌＴＯＮ、Ｔ、Ｅ、（１９Ｂ３）　、　＠Ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ、５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒ１ｎｃｉｐ ｌｅｓ　’、Ｆｒｅｅｍａｎ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。 −ＤＥ　ＢＯＥＲＨ，Ａ、、　Ｃ０Ｍ５ＴＯＩＪ　Ｌ、　Ｊ、及びＶＡＳＳＥＩ ？　Ｍ、　（１９８３）　ＰＮＡＳ靭：　２７−２５゜ −ＤＥＬＩ（ＡＩＳＥ、　Ｐ、、　ＶＡＮ　ＢＥＬＬＥ　Ｄ、、　ＢＡＲＤＩＡ ＵＸ、　Ｌ及びＷＯ［ｌＡＫ、　Ｓ。 （１９８４）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｇｒａｐｈ、３　：　１１６−１１９゜−ＤＩ ＬＬ、　Ｋ、　Ａ、　（１９８７）　Ｐｒｏｔ、　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ、ユニ　３ ６９−３７２゜−ＤＩＳＣＨＥ、　Ｚ、、及びＥ、　ＢＯＲＥＮＦＲＥＵＮＤ　 （１９５１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ坦２　：　５８３−５８７゜ ＤＯＤＥＴ、　Ｂ、（１９８７）　Ｌａ　Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ　１８　：　６５ ８−６６８゜−ＦＥＲＳ）ＩＴ、　Ａ、　Ｒ，（１９８５）、”Ｅｎｚｙｍｅ　 ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　”。 Ｆｒｅｅｄｍａｎ＋　Ｈ，Ｈ，、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。 −ＦＬＥＴＣＨＥＲ，Ｒ，及びＲＥＥＶＥＳ、　Ｃ，Ｍ、　（１９６４）　Ｃｏ ｍｐｕｔ、　Ｊ、６　：１６３−１６８゜ −ＰＬＥＴＣＨＥＲ，Ｒ，及びＲＥＥＶＥＳ、　Ｃ，Ｉ’！、　（１９６６）　 Ｃｏ＋ｎｐｕｔ、　Ｊ、−ヱ；１４９−１５８゜ −ＧＯＤＦＲＥＹ、　Ｔ、及びＲＥＩＣＨＥＬＴ、　Ｊ、　（１９８３）　、” ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ 。 −ＧＯＬＤＢｆ’ｌ？Ｇ、月、　Ｅ、（１９６９）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ 、並：　４４１−４４６゜−ＧＯＴＴＳＣ）ＩＡＬＫ、Ｎ、ａｎｄ　ＪＡＥＮＩ （ＪＥ、Ｒ，（１９８７）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ａｐｐｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９　：　３８９−４００゜−）ＩＡＬＬＥＷＥＬＬ　Ｒ，Ａ 、ら（１９８５）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３　：　２０１７− ２０３４゜−）ＩＡＬＬＥＷＥＬＬ　Ｒ，Ａ、ら（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｗ、　２６４　：　５２６０−５２６８゜−ＨＡＲＴＬＥＹ　Ｒ，Ｗ 、（１９８８）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２０２　：　９１３−９１５゜ −ＨＡＲＴＺ　Ｊ、　Ｗ、及びＤＥＵＴＳＣＨＨ，Ｆ、　（１９７２）　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。 −Ｈ０Ｌ＋　Ｗ、　Ｇ、＋　１９８５　、　Ｐｒｏｇｒ、　Ｂｉｏｐｈ、　Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、旦：　１４９−１９５゜−ＨｏＩＪＩ［］ＵＩＳＴ、　Ｗ、　 Ｒ，及び５ＣＨＲＯＥＤＥＲ，ＩＡ、Ａ、　（１９６４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、３２　：　６３９−６４１゜−）ｆ ＯＷＡＲＤ−ＦＬＡＮＩ）ＥＲ５Ｐ、、　ＢＯＹＣＥ　Ｒ，Ｐ、及びり、　Ｔ） ＩＥＲＴＯＴ　（１９６６）−ＩＮＧＬＩＳ、　Ａ、　Ｓ、（１９８３）　Ｍｅ ｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、９１　：　３２４−−ＪＡＥＮＩＣＫＥ、　Ｒ，（１ ９８７）　Ｐｒｏｇ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　、　ｍｏｌｅｃ、Ｂｉｏｌ、旦：１１ ７−２３７゜ −ＪＡＮＩＮ、　Ｊ、（１９７９）　Ｂｕｌｌ、　Ｉｎ５ｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ （Ｐａｒｉｓ）　７７　：　３３７−３７４゜−ＪＡＮＩＮ、　Ｊ、及びＷＯＤ ＡＫ、　Ｓ、　Ｊ、　（１９８３）　Ｐｒｏｇ、　Ｂｔｏｐｈｙｓ、　ａｏｌｅ ｃ。 Ｂｉｏｌ、　４２　：　２１−７８゜ −ＫＡＬＩＺＭＡＮＮ、　Ｗ、（１９５９）　Ａｄｖ、　Ｐｔｏｔ、　Ｃｈｅｉ ｉ、ｌｊｌ　：　１−６３゜−ＫＥＲ５ＴＥＲ５−ＨＩＬＤＥＲ５ＯＮら（１９ ８７）　Ｅｎｚｙｔａｅ、　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、９　：１４５− １４８゜ −ＫＬＩＢＡＮＯＶ、　Ａ、　Ｍ、（１９８３）　Ａｄｖ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、２９　：　１−２８゜−ＫＮＯＷＬＥＳ、　Ｊ、　Ｒ，（１９ Ｂ？）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６　：　１２５２−１２５８゜−ＫＯＥＮＩＧ、 　Ｒ，Ｊ、　ＢＬＯＢＳＴＥＩＮ、　Ｓ、　Ｈ，及びＣＥＲＩＩＭｌ、　Ａ、　 （１９７７）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅ＋＊、　２５２　：　２９９２−２９９ ７゜−ＫＹＴＥ、及びＤＯＯＬＩＴＴＬＥ、　（１９８２）　Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、　１５７　：　１０５−１３２゜ＬＡＥＭＭＬｌ、　Ｕ、　Ｋ、（１ ９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　６８０−６８５゜〜ＬＥＥ、　Ｂ、　Ｋ 、及びＩＩＩＣＦＩＡＲ［ｌＳ、　Ｆ、本（１９７１）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ、　５５　：３７９−４００゜ −ＭＡＮＩＡＴＩＳ、　Ｔ、、　ＦＲＩＴＳＣＢ、　Ｅ、　Ｆ、及びＳＡＭＢＲ ＯＯＫ、　Ｊ、　５．（１９８２）”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　： 　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ″、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａ ｒｂｏｒ　Ｌ４ｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｒａｒｂｏｒ、 　Ｎ、　Ｙ。 −ＭＡＲＫＬＵＮＤ　Ｓ、及びＭＡＲＫＬＵＮＤ　Ｇ、　（１９７４）　Ｅｕｒ 、　Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ。 ４７　：　４６９−４７４゜ −ＭＡＲＭＯＣＣＴＩＩ　Ｆ、、　Ｉ’１ＡＶＥＬＬＩ　１．、　ＲＩＧＯＡ、 、　５ＲＥＶＡＮＡＴＯＲ，、ＢＯ３５Ａ　Ｆ。 及びＲＯＴＩＬＩＯＧ、　（１９８２）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、２１　：　２８５３ −２８５６゜−ＭＡＴＵＳＵ？ＩｔｌＲＡ　、翫、　ＢＥＣＫＴＥｔ、、　Ｗ、 　Ｊ、及びＭＡＴＴＨＥ賀Ｓ、　Ｂ、鰐。 （１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３４　：　４０６−４１０゜−騒ＴＴＨＥ讐Ｓ 、　Ｂ、　Ｗ、、　ＮＩＣＨＯＬＳＯＮ、　Ｉｌ、及びＢＥＣＫ置、　Ｗ、　Ｊ 、　（１９Ｂ７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４　：　６６６３ −６６６７゜−ＭＡＸＡＭ　Ａ、　？１．　及びＧＩＬ［ｔＥＲＴ、　Ｈ，（１ ９８０）　Ｍｅｔｈ、εＨ２ｙｍｏ１．　６５　：４９９−５５９゜ −ＭＩＬＬＥＲ，Ｊ、ｌ（、（１９７２）、”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”＋Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒＳｎｇ　）ｌａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ 、Ｙ。 −？ＩＩＬＬＥＲＳ、、　ＬＥＳＫ　Ａ、　Ｍ、及びＪ、　ＪＡＮＩＮ　（１９ ８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２８　：８３４−８３５゜ −ＭＩＳＳＥＴ　Ｏ，、ＢＯ５ｆ）、　Ｊ、　ｌ’１．及び”　０ＰＰＥＲＤＯ ＥＳ　Ｆ、　Ｒ，（１９８６）Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５７　：　４ ４１−４５３．　’ＭＯＲＡＳ　Ｄ、、０ＬＳＥＮ　Ｋ、Ｗ、、５ＡＢＥＳＡＮ 　Ｍ、Ｎ、、ＢＵＥＨ？ｉ□ＥＲ？１．．ＦＯＲＤＧ、　Ｃ，及びＲＯ５ＳＭＡ Ｎ　Ｎ、　Ｇ、　（１９７５）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５０　：９ １３７−９１６２゜ −ＭＲＡＢＥＴ、　Ｎ、　Ｔ、、　５）ＩＡＥＦＦＥＲ，Ｊ、　Ｒ，、１ＩｃＤ ＯＮＡＬＤ、　Ｌ　Ｊ、及びＢＵＮＮ。 Ｈ，Ｆ、（１９８６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｓ、２６１　：　１１１１− １１１５゜−ＰＡＮＴＯＬＩＡＮＯ，Ｍ、獣、ＬＡＤＮＥＲ，Ｒ，Ｃ，、ＢＲＹ ＡＮ、Ｐ、Ｎ、、ＲＯＬＬＥＮＣＥ。 Ｍ、　Ｌ、、　ＷＯＯＤ、　Ｊ、　Ｆ、及びＰＯＵＬＯ５，Ｔ、　Ｌ、　（１９ ８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ韮　：　２０７７−２０８２゜ −ＦＥＲＲＹ、　Ｌ、　Ｊ、及びＷＥＴＺＥＬ、　Ｒ，（１９８４）　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２６　＝　５５５−５５７゜−ＰＥＲｔｌＴＺ、　Ｆｌ、　Ｆ、（１ ９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２０１　：　１１８７−１１９１゜−ＰＯＲＴＥＲ， Ｒ，Ｒ，（１９７３）　５ｃｉｅｎｃｅ　１８０　：　７１３−７１６゜−ＰＲ ＩＶＡＬＯＶ、　Ｐ、　Ｌ、（１９７９）　Ａｄｖ、　Ｐｒｏｔ、　Ｃｈｅｗ、 　３３　：　１６７−２４１゜−ＰＴＩＴＳＹＮ、　６．　Ｂ、（１９８７）　 Ｊ、　Ｐｒｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　６　：　２７３−２９３゜−ＲＥＹ　Ｆ、、Ｊ ＥＮＫＩＮＳ、Ｊ、、ＪＡＮＩＮ　Ｊ、、ＬＡＳＴＥＦＩＳ、１．、ＡＬＡＲＤ 　Ｐ、。 ＣＬＡＥＳＳＥＮＳ　Ｍ、、　ＭＡＴＴＨＹＳＳＥＮＳ　Ｇ、及びＷＯＤＡＫ　 Ｓ、（１９８Ｂ）　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ４　：　１６５−１７２゜ −ＲＯ５Ｅ、　Ｇ、　Ｄ、　（１９７９）　Ｊ、　Ｍｏ１．　旧ｏ１．１３４　 ：　４４７−４７０゜−ＲＯＳＥ、Ｇ、Ｄ、、ＧＥＳＥＬＯ讐ＩＴＺ、Ａ、Ｒ， 、ＬＥＳＳＥＲ，Ｇ、Ｊ、、ＬＥＥ、Ｒ，Ｈ。 及びＺＥＩ（ＦＬＩＳ、　Ｍ、　Ｈｏ（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２９　 ：　８３４−８３８゜−５ＡＤＡＮＡ　及び）ＩＥＮＬＥＹ（１９８６）　Ｂｉ ｏ↑ｅｃｈｎｏ１．　Ｂｉｏｅｎｇ、２８　：　２５６−２６８゜−５ＡＩＩＥ Ｒ，Ｒ，Ｔ、、　ＨＥＨＩＲ，Ｋ、、　ＳＴＥＡＲＭＡＮ、　Ｒ，Ｓ、、　ＷＥ ＩＳＳ、　Ｍ、　Ａ、。 