BG61614B1

BG61614B1 - Новоохарактеризирана оксалатоксидаза и нейното приложение

Info

Publication number: BG61614B1
Application number: BG98069A
Authority: BG
Inventors: Christina L. Hartman; Sarjit S. Johal; Mark R. Schmitt
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1991-02-25
Filing date: 1993-08-25
Publication date: 1998-01-30
Also published as: AU1207492A; BR9205664A; FI933718L; CA2107804C; DK0636181T3; HUT67049A; GB9203929D0; AU656761B2; BG98069A; ES2152225T3; FI933718A0; CA2107804A1; RU2136755C1; DE69231588T2; US5866778A; GR3035217T3; EP0636181B1; HU214357B; HU9302252D0; ATE197814T1

Description

Изобретението се отнася до генетично подобрение на растенията чрез използване на рекомбинантни ДНК техники. По-специално, но не изключително, изобретението се отнася до подобрение устойчивостта на растенията към болести.

От началото на развитието на земеделието съществува проблемът с болестите по растенията. Исторически са направени много крачки напред срещу болести по растенията, например използване на хибридни растения, пестициди и подобрени селскостопански работи. Но както всеки запознат с тези проблеми може да потвърди, болестите по растенията са труден и постоянен проблем в култивирането на растения.

Изобретението представлява важна стъпка напред в решаване на проблема с болести по растенията чрез използване на отдавна известен факт относно метода, по който отделни микроорганизми, по-специално микроскопични гъби, атакуват растенията. По-специално, изобретението се отнася до средство, с което етиологичният (причинителят на болестта) агент се забавя или се спира действителното му проникване в растителната тъкан, като по такъв начин се предотвратява заболяването.

Алтернативно, в случаи, където не е предотвратена пълната инвазия, изобретението осигурява за растенията средство за редуциране на ефектите от инфекции, така че да се намали или предотврати загиването на растенията, дължащо се на тези болести.

За да инфектира растението даден патоген трябва да е способен да получи достъп до и след това в цялото растение. Растителните патогени постигат това по различни начини. Общо взето, това се постига чрез отделяне на химически субстанции, които въздействат на определен компонент и/или метаболитни механизми в растението, което е атакувано, например организмът-приемник на патогените. Главните групи съединения, които се отделят чрез растителните патогени и които са свързани с механизма на причиняване на болестта, са токсини, ензими, полизахариди и/или други ефектори на растеж. Такова химическо съединение е оксалова киселина и оксалат, които могат да се разградят чрез ензима оксалатоксидаза. Макар че реакцията, катализирана от оксалатоксидазата, е добре известна, физикохимичните свойства на ензима оксалатоксидаза от ечемик са неточно описани в литературата. Отделянето на оксалова киселина като средство, чрез което растителните патогени атакуват организма на растението, е присъщо на редица родове фунги, по-специално родовете Sclerotinia, Sclerotium, Aspergillus, Streptomyces, Penicillium, Pythium, Paxillus, Mycena, Leucostoma, Rhizoctonia и Schizophyllum. Тези родове фунги, по-специално фунгите от рода Sclerotinia, са известни като причинители на деструктивни и фатални болести при редица висши култивирани растения, включително полски култури като слънчоглед, соя, боб (найобщо), алфа алфа, лен, шафран, фъстък и детелина, зеленчукови култури като маруля, домати, тикви, картофи, моркови, репички, грах, лещи, зеле, цветно зеле и брюкселско зеле, цветя като петунии и пиретрум и дървесни видове като праскова. Болестите включват не само болести преди прибиране на реколтата в полето, но също и болести след прибиране на реколтата при превозването и съхранението.

Симптомите, причинени от споменатите родове фунги, варират в зависимост от растителния организъм и частта от растителния организъм, инфектирана с болестта, както и в зависимост от околните условия по време на патогенната атака. Например характерна особеност на всички Sclerotinia болести е увяхване и опадане на листата, при което гъбите бързо завладяват “сърцето” на растението и след това стеблото. Болестта е фатална.

В течните култури на Sclerotinia се наблюдава концентрация на оксалова киселина от 1000 до 10 000 ppm, спрямо растежната среда, възрастта на културата и други параметри. Определени растителни тъкани като листа на боб и слънчоглед, изложени на ниски концентрации от оксалова киселина, веднага показват признаци на увяхване и умъртвяване на клетки, което показва важността на оксаловата киселина в по-късните етапи на болестта. Точният механизъм на болестта, пораждащ действие на оксаловата киселина след инфекция, е непознат, макар че теориите го отнасят към хелатиране на двувалентни метали, наместващи се в стените на растителната клетка и/или отключващи метлболитните ензими, оси61614 гуряващи микросреда за действието на хидролитичните ензими, отделени от тези гъби. От наличните данни става ясно, че оксаловата киселина е интегрален компонент на патогенната атака. Данни за това заключение са получени от различни изследвания, включително изследвания с оксалат - минус Sclerotinia мутанти, които изглежда, че имат нормалния комплект хидролитични ензими и други фактори, но не предизвикват болестни симптоми. Ревертанти на тези оксалат-минус мутанти показват нормално болестно развитие и характеристики.

Високата степен на вирулентност на болестите, свързана със споменатите родове фунги, е добре известна. Например листата на растящите в оранжерия слънчогледови растения, инфектирани със Sclerotinia sclerotorum, често проявяват увяхване и некроза на вътрешните проводящи снопчета 3 до 5 дни след инокулирането. Изследването на тези растения показва причиняваща увяхване субстанция във водни екстракти от увредени хипокотили (част от главната ос на растителния ембрион или младите стръкчета под котиледона). Химически опити, включващи тънкослойна хроматография и газовотечна хроматография, показват, че това увяхване се предизвиква от субстанция, съдържаща оксалова киселина, и че увяхналите листа от инфектирани растения съдържат над 15 пъти повече оксалова киселина, отколкото листата на здрави растения. Както вече е отбелязано, оксаловата киселина преминава системно през растението, като причинява болестни симптоми в тъканите, които са отдалечени от началната точка на инфекцията и не са непременно инфектирани с фунгални хифи.

