BG61596B1

BG61596B1 - Многослойни мембрани за направлявана регенерация на тъкани

Info

Publication number: BG61596B1
Application number: BG98862A
Authority: BG
Inventors: Franco Dorigatti; Lanfranco Callegaro; Aurelio Romeo
Original assignee: M.u.r.s.t. Italian Ministry for Universities and Scientific and Technological Research
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1998-01-30
Also published as: DE69230182T2; GR3032451T3; CA2126087A1; EP0625056B1; KR100252192B1; EP0625056A1; DK0625056T3; CA2126087C; HUT68706A; JP3277212B2; WO1993011805A1; NZ246576A; NO942329L; ES2141145T3; BG98862A; AU669148B2; HU217989B; ITPD910228A0; US5622707A; JPH07502431A

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до многослойни мембрани за направлявана регенерация на тъкани, както и до нов биоматериал, наречен многослойна мембрана, получен от производни на хиалуроновата киселина, до методите за производство и до приложението на тези многослойни мембрани в хирургията за направлявана регенерация на тъкани при обработката на повърхностни и вътрешни поражения.

Хиалуроновата киселина е естествен хетерополизахарид, съставен от редуващи се остатъци от D-глюкоронова киселина и N-ацетил-О-глюкозамин. Тя е линеен полимер с молекулно тегло между 50 000 и 13 000 000 в зависимост от източника, от който е получена и използваните методи за получаване и определяне. В природата се намира в перицелуларни гелове, в основната субстанция на съединителните тъкани при гръбначните организми, където тя е един от основните компоненти, в синовиалната течност на ставите, в стъкловидното тяло на окото, в тъканта на пъпната връв и в гребена на петела.

Предшестващо състояние на техниката

Известни са специфични фракции от хиалуроновата киселина с определени молекулни тегла, които не притежават възпалително действие и които, следователно, могат да се прилагат за стимулиране зарастването на рани, да заместят ендобулбарни течности или които могат да се използват в терапията при патология на ставите чрез вътрешноставни инжекции, както е описано в ЕР 0 138 572.

Известни са също естери на хиалуроновата киселина, в които всички или някои от карбоксилните групи на киселината са естерифицирани, както и приложението им във фармацевтичната и козметична промишленост и в областта на биоразграждащитс се пластмаси, както е описано в US №№ 4 851 521; 4 965 353 и 5 147 861 и в ЕР 251 905 А2.

Известно е, че хиалуроновата киселина подпомага процесите на възстановяване на тъканите, специално в първите стадии на гранулацията, чрез стабилизиране коагулационната мрежа и контролиране нейното разграждане, благоприятствайки възстановяването на противовъзпалителните клетки, като полиморфонуклеарните левкоцити и моноцити на мезенхимните клетки, каквито са фибробластите и ендотелните клетки, и ориентиране на последващата миграция на епителните клетки.

Известно с, че използването на разтвори на хиалуроновата киселина може да ускори оздравяването при пациенти, засегнати от рани от залежаване, протриване и изгаряния.

Описана е ролята на хиалуроновата киселина в различните фази, които съставляват процесите на възстановяване на тъканите, чрез конструирането на теоретичен модел от Weigel Р. Н. et al.: “A model for the role of hyaluronic acid and fibrin in the early events during the inflammatory response and wound healing”, J. Theor. Biol., 119: 219, 1986.

Изследванията, насочени към получаването на продукти за прилагане върху кожата, съставени от естери на хиалуроновата киселина, като такива или в смеси с други полимери, са довели до създаването на различните типове продукти. Между тях са тъканите, например марли с различна дебелина (брой нишки на сантиметър), с различни размери и с нишки с различно дение (теглото за 9000 m нишка).

Предложени са филми с най-разнообразни дебелини, както е известно от US 4 851 521 и US 4 965 353.

Едно от ограниченията в употребата на изработените продукти, съставени от естери на хиалуроновата киселина или от смеси на същите с други полимери, е тяхната ниска механична устойчивост, която може да предизвика сериозни проблеми при употребата им. В случая на биоматериали, като мембрани или други типове филмообразуващи продукти, които трябва да бъдат зашити на място, хирургичните игли или конци могат да доведат до появата на пукнатини, срезове или разкъсвания, които рискуват структурната херметичност на мембраната и в резултат на това стабилността на мембраната на мястото й на прилагане, като по този начин раната остава отворена за замърсявания и нежелани последици.

Тенденция в съвременната хирургия е използването, там където е възможно, на биоматериали с висока биосъвместимост, като тези, получени от естерите на хиалуроновата киселина, характеризиращи се също така и с висока биоразграждаща се и биоабсорбираща способност.

Техническа същност на изобретението

Целите на изобретението включват методи за получаване, характеризиране и приложението на многослойни, биосъвместими и биоабсорбиращи се мембрани, включващи естери на хиалуроновата киселина, поотделно или в смеси. В сравнение с други мембрани, получени от същите естери на хиалуроновата киселина, тези многослойни мембрани имат подобрена механична устойчивост на опън и на физично и механично разкъсване, дори когато са използвани хирургични шевове или други средства за свързване, нормално приложими в хирургичната практика за прилагане на биоматериали във или на повърхността на човешкото тяло. Освен тези нови механични свойства, многослойните мембрани са също така високо биосъвместими и биоразграждащи се.

Многослойните мембрани съгласно изобретението могат да включват естери на хиалуроновата киселина, използвани поотделно или в комбинация, естери на алгиновата киселина, също използвани отделно или в смеси, както и смесени мембрани, включващи комбинация от естери на хиалуроновата и алгиновата киселина или такива естери в комбинация с други полимери.

Други приложения на изобретението се описват по-долу и са илюстрирани с помощта на приложените чертежи. Посочените примери не ограничават обхвата на изобретението.

Кратко описание на чертежите

Настоящото изобретение се илюстрира от приложените фигури, от които:

фигура 1 е схематична диаграма, илюстрираща етапите, включени в производството на многослойните мембрани съгласно изобретението;

фигура 2 показва мрежата HYAFF 7, която е получена съгласно метода, описан в пример 27;

фигура 3 показва мрежата HYAFF 7, показана на фиг. 21 след нанасяне на полимерното свързващо вещество HYAFF 11, както е описано в пример 27.

Следващото подробно описание на изобретението е дадено, за да помогне на специалистите в тази област да изпълнят практически изобретението. Описанието не ограничава изобретението, тъй като са възможни модификации и варианти на разгледаните изпълнения.

Съдържанията на всеки един от цитираните литературни източници в представеното изобретение са включени в тяхната цялост.

Съгласно изобретението са създадени многослойни мембрани, имащи основно тегло между около 8 и около 50 g/cm², с дебелина в сухо състояние между около 0,08 и около 0,5 mm, минимална якост на опън при разкъсване в сухо състояние от около 100 до около 1000 kg/cm², удължение в сухо състояние между около 3 и 12 %, минимална якост на опън при разкъсване в мокро състояние между около 30 и около 450 kg/cm² и удължение в мокро състояние между около 20 и около 60 %, якост на скъсване в мокро състояние от около 40 до около 200 kg/cm² и в мокро - от около 20 до около 160 kg/cm².

Мембраната съгласно изобретението е многослойна структура, включваща полимерно свързващо вещество, в което е включена подсилваща (армираща) мрежа от същия или от различен материал, от който е изградена мрежата. Армиращата мрежа, която предпазва от разпространяването на пукнатини или разкъсване, причинени от хирургически игли или шевове, включва многовлакнеста, а възможно и усукана нишка (кабел), получена чрез екструзия на сухо или мокро, изтъкана в трикотажна тъкан с деление (екартеман) между 10 и 16.

Многовлакнестият кабел в съставен от между 30 и 120 влакна (филамента) с диаметър между 18 и 30 рт и между около 150 и около 400 дение.

Полимерното свързващо вещество и вътрешната армираща мрежа могат да включват естерите на хиалуроновата киселина, както е описано в US 4 851 521 и US 4 965 353 и в публикацията на РСТ WO 92/13579, използвани поотделно или в смеси един с друг в различни процентни съотношения.

Освен това, полимерното свързващо вещество, в което е включена армиращата мрежа, може да включва смеси от един или повече естери на хиалуроновата киселина в допълнение към биологично и фармакологично активните съставки на желираните полизахариди като хитин, алгинати, цитозан, гелан и техните синтетични или полусинтетични производни.