ＪＥＩＴＬＥＲ−ＮＩＬＳＳＯＮ、　Ａ、、　５ＵＣＨＡＮＥＸ、　Ｅ、　Ｇ、 及びＰＡＢＯ，Ｃ，Ｏ。 （１９８６）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ、ｒｙ　２５　：　５９９２−５９９８゜ −３ＫＡＲＺＹＮＳＫＩ　Ｔ、、　ＭＯＯＤＹ　Ｐ、　Ｃ，Ｅ、及び同ＮＡＣＯ ＴＴ　Ａ、　Ｊ、　（１９８７）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１９３　：　１ ７１−１８７゜−５ＴＡＮＳＳＥＮＳ、　Ｐ、、　ＭｃＫＥＯＷＮ、　Ｙ、、　 ＦＲＩＥＤＲＩＣ）ｌ、に、及びＦＲＩＴＺ。 Ｈｏ−Ｊ、（１９８７）、”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅ ｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇａ ｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｏｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅｐＭａ　 ｐｈａｓｍｉｄ　ｖｅｅｔｏｒｓ”、　ｔｈｅ　ＥＭＢＯ１ａｂｏｒａｔｏｒｙ 　ｃｏｕｒｓｅで用いたマニュアル、”Ｄｔｒｅｅｔ、ｅｄ　Ｍｕｔａｌｅｎｅ ｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅ−ｒｉｎｇ　”　Ｍａｘ　Ｐ ｌａｎｃｋ　Ｉｎ５ｔｉｔ：；ｔ　Ｆ’ｊｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、　Ｍａｒｔ ｉｎｓｒｉｅｄ。 Ｊｕｌｙ　４−１８　、１９８７で開催。 −ＴＡＮＮＥＲＪ、Ａ、、ＧＥＴＺＯＦＦ　Ｅ、Ｄ、、ＢＥＥＭ　Ｋ、Ｌ、ＲＩ ＣＩ（ＡＲＤＳＯＮ　Ｊ、Ｓ。 及びＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ　Ｄ、　Ｃ，（１９Ｂ２）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ ｉ、ユ６１　：　１８１−２１７゜−ＴＡＹＬＯＲＷ、　Ｒ，（１９８８）　Ｐ ｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２　：　７７−８６゜−ＴＯＲＣＨＩ Ｌ　ＩＮ　ら（１９８３）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｃａｔａｌ、　１９　：　２９１ −３０１゜−ＶＡＮ　ＢＥＹＮＵＭ　及びＲＯＥＬＳ、　ｅｄｓ。（１９８５） 　、’″５ｔａｒｃｈ　ＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＴｅｃｔ＋ｎｏｌｏｇｙ　”、Ｍ ａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ。 −ＶＩＡＥＮＥ　Ａ、、ＢＡＩＩＷ　Ｇ、、ＶＡＮ　ＫＡＥＲＴ　Ｌ、、ＶＡＮ ＤＥＫＥＲＣＫＨＯνＥ　Ｊ、。 ＶＡＮ　ＭＯＮＴＡＧＥ　？！、及びＤ）ＩＡＥｓＥ　Ｐ、　（１９８８）　Ａ ｒｃｈ、　Ｉｎｔ。 Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、９６　：　Ｂ　１９７゜−ＶＩＡＥＮＥ　Ａ 、及びＤＨＡＥＳＥ　Ｐ、（１９８９）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 １７　：　１２５１゜−ＶＩＬＬＡＦＲＡＮＣＡ、Ｊ、Ｅ、、ｌｌ０ＷＥＬＬ、 Ｅ、Ｅ、、０ＡＴＬＥＹ、Ｓ、Ｊ、、ＸＵＯＮＧ。 Ｎ、及びＫＲＡＩＩＴ、　Ｊ、　（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２ ６　：　２１８２−２１８９゜−ＶＩＬＬＡＦＲＡＮＣＡ、Ｊ、　Ｅ、、ＨＯＷ ＥＬＬ、Ｅ、　Ｅ、、ＶＯＥＴ、Ｄ、　Ｈ’、、５ＴＲＯＢＥＬ。 ？１．　Ｓ、、　０ＧＤＥＮ、　Ｒ，Ｃ，、ＡＢＥＬＳＯＮ、　Ｊ、　Ｎ、及び ＫＲＡＩＪＴ、　Ｊ、　（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２　：　７８２−７ ８８゜−ＷＡｔＫＥＩＩ　Ｊ、　Ｅ、、圓０ＮＡＣＯＴＴ、　Ａ、　Ｊ、及びＨ ＡＲＩＩＩＳ、　Ｊ、　１．　