От този преглед става ясно, че подходящото идентифициране, изолиране и изразяване на оксалатразграждащия ензим като оксалатоксидаза, оксалатдекарбоксилаза или подобен ензим в растенията биха могли съвсем да намалят патргенността на фунгите, които отделят оксалова киселина като ключов компонент на патогенността. Съгласно изобретението се обяснява и осъществява целта за правилно идентифициране и изолиране на гена на протеин, който е подходящ за въвеждане на оксалатоксидазна активност в растения и микроби, като се използват техниките на генното инженерство.

Оксалати се намират също често в някои растителни видове като продукти, естествено продуцирани от самото растение. Природно-намиращият се оксалат акумулира в някои зеленолистни зеленчуци като спанак и ревен и някои фуражни бобови растения.

Макар че такива видове култури са потенциални източници на хранителни витамини и минерали, поглъщането на големи количества е токсично за хората, тъй като те се свързват с калциевия йон и се утаяват като неразтворим калциев оксалат в бъбреците, което води до хипероксалуриа и разграждане на реналната тъкан.

Известно е също така, че оксаловата киселина може да взаимодейства с други растителни метаболити, като образува оксалатни производни, които са високотоксични. В един пример е посочено образуването на съединението р-Ц-оксалил-Ь-а-З-диаминопропионова киселина, която е невротоксин.

Присъствието на оксалова киселина в някои растителни видове изключва употребата им като храна за човека и животните.

В частност, съгласно изобретението е охарактеризиран ензим, полезен за попречване патогенното включване на оксалова киселина. Уникално охарактеризираният ензим оксалатоксидаза катализира или подпомага реакцията, като включва окислително разлагане на оксалатите до получаване на въглероден диоксид и водороден пероксид. Общият вид на тази реакция е оксалатоксидаза

Оксалат - О₂-----——---> 2СО₂ + Н₂О₂

Изследването на този ензим има за резултат не само неговото идентифициране, изолиране и експресия, но също и неговото характеризиране и клониране, така че генът за експресия на ензима да може да се вкара в растенията и да се излъчи от растенията, при което се допринася за устойчивост към заболявания от фунги, в които оксаловата киселина е критичен компонент. Такова трансформиране на растението би защитило трансформираните растения срещу разрушителни болести, причинени от ефекта на оксаловата киселина.

Прилагането на изобретението не се ограничава до патогенеза на растенията. Друго предимство на изобретението е вкарването на оксалатоксидазсн ген в растението, за да се получат растения с ниско съдържание на оксалова киселина. Това може да бъде полезно поспециално за високооксалатните растения като фъстъци, кръмно цвекло, спанак, ревен, ече- 5 мик и много треви. Виж Libert и Franceschi, 1987, J/Agric. Food. Chem., 35:926-938. Също така изобретението намира приложение и за получаване на оксалатразграждащи ензими в голям мащаб. Нуждата от такива оксалатраз- 10 граждащи ензими в голям мащаб е известна в различни области, вкл. необходимостта от използването им за изследователски комплекти за установяване присъствието и/или количеството на оксалова киселина и за използване 15 при разграждане на оксалова киселина в хранителни продукти, алкохолни напитки и търговски процеси, например микробната оксалатдекарбоксилаза се използва в пивоварното производство (US 4 652 452), а полученият окса- 20 лат може също да се разгради, като се използва оксалатоксидаза.

Обект на изобретението е осигуряване на средство за разграждане на оксалова киселина в растения. 25

Съгласно изобретението се получава сДНК, получена от РНК, кодираща ензима оксалатоксидаза и имаща ДНК последователност на фиг.1, нейни варианти, допуснати от изграждането на генетичния код и геномна ДНК, 30 към която посочената сДНК хибридизира.

Изобретението по-нататък се отнася до ензима, имащ способността да разгражда оксалати, охарактеризиран с отделна субединица от приблизително 25 kD и в частност по същес- 35 тво чиста оксалатоксидаза за използване при третиране на растения за разграждане на оксалова киселина в тях, като посочената оксалатоксидаза има аминокиселинна последователност, показана на фиг.2 и характеризираща 40 се с pH оптимум 3,5, положителна топлинна стабилност, отделна субединица от приблизително 25 kD и протеазна стабилност.

Споменатата оксалатоксидаза може да се приготви в препарат с подходящ за агрономи- 45 чески цели носител за доставяне на оксалатоксидазата в растенията.

Изобретението също така осигурява метод за разграждане на оксалова киселина в растения, състоящ се в доставяне на това рас- 50 тение на ензим, разграждащ оксаловата киселина, така че да му осигури защита от оксалова киселина.

За предпочитане ензимът е оксалатоксидаза.

Доставянето на ензима, разграждащ оксаловата киселина, може да се осъществи чрез прилагане към растението или към жизненото пространство на растението на този ензим в комбинация с агрономически приемлив носител или алтернативно чрез генетична трансформация на растителния геном с ген, кодиращ оксалатоксидаза.

Изобретението осигурява и метод за намаляване на оксалати в растителна тъкан, обхващащ устойчиво включване в генома на растението на ген, кодиращ ензима оксалатоксидаза, например чрез генетична трансформация. Подходяща конструкция на ген за тази цел може да съдържа инициираща последователност, транзитен пептид, структурна генна последователност, кодираща посочения ензим оксалатоксидаза и генна терминираща последователност.

Освен това изобретението осигурява също трансформирана растителна клетка, съдържаща ген за експресия на оксалатоксидаза. Посоченият ген може да има последователността от фиг.1.

Изобретението осигурява и метод за борба с растителна патогенеза от инфектиране с гъби, които отделят оксалова киселина, състоящ се в устойчиво включване в генома на растението чрез трансформиране на ген, кодиращ оксалатоксидаза.

Примери за родове микроскопични гъби, които отделят оксалова киселина са Sclerotinia Sclerotium, Aspergillus, Streptomyces, Penicillium, Pythium, Paxillus, Mycena, Leucostoma, Rhizoctonia, Whetzelinia и Schizophyllum.