Представените многослойни мембрани са уникални по това, че са изцяло биосъвместими и биоразграждащи се, защото те са съставени отвътре и отвън от материали, притежаващи такива характеристики. Многослойна структура, т.е. полимерното свързващо вещество-мрежа/полимер представлява единна маса, в която двете съставни части са неразделящи се, дори при намокряне. Това е в резултат на използваната техника на нанасяне на покритие върху армиращата мрежа, при която разтворът с полимерното покритие съдържа разтворител, който е също така и разтворител, използван за получаването на материала, съставящ армиращата мрежа. Разтворителят действа върху мрежата, създавайки химична връзка между полимерното свързващо вещество и армиращата мрежа. Крайният продукт е единно цяло, включващо двете комбинирани структури.

Представените многослойни мембрани са също така уникални поради факта, че е възможно да се променят механичните характеристики на материала - устойчивост и твърдост при навлажняване. Това е възможно да се постигне чрез въвеждане на биосъвместими и биоразграждащи се мрежи, образуващи едно цяло с полимерното свързващо вещество. По такъв начин, могат да се постигнат различни механични свойства чрез използването на различни материали, изграждащи нишките, с модулиране на свойствата им. Например, свойствата на нишките по отношение на HYAFF 11 и ALAFF 11, могат да се представят по следния начин:

Якост	Удъл-	Модул на
	на опън	жение	Юнг
	(МРа)	(%)	(МРа)
HYAFF 11	39	96	560
ALAFF 11	183	15	5428

Така, многослойните мембрани от представеното изобретение притежават предимството, че твърдостта на вътрешната мрежа може да се изменя (модулира), съобразно нуждите, като същевременно се гарантира цялостта на крайния продукт. Традиционните многослойни материали за биомедицинско приложение, включващи армиращи мрежи в полимерно свързващо вещество, имат недостатъка, че двата компонента притежават различни механични характеристики и следователно са склонни да се отделят един от друг при дадени условия, например влага.

Многослойните мембрани от представеното изобретение притежават и предимството, че при все че са изработени от материали с различни химични/физични характеристики, те не се разделят един от друг по време на приложението им.

Многослойните мембрани с гореспоменатите характеристики могат да се получат от армираща мрежа, получена по описания подолу начин.

Във връзка с фиг. 1, в съда (1) се приготвя полимерен разтвор с концентрация между около 80 и около 180 mg/ml, след което се подава, посредством зъбната помпа (2), във филера, който е с между около 30 и около 120 отвора, за мокра екструзия, като всеки отвор е с диаметър между около 30 и около 120 μ. Екструдираният по този начин многовлакнест кабел преминава през коагулационната баня (3) и след това се придвижва посредством транспортни валци в три последователни бани за изплакване (4, 5, 6). Отношението между скоростта на третите валци (III) и това на първите валци (1) се нарича изтеглящо отношение и варира между около 1 и около 1,3, докато скоростта на валците варира между около 2 и около 30 об.мин¹. След като е преминал през изплакващите бани, многовлакнестият кабел се изсушава с топъл въздух (7) при температура, варираща между около 40 и около 55°С и се навива върху рамката (8). Дението на нишката варира между около 150 и около 400. След това многовлакнестият кабел се усуква между около 90 и около 200 пъти на метър и се изтъкава на стан в гладка трикотажна тъкан с деление (екартеман) между около 10 и около 16 (9, 10). След като излезе от стана, тъканта се подава в каландера (11), който я изтънява. Полимерното свързващо вещество се подава през двете въздушни четки (14), които го пулверизират под формата на полимерен разтвор с концентрация между около 30 и около 120 mg/ml. Разтворителят, кой4 то може да се използва за получаването на този полимерен разтвор, може да бъде апротонен разтворител и може да включва амид на карбонова киселина, по-специално диалкиламид на алифатна киселина с между 1 и 5 въглеродни атома и произлязъл от алкилни групи с между 1 и 6 въглеродни атома и от органичен сулфоксид т.е., диалкилсулфоксид с алкилни групи с максимум 6 въглеродни атома, каквито са специално диметилсулфоксид или диетилсулфоксид и от флуориран разтворител с ниска точка на кипене, като хексафлуороизопропанол. Също така полезен е и N-метил-пиролидон. Пулверизираната мрежа преминава през коагулационната баня (15), промивна камера (16) и през сушилна камера с горещи валци с температура, варираща между около 40 и 55°С (17).

Коагулиращите вани 3 и 15 са от неръждаема стомана и са под формата на обра- 20 тен триъгълник, така че екстрахираният разтворител да може да се утаи в най-дълбоката част, докато материалът, който се обработва, може да се поддържа в контакт със свеж коагулиращ разтворител. 25

Процесът коагулация по същество е процес на екстракция, при който от разтвора на полимер и разтворител може да се постигне екстракция на солубилизиращия разтворител и втвърдяването на полимера може да се про- 30 веде чрез прибавянето на втори разтворител, например етанол, в който солубилизиращия разтворител, например диметилсулфоксид, е разтворим, както и самия полимер.

Следователно, изобретението се отнася 5 до нов клас продукти, които ще се използват в областта на медицината и фармацията за лечение на вътрешни или повърхностни нарушения. Продуктът е известен като многослойна мембрана и е напълно или частично биосъв10 местим и биоразграждащ се. Той е съставен от естери на хиалуроновата киселина, поотделно или смесени с други естествени, синтетични или полусинтетични полимери. Такива материали показват висока механична устойчи15 вост, специално спрямо разкъсване, което би се появило в хирургията, когато мембраните сс фиксират към тъканите, заобикалящи оперираното място.

По-голямата механична якост на представените многослойни мембрани, в сравнение с мембраните, получени чрез проста екструзия, може да се определи чрез механични изпитания. За да се демонстрира това, проведено е сравнение между непрекъсната мембрана от етилов естер на хиалуроновата киселина и многослойна мембрана от мрежа от диетилов естер на хиалуроновата киселина и полимерно свързващо вещество от бензилов естер на хиалуроновата киселина. Резултатите от сравнителните изпитания са дадени по-долу в таблица 1.

Таблица 1

	Тип мембрана
Непрекъснат	Многослоен
Сух	Мокър	Сух	Мокър
Дебелина (цт)	18,8	60	195	400
Минимална якост на опън
при разкъсване (kg/cm²)	1000	40	650	120
Удължение (%)	6	42	7	50
Якост на разкъсване (kg/cm²)	15	8	90	50

Якостта на разкъсване се определя, като се прекара хирургически конец 8/0 през мембраната с хирургическа игла.

Тези данни показват, че при мокри ус50 ловия (работни условия) механичните характеристики на многослойната мембрана от представеното изобретение са забележимо по-добри от тези на традиционните непрекъснати мембра5 ни.

Естерите на хиалуроновата киселина

Естерите на хиалуроновата киселина, полезни за изобретението, са естери на хиалуроновата киселина с алифатни, арилалифатни, циклоалифатни или хетероциклсни алкохоли, в които са естерифицирани всички (така наречени “тотални естери”) или само част (т.н. “частични естери”) от карбоксилните групи на хиалуроновата киселина и соли на частичните естери с метали или с органични основи, биосъвместими или приемливи от фармакологична гледна точка.

Полезните естери включват естери, които произлизат от алкохоли, самите те притежаващи забележимо фармакологично действие. Наситените алкохоли от алифатния ред или прости алкохоли от циклоалифатния ред са също така полезни за изобретението.

В посочените естери, в които някои от карбоксилните групи остават свободни (т.е. частични естери), могат да бъдат превърнати в соли с метали или органични основи, каквито са алкалните или алкалоземни метали или с амоняк или азотсъдържащи органични основи.

Повечето от естерите на хиалуроновата киселина (HY), за разлика от самата HY, проявяват известна степен на разтворимост в органични разтворители. Тази разтворимост зависи от процента естерифицирани карбоксилни групи и от типа на алкидната група, свързана с карбоксилната. Следователно, едно HY съединение с естерифицирани всички карбоксилни групи, притежава добра разтворимост при стайна температура, например в диметилсулфоксид (бензиловият естер на HY се разтваря в диметилсулфоксид в степен 200 mg/ml). Повечето от тоталните естери на HY притежават също така, за разлика от самата HY и специално нейните соли, слаба разтворимост във вода и са в основни линии неразтворими във вода. Характеристиките на разтворимост, заедно със забележимите високоеластични свойства, правят HY естерите особено предпочитани за използването им в многослойните мембрани.