（１９８０）Ｂｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０ ８　：　５８１−５８６゜−ＷＡＴＳＯＮ、　Ｊ、　Ｄ、、　ＴＯＯＺＥ、　Ｊ 、及びＫＵＲＴＺ、　Ｄ、　Ｔ、　ｉｎ”　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＡＮ　 ”　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ。 −ＷＥＬＬＳ、　Ｊ、　Ａ、及びＰＯＷＥＲＳ、　Ｄ、　Ｂ、　（１９８６）　 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ。 邪１　：　６５６４−６５７０゜ 一賀ＥＬＬＳ、Ｊ、Ａ、、ＰＯ圓ＥＲ５，Ｄ、Ｂ、、ＢＯＴＴ、Ｒ，Ｒ，、ＧＲ ＡＹＣＡＲ，Ｔ、Ｐ。 及びＥＳ置Ｌ、　Ｄ、　Ａ、　（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８４　：１２１９−１２２３゜ −ＷＥＴＬＡＬＩＦＥＲ，Ｄ、　Ｂ、（１９７３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７０　：６９７−７０１゜ −ＷＥＴＺＥＬ、Ｒ，（１９８５）　Ｅｕｒ、　ｐａｔ、　ａｐｐｌｉｃ、＃　 ８５３０１２９．９゜−讐ＥＴＺＥＬ、　Ｒ，（１９８７）　ＴｌＢ５　１２　 ：　４７８−４８２゜ＷＩＧＬＥＹ、Ｄ、Ｂ、、ＬＹＡＬＬ、Ａ、、）ＩＡＲＴ 、Ｋ、Ｗ、ａｎｄ　）ｌｏｌ、ＢＲＯＯＫ、Ｊ、Ｊ。 （１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｅ、　１ ４９　：　９２７−９２９゜−ＷＩＮＮＡＣＫＥＲＥ、−Ｌ、（１９８７）　” 　Ｆｒｏｍ　Ｇｅｎｅｓ　ｔｏ　Ｃ１ｏｎｅｓ　”　ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒ ｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。 −ｊｌｌＮＴＥＲＢＯＵＲＮ　Ｃ，Ｃ，、ＨＡ誓ＫＩＮＳ　Ｒ，Ｅ、、ＢＲＩＡ Ｎ　？１．　ＡＮＤ　ＣＡＲＲＥＩ、Ｒ，Ｗ、（１９７５）　Ｊ、　Ｌａｂ、Ｃ ｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、　８５　：　３３７−３４１゜−ＷＯＤＡＫ、　Ｓ、、　ａ ｎｄ　ＪＡＮＩＮ　Ｊ、（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ　２０　：６ ５４４−６５５２゜ −ＷＵＴＨＲＩＣＬ　Ｌ　（１９８６）　ｉｎ　”　ＮＭＲｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ　ａｎｄ　ＮｕｃｌｅｉｅＡｃｉｄｓ　”＊　Ｊ、ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎ ｓ。 −ＷＹ（Ｊ：ＯＦＦ、　Ｉｔ、　Ｗ、、　）ＩＩＰＳ、　Ｃ，Ｈ，Ｗ、　ａｎｄ 　ＶＡＮ　Ｖ［］ＮＡＫＩＳ、　Ｈ，、ｅｄｓ（１９８５）　ｉｎ“Ｄｉｆｆｒ ａｃｔｉｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｃｒｏｍ ｏ−Ｉｅｃｕｌｅｓ　”、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、Ｖｏｌｓ、　１１４−１ １５．　Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ。 −ＹＡＭＡＮＡＫＡ、　Ｋ、（１９７１）　Ｂｕｌｌ、　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　 Ｍｅｄ、　５ｃｈｏｏ１１８　：　１−５゜−ＹＡＮＮＩＳＣＨ−ＰＥＲＲＯＮ 　Ｃ，、νＩＥＩＲＡ　Ｊ、ａｎｄ　ＭＥＳＳＩＮＧ　Ｊ、＜１９８５＞−ＺＡ ＬＥ、Ｓ、Ｅ、ａｎｄ　ＫＬＩＢＡＮＯν、　Ａ、Ｍ、（１９８６）　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ本明細書で用いた表現の追加的定義として（それらが上記の文 献で十分に明瞭でない限りにおいて）、単行本、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　”　、第４版、Ｊａｍｅｓ　Ｄ、　１ｌｌａ ｔｓｏｎ、　Ｎａｎｃｙ　Ｈ。 ）１ｏｐｋｉｎｓ、　Ｊｅｆｆｒｅｙ　Ｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｊｏａｎ　Ａｒ ｇｅｔｓｉｎｇｅｒ　５ｌｉｔｚ及びＡｉａｎ　Ｍ、　Ｗｅｉｎｅｒ編、（１９ ８７）　ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕｍｍｉｎｇｓＰｕｂｌＣｕｍｍ１ｎ　 Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ、出版を参照できる。 以下の請求の範囲において「天然の蛋白質又はその突然変異体」とは下記を意味 するものである。 （１）「天然の蛋白質」とは、天然に生じた蛋白質そのもの、又は人工的に、例 えば遺伝子工学手法で得られた同じ基本的アミノ酸配列を持つ蛋白質の両者を云 い、 （２）その突然変異体は、本質的に同じ本質的な生物学的特性を有し、置換を受 けるべき当該リシンまたはアルギニン残基がその突然変異により影響されていな い点を除いては、対応する遺伝子における可能な突然変異を実際に起している任 意の変種でありうる。 浄書（内容に変更なし） ０　３０　６０　９０　１２０　１５０　１Ｂ。 時間（分） 浄書（内容に変更なし） ５０ｍＭ　５ＩＯＰＳ、ｐ）ｉ７．２、２５℃＋　１０ｍＭ＼ｉｇ　テのＥｃｏ Ａｍｉ　（ＤＳｈｉ）ＧＩ　の熱失活動力学時間（分） 浄書（ｔ≦Ｇに変更なし） ５０ｍＳＩ　５ＩＯＰＳ％ｐＨ７，２，２５℃＋ｌｏｍＭＣｏ　でのＥｃｏＡｍ ｉ　（ＤＳＭ）　ＧＩ　Ｏ熱失活動力学時　間　（分） ＃２しく？５ン；こ変３ミなし） ＦＩＧ、４ ５０ｍＭ　ＭＯＰＳ％ｐ＋−１７，２，２５℃でのＧＩの熱失活にライて温度依 存性のアレニウスプロット 浄書（内容に変更なし） 金ＩＡｍ加なしで７２℃でＥｅｏＡｍｉ（ＤＳＭ）グルコースイノメラーゼの熱 失活のｐＨ依存性 ４．５　５．５　６．５　７．５　８．５Ｈ ＦＩＧ、５ 残　留　活　性　（χ） ＦＩＧ、７　浄書（内容←ヌ疋女し） 残留活性（χ） ＃ｆ（内容に変更なし） 吸光度（Ａ２Ｂ０　） ＦＩＧ、９Ａ 浄書（内存に変更なし） 四量体　−、、−一−，ａ、、−〆 ＋ 一一−ＮＡＣＮＯ−−−− ＋ ＮａｃＮｏ　ＦＩＧ、　ＩＯＡ 浄書（内容に変更なし） 四量体−Ｎ−−４４−−１ 匪　モミモモ　モ　匪 一−−ＮＡＣＮＯ−−−− 浄書（内容に変更なし） ０　ｔｏ　２０　３０　４０　５０　６０　７０浄書（古書８二王、（なし） Ｇｌ　突然変異体　Ｋ２５３Ｑの熱失活動力学時間（分） 浄書（内容に変更なし） Ｓｕｐｅｒｓｏｓｅ−１２でのＳＥＣ−１−ＩＰＬＣ（Ｊ　ＣＪＣＪＩＪ　ロ　 （ＪＣＪ（Ｊ定、西。　仁、ギー　暮、乏２　じ、８゜ＵＵＵ　υ　Ｑ　Ｑ ρ　ｆり ←　Ｑ　Ｑ　Ｑ　じ　く　＠ ｈｔａ、　ａ＜　００　じ＜　ｔ、ｐ＊　＠ロ　Ｕ〉　ト＝ｏｕｕｕｕｏ　ロ　 リ （く　←　く　Ｑ　く　く　← ＜’ａｔ　Ｈロ　く−　じロ　＜Ｅ−＜Ｗ：　＜％　リ−ＣＯロ（Ｊ　Ｗ（Ｊ　 ｌ：ｌＵ　Ｎじ　ψじ　０じ　ＷＵ口←　マ←　■＜　？ＣＪ　ロく　ψＣＪ　 −ｕ　ψＱ？　ＣＪ　、、！　ψ（−ψＱ工　ψ（Ｔｈ　ＮＣＪＯさＱＬ　Ｆ← り　ロＱ巳ＣｊＬＩＵｕＵＵＵ＜ 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”１３４　１４３　１５２　１６１　１７０八ＣＡ　Ａ／−Ｇ　ＡＣＡ　ＧＧＡ 　ＡＡＣＧＣＴ　ＧＧＡ　ＡＧＴ　ＣＧＴ　ＴＴ’Ｇ　ＧＣＴ　ＴＧＴ　ＣＧＴ Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　”ｌ’ｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒ ｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　ＧｌｙＦｉｇｕｒｅ　１Ｂ 浄書（内存に変更なし） 浄書（内存に変更なし） ←−くψ　くコ　しく７　（Ｖ、＠　７ト勺　くメ　＜−＜−４＜＞ＵＬ （〉＜−　じり　し＝　く二　！