Особено интересна гъба съгласно изобретението е Sclerotinia sclerotorum, която инфектира например слънчоглед (Helianthus annuus).

Така изобретението се отнася до разбиране и оценяване на използването на оксалатразграждащия ензим (оксалатоксидаза за търговски цели), например във ферментационната индустрия или за агрономически цели, например за намаляване податливостта на растенията към оксалова киселина или за намаляване концентрацията на ендогенна оксалова киселина в растенията.

Изобретението има особено подходящо приложение в селското стопанство за използване на оксалатразграждащи ензими за намаляване смъртността на растенията или деструкция от болести или други феномени, в които оксаловата киселина играе критична инвазивна роля.

Изобретението може да се използва и за предотвратяване смъртността на растенията и инфектиране с болести, при които оксаловата киселина е критична. Такива болести обикновено се причиняват от специфични родове фунги, посочени тук.

Съгласно изобретението се препоръчва оценяване на новото използване на оксалатразграждащите ензими, което се подсилва от това, че установените физикохимични свойства на оксалатоксидаза от ечемик, както е посочено в литературата, са некоректни. Съответно съгласно изобретението е получен по същество чист и охарактеризиран ензим оксалатоксидаза, неописан досега. В действителност претендираното съществено пречистване на ензима, както е описано в литературата, е посочено тук като неточно. По-специално, съгласно изобретението се описва по същество чиста оксалатоксидаза със специфичен тотален аминокиселинен състав (фиг.2), pH оптимум 3,5, неутрална изоелектрична точка, положителна стабилност при нагряване, протеазна стабилност и отделна субединица от приблизително 25 kD.

Описан е и по същество чист ген, кодиращ ензима оксалатоксидаза със специфична ДНК последователност, както е посочено на фиг.1. Генът, кодиращ ензима оксалатоксидаза, има посочените по-горе характеристики. В частност, генът, кодиращ ензима, проявяващ оксалатоксидазна активност, има отделна субединица от приблизително 25 kD и взаимодейства специфично с антитела, възникнали срещу пречистена оксалатоксидаза от ечемик, и има аминокиселинна последователност, показана на фиг.2.

В изобретението са описани също и средства за борба с растителни патогени, които включват химикали, проявяващи разграждаща оксаловата киселина активност, в частност оксалатоксидазна активност. Специфично, растителното средство има оксалатоксидазна активност в количество, достатъчно да прекрати произвеждането на оксалова киселина от патогени. Ясно е, че друго агрономично приложение на такова средство е да свърже средствата с подходящ носител, който е агрономически приемлив, осигуряващ освобождаването на средството директно към растението или към почвата.

Трансформираната растителна клетка също е описана тук, която клетка се трансформира чрез гена, кодиращ експресията на оксалатоксидазата или друг оксалатразграждащ ензим. Генът, кодиращ такъв ензим, може да включва ДНК последователност, посочена на фиг. 1, която по същество кореспондира с ензима оксалатоксидаза, по същество пречистен съгласно изобретението.

Описан е и метод за осигуряване защита на растението от оксалова киселина при нужда от такава защита. Методът включва осигуряване на ензим, разграждащ оксаловата киселина в количество, достатъчно да се защити растението от оксалова киселина при нужда от такава защита. За предпочитане се има предвид, че ензимът, разграждащ оксаловата киселина, е оксалатоксидаза, кодирана от гена, имащ посочената на фиг. 1 структура.

Методологията за осигуряване на такава защита може да има многообразни форми, включително трансформиране на растението с гена, кодиращ ензима, разграждащ оксаловата киселина и в частност кодиращ оксалатоксидаза. Алтернативно, методът може да включва осигуряване на ензим, разграждащ оксаловата киселина в комбинация с агрономически приемлив носител за директно приложение към растението или към почвата, в която расте растението.

Пречистената оксалатоксидаза съгласно изобретението, нейното използване като средство за борба с патогенеза и използването й за трансформиране на растителната клетка осигурява оригинален и уникален подход за контрол на болести по растенията, в които оксаловата киселина е критичен компонент или по време на патогенеза, или в етапа на инвазия. Добре известно е, че активността на ензима оксалатоксидаза е такава, че допринася за разграждане на оксалова киселина. Все пак съгласно изобретението за първи път се оценява, че чрез въздействие върху оксаловата киселина чрез химическо разграждане, например чрез ензимно разграждане, се постига значителна агрономическа полза в обсъжданата резистентност спрямо тези болести, в които оксаловата киселина има критична роля. Така изобретението има голямо значение поради главната напаст в търговското култивиране на агрономически важни растения, например култури като слънчоглед, където фунги като Sclerotinia причиняват отделяне на оксалова киселина.

Постиженията съгласно изобретението могат да се използват или чрез трансформиране на растението, или чрез прилагане на оксалатоксидаза като традиционен пестицид найвече в комбинация с подходящ носител, който е приемлив в земеделието. Едно от най-важните предимства от използването на оксалатоксидазата като пестицид е, че тя е екологически чиста, не замърсява и не вреди на растението.

Ако се използва външно прилагане на ензима за защита на растението или част от растението срещу патогени, ензимът се разрежда до образуване на течен разтвор или суспензия или се смесва с твърд разредител, за да се приложи като прах. Прецизният начин на приложение ще зависи отчасти от отделните патогени, но и от растенията, към които са насочени. Подробни методи, приспособяване на общи методи на приложение към специфични култури и патогени могат да се намерят в “Методи за оценка на пестициди за контрол на растителни патогени”, K.D. Hichy и сътр., The American Phytopathological Society, 1986. Помощни вещества, които могат да се прибавят към препаратите за приложение, включват средства, подпомагащи солюбилизирането, омокрящи средства и стабилизатори или средства, които продуцират микрокапсулиран продукт. Такива помощни вещества са добре известни в областта.

При външно приложение могат също да се използват рекомбинантни микроорганизми или в жизненоспособна форма, или след превръщане в нежизненоспособна форма по метод, който не инактивира ензима.