Алкохолите от алифатния ред, които се използват като естерифициращи агенти за карбоксилните групи на хиалуроновата киселина за многослойните мембрани, съгласно изобретението, са например тези, с максимум 34 въглеродни атома, които могат да бъдат наситени или ненаситени и които евентуално могат да бъдат заместени с други свободни функционални или функционално-модифицирани групи, като аминна, хидроксилна, алдехидна, кетогрупа, меркаптан или карбоксилни групи или от групи, получени от тях, като хидрокарбил или дихидрокарбиламино групи (оттук нататък терминът “хидрокарбил” ще бъде използван за означаване не само на едновалентни радикали на въглеводородите като тези от типа С Н но също така и на двувалентни или тривалентни радикали, като “алкилени” С_пН_2пили “алкилидени” С_пН_2п), етерни или естерни групи, ацетални или кетални групи, тиоетерни или тиоестерни групи и естерифицирани карбоксилни или карбамидни групи и карбамид, заместен с една или повече хидрокарбил ни групи, с нитрилна група или с халогени.

От групите, съдържащи хидрокарбилни радикали, се предпочитат нисшите алифатни радикали, като алкили с максимум 6 въглеродни атома. Такива алкохоли могат също така да бъдат с прекъсната въглеродна верига от някакъв хетероатом, като кислород, азот и сяра. Предпочитат се алкохоли, заместени с една или две от споменатите функционални групи.

Алкохолите от гореспоменатите групи, които се предпочитат, са тези с максимум 12, а по-специално с 6 въглеродни атома и в които хидрокарбилните атоми в гореспоменатите амино, етерни, естерни, тиоетерни, тиоестерни, ацетални и кетални групи представляват алкилови групи с максимум 4 въглеродни атома, а също така в естерифицираните карбоксилни или заместени карбамидни групи, хидрокарбилните групи са алкили със същия брой въглеродни атоми и в които амино или карбамидните групи могат да бъдат алкиленамино или алкиленкарбамидни групи с максимум 8 въглеродни атома. От тези алкохоли, за предпочитане са наситените и ненаситени алкохоли, като метилов, етилов, пропилов и изопропилов алкохол, n-бутилов алкохол, изобутилов алкохол, третичен бутилов алкохол, амило-, пентил-, хексил-, октил-, нонил- и додецилов алкохол, преди всичко тези с линейна въглеродна верига, като нормален октили додецилалкохол. От заместените алкохоли от тази група, са полезни двувалентните алкохоли, като етиленгликол, пропиленгликол и бутиленгликол, тривалентните алкохоли като глицерин, алдехидалкохоли като тартронов алкохол, карбоксилирани алкохоли като млеч ните киселини, например, гликоловата киселина, маловата киселина, винените киселини, лимонена киселина, аминоалкохолите, като нормален аминоалкохол, аминопропанол, нормален аминобутанол и техните диметилирани и диетилирани производни в аминогрупата, холин, пиролидинилетанол, пиперидинилетанол, пиперазинеилетанол и съответните производни на нормалния пропил или нормалния бутилалкохол, монотиоетиленгликол или неговите алкилови производни, като етиловите производни в мекраптановата функционална група.

От висшите наситени алифатни алкохоли за предпочитане са цетилов и мерицилов алкохол, но за целта на изобретението от особена важност са висшите ненаситени алкохоли с една или две двойни връзки, особено тези, съдържащи се в много от етеричните масла с афинитет към терпена, като цитронелол, гераниол, нерол, неролидол, линалол, фарнезол, фитол. От ненаситените нисши алкохоли от значение е да се имат предвид алилалкохол и пропаргилалкохол. От арил,алифатните алкохоли за предпочитане са тези само с един бензолов остатък и тези, в които алифатната верига е с максимум 4 въглеродни атома и в които бензолният остатък може да се замести с между 1 и 3 метилови групи или хидроксилни групи или с халогенни атоми, специално с хлор, бром и йод и в които алифатната верига може да се замести с една или повече функционални групи, избрани от групата, съдържаща свободни аминогрупи или моно, или диметилирани или от пиролидинови или пиперидинови групи. От тези алкохоли най-предпочетените са бензилалкохол и фенетилалкохол.

Алкохолите от циклоалифатния или алифатния-циклоалифатен ред могат да се получат от моно- или полициклени въглеводороди, могат да притежават препоръчително максимум 34 въглеродни атома, могат да са незаместени и да съдържат един или повече заместители, като тези, споменати по-горе за алифатните алкохоли. От алкохолите, получени от циклични монопръстенни въглеводороди, за предпочитане са тези с максимум 12 въглеродни атома, пръстени с препоръчителен брой въглеродни атоми между 5 и 7, които могат да са заместени, например с между една и три по-нисши алкилови групи, като метил, етил, пропил или изопропил. Като най-предпочетени специфични алкохоли от тази група са следните: циклохексанол, циклохександиол, 1,2,3-циклохексантриол и 1,3,5-циклохексантриол (флороглуцитол), инозитол, а алкохолите, които са произлезли от р-метан, такива като карвоментол, ментол и α-γ -терпинеол, 1-терпинеол, 4-терпинеол и пиперитол или смес от тези алкохоли, известни като “терпинеол”, 1,4- и 1,8-терпин. От алкохолите, които са произлезли от въглеводороди с кондензирани ядра, такива като туян, пинан или камфан, предпочетени са следните: туянол, сабинол, пинол хидрат, D и L-борнеол и D и L-изоборнеол.

Алифатно-циклоалифатните полициклени алкохоли, които ще се използват за естери в изобретението, са стероли, холеви киселини и стероиди, като полови хормони и техните синтетични аналози, специално кортикостероиди и техните производни. Следователно, възможно е да се използват: холестерол, дихидрохолестерол, епидихидрохолестерол, копростенол, епикопростанол, ситостерол, стигмастерол, ергостерол, холева киселина, деоксихолева киселина, литохолева киселина, естриол, естрадиол, еквиленин, еквилин и техните алкилирани производни, както и техните етинилови или пропинилови производни на 17 място, като 17а-етинилестрадиол или 7а-метил-17аетинил-естрадиол, прегненолон, прегнандиол, тестостерон и неговите производни, като 17а -метилтестостерон, 1,2-дехидротестостерон и 17а-мстил-1,2-дехидротестостерон, алкинилираните производни на 17-то място на тестостерона и на 1,2-дехидротестостерона, като 17а -етинилтестостерон ,17а- пропинилтестостерон, норгестрел, хидроксипрогестерон, кортикостерон, деоксикортикостерон, 19-нортестостерон, 19-нор-17а-метилтестостерон и 19-нор-17аетинилтестостерон, антихормони като ципротерон, кортизон, хидрокортизон, преднизон, преднизолон, флуорокортизон, дексаметазон, бетаметазон, параметазон, флуметазон, флуоцинолон, флупреднилиден, клобетазол, беклометазон, алдостерон, деоксикортикостерон, алфаксолон, алфадолон и боластерон. Като естерифициращи компоненти за естерите съгласно изобретението, са от полза следните съединения: генини (агликони) на кардиоактивните гликозиди, като дигитоксигенин, гитоксигенин, дигоксигенин, строфантинидин, тигогенин и сапонини.

Други алкохоли, които ще се използват в изобретението са витамини, като аксерофтол, витамини D₂ и D₃, аневрин, лактофлавин, аскорбинова киселина, рибофлавин, тиамин и пантотенова киселина.

От хетероциклените киселини,следните могат да бъдат разгледани като производни на гореспоменатите циклоалифатни или алифатно-циклоалифатни алкохоли, ако техните линейни или циклични вериги са прекъснати от един или повече, например между един и три хетероатома, подбрани примерно от групата, съставена от -0-, -S-, -N- и -NH- и в тези съединения може да има една или повече ненаситени връзки, например двойни връзки, поспециално между една и три, като по този начин се включват и хетероциклени съединения с ароматни структури. Като примери могат да се посочат следните съединения: фурфурилов алкохол, алкалоиди и производните им, като атропин, скополамин, цинхонин, 1а-цинхонидин, хинин, морфин, кодеин, налорфин, N-бутил-скополамониев бромид, аймалин, фенилетил-амини, като ефедрин, изопротеренол, епинефрин; фенотиазинови лекарства, като перфеназин, пипотиазин, карфеназин, хомофеназин, ацетофеназин, флуофеназин и N-хидроксиетилпрометазин хлорид; тиоксантенови лекарства като флупентиксол и клопентиксол; антиконвулсанти, като мепрофендиол; антипсихотични като опипрамол; антиеметични, като оксипендил; аналгетични, като карбстидин, фсноперидин и метадол; хипнотични, като етодроксизин, анорексични, като бензидрол и дифеметоксидин; слаби транквилизатори като хидроксизин; мускулни релаксанти, като цинамедрин, дифилин, мефенизин, метокарбамол, хлорфенезин, 2,2-диетил-1,3-пропандиол, гайфенезин, хидроциламид; коронарни съдоразширяващи средства, като дипидамол и оксифедрин; адренергични блокиращи средства, като пропанолол, тимолол, пиндолол, бупранолол, атенолол, метропролол, практолол; антинеопластични средства, като 6-азауридин, цитарабин, флуоксиридин; антибиотици, като хлорамфеникол, тиамфеникол, еритромицин, олеандомицин, линкомицин; антивирусни средства, като идоксуридин; периферни съдоразширители като изоникотинилов алкохол; каробонови анхидразни инхибитори като сулокарбилат; антиастматични и противовъзпалителни средства, като тиарамид; сулфамиди, като 2-р-сулфанилонов етанол.

