JPH06504914A

JPH06504914A - 新しく特性決定されたシュウ酸塩オキシダーゼ及びその使用

Info

Publication number: JPH06504914A
Application number: JP4504691A
Authority: JP
Inventors: ハートマン，クリスチナ，エル．; ジヨール，サリイツト，エス．; シユミツト，マーク，アール．
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1991-02-25
Filing date: 1992-02-24
Publication date: 1994-06-09
Also published as: AU1207492A; BR9205664A; FI933718L; CA2107804C; DK0636181T3; HUT67049A; GB9203929D0; AU656761B2; BG98069A; ES2152225T3; FI933718A0; CA2107804A1; RU2136755C1; DE69231588T2; US5866778A; GR3035217T3; EP0636181B1; HU214357B; HU9302252D0; ATE197814T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１４、前記遺伝子が添付図面の図１のＤＮＡ配列を含むものである、請求の範囲第１３項記載の形質転換細胞。

１５、前記遺伝子によって発現された前記シュウ酸塩オキシダーゼが約２５キロダルトンの単一のサブユニットである、請求の範囲第１３項記載の形質転換細胞。

１６、シュウ酸を分泌するカと菌類の感染による植物の病気発生を撲滅する方法であって、シュウ酸塩オキシダーゼをコード化する遺伝子を、形質転換によって前記植物のゲノム中に安定的に組み込むことからなる、シュウ酸を分泌するカビ菌類の感染による植物の病気発生を撲滅する方法。

１７、前記のカビ菌類が、スフレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　）属、スクレロチウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｓ）属、アスペルギルス（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　＞属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｔｃｉｌｌｉｕｉ　）属１．ピチウム（Ｐｙｔｈｌｕｍ　）属、パキシラス（Ｐａｘｉ　Ｉ　１ｕｓ）属、マイセナ（Ｍｙｃｅｎａ）属、リューコストマ（Ｌｅｕｃｏｓｔｏｓ＋ａ）属、リゾクトニア（Ｒｈ１ｚｏｃｔｏｎｉａ　）属、ウエットゼリニア（Ｖｈｅｔｚｅｌｉｎｉａ　）属及びシゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕａ　）属からなるシュウ酸分泌性のカビ菌類の群から選択される一つの属のものである、請求の範囲第１６項記載の方法。

１８、前記のカビ菌が菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｌｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｏｒｕｍ　）である、請求の範囲第１７項記載の方法。

１９、前記植物がヒマワリ（Ｈｅ１１ａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｕｓ）　テある、請求の範囲第ｉｅ項記載の方法。

２０、植物であって、そのゲノム中に形質転換によって、シュウ酸塩オキシダーゼをコード化する遺伝子が安定的に組み込まれた植物。

明細書新しく特性決定されたシュウ酸塩オキシダーゼ及びその使用本発明は、組換えＤＮＡ技術の使用による植物の遺伝子の改良に関する。しかし本発明は専らこれのみに関するものではなく、特に、本発明は病害に対する植物の耐性の改良に関する。

農業の始まりから、人間は植物の病害の問題に直面してきた。歴史を通じて、雑種（ｈｙｂｒｉｄ）植物、農薬及び改良された農業手法の使用によって例証されるように、植物の病害に対して多くの研究がなされてきた。しかしながら、農業経営者、家庭園芸家、又は室内用観賞植物（４１０ｕｓｅ　ｐｌａｎｔ）愛好者によって証言され得るように、植物の病害の問題は植物栽培において進行中でしかも絶え間なく続く問題である。本発明は、ある種の微生物特にカビＷｔＷＡ（ｆｕｎｇｉ）が植物を襲う方法について長い間知られている事実を利用することによって、植物の病害の問題の解決において将来に向かりて大きな一歩を成すものである。具体的に言うと、本発明は、病原体（病因微生物とも言う）（ｅｔｉｏｌｏｇｉｃ　ａｇｅｎｔ）が植物組織の中に実際に侵入することを遅らせるか又は防止し、それによって病害を防止する手段を取扱うものである。また、病原体の完全な侵入が防止されない場合においては、本発明は、感染の影響を軽減させそれによって病害による植物の死亡数（ｍｏｒｔａｌ　１ｔｙ）を減少させるか又は防止する手段を植物に付与するものである。