Макар че в известното ниво се съобщава за пречистена и охарактеризирана оксалатоксидаза, съгласно изобретението е установено, че тези съобщения са неточни и ензимът фактически никога не е бил точно пречистен и охарактеризиран. Както е използван тук терминът “оксалатоксидаза”, той се отнася до пречистената и охарактеризирана форма на ензима, както е посочено тук, ако не е казано друго. Разликата между съществуващите литературни съобщения и пречистеният охарактеризиран ензим от изобретението са посочени тук в подробности и накратко са събрани в таблица 1.

Онечистванията в търговски достъпните препарати оксалатоксидаза както и неточното охарактеризиране на ензима в литературата е очевидно, след като съгласно изобретението за пръв път е пречистена оксалатоксидаза от коренчета на покълнал ечемик. Използват се две процедури. Съгласно едната пречистването на оксалатоксидаза от коренчета на покълнал ечемик включва хомогенизиране на замразена тъкан в 1 до 4 обема вода и пречистване из водния екстракт, последвано от филтриране през марля за отстраняване на отломките. Разтворът след това се пречиства чрез центрофугиране при 18000 g за 30 min, последвано от термообработка при 80°С за 3 min, като утайката в двата етапа се отстранява. Утаеният протеин от супернатанта между 30 и 70% насищане с амониев сулфат /NH₄/₂SO₄ се събира чрез центрофугиране и се диализира срещу вода. Повторно разтвореният протеин от етапа на утаяване с амониев сулфат се фракционира върху Pharmacia FPLC, като се използва Моно S 10/ 10 колона, еквилибрирана с 25 mM калиев ацетат с pH 4,8, и се елуира с градиент от 0,0 до 0,4 М NaCl в същия буфер. Оксалатоксидазната активност се измерва по метода на Sugiura и сътр., 1979, Chem. Pharma. Bull., 17, /9/:2003. Главните фракции с оксалатоксидазна активност се обединяват, еквилибрират се с калиево-ацетатен буфер с pH 4,8 и се хроматографират повторно на FPLC, като се използва Моно S 5/5 колона, елуирана с буферите и градиент от NaCl както по-горе. Главните фракции от Моно S 5/5 етап се обединяват, еквилибрират се с 25 mM трис-CI, pH 7,6 в Моно Q 5/5 колона и се елуират с градиент от 0,0 до 0,4 m NaCl. Електрофореза върху натриев додецилсулфат полиакриламиден гел на главните фракции с оксалатоксидазна активност показва изразени протеинови ивици при проявяване на петната със сребро при приблизително 25 и 38-40 kD. Последващото фракциониране на нативния протеин върху Superose-12 гел филтрационна колона, (еквилибрирана с 50 mM калиев ацетат, pH 4,8) върху FPLC показва добре дефиниран пик от активност, елуирана при време, съответстващо на молекулно тегло 25000. Не е установена никаква оксалатокси6 дазна активност, елуирана в някоя друга фракция, свързана с друго молекулно тегло.

Вторият метод включва използване на детергентна екстракция. Коренчета на покълнал ечемик на възраст 4 до 7 дни се стриват 5 на прах в присъствие на течен азот и се съхраняват при -80°С. Съхранението при тези условия не води до забележима загуба на активност. Съхраняваната така тъкан се хомогенизира с дестилирана вода, съдържаща 0,5% натриева сол на тауродеоксихолат, филтрира се и се центрофугира. Оксалатоксидазното изследване на две фракции (супернатанта и гранули) показва, че двете фракции имат активност. Съответно, гранулите се екстрахират с дестилирана вода, съдържаща 0,5% тауродеоксихолат. След изчерпателна диализа срещу дестилирана вода се прибавя амониев сулфат за концентриране и фракциониране на разтворената супернатантна проба. Утаените протеини (3070% амониево-сулфатни фракции) след това се суспендират отново в малък обем дестилирана вода, съдържаща детергент, и се обезсоляват на малка проникваща гел колона (Sephadex G 25). Активната фракция се пропуска 25 през анионообменна колона (DEAE), като се използва трис-HCl, pH 7,5 буфер и елуиране на свързания протеин, като се използва градиент от натриев хлорид. Ензимноактивните фракции се концентрират, изсолват се и след това се пропускат през Моно Q колона (Pharmacia). За елуиране на протеините отново се използва градиент от натриев хлорид. Изследването за активност показва, че оксалатоксидазата е концентрирана в три фракции. При анализ на тези фракции чрез електрофореза на SDS полиакриламиден гел активността е 10 определена, че е свързана с полипептид от около 25 kD молекулно тегло.

След пречистване се извършва охарактеризирането на получената пречистена хомогенизирана оксалатоксидаза. Както е пока15 зано на таблица 1, свойствата на протеина, получен в резултат на това пречистване, ясно се различават от тези, описани в литературата. Това показва, че въпреки опитите на други специалисти в областта да пречистят ензима 20 оксалатоксидаза, това не е постигнато до настоящото изобретение, съгласно което този ензим е точно описан и цялостно идентифициран чрез изясняване на неговите физикохимични свойства. Резултатите от физикохимичното охарактеризиране са посочени в таблица 1. За сравнение са посочени характеристиките на ензима от цитираната литература.

Таблица 1

Свойства	Свойства на оксалатоксидазата
Литература	Изобретение
pH оптимум	3,5	3,5
Стабилност при
нагряване	+	+
Субединица №	2	1
Размер	75 к	25 к
pi	2,8	прибл. 7
Кофактор	-	-
Протеазна стабилност	непозната	+
Мембранно свързване	неясно	+

Отличителните особености на ензима съгласно изобретението, проявяващ оксалатоксидазна активност, са представени в табли- ^0 ца 2. Както се вижда от нея, съгласно изобре тението е установен аминокиселинен състав, различен от посочения в литературата. Виж Chiriboda, J. /1966/ Archives of Biochemistry and Biophysics, 116, 516-523.