В някои случаи са подходящи естерите на хиалуроновата киселина, в които естернитс групи са произлезли от две или повече терапевтично активни хидроксилни субстанции и естествено, могат да се получат всички възможни варианти. От специален интерес са субстанциите, в които са застъпени два типа различни естерни групи, произлизащи от лекарства с хидроксилен характер и в които останалите хидроксилни групи са свободни, превърнати в сол с метали или с основа, като е възможно също така и самите основи да са терапевтично активни, например, със същата или подобна активност както тази на естерифициращия компонент. По-точно, възможно е да се получат естери на хиалуроновата киселина, произлизащи от една страна от противовъзпалителен стероид, като един от тези, посочени по-горе, а от друга - от витамин, алкалоид или антибиотик, като един от споменатите по-горе.

Метод за получаване на естери на хиалуроновата киселина съгласно изобретението

Метод А:

Естерите на хиалуроновата киселина могат да бъдат получени по известни методи за естерифициране на карбоновите киселини, например чрез обработка на свободна хиалуронова киселина с желаните алкохоли в присъствието на катализиращи вещества, като силни неорганични киселини или йонообменни агенти от киселинен тип или с естерифициращ агент, способен да въведе желания алкохолен остатък, в присъствието на неорганични или органични основи. Като естерифициращи агенти е възможно да се използват тези, известни от литературата, като особено подходящи са естерите на различни неорганични или органични сулфонови киселини, като хидрациди, т.е. хидрокарбилни халогениди, като метил- или етилйодид или неутрални сулфати или хидрокарбилни киселини, алифати, карбонати, силикати, фосфити или хидрокарбил сулфонати, като метилбензол или р-толуол-сулфонат или метил- или етил хлорсулфонат. Реакцията може да се извърши в подходящ разтворител, например алкохол, за предпочитане такъв, отговарящ на алкиловата група, която ще се въведе в карбоксилната група. Но реакцията може също така да се извърши и в неполярни разтворители, каквито са кетоните, етерите или диоксана или в апро8 тонни разтворители, като диметилсулфоксид. Като основа е възможно да се използва например хидроокис на алкален, алкалоземен метал или магнезий, както и сребърен окис или основна сол на един от тези метали, като карбонат и, от органичните основи - третична азотна база, като например пиридин или колидин. Вместо основа е възможно също така да се използва йонообменна смола от основен тип.

При друг метод за естерифициране се прилагат метални соли или соли с органични азотни бази, например, амониева основа или заместени амониеви соли. За предпочитане е да се използват солите на алкални или алкалоземни метали, но могат да се използват и солите на други метали. Естерифициращите агенти в този случай са също така онези, споменати по-горе, като същото се отнася до разтворителите. За предпочитане е да се употребяват апротонни разтворители, например диметилсулфоксид и диметилформамид.

В получените съгласно тази или някоя друга процедура, описана по-нататък, естери, свободните карбоксилни групи на частичните естери могат да бъдат превърнати в сол, ако е желателно, по известни per se методи.

Метод Б:

Хиалуроновите естери могат да се получат също така по метод, който се състои в обработка на кватернерна амониева сол на хиалуроновата киселина с естерифициращ агент, за предпочитане в апротонен органичен разтворител.

Като органични разтворители е препоръчително да се използват апротонни разтворители, като диалкилсулфоксиди, диалкилкарбоксамиди, като особено специални са диалкилсулфоксиди с нисш алкил, специално диметил-сулфоксид и нисш алкил диалкиламиди на нисши алифатни киселини, като диметил- или диетилформамид или диметил или диетилацетамид.

Възможна е и употребата на други разтворители, които не са винаги апротонни, като алкохоли,етери,кетони,естери, специално алифатни или хетероциклени алкохоли и кетони с ниска точка на кипене, като хексафлуороизопропанол, трифлуороетанол и N-метилпиролидон.

Реакцията се извършва, за предпочитане в температурния интервал между 0 и 100°С, по-специално между 25 и 75°С, например при около 30°С.

Естерифицирането се провежда, за предпочитане, чрез прибавянето на порции на естерифициращ агент към гореспоменатата амониева сол в един от гореспоменатите разтворители, например диметилсулфоксид.

Като алкилиращи агенти е възможно да се използват, посочените по-горе, специално хидрокарбилни халогени, например алкил халогени. Като изходящи кватернерни амониеви соли е за предпочитане да се прилагат нисши амониеви тетраалкилати, като алкилните групи е препоръчително да бъдат с между 1 и 6 въглеродни атоми. Най-често се използва тетрабутиламониев хиалуронат. Тези кватернерни амониеви соли е възможно да се получат чрез взаимодействие на метална сол на хиалуроновата киселина, за предпочитане една от тези, посочени по-горе, специално натриева или калиева сол, във воден разтвор с превърната в сол сулфонова смола с кватернерна амониева основа.

Вариант на описаната по-горе процедура е реакцията на калиева сол на хиалуронова киселина, разтворена в подходящ разтворител, като диметилсулфоксид, с подходящ алкилиращ агент, в присъствието на каталитично действащи количества от кватернерна амониева сол, като тетрабутиламониев йодид.

За получаването на естери на хиалуроновата киселина е възможно да се използват хиалуронови киселини от всякакъв произход, например, киселините, екстрахирани от гореспоменатите изходни материали, например от гребен на петел. Получаването на тези киселини е описано в литературата: препоръчително е да се прилагат пречистени хиалуронови киселини. Използват се специално хиалуронови киселини, включващи молекулни фракции от интегрални киселини, получени директно чрез екстракция на органичните материали с молекулни тегла, вариращи в широк интервал, например от около 90 - 80 % (Мол. тегло = 11,7 - 10,4 млн) до 0,2 % (Мол. тегло = 30 000) от молекулното тегло на интегралната киселина, притежаваща молекулно тегло 13 милиона, за предпочитане между 5 и 0,2 %. Такива фракции могат да бъдат получени по различни методи, описани в литературата, като хидролиза, окисление, ензимни или физични процедури, като механични или радиационни методи. По време на процедурите, описани в литературата често се получават първични екстракти (Balazs et al., публикувана в “Cosmetics & Toiletries”). Разделянето и пречистването на получените молекулни фракции се извършва по известни техники, например чрез филтруване през молекулно сито.

В допълнение, полезни са пречистени фракции, които могат да се получат от хиалуронова киселина, като например тези, описани в ЕР 0138572.

Получаването на соли на хиалуроновата киселина с горепосочените метали за приготвяне на изходните соли за специалната процедура за естерифакция, се извършва по известни начини, например при реакция между хиалуронова киселина със стехиометрично изчислено количество алкални хидроокиси или с основните соли на тези метали като карбонати или бикарбонати.

В частичните естери е възможно да се превърнат в сол всички останали карбоксилни групи или само част от тях, като се дозират количествата основа, така че да се получи желаната стехиометрична степен на образуване на сол. С правилната степен на превръщане в сол е възможно да се получат естери с широк диапазон от различни дисоциационни константи, които следователно ще бъдат в състояние да дадат желаното pH в разтвор или in situ по време на приложението им в терапията.

Примери за изпълнение на изобретението

Следващите примери обясняват получаването на естери на хиалуроновата киселина, полезни за многослойните мембрани съгласно изобретението.

Пример 1 - Получаване на (частичен) пропилов естер на хиалуронова киселина (HY)

- 50 % естерифицирани карбоксилни групи

- 50 % превърнати в сол карбоксилни групи (Na)

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 1,8 g (10,6 mol) пропилойодид и полученият разтвор се поддържа при температура 30°С в продължение на 12 часа.

Прибавя се разтвор, съдържащ 62 ml вода и 9 g натриев хлорид и получената смес се излива бавно в 3 500 ml ацетон при постоянно разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива трикратно с 500 ml ацетон/вода 5 : 1 и трикратно с ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на осем часа при 30°С.

След това продуктът се разтваря в 550 ml вода, съдържаща 1 % натриев хлорид и разтворът се излива бавно в 3 000 ml ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и се промива двукратно с 500 ml ацетон/вода (5 : 1) и трикратно с 500 ml ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 7,9 g частичен пропилов естер от заглавието. Извършва се количественото определяне на естерните групи, като се прилага методът на R. Н. Cundiff and Р. С. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028 - 1030 (1961)].