−１ｖトケ　←−（０（＋−ｔ　＜二　く■ ＜ニー　０■　ＣＪＩ−＋　（Ｊ−じ−　くＳＵ＜　Ｅ４ｖ）　υユ　くト　じ じ　く−ｅＦ！　！ニー；　トｘ　＜　−４（Ｖ　リ“ｕ−＋　Ｓり　ｌ−ぐ　 ＜ト＜１ ０（リ＞　ａ＞　じ〉　く二　くく 口　七Ｆ　：　５ｊ　：　しε　＝　乏！　詔　にご　ご　ごごｒ−ｕ＜　ｒ− ｕ＜　ｃｏ　ｕ＜　ｃｏ　じｏ　のｕ＝　ｍ　ｔｐｑト、つ＜　り　ｏｈ　＜ｅ 　ｕ　ニ　０仁Ｃ’ｗ　＜　＞　トＵ　＜−＜　ｖ　＜切Ｖ＜　＜−＜Σ　（Ｊ じ　じくり＜ （Ｊ−Ｆ−句＜Ｃコ（ノＣ（ン５鴨（−１−（＞　Ｑ−ｔ　（Ｊｐｓ　＜リ　Ｌ ）−１＜心←←　リ＜　ａ＜　＜＜　リリ　トド よ　８　ｅ　’；　５Ｆ　’：；　’ｔＥ　訊　Ｌ；　ニ　コニ　ｓ　に；１　 Ｑヘ　ト　←リ　■　リー　−０〉　■　００　■　じ〉！呂　ＬＬｅ　＜＞　 Ｅ−１１＜＞　にΔ＜ｌｙ　＜ＴＡ（、！：５　＜Ｘ　（コ０−　くト　＜　ｔ Ｊ　ｌ−、ｊ　＜　、ＪＥ−ＣＬ　＜ＯＵ＞　ＵＱ、　Ｈ，：　＜。 くψ　しｌ−Ｉ　じ−くψ　Ｑ− リ＜　ｕＱ、　０１ｌ）　Ｕ＜　ＵＪ　Ｕｌ”−Ｆｉｇｕｒｅ　２１ Ｂ１（内存に変７９なしン Ｂ１（内存に変更なし） 手続補正書く方式） ％式％ ５、補正命令の日付　平成２年１２月１１日国際調査報告 １１ＩｗｌＮ［＾−−…−一　ＰＣτ／！：Ｐ　８９１００８１８！際調査報告 　ＥＰ　８９００１１３８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．出発蛋白質から誘導され、安定性に関する付随する調節効果を伴う、出発蛋 白質と本質的に同種の生物学的活性を有するところの生物学的活性変性蛋白質を 製造する方法において、出発蛋白質が、出発蛋白質の生物学的活性を実質的に変 えることなしに、リシン残基のアルギニン残基への置換またはその逆を立体的に 収容しうる部位（置換部位）に位置ずるリシン残基又はアルギニン残基を当初有 する蛋白質から選択され、上記の当初のリシン残基をアルギニン残基で置き換え る、又は逆に上記の当初のアルギニン残基をリシン残基で置き換えることを包含 し、 但し、出発の生物学的活性蛋白質はグルコースイソメラーゼではないところの方 法。 ２．出発蛋白質が天然蛋白質である請求項１記載の方法。 ３．置換部位が、蛋白質の３次元構造中に上記置換を収容する部位である請求項 １又は２に記載の方法。 ４．（１）上記蛋白質が、少くとも二つのドメインを含む単量体蛋白質又は少く とも二つのサブユニット（その一部又は総てがドメインを含んでいてもよい）よ り成るオリゴマー蛋白質であり、 （２）上記ドメイン又は適当な場合にはサブユニットは、好ましくは上記ドメイ ン又はサブユニット間の界面において、低い溶媒アクセシビリティの部位を含み 、 （３）低い溶媒アクセシビリティの上記部位のいくつかは、出発蛋白質において 他の部位の他のアミノ酸残基との静電相互作用に関与するアミノ酸残基を含み、 （４）リシン又はアルギニン残基を含みかつ上記置換を立体的に収容しうるとこ ろの上記置換部位は、低い溶媒アクセシビリティの上記部位の一つと一致する請 求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。 ５．適当な表現配列の制御下で、調節された安定性の上記変性蛋白質をコードす るように遺伝子的に操作された（たとえは部位指定突然変異生成により）ＤＮＡ インサートを含むベクターで形質転換されたホスト細胞を適当な培養条件で培養 すること、この際一方では上記ホスト細胞及び他方では上記ベクターは、形質転 換ホスト細胞が上記培養条件下で上記変性蛋白質を作ることができるようにされ ているものであること、及び培養ホスト細胞により作られた代謝生成物から上記 変性蛋白質を回収することを包含する請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法 。 ６．上記ベクターが分泌シグナル配列をも含み、上記変性蛋白質は上記ホスト細 胞培養の細胞質空間又は培地から回収される請求項５記載の方法。 ７．上記置換部位における当初のりシンをアルギニン残基で置き換えることを包 含する、高められた熱安定性及び／又は化学的変性に対する安定性を有する生物 学的活性変性蛋白質を作る請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。 ８．上記置換部位における当初のリシンをアルギニン残基で置き換えることを包 含する、低減された熱安定性及び／又は化学的変性に対する安定性を有する生物 学的活性変性蛋白質を作る請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。 ９．変性された生物学的活性蛋白質において、それが天然蛋白質又は同じ必須の 生物活性を有するその突然変異体と区別されること、天然蛋白質が有する必須の 生物学的活性を本質的に変えることなしに、リシン残基をアルギニン残基に又は 逆にアルギニン残基をリシン残基に置き換えることを収容しうる天然蛋白質の部 位に対応する構造部位において天然蛋白質又はその突然変異体中のリシンの代り にアルギニン又は天然蛋白質又はその突然変異体中のアルギニンの代りにリシン が、アミノ酸残基の少くとも一つ（置換アミノ酸残基）であり、但し出発の生物 学的活性蛋白質はグルコースイソメラーゼではないところの蛋白質。 １０（１）少くとも二つのドメインを含む単量体蛋白質文は少くとも二つのサブ ユニット（その一部又は総てがドメインを含んでいてもよい）より成るオリゴマ ー蛋白質であり、（２）上記ドメイン又は適当な場合にはサブユニットは、好ま しくは上記ドメイン又はサブユニット間の界面において、低い溶媒アクセシビリ ティの部位を含み、 （３）上記部位のいくつかは、他の部位の他のアミノ酸残基との静電相互作用に 関与するアミノ酸残基を含み、（４）上記置換アミノ酸残基を含む上記部位が低 い溶媒アクセシビリティの上記部位の一つと一致することを特徴とする請求項９ 記載の蛋白質。 １１．置換アミノ酸残基を含む上記部位が３次元構造中に置換を収容しうる天然 蛋白質のそれに対応する部位である請求項９又は１０記載の蛋白質。 １２．置換アミノ酸残基が、天然蛋白質又はその突然変異体中のリシンの代りに アルギニンである請求項９〜１１のいずれか一つに記載の蛋白質。 １３．置換アミノ酸残基が、天然蛋白質又はその突然変異体中のアルギニンの代 りにリシンである請求項９〜１１のいずれか一つに記載の蛋白質。 １４．スーバーオキシドディスムターゼ、好ましくはウシまたはヒト銅亜鉛スー バーオキシドディスムターゼである請求項９〜１３のいずれか一つに記載の蛋白 質。 １５．天然のヒト銅亜鉛スーバーオキシドディスムターゼにおける位置９、１２ ２及び１２８の一つ以上においてリシン残基がアルギニン残基へと置き代ってい る請求項１４記載のヒト銅亜鉛スーバーオキシドディスムターゼ。 １６．天然のウシ銅亜鉛スーバーオキシドディスムターゼにおける位置９及び１ ２０の一つ以上においてリシン残基がアルギニン残基へと置き代っている請求項 １４記載のウシ銅亜鉛スーバーオキシドディスムターゼ。 １７．グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデハイドロゲナーゼ、好ましくは バチルスズブチリスからのそれである請求項９〜１３項のいずれか一つに記載の 変性された生物学的活性蛋白質。 １８．バチルスズブチリスの天然のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデハ イドロゲナーゼにおける位置２８２においてグリシン残基がアルギニン又はリシ ン残基へと置き代っているバチルスズブチリスグリセルアルデヒド−３−ホスフ ェートデハイドロゲナーゼ。 １９．請求項９〜１８のいずれか一つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列。 ２０．請求項１９記載のＤＮＡ配列を含むフラスミド。 ２１．請求項１９記載のＤＮＡ配列を含み、好ましくは適当な表現シグナルに動 作可能に結合されたＤＮＡ配列を含んでＤＮＡ配列が生物学的活性蛋白質として ホスト環境中で表現されるところの、好ましくは原核性又は真核性細胞であるホ スト環境。