Таблица 2

Аминокиселина	Изобретение	Литература
Asx	12,53	8,44
Ser	8,65	6,50
Gly	13,31	10,75
Glx	7,42	6,80
Thr	8,10	5,18
Ala	7,93	7,85
Vai	8,41	6,40
Met	2,85	0
Tyr	0,98	0,93
He	2,15	6,39
Leu	9,36	-
Phe	6,89	-
His	1,79	1,68
Lys	5,98	4,90
Trp	-	-
Arg	3,65	3,48

Частично пречистена оксалатоксидаза от коренчета на покълнал ечемик се солюбилизира, подлага се на катионообменна хроматогра- 25 фия, като се използва Моно S колона (25 тМ калиев ацетат, pH 4,8 и се елуира с 0 до 400 милимоларен градиент от калиев хлорид в същия буфер). Полученият ензимноактивен протеин след това се пречиства чрез препаратив- 30 на електрофореза натриев додецилсулфат полиакриламиден гел. Открива се една протеинова ивица при около 25 kD молекулно тегло и след това се изрязва от гела. Влажните гелни отрязъци се фрагментират, смесват се с добавка на 35 Freund и се инжектират мускулно в задната част на бедрения мускул, близо до кръста на зайци. Зайците се подсилват с допълнително количество протеин и се прави измерване на кръвна проба, за да се осигури произвеждане- 40 то на специфични антитела оксалатоксидаза. След около 4 месеца животните се обезкръвяват. Произведените заешки поликлонални антитела са с много висок титър.

Генът, кодиращ получената от ечемик 45 оксалатоксидаза, има структурата, показана на фиг.1, и се клонира, както е показано на фиг.4, като се използва сДНК банка, създадена от ечемичени коренчета. Тоталната РНК се получава от ечемичени коренчета. Полиадени- 50 лираната РНК след това се получава от тоталната РНК и се използва за синтез на ДНК. И тоталната и полиаденилираната РНК се получават, като се използва търговски достъпна РНК екстракция и набор за пречистване на тРНК съгласно стандартните инструкции, дадени за набори (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.). Конструкцията на банката е търговски изпълнена (Cloutech Laboratories). Избраният вектор за банката е ламбда gt 22. Избира се използването на този експресионен вектор, като се има предвид високият титър и специфичност на оксалатоксидазния антисерум. Какъвто и експресионен вектор да се избере за използване при това превръщане, предимство за вектора е възможността да се използва имунологична преграда за протеиновия продукт от оксалатоксидазни сДНК клонове. Въз основа на средно включения размер от 1,8 килобази за сДНК и доброто представяне на броя на независимите клонове (1,7 х 10*) се заключава, че банката трябва да съдържа сДНК клон за оксалатоксидазен протеин приблизително 25 kD по размер.

Първоначалното отсяване на банката се извършва с антисерум спрямо оксалатоксидазата съгласно стандартни процедури като например Huynh, Т. и сътр. (1985), ДНК техники за клониране: A Practice Approach, D. Glover, ed. IRL Press Oxford. След като е получена информация за N-крайната аминокиселинна последователност на разгънатия оксалатоксидазен протеин (с изключение на Nкрайния остатък), N-крайната последователност също се използва, за да се потвърди идентичността на който и да е получен сДНК клон положителен при началното имунологично изследване. 1,2 х 10* плаки от сДНК банката се отсяват с антисерум. Получават се 14 потенциално положителни сигнали, единият от които е много по-силен от останалите. Два последователни кръга от повторно отсяване с антисерума се правят върху тези 14 клона, за да се получи положително потвърждаване, изолират се отделни плаки, които могат да се охарактеризират на молекулно ниво. Плака № 12 отново дава най-силния сигнал при тези последователни отсявания. Плака № 12 след това се използва за пречистване на оксалатоксидазните антитела като тест за специфичност на сигнала на плаката съгласно стандартна процедура, както е описано например от Hunyh, Т. и сътр. Пречистените антитела от плака № 12 се използват като проба за Western8 блот акриламиден гел на оксалатоксидазния протеин. Пречистените антитела от плаката взаимодействат специфично с оксалатоксидазата, показвайки образец, идентичен с този на пречистеното антитяло като проба.

Инсертът (сДНК продукт, клониран във вектора ламбда gt 22) на плака 12 се събира, като се използва стандартен метод полимеразна верижна реакция (PCR), както е дадено за пример от Ausubel, F.M. и сътр., 1988, “Полимеразна верижна реакция”, в “Текущи протоколи в молекулярната биология”, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, Ню Йорк, pp 15.0.1-15.4.6. Инсертът в плака 12 се оценява като 650-750 базови двойки. Размерът на инсерта в плака 12 е съвместим с протеин с около 25 kd. На база на началния размер, намерен за сДНК инсерта и резултатът от пречистването на антитялото върху плаката, плака 12 се счита най-добрата възможност за следващи молекулни анализи. № 12 инсерт, получен чрез PCR, след това се реклонира в плазмиден вектор, по-лесно поддаващ се на анализ. сДНК инсертът от клон 12 също се използва като проба за Northem-блот на РНК от ечемичени коренчета за определяне на големината на РНК за оксалатоксидаза. Електрофореза във формалдехиден гел и прехвърляне в найлонова мембрана се провежда съгласно процедурите, препоръчани от търговския предложител на мембрани Schleicher и Schuell. Проба 12 се хибридизира до единичен тРНК вид, приблизително 800-850 бази дължина.

Дидезоксинуклеотидната последователност се осъществява върху реклонирана инсерция на плака 12. Използва се търговски достъпният набор Т7 последователност (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) и препоръчаните процедури за приготвяне. Ечемичената сДНК инсерция се определя като приблизително 690 бази дължина с известна несигурност в два малки участъка, всеки покриващ не повече от 10 бази двойки, С-края и идентичността на три N-крайни бази. Нуклеотидната последователност на клон 12 инсерцията е показана схематично на фиг. 1. Частичната протеинова последователност след това се потвърждава от нуклеотидната последователност на клон 12 и се сравнява с N-крайната аминокиселинна последователност, получена директно от пречистена оксалатоксидаза. Това сравнение е показано на фиг.З.