Пример 2 - Получаване на (частичен) изопропилов естер на хиалуронова киселина (HY) - 50 % естерифицирани карбоксилни групи - 50 % превърнати в сол карбоксилни групи (Na)

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 160 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 1,8 g (10,6 mol) изопропилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30“С.

Прибавя се разтвор, съдържащ 62 ml вода и 9 g натриев хлорид и получената смес се излива бавно в 3 500 ml ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива трикратно с 500 ml ацетон/вода (5 : 1), трикратно с ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на 8 часа при 30°С.

След това продуктът се разтваря в 550 ml вода, съдържаща 1 % натриев хлорид и разтворът се излива бавно в 3 000 ml ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива двукратно с 500 ml ацетон/вода (5 : 1) и трикратно с 500 ml ацетон, накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30С.

Получават се 7,8 g частичен изопропилов естер - съединението от заглавието. Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се прилага методът на R. Н. Cundiff and Р. С. Markunas [Anal. Chem. 33,

1028 - 1030 (1961)].

Пример 3 - Получаване на (частичен) етилов естер на хиалуроновата киселина - 75 % естерифицирани карбоксилни групи - 25 % превърнати в сол карбоксилни групи (Na)

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуроновата киселина с молекулно тегло 250 000, отговарящо на 20 mol от мономера се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 2,5 g (15,9 mol) етилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

След това продуктът се разтваря в 550 ml вода, съдържаща 1 % натриев хлорид и разтворът се излива бавно в 3 000 ml ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива двукратно с 500 ml ацетон/вода (5 : 1) и трикратно с 500 ml ацетон, накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С.

Получават се 7,9 g частичен изопропилов естер - съединението от заглавието. Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се прилага методът на R. Н. Cundiff and Р. С. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028 1030 (1961)].

Пример 4 - Получаване на (частичен) метилов естер на хиалуроновата киселина - 75 % естерифицирани карбоксилни групи - 25 % превърнати в сол карбоксилни групи

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 80 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 2,26 g (15,9 mol) метилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Прибавя се разтвор, съдържащ 62 ml вода и 9 g натриев хлорид и получената смес се излива бавно в 3 500 ml ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива трикратно с 500 ml ацетон/вода (5:1), трикратно с ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на 8 часа при 30°С.

Получава се 7,8 g частичен изопропилов естер - продуктът от заглавието. Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се прилага методът на R. Н. Cundiff and Р. С. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028 1030 (1961)].

Пример 5 - Получаване на метилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 120 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 3 g (21,2 mol) метилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С.

Получава се 8 g етилов естер - продуктът от заглавието. Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се използва методът на R. Н. Cundiff and Р. С. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028 - 1030 (1961)].

Пример 6 - Получаване на етилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 85 000, отговарящи на 20 mol мономер, се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 3,3 g (21,2 mol) етилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при ЗО°С.

Пример 7 - Получаване на пропилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер, се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 3,6 g (21,2 mol) пропилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получава се 8,3 g пропилов естер - съединението от заглавието. Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се използва методът на R. Н. Cundiff and Р. С. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028 - 1030 (1961)].

Пример 8 - Получаване на (частичен) бутилов естер на хиалуронова киселина - 50 % естерифицирани карбоксилни групи - 50 % превърнати в сол карбоксилни групи (Na)

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 620 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 1,95 g (10,6 mol) п-бутилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Прибавя се разтвор, съдържащ 62 ml вода и 9 g натриев хлорид и получената смес се излива бавно в 3 500 mJ ацетон при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива трикратно с 500 ml ацетон/вода (5 : 1), трикратно с ацетон и накрая се суши под вакуум в продължение на 8 часа при 30°С.

Получава се 8 g частичен бутилов естер - Съединението от заглавието. Извършва се ко личествено определяне на естерните групи, като се използва методът на R. Н. Cundiff and Р. С. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028 - 1030 (I960].

Пример 9 - Получаване на (частичен) етокси-карбонилметилов естер на хиалуроновата киселина - 75 % естерифицирани карбоксилни групи - 25 % превърнати в сол карбоксилни групи

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 180 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 2 g (15 mol) тетрабутиламониев йодид и 1,84 g (15 mol) етил-хлорацетат и полученият разтвор се поддържа в продължение на 24 часа при 30°С.

Получава се 10 g етоксикарбонил метилов естер - съединението от заглавието.

Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се използва методът на R. Н. Cundiff and Р. С. Markunas [Anal. Chem. 33, 1028 - 1030 (1961)].

Пример 10 - Получаване на п-пентилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 620 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 3,8 g (25 mol) n-пентилбромид и 0,2 g тетрабутиламониев йодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получава се 8,7 g n-пентилов естер съединението от заглавието. Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се използва методът, описан в Siggia S. & Hanna J. G. “Quantitative organic analysis via functional groups” 4th Edition, John Wiley and Sons, (p. 169 - 172).

Пример 11 - Получаване на изопентилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 3,8 g (25 mol) изопентилбромид и 0,2 g тетрабутиламониев йодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получават се 8,6 g изопентилов естер съединението от заглавието. Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се използва методът, описан в Siggia S. & Hanna J. G. “Quantitative organic analysis via functional groups” 4th Edition, John Wiley and Sons, (p. 169 - 172).

Пример 12 - Получаване на бензилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,5 g (25 mol) бензилбромид и 0,2 g тетрабутиламониев йодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получават се 9 g бензилов естер - съединението от заглавието. Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се използва методът, описан в Siggia S. & Hanna

J. G. “Quantitative organic analysis via functional groups” 4th Edition, John Wiley and Sons, (p. 169 - 172).

Пример 13 - Получаване на β-фенилетилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 125 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,6 g (25 mol) 2-бромоетилбензол и 185 mg тетрабутиламониев йодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получава се 9,1 g β-фенилетилов естер - съединението от заглавието. Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се използва методът, описан в Siggia S. & Hanna J. G. “Quantitative organic analysis via functional groups” 4th Edition, John Wiley and Sons, (p. 169 - 172).

Пример 14 - Получаване на бензилов естер на хиалуроновата киселина g калиева сол на хиалуроновата киселина с молекулно тегло 162 000 се суспендират в 200 ml диметилсулфоксид, прибавят се 120 mg тетрабутиламониев йодид и 2,4 g бензилбромид.

Суспенсията се разбърква в продължение на 48 часа при 30°С. Получената смес се излива бавно в 1 000 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и се промива четирикратно със 150 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С.

Получава се 3,1 g бензилов естер - съединението от заглавието. Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се използва методът, описан в Siggia S. & Hanna J. G. “Quantitative organic analysis via functional groups” 4th Edition, John Wiley and Sons, (p. 169 - 172).

Пример 15 - Получаване на (частичен) пропилов естер на хиалуроновата киселина 85 % естсрифицирани карбоксилни групи - 15 % превърнати в сол карбоксилни групи

12,4 g тетрабутиламониева сол на хи алуронова киселина с молекулно тегло 165 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 2,9 g (17 mol) пропилйодид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получава се 8 g частичен пропилов естер - съединението от заглавието.

Пример 16 - Получаване на п-октилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящо на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,1 g (21,2 mol) 1-бромоктан и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и се промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получава се 9,3 g октилов естер - съединението от заглавието.

Извършва се количествено определяне на естерните групи, като се използва методът, описан от Siggia S. & Hanna J. G. “Quantitative organic analysis via functional groups” 4th Edition, John Wiley and Sons, (p. 169 - 172).

Пример 17 - Получаване на изопропилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хи алуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 2,6 g (21,2 mol) изопропилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 8,3 g изопропилов естер - съединението от заглавието.

Пример 18 - Получаване на 2,6 -дихлорбензилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 5,08 g (21,2 mol) 2,6-дихлорбензилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получава се 9,8 g 2,6дихлорбензилов естер - съединението от заглавието.

Пример 19 - Получаване на 4-трет.-бутилбензилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,81 g (21,2 mol) 4-трет.-бутилбензилов бромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получава се 9,8 g 4-трет.-бутилбензилов естер - съединението от заглавието.

Пример 20 - Получаване на хептадецилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 6,8 g (21,2 mol) хептадецилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получава се 11 g хептадецилов естер - съединението от заглавието.

Пример 21 - Получаване на октадецилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 7,1 g (21,2 mol) октадецилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получава се 11 g октадецилов естер - съединението от заглавието.

Извършва се количествено определяне на естерните групи, като си използва методът, описан от Siggia S. & Hanna J. G. “Quantitative organic analysis via functional groups” 4th Edition,

John Wiley and Sons, (p. 169 - 172).