植物病原菌が植物に感染するためには、該植物病原菌は植物の中に進入し、そしてその後に植物の至るところ侵攻できるものでなければならない。植物病原菌は種々の方法でこれを達成する。一般に、これは襲撃されるべき植物すなわち病原菌の宿主のある種の成分及び／又は代謝機構に影響を及ぼす化学物質を分泌することによって達成される。植物病原菌によって分泌される化合物及び病害を引き起こす機構すなわち病因機構に関連する化合物の主な群は、毒素類、酵素類、多糖類及び／又は別の成長のエフェクター類である。かかる化合物の１つは、シュウ酸又はシュウ酸塩（ｏｘａｌａｔｅ）であり、これらは酵素、シュウ酸塩オキシダーゼ（ｏｘａｌａｔｅ　ｏｘｉｄａｓｅ）によって分解され得る。シュウ酸塩オキシダーゼによって触媒作用される反応は周知であるが、大麦のシュウ酸塩オキシダーゼによって例証されるような酵素、シュウ酸塩オキシダーゼの物理化学的性状は、文献に誤って報告されている。植物病原菌が植物宿主を襲う手段としてシュウ酸を分泌することは、多数のカビ菌属（ｆｕｎｇａｌ　ｇｅｎｅｒａ）に通に認められる。これらの属のカビ菌、特にスフレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｌｎｉａ）属のカビ菌は、多数の高等栽培植物、例えば圃場作物例えばヒマワリ、ダイズ、マメ類一般、セイヨウアブラナ／カノラ（ｃａｎｏｌａ）、ムラサキウマゴヤシ、アマ（亜麻）、ベニバナ、ラッカセイ及びクローバ−１野菜作物例えばレタス、トマト、キュウリ、ジャガイモ、ニンジン、ハツカダイコン、エントウ、レンズ豆、キャベツ、ブロッコリ及び芽キャベツ、花類例えばペチュニア及びキク、並びに樹木類例えばモモの破滅的及び致命的病気を引き起こすことが知られている。これらの病気としては、圃場における収穫前の病気ばかりではなく、収穫後の輸送及び貯蔵中の病気が挙げられる。

前記の属のカビ菌類によってもたらされる病徴（ｓｙｓｐｔｏａ＋ｓ）は、宿主植物及び病気に感染した宿主植物の部分によって変動し、しかも病原菌が襲う時の環境条件にも左右される。例えば、あらゆる菌核病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｌａ　ｄｉｓｅａｓｅ）の特徴は、葉の萎れ（ｗｉｌｔｉｎｇ）と衰弱であり、その結果として前記カビ菌類が植物の“芯（ｈｅａｒｔ）”及び茎の至るところを侵す。この病気は致命的である。

スフレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　）菌の液体培養においては、増殖培地、培養の期間（ａｇｅ）及び他の種々の因子に応じてｌ　、　０００ｐｐｍから１０．０００ｐｐ■の範囲にわたるシュウ酸量（Ｉ　ｅｖｅ　Ｉ　）が認められている。

低濃度のシュウ酸に暴露されたある種の植物組織、例えばエントウ及びヒマワリの葉は、萎れの兆候と、病気の後の諸段階においてシュウ酸の重要性を示唆している細胞死の兆候とを急速に示す。種々の理論は、植物細胞壁及び／又は鍵代謝酵素を妨害する２価金属のキレート化から、これらのカビ菌類によって分泌される加水分解酵素が作用するための最適微細環境（ｓｌｃｒｏ−ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）の提供までその範囲が及んでいるが、感染後にシ二つ酸の働きを惹起する病気の正確な機構は未知である。それにもかかわらず、シュウ酸が病原菌襲撃の必須成分であることは、現存の文献証拠から明らかである。この結論の証拠は、幾つかの研究例えばシュウ酸塩欠ｔｊ（ｏｘａｌａｔｅ−ｍｉｎｕｓ）スフレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　）変異株についての調査によって得られている。該変異株は、加水分解酵素及び他の諸因子の通常的補体を有すると思われるが、病気の総体的兆候（ｓｙｌＩｐｔｏｍｏｌｏｇｙ）を生じないように思われる。これらのシュウ酸塩欠損変異株の復帰突然変異体は、正常な病気の進展（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）及び特徴を示した。

前記の属のカビ菌類に関連した病気の高度の毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）は周知である。例えば、菌核病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　５ｃｌｅｒｏｔｏｒｕｓ）に感染した温室栽培ヒマワリの葉は、感染後３〜５日目に萎れ及び付随した壊！（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を示す場合が多い。これらの植物の研究において、胚軸（植物の胚の軸すなわち子葉より下の茎の部分）の病巣の水抽出物中に萎凋病（ｖｉ　ｌ　ｔ）誘発物質が存在することが明らかにされている。化学的試験例えば薄層クロマトグラフィー及び気液クロマトグラフィーにより、この萎凋病誘発物質がシュウ酸を含んでいること及び感染した植物由来の萎れた葉が健全な植物の葉の１５倍以上も多くシュウ酸を含んでいることが例証されている。すでに認められているように、シュウ酸は植物中を浸透的に（ｓｙｓｔｅ■ｆｅａｌｔｙ）移動して、感染の開始点から離れている組織ばかりでなく菌糸に必ずしも感染していない組織にも病気の徴候を生じる。

この背景に関連して、本発明者らは、シュウ酸塩分解酵素例えばシュウ酸塩オキシダーゼ、シュウ酸塩デカルボキシラーゼ又は植物による同様の酵素を適切に同定し、単離し且つ発現させることによって、シュウ酸を病原性の鍵成分として分泌するカビ菌類の病原性をうまく弱め得ることを実現させた。従って、本発明者らは、遺伝子工学の技法を使用して、植物及び微生物中にシュウ