Генът със структура, показана на фиг.1, съдържащ кодираща последователност на разгънатия оксалатоксидазен ензим, може да се прикрепи към генетични регулаторни елементи, които са необходими за експресия на структурния ген в дефинирана клетка гостоприемник. Първият тип регулаторен елемент, който се изисква, е ген промоторен участък, който съдържа ДНК последователности, разпознати с биологична техника в растителната клетка и които предизвикват транскрибция на ДНК последователността в пратеника РНК/шРНК. тРНК след това се транслира в протеина, продуциращ кодове за структурната генна област. Активаторът се прикрепва срещу или 5'-посока към гена за оксалатоксидаза, което може да се осъществи съгласно стандартни методи, известни в областта, например Т. Maniatis и сътр., 1982, Молекулярно клониране, Cold Spring Harbor Laboratory, Ню Йорк, pp. 104106. Промоторните участъци, които могат да се използват за експресия на оксалатоксидазния ген в растителните клетки, включва промотори, които са активни за много различни растителни тъкани. Например 35S промотор от вируса на мозайката по цветно зеле може да бъде подходящ за тази цел. Друг вид промотор, който може да се използва в растителни клетки, е такъв, който експресира при поограничени условия. В този клас могат да се включат промотори активни само в определена тъкан/и/ на растението и/или се активизират от определен стимул като нараняване. Пример за такъв промотор може да бъде 5' регулаторният участък от гена за фенилаланин амониева лиаза (PAL). Този промотор е обсъждан от Liang, X. и сътр., 1989, PNAS, USA, 8:9284-9288. Експресията на оксалатоксидазния ген в микробиални гостоприемници може да се постигне чрез използване на промотори, получени от микробиални източници. Примери за такива промотори е trp промотор за експресия в бактерии като Е. coli, както е посочено като пример от Amann, Е и сътр., 1983, Gene, 25:167-178, или глицералдехидфосфатдехидрогеназен (GAPD) промотор за експресия в дрожди, както е посочено например от Edeus, Е. и сътр., 1984, “Синтез и добиване на растителен протеин Thaumatin в дрожди”, Cell 37:629-633. Последователността на гена промотор може също да се получи частично или изцяло от промоторни последовател9 ности, намерени в клетки, различни от тези на клетката гостоприемник, доколкото те отговарят на горните критерии за транскрибция и транслация.

Вторият генетичен регулаторен елемент, който по желание трябва да бъде, но не е необходимо да бъде прикрепен към оксалатоксидазния ген, е терминатор или полиаденилаторна последователност, която активира ефективно терминирането на транскрибцията на гена и в еукариоти, също активира полиаденилирането, например прибавянето на всякакъв брой аденозиннуклеотиди при 3' края на шРНК. Стандартни методи, известни в областта, могат да се използват за достигане на крайния център зад или 3' на гена. (Виж напр. Т. Maniatis и сътр., рр. 104-106). Пример за такъв терминатор на полиаденилаторна последователност за експресия в растения може да бъде синтезен ген от октопин от Agrobacterium tumefaciens Ti плазмид, както е формулирано от Н. De Greve и сътр., 1982, “Нуклеотидна последователност и транскриптна карта на Agrobacterium tumefaciens Ti плазмид - кодиращ октопин синтазен ген”, J. Mol. Appl. Genet., 1:499-511. Пример за такъв терминатор за експресия в микробиални гостоприемници е rho - независима транскриптазна терминаторна последователност от Salmonella typhimurium. Виж например М.Е. Winkler, 1987, “Escherichia coli и Salmonella typhimurium: Клетъчна и молекулярна биология”, F.C. Neidhardt, American Society for Microbiology. Генната терминаторна последователност може да се получи също така частично или изцяло от терминаторни последователности, намерени в клетки, различни от тези на клетката - приемник, доколкото те отговарят на горните критерии за транскриптазно терминиране и полиаденилиране, изисквано от клетката гостоприемник.

Друг вид регулаторен елемент, който може да се прикрепи към гена за оксалатоксидаза, е ДНК последователност, кодираща водещ пептид. Водещият пептид се прикрепва към аминокрая на протеина и позволява протеинът да се локализира към клетъчната стена или да се излъчи от клетката гостоприемник. По време на процеса на локализиране водещият пептид се отцепва, произвеждайки протеинов продукт с последователността на разгънатия протеин. ДНК последователността на водещия пептид се включва между промотора и кодиращия участък. Стандартни методи, известни в областта, могат да се използват за прикрепване на ДНК последователност на водещия пептид (Виж например Maniatis, Т. и сътр., рр. 104106). Примери за такива водещи последователности могат да включват водещия пептид от удължения ген на растения (Chen J. и Varner, J.E., “Извънклетъчен матричен протеин в растения: характеризиране на геномното удължаване на клон при моркови”. ЕМВО J 4:2145-2151, 1985) от бактериален ре1В (пектатлиаза) ген на Erwinia carotovora (Lei, S.P. и сътр., 1987, J. Bacteriol, 169:4379) и от перпрофактор на дрожди (Smith, R.A. и сътр. Science 229:1219-1229, 1985). Водещата пептидна последователност може също да се получи изцяло или отчасти от терминаторните последователности, намиращи се в клетки, различни от тези на клетката гостоприемник, доколкото отговарят на горните критерии за произвеждане и локализиране на протеин в клетката гостоприемник.

Всеки от различните методи, известен за вкарване на чужди гени в растенията, може да се използва за въвеждане на оксалатоксидазен ген в растението гостоприемник. Методологията, избрана за довеждане докрай на трансформацията на растението с оксалатоксидазен ген, зависи много от растението гостоприемник. Например една добре охарактеризирана методология, която може да бъде полезна за трансформация на растения с оксалатоксидазен ген, е Agrobacterium междинна трансформация.