Пример 22 - Получаване на 3-фенилпропилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,22 g (21,2 mol) 3-фенилпропилбромид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получават се 9 g 3-фенилпропилов естер - съединението от заглавието.

Пример 23 - Получаване на 3,4,5-триметокси-бензилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,6 g (21,2 mol) 3,4,5-триметоксибензилхлорид и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получава се 10 g 3,4,5-триметоксибензилов естер - съединението от заглавието.

Пример 24 - Получаване на цинамилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,2 g (21,2 mol) цинамилбромид и получе15 ният разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получава се 9,3 g цинамилов естер - съединението от заглавието.

Пример 25 - Получаване на децилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 mi диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,7 g (21,2 mol) 1-бромодекан и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получава се 9,5 g децилов естер - съединението от заглавието.

Пример 26 - Получаване на нонилов естер на хиалуроновата киселина

12,4 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина с молекулно тегло 170 000, отговарящи на 20 mol мономер се разтварят в 620 ml диметилсулфоксид при 25°С, прибавят се 4,4 g (21,2 mol) 1-бромононан и полученият разтвор се поддържа в продължение на 12 часа при 30°С.

Получената смес се излива бавно в 3 500 ml етилацетат при непрекъснато разбъркване. Образува се утайка, която се филтрува и промива четирикратно с 500 ml етилацетат и накрая се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. Получава се 9 g нонилов естер - съединението от заглавието.

Естери на алгиновата киселина

Естерите на алгиновата киселина, които могат да се използват съгласно изобретението могат да се получат по метода, описан в ЕР 0 251 905 А2, като се излезе от кватернерни амониеви соли на алгиновата киселина с естерифициращ агент, за предпочитане в апротонен органичен разтворител, като диалкилсулфоксиди, диалкилкарбоксамиди, като особено подходящи са нисшите алкилни диалкилсулфоксиди, най-вече диметилсулфоксид и нисши алкилни диалкиламиди с нисши алифатни киселини, като диметил- или диетилформамид или диметил- или диетилацетамид. Възможно е, обаче, да се използват и други разтворители, които са не винаги апротонни, като алкохоли, етери, кетони, естери, специално алифатни или хетероциклени алкохоли и кетони с ниска точка на кипене, като хексафлуоризопропанол и трифлуоретанол. Препоръчително е реакцията да се проведе при температури между около 0 и 100°С, по-специално - между около 25 и 75°С, например около 30°С.

За предпочитане е естерифицирането да се проведе чрез постепенно прибавяне на естерифициращ агент към гореспоменатата амониева сол, разтворена в един от споменатите разтворители, например в диметилсулфоксид. Като алкилиращи агенти могат да се използват вече посочени по-горе, особено хидрокарбил халидите, например алкил халиди.

Предпочетеният естерифициращ процес следователно включва взаимодействие, в органичен разтворител, на кватернерна амониева сол на алгиновата киселина със стехиометрично количество от съединение с обща формула

А - X в която А е подбрано от групата, състояща се от алифатни, арилалифатни, циклоалифатни, алифатно-циклбалифатни и хетероциклени радикали, a X означава халогенен атом, и при който споменатото стехиометрично количество на А-Х се определя от желаната степен на естерификация.

Като изходни кватернерни амониеви соли е препоръчително да се използват нисши алкилни тетраалкилати, чиито алкилни групи притежават, за предпочитане от 1 до 6 въглеродни атома. Най-често се прилага тетрабутиламониев алгинат. Тези кватернерни амониеви соли могат да бъдат получени при взаимодействието на метална сол на алгиновата киселина, за предпочитане една от тези, споменати по-горе, особено натриевата или калиева сол, във воден разтвор с превърната в сол сулфонова смола с кватернерна амониева основа.

Вариант на по-горе описаната процедура се състои във взаимодействие на калиева или натриева сол на алгиновата киселина, разтворена или суспендирана в подходящ разтворител, като диметилсулфоксид, с подходящ алкилиращ агент в присъствието на каталитично действащо количество кватернерна амониева сол, например тетрабутиламониев йодид. Тази процедура прави възможно получаването на тотални естери на алгиновата киселина.

За получаването на нови естери е възможно използването на алгинови киселини от всякакъв произход. Получаването на тези киселини е описано в литературата. За предпочитане е да се прилагат пречистени алгинови киселини.

В частичните естери е възможно превръщането в сол на всички оставащи карбоксилни групи или само на част от тях, като количеството основа се дозира така, че да се получи желаната стехиометрична степен на превръщане в сол. При правилно дозиране степента на превръщане в сол, е възможно да се получат естери с широк диапазон от различни дисоциационни константи, като по този начин се създаде желаното pH на разтворите in situ по време на терапевтичното приложение.

Особено полезни за представените многослойни мембрани са ALAFF 11, бензилов естер на алгиновата киселина и ALAFF 7, етилов естер на алгиновата киселина.

С чисто илюстративна цел, по-долу са дадени някои примери за това как могат да се получат многослойните мембрани и как да се използват в практиката.

Пример 27

Произведена е многослойна мембрана, съставена от бензилов естер на хиалуроновата киселина HYAFF 11, т.е. хиалуронова киселина естерифицирана 100 % с бензилов алкохол, с армираща мрежа, изградена от етилов естер на хиалуроновата киселина HYAFF 7, т.е. хиалуронова киселина, естерифицирана 100 % с етанол с базисно тегло 14 mg/cm², дебелина 0,25 mm, минимална якост на опън при разкъсване и удължение в сухо състояние, съответно 400 kg/cm² и 7 %, минимална якост на опън и удължение в мокро състояние, съответно 50 kg/cm² и 55 %, якост на опън в сухо състояние - 90 kg/cm² и якост на опън в мокро състояние 50 kg/cm², съгласно описаната подолу процедура.

Мрежата HYAFF 7 е получена, като се излезе от разтвор на HYAFF 7 в диметилсулфоксид с концентрация 125 mg/ml, приготвен в съд 1, показан на фиг. 1. Разтворът се поема от зъбната подхранваща помпа (2) и се подава във филера за мокра екструзия, който е снабден със 100 отвора, всеки от тях с размер 65 цт в диаметър.

Екструдираният многовлакнест кабел се прекарва през коагулационната баня (3), съдържаща абсолютен етанол и след това през транспортните валци - в три последователни изплакващи бани (4, 5 и 6), съдържащи също така абсолютен алкохол. Отношението между скоростта на третите валци (III) към това на първите (I) се нарича изтеглящо отношение и стойността му е 1,05, докато скоростите на отделните валци са 23 об.мин’¹ (валци I), 24 об,мин ¹ (валци II и III), 25 об.мин'¹ (валци IV). След като многовлакнестият кабел е преминал през изплакващите бани, той се изсушава с топъл въздух (7) с температура 45°С и се намотава на рамката (8). Кабелът е 237 дение. Многовлакнестият кабел след това се пресуква 135 пъти на метър и се изтъкава на стан в гладка трикотажна тъкан с деление 14 (9, 10). От стана тъканта се подава в каландъра (11), който я изтънява. На фиг. 2 е показана мрежата, получена в резултат на този процес.

Полимерното свързващо вещество се нанася чрез двете въздушни четки (дюзи) (14), които пулверизират разтвор на HYAFF 11 в диметилсулфоксид с концентрация 40 mg/ml. Така пулверизираната мрежа се прекарва през коагулационната баня (15), съдържаща абсолютен етанол, през изплакващата камера (16), съдържаща чиста, дестилирана вода и през специалната сушилна камера (17) с топъл въздух 50°С. На фиг. 3 е показан крайният продукт.

Пример 28

Армирана мембрана, съставена от по17 лимерно свързващо вещество от частичен бензилов естер (75 %) на хиалуронова киселина HYAFF 11р75 с армираща мрежа, съставена от тотален бензилов естер на хиалуроновата киселина - HYAFF 11 с базисно тегло 10 mg/cm², дебелина 0,15 mm и минимална якост на опън при разкъсване и удължение в сухо състояние, съответно 300 kg/cm² и 4 %; минимална якост на опън при разкъсване и удължение в мокро състояние, съответно 40 kg/cm² и 45 %; якост на опън в сухо състояние 120 kg/cm² и в мокро състояние 60 kg/cm², е произведена съгласно следната процедура.

HYAFF 11р75 се получава по следната процедура. 10 g тетрабутиламониева сол на хиалуронова киселина, с молекулно тегло 620,76, равно на 16,1 наномола, се разтварят в смес от N-метил пиролидон/вода, 90/10, 2,5 % тегл., за получаването на 400 ml разтвор. Разтворът се охлажда до 10°С, след това през разтвора барботира пречистен азот в продължение на 30 min. Този разтвор след това се естерифицира с 1,49 ml (равни на 12,54 mmol) бензилбромид. Разтворът се разтръсква леко в продължение на 60 часа при 15 - 20°С.