При Agrobacterium междинната трансформация с оксалатоксидазен ген се следват процедури, добре известни за тази методология. Първо, генната касета, подходяща за експресия в растения, се вкарва в инактивиран щам от Agrobacterium tumefaciens като междинен гостоприемник. Оксалатоксидазната генна касета се вкарва в Т-ДНК областта на рекомбинантния плазмид, съдържащ избран маркиращ ген, кодиращ неомицинфосфотрансфераза II, фосфинотрицинацетилтрансфераза или подобни. Тази методология е описана в литературни публикации, включително Horsch и сътр., 1985, “Прост и всеобхватен метод за трансформиране на гени в растения”, Science 227:1229-1231. Части от растителна тъкан, например лист, котиледон или хипокотил, се публикуват заедно с бактерията на 2-3 дни.

преди бактериите да се убият с антибиотици като карбеницилин. Други антибиотици, съответстващи на използвания избран маркиращ ген, се включват в растителната тъканна културална среда, така че да растат само трансформираните растителни клетки.

Растенията, регенерирани от трансформираните клетки, след това се изследват за присъствие и експресия на оксалатоксидазен ген. Имунотест и тест за оксалатоксидазна активност могат да се използват за идентифициране на отделните трансформанти. Проба за толерантност към екзогенна оксалова киселина също може да се използва като функционален тест в интактни тъкани.

Както е отбелязано, различни други методологии са подходящи за трансформация на растения, освен трансформация с Agrobacterium. Примери за такива други методи за доставяне на ДНК са електропорация, т.е. химически индуцирано освобождаване в протопласти, микроинжектиране, биолостика и други. Примери за видове растения, които не са особено подходящи за Agrobacterium междинна трансформация, са соя и някои житни растения, включително царевица. При тези растения могат напълно благоприятно да се използват други методологии за трансформиране на растението освен Agrobacterium междинна трансформация.

Изобретението се пояснява с приложените фигури, от които:

фигура 1 представлява сДНК последователност, реверсивно конструирана от тРНК кодираща оксалатоксидаза от ечемичени кълнове;

фигура 2 - аминокиселинна последователност, транслйрана от сДНК, показана на фиг.1;

фигура 3 показва диаграмно начина на клониране на' оксалатоксидазния ген и е описан подробно в примери 1 и 2;

фигура 4 - диаграмно начина на клониране, описан в пример 3 и 4;

фигура 5 - структурата на плазмида pVB 1; фигура 6 - структурата на плазмида pBinl9Rr.

Изобретението се илюстрира със следните примери.

Пример 1. Конструиране на вектор за трансформация на домати, несекретиращ оксалатоксидаза.

а) Реконструиране на оксалатоксидаза в цяла дължина с отворена рамка на разчитане (ORF);

Олигонуклеотидите 1219901Аи 1219901 (комплементарен) се определят и синтезират до образуване на линкер с HindHI място при 5’ края и Bsal мястото при 3' края олиго 1219901 А:

5-AGCTTGATGGGTACCTCGGACCCA GACCCACTCCAGGACTTCTGCGTCGCGGACC TCGATGGCAAGGCGGTCTCG-3' Олиго 1219901А (комплементарен) 5'-TCACCGAGACCGCCTTGCCATC GAGGTCCGCGACGCAGAAGTCCTGGAGTGGGT

CTGGGTCCGAGGTACCCATCA-3'

Олигонуклеотидите се хибридизират и се клонират в клон # 22, накъсан с HindHI и частично с Bsal до получаване на клон рОХОХ1, съдържащ разгъната оксалатоксидаза ORF, както е посочено при пептидната последователност.

След клониране на Hindlll/Bsal, свързан с клон # 22, цялостта на разгънатата оксалатоксидаза се потвърждава с ДНК последователност.

б) Включване на оксалатоксидаза ORF в експресионен вектор;

Кодиращият разгъната оксалатоксидаза участък се изолира от агароза, като 700 Ьр HindIII/Bam HI фрагмент и краищата се правят тъпи с Т₄ ДНК полимераза. pNB33A се нарязва с Xbal и PstI, векторният фрагмент се изолира от агароза и краищата се правят тъпи с Т₄ полимераза.

Тези фрагменти на двата тъпи края се свързват заедно, като дават клона pNBOXOXl. Правилното кодиране на оксалатоксидазния кодиращ участък в pNBOXOXl се потвърждава с ДНК последователност.

с) Трансфер на оксалатоксидазна експресионна касета в pBin 19Ri;

pNBOXOXl се нарязва с HindHI и частично с EcoRI. 1,9 kb експресионна касета се изолира от агароза и се клонира в pBinl9Ri (фиг.6), нарязва се с EcoRI и HindHI.

Присъствието на оксалатоксидазна експресионна касета в клон pNO XI се потвърждава чрез ограничаване на плазмида ДНК с EcoRI и HindHI.

Пример 2. Конструиране на вектор за трансформиране на слънчоглед, несекретиращ оксалатоксидаза.

а) Tрансфер на оксалатоксидазна експресионна касета в pVBl;

2,1 kb EcoRI/Hindlll фрагмент, съдържащ оксалатоксидазна експресионна касета, изолирана от pNBOXOXl, описан в пример 1, се клонира в pVBl (фиг.5), нарязва се с EcoRI и Hindlll до получаване на клон pVBOXl.

Присъствието на оксалатоксидазна експресионна касета в клон pVBOXl се потвърждава чрез ограничаване на плазмида ДНК с EcoRI и Hindlll.

б) Включване на Hygromicin резистентен ген в pVBOXl;

2,3 kb Hindlll фрагмент, съдържащ Hygromicin резистентна касета, се изолира от P19HYG, клонира се в pVBOXl и се накъсва с Hindlll, като се получава клон pHOXl.

Присъствието и ориентирането на Hygromicin касетата в клон pHOXl се потвърждава чрез смилане на плазмид ДНК с EcoRI.

Пример 3. Конструиране на вектор за трансформиране на домати, секретиращ оксалатоксидаза.

а) Образуване на екстензин транзитен пептид/оксалатоксидазно сливане чрез PCR;

За да се слее разгънатата оксалатоксидаза с началния екстензин транзитен пептид, олигонуклеотидите ЕХТОХ-5 и ЕХТОХ-3 се определят и синтезират.

ЕХТОХ-5 5'-TTCAACTGGTACCATTTGTTTCAAA GATGGGAAAAATGGCTTCTCTAT 'ПВССАСАТГГГГАОЧХХТПТАОгаГАСТ’ TAGCTTAGCTTCTGAAACCGACCCAGACCC

ACTCCAGGACTTC-3'

ЕХТОХ-3

5-CTATTAAATTCGCGGTACCTGGA TATATAGAATTAC-3'

Олигонуклеотидите се използват като начални PCR с pNBOXl като шаблон. Полученият 771 вр ЕХТОХ PCR продукт, съдържащ с 23 аминокиселини екстензин транзитен пептид, слят в рамка към разгънатия оксалатоксидаза кодиращ участък, се накъсва с KpnI.

б) Включване на ЕХТОХ PCR продукта в pJRl/pUC/;

Разграденият с KpnI ЕХТОХ PCR продукт, описан по-горе, се клонира в pJRl/pUC/ и се нарязва с KpnI до получаване на клона pJEXTOXl. Ориентирането и последователността на ЕХТОХ PCR продукта в pJEXTOXl се потвърждава с ДНК последователността.

с) Трансфер на ЕХТОХ експресионна касета в pBinl9i;

Екстензин/оксалатоксидазната експресионна касета се изолира от pJEXTOXl като

1,5 kb EcoRI/Hindlll фрагмент и се клонира в pBin 19i, нарязва се с EcoRI и Hindlll до получаване на клона pNEXTOXl.

Присъствието на експресионната касета в pNEXTOXl се потвърждава чрез смилане на плазмид ДНК с EcoRI и Hindlll.

Пример 4. Конструиране на вектор за трансформация на слънчоглед, секретиращ оксалатоксидаза.

а) Изолиране на секретираща експресионна касета и включване в pVBl;

1,5 kb EcoRI/Hindlll фрагмент и се клонира в pVBl, нарязва се с EcoRI и Hindlll до получаване на клон pVEXTOXl.

Присъствието на експресионната касета в pVEXTOXl се потвърждава чрез смилане на плазмид ДНК с EcoRI и Hindlll.

б) Включване на Hygromicin резистентен ген в pVEXTOXl;

2,3 kb Hindlll фрагмент, съдържащ Hygromicin резистентна касета, се изолира от pl9HYG и се клонира в pVEXTOXl, нарязва се с Hindlll до получаване на клон рНЕХТОХ1. Присъствието и ориентирането на Hygromicin касетата в клон pHEXTOXl се потвърждава чрез смилане на плазмид ДНК с EcoRI.

Claims

Патентни претенции

1. сДНК, получена от РНК, която кодира ензима оксалатоксидаза с ДНК-последователност, показана на фиг.1, и нейни варианти, допуснати от израждането на генетичния код.
2. Геномна ДНК, към която е хибридизирана сДНК съгласно претенция 1.
3. Ензим, способен да разгражда оксалова киселина, охарактеризиран с отделна субединица от приблизително 25 kD.
4. По същество чиста оксалатоксидаза за използване при третиране на растения за разграждане на оксалова киселина в тях, като посочената оксалатоксидаза има аминокиселинна последователност, показана на фиг.2, и характеризираща се с pH оптимум 3,5. по12

616’4 ложителна топлинна стабилност, отделна субединица от приблизително 25 kD и протеазна стабилност.
5. Оксалатоксидаза съгласно претенция 4, съдържаща агрономически подходящ носител за доставяне на оксалатоксидазата в растенията.
6. Метод за разграждане на оксалова киселина в растения, който се състои в доставяне на растението на ензим, разграждащ оксаловата киселина, така че да се осигури защитата му от оксалова киселина.
7. Метод съгласно претенция 6, при който посоченият ензим е оксалатоксидаза.
8. Метод съгласно претенция 6, при който доставянето на ензима, разграждащ оксаловата киселина, се осъществява чрез прилагане към растението или към жизненото пространство на растението на този ензим в комбинация с агрономически приемлив носител.
9. Метод съгласно претенция 7, при който ензимът оксалатоксидаза се доставя на растението чрез генетична трансформация на растителния геном с ген, кодиращ оксалатоксидаза.
10. Метод за намаляване на оксалат в растителна тъкан, състоящ се в устойчиво включване в генома на растението на ген, кодиращ ензима оксалатоксидаза.
11. Метод съгласно претенция 10, при който посоченият ген се включва в растението чрез генетична трансформация.
12. Метод съгласно претенция 11, при който растителният геном се трансформира с генна структура от инициираща последователност, транзитен пептид, структурна генна последователност, кодираща посоченият ензим оксалатоксидаза, и генна терминираща после5 дователност.
13. Трансформирана растителна клетка, съдържаща ген за експресия на оксалатоксидаза.
14. Трансформирана клетка съгласно пре10 тенция 13, при която посоченият ген включва

ДНК последователността, показана на фиг.1.
15. Трансформирана клетка съгласно претенция 13, при която оксаловата киселина, експресирана от посочения ген, е с отделна

15 субединица от приблизително 25 kD.
16. Метод за борба с растителна патогенеза от инфектиране с фунги, които отделят оксалова киселина, състоящ се в устойчиво включване в генома на растението чрез трансформация на ген, кодиращ оксалатоксидаза.
17. Метод съгласно претенция 16, при който фунгите са от родовете, избрани от групата на фунги, отделящи оксалова киселина като Sclerotinia, Sclerotium, Aspergillus, Streptomyces, Penicillium, Pythium, Paxillus, Mycena, Leucostoma, Phizoctonia, Whetzelinia и Schizophyllum.
18. Метод съгласно претенция 17, при който фунгата е Sclerotinia sclerotorum.
19. Метод съгласно претенция 16, при който растението е слънчоглед (Helianthus anuus).