Извършва се последователно пречистване чрез утаяване в етилацетат, последвано от прибавянето на наситен разтвор на натриев хлорид и неколкократни промивания със смес от етилацетат/абсолютен етанол, 80/20. Твърдата фаза се отделя чрез филтруване и се обработва с безводен ацетон. По този начин се получават 6,8 g от продукта, представляващи добив около 95 %.

Мрежата HYAFF 11 е получена, като се излезе от разтвор на HYAFF 11 в диметилсулфоксид с концентрация 145 mg/ml, приготвен в съд 1, показан на фиг. 1. Разтворът се поема от зъбната подхранваща помпа (2) и се подава във филера за мокра екструзия, който е снабден със 70 отвора, всеки от тях с диаметър 50 цт.

Екструдираният многовлакнест кабел се прекарва през коагулационната баня (3), съдържаща 90 % абсолютен етанол и 10 % чиста, дестилирана вода и след това през транспортните валци - в три последователни изплакващи бани (4, 5 и 6), съдържащи също така 90 % абсолютен алкохол и 10 % чиста дестилирана вода. Отношението между скоростта на третите валци (III) към това на първите (I) се нарича изтеглящо отношение и стойността му е 1,03, докато скоростите на отделните валци са 20 об.мин'¹ (валци I), 21 об.мин'¹ (валци II и III), 22 об.мин ¹ (валци IV). След като многовлакнестият кабел е преминал през изплакващите бани, той се изсушава с топъл въздух (7) с температура 47°С и се намотава на рамката (8). Полученият кабел е 150 дение. Многовлакнестият кабел след това се пресуква 90 пъти на метър и се изтъкава на стан в гладка трикотажна тъкан с деление 12 (9, 10). От стана тъканта се подава в каландъра (11), който я изтънява.

Полимерното свързващо вещество се нанася чрез двете въздушни четки (дюзи) (14), които пулверизират разтвор на HYAFF 11р75 в диметилсулфоксид с концентрация 30 mg/ml. Така пулверизираната мрежа се прекарва през коагулационната баня (15), съдържаща абсолютен етанол, през изплакващата камера (16), съдържаща чиста, дестилирана вода и през специалната сушилна камера (17) с топъл въздух 45°С.

Пример 29

Многослойна мембрана, съставена от свързващо вещество от частичен бензилов естер (75 %) на хиалуронова киселина - HYAFF 11 р75 с армираща мрежа, съставена от смес на влакна от тотален бензилов естер на хиалуроновата киселина - HYAFF 11 и от бензилов естер на алгиновата киселина - ALAFF 11, в еднакво процентно съотношение и базисно тегло 16 mg/cm², дебелина 0,25 mm и минимална якост на опън при разкъсване и удължение в сухо състояние, съответно 350 kg/cm² и 5 %; минимална якост на опън при разкъсване и удължение в мокро състояние, съответно 100 kg/cm² и 35 %; якост на якост на скъсване в сухо състояние 110 kg/cm² и в мокро състояние 70 kg/cm², е произведена съгласно следната процедура.

Бензиловият естер на алгиновата киселина - ALAFF 11 се получава по метод, описан в US 5147861 и ЕР 0251905 А2. 10 g (23,9 mol) тетрабутиламониева сол на алгиновата киселина се разтварят в 400 ml диметилсулфоксид при 25°С. Прибавят се 4,45 g (26 mol) бензилбромид и 0,1 g тетрабутиламониев йодид.

Разтворът се разбърква добре в продължение на 12 часа при 30°С и след това се излива бавно на равномерни капки и при разбъркване в 3,5 1 етилацетат (или толуол). Утайката се филтрува и след това се промива четирикратно с етилацетат и се суши под вакуум в продължение на 24 часа при 30°С. По този на18 чин се получават 5 g от съединението.

Мрежата, образувана от многовлакнестите кабели на HYAFF 11 и ALAFF 11 в еднакво процентно съотношение се получава, като се излезе от два отделни многовлакнести кабела, единият от HYAFF 11 със 60 дение, а другият - от ALAFF 11 със 75 дение.

Многовлакнестият кабел от HYAFF 11 е получен по метода, описан в пример 2, докато многовлакнестият кабел от ALAFF 11 е получен по следния начин. Разтвор на ALAFF 11 в диметилсулфоксид с концентрация 100 mg/ml, се приготвя в съд 1, показан на фиг. 1. Разтворът се поема от зъбната подхранваща помпа (2) и се подава във филера за мокра екструзия, който е снабден с 35 отвора, всеки от тях с диаметър 50 pm.

Екструдираният многовлакнест кабел се прекарва през коагулационната баня (3), съдържаща 45 % абсолютен етанол, 45 % етилацетат и 10 % чиста, дестилирана вода. След това се придвижва чрез транспортните валци - в три последователни изплакващи бани (4, 5 и 6), съдържащи ацетон. Отношението между скоростта на третите валци (III) към това на първите (I) се нарича изтеглящо отношение и стойността му е 1,1, докато скоростите на отделните валци са 20 об.мин’¹ (валци I), 21 об.мин·¹ (валци II и III), 22 об.мин ¹ (валци IV). След като многовлакнестият кабел е преминал през изплакващите бани, той се изсушава с топъл въздух (7) с температура 55°С и се намотава на рамката (8). Кабелът HYAFF 11 със 60 дение и кабелът ALAFF 11 със 75 дение се комбинират в пресукващата машина, даваща многовлакнест кабел от HYAFF 11 и ALAFF

11. Многовлакнестият общ кабел след това се пресуква 90 пъти на метър и се изтъкава на стан в гладка трикотажна тъкан с деление 12 (9, 10). От стана тъканта се подава в каландъра 11, който я изтънява.

Полимерното свързващо вещество се нанася чрез двете въздушни четки (дюзи) (14), които пулверизират разтвор на HYAFF 11 р75 в диметилсулфоксид с концентрация 30 mg/ml. Така пулверизираната мрежа се прекарва през коагулационната баня (15), съдържаща абсолютен етанол, през изплакващата камера (16), съдържаща чиста, дестилирана вода и през специалната сушилна камера (17) с топъл въздух 45°С.

Пример 30

Механичните и биологични предимства на многослойните мембрани съгласно представеното изобретение са били показани чрез серия клинични и периодонтални хирургически експерименти, проведени с използването на материалите, описани в пример 1, съгласно стандартните ръководни предписания за регенерация на тъканите. Тези предписания изискват материалът, който ще се постави съгласно подходящите хирургични техники чрез зашиване към мястото на прилагане, да стимулира образуването на нови тъкани, да замести увредените или разрушени при различните периодонтални патологии.

Такива поражения, най-общо представляват загуба на оригиналната структура на периодонталната тъкан и интрофлексия в така образуваните кавитети, в мукогингивалната тъкан. Това води до неправилно оздравяване с отслабващ ефект върху функциите, структурата и стабилността на включените зъбни елементи. Изследвани са два типа дефекти. Първият включва перирадикулярни увреждания от различни видове (на една или повече стени, частично или пълно разкрити бифуркации, кръгли или полукръгли дефекти). Вторите включват костни ръбове, които са твърде фини, за да издържат нормално зъбно заместване или поставянето на имплант. Сравнителни стойности включват цялостта на армираната мембрана по време и място на нейното прилагане (максималната цялост е обозначена с +++), възпалението на тъканите над мембраната (максималното възпаление е означено с +++), намаляване на дефекта 30 дни след хирургическата намеса (максималното намаление означено с +++) и резорбция на поместения материал (максимална резорбция означена с +++). Таблица 2 показва примери на данни, свързани с хирургичните операции върху хора в клинични експерименти, с използването на многослойните мембрани, като тези, описани в пример 27.

(30 дни)

ТАБЛИЦА 2

Случай Тип операция Цялост Възпаление, Намаляване Резорбция Бр. на дефекти

1	1	+ + +
2	1	+ + +
3	1	+ + +
4	1	+ + +
5	1	+ + +
6	1	+ + +
7	1	+ + +
8	1	+ + +
9	1	+ + +
10	1	+ + +
11	1	+ + +
12	1	+ + +
13	2	+ + +
14	2	+ + +
15	2	+ + +
16	2	+ + +·
17	2	+ + +·

4- --	+ +· -	-++ -
+ + -	+ 4- -	+ + -
+ - -	+ + +	+ + +
+ - -	+ + -	+ + -
+ --	+ + +	+ + +
+ --	++ -	4-+ -
+ + -	+ + -	+ + -
+ - -	+ + +	+ -++-
+ - -	+ + -	+ +· -
+ --	+-+ -	+ + -
+ + -	+ + -	+ +· -
+ - -	++· -	+ + -
4- 4—	+ + +	+ + -
+ +	+ + -	+ - -
+ 4-4-	+ --	+ --
+ +· -	+ + -
+ + -	+ + -	+ + -

= Перирадикуларни увреждания » Нарастване на костен ръб

Резултатите, показани в таблица 2, показват, че съставните мембрани съгласно изоб- 30 ретението успешно съчетават биосъвместимостта, биопоглъщането и биоразграждането с висока степен на механична устойчивост. Тази комбинация от свойства не е представена в други продукти, използвани за същите приложе- 35 ния в периодонталната хирургия, показвайки превъзходството на представените многослойни мембрани пред традиционните продукти.

Описаните примери не ограничават обсега на изобретението. 40

Claims

1. Многослойна мембрана, включваща армираща мрежа, включена в полимерно свър- 45 зващо вещество, при което споменатата мрежа е съставена най-малко от един материал, избран от групата, състояща се от хиалуронова киселина или нейно производно или алгинова киселина или нейно производно, а споменато- 50 то свързващо вещество е съставено най-малко от един материал, избран от групата, състояща се от хиалуронова киселина или нейно производно, алгинова киселина или нейно производно и желиран полизахарид.

2. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, в която посоченото производно на хиалуроновата киселина е естер на хиалуроновата киселина.

3. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, в която посоченото производно на алгиновата киселина е естер на алгиновата киселина.

4. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, в която посоченият желиран полизахарид е най-малко един член избран от групата, състояща се от хитин, алгинат, цитозан, гелан, синтетично производно на някое от горепосочените съединения, или полусинтетично производно на някое от горепосочените съединения.

5. Многослойна мембрана съгласно претенция 2, в която посоченият естер на хиалуроновата киселина е застъпен сам или в комбинация с други естери на хиалуроновата киселина.

6. Многослойна мембрана съгласно претенция 3, в която посоченият естер на алгиновата киселина е застъпен сам или в комбинация с други естери на алгиновата киселина.

7. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, при което посочената многослойна мембрана включва естер на една отделна хиалуронова киселина или смес от естери на различни хиалуронови киселини.

8. Многослойна мембрана, съгласно претенция 1, при което посочената многослойна мембрана включва естер на една отделна алгинова киселина или смес от естери на различни алгинови киселини.

9. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, при което посочената многослойна мембрана включва смес от естер на хиалуроновата киселина и естер на алгиновата киселина.

10. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, при което посочената многослойна мембрана включва смес от естери на хиалуроновата киселина и естери на алгиновата киселина.

11. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, при което посочената многослойна мембрана включва смес от естери на хиалуроновата киселина, естери на алгиновата киселина и най-малко един желиран полизахарид, избран от групата, съставена от хитин, алгинат, цитозан, гелан, тяхно синтетично производно и тяхно полусинтетично производно.

12. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, в която посочените мрежа и свързващо вещество включват естер на хиалуроновата киселина или нейно производно.

13. Многослойна мембрана съгласно претенция 12, в която посоченото производно е естер на хиалуроновата киселина.

14. Многослойна мембрана съгласно претенция 13, в която посочената мрежа включва етилов естер на хиалуроновата киселина, а споменатото свързващо вещество включва бензилов естер на хиалуроновата киселина.

15. Многослойна мембрана съгласно претенция 13, в която споменатата мрежа включва бензилов естер на хиалуроновата киселина, а посоченото свързващо вещество включва частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина.

16. Многослойна мембрана съгласно претенция 15, в която посоченият частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина е 75 % бензилов естер на хиалуроновата киселина.

17. Многослойна мембрана съгласно претенция 13, в която споменатата мрежа включва етилов естер на хиалуроновата киселина, свързващото вещество включва частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина.

18. Многослойна мембрана съгласно претенция 17, в която частичният бензилов естер на хиалуроновата киселина е 75 % бензилов естер на хиалуроновата киселина.

19. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, в която посочената мрежа включва смес от влакна на бензилов естер на хиалуроновата киселина и бензилов естер на алгиновата киселина, а споменатото свързващо вещество включва частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина.

20. Многослойна мембрана съгласно претенция 19, в която споменатите влакна са в равни количества и в която посоченият частичен бензилов естер на хиалуроновата киселина е 75 % бензилов естер на хиалуроновата киселина.

21. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, притежаваща базово тегло между 8 и 50 g/cm²; деление (екартеман) от около 0,08 mm до около 0,5 mm; минимална якост на опън при разкъсване в сухо състояние между около 100 и 500 kg/cm²; удължение в сухо състояние между около 3 и около 12 %; минимална якост на опън при скъсване в мокро състояние между около 30 и около 450 kg/cm²; удължение в мокро състояние между около 20 и около 60 % и якост на скъсване в сухо състояние между 40 и около 200 kg/cm² и якост на скъсване в мокро състояние между 20 и около 160 kg/cm².

22. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, притежаваща базово тегло около 14 g/cm²; деление (екартеман) от около 0,25 mm; минимална якост на опън при разкъсване в сухо състояние от около 400 kg/cm²; удължение в сухо състояние около 7 %; минимална якост на опън при скъсване в мокро състояние около 50 kg/cm² и удължение в мокро състояние около 55 % и якост на скъсване в сухо състояние около 90 kg/cm² и якост на скъсване в мокро състояние около 50 kg/cm².

23. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, притежаваща базово тегло около 10 g/cm²; деление (екартеман) от около 0,15 mm; минимална якост на опън при разкъсване в сухо състояние от около 300 kg/cm²; удължение в сухо състояние около 4 %; минимална якост на опън при скъсване в мокро състояние около 40 kg/cm² и удължение в мокро състояние около 45 % и якост на скъсване в сухо състояние около 120 kg/cm² и якост на скъсване в мокро състояние около 60 kg/cm².

24. Многослойна мембрана съгласно ripe- 5 тенция 1, в която споменатата армираща мрежа включва многовлакнеста мрежа, съставена от множество кабели от около 30 до 100 снопчета от влакна, като всяко едно от тях е с размери между около 18 и около 35 цт в диаметър, при което кабелът е с между около 150 и около 400 дение, в него влакната са усукани между около 90 и около 200 пъти на метър и който е преработен в трикотажна тъкан с деление между около 10 и 16.

25. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, в която споменатата армираща мрежа включва многовлакнеста мрежа, съставена от множество кабели от най-малко 100 снопчета от влакна, при което кабелът е около 237 дение и в който влакната са усукани около 135 пъти на метър и който е преработен в трикотажна тъкан с деление около 14.

26. Многослойна мембрана съгласно претенция 1, в която споменатата армираща мрежа включва многовлакнеста мрежа, съставена от множество кабели от около 100 снопчета от влакна, при което кабелът е около 150 дение и в който влакната са усукани около 90 пъти на метър и който е преработен в трикотажна тъкан с деление около 12.

27. Многослойна мембрана съгласно претенция 2 или 3, в която алкохолът на споменатия естер е фармакологично неактивен алкохол.

28. Многослойна мембрана съгласно претенция 27, в която посоченият алкохол е алифатен, арилалифатен, циклоалифатен или хетероциклен алкохол.

29. Многослойна мембрана съгласно претенция 2 или 3, в която алкохолът от посочения естер е фармакологично активен алкохол.

30. Метод за направлявана регенерация на тъкани, характеризиращ се с това, че включва здраво закрепване на повърхностни или вътрешни увреждания с многослойна мембрана, включваща армираща мрежа, включена в полимерно свързващо вещество, при което мрежата включва най-малко един материал, избран от групата, съставена от хиалуронова киселина или нейно производно и алгинова киселина или нейно производно и споменатото свързващо вещество включва наймалко един материал, избран от групата, съставена от хиалуронова киселина или нейно производно, алгинова киселина или нейно производно и желиран полизахарид.

31. Метод за получаване на многослойна мембрана, характеризиращ се с това, че включва образуването на армираща мрежа, при което посочената мрежа включва най-малко един материал, избран от групата съставена от хиалуронова киселина или нейно производно и алгинова киселина или нейно производно и нанасяне върху мрежата на свързващо вещество, включващо най-малко един материал, избран от групата, съставена от хиалуронова киселина или нейно производно, алгинова киселина или нейно производно и желиран полизахарид.

32. Приложение на многослойна мембрана съгласно всяка една от претенциите от 1 до 29 в хирургията за направлявана регенерация на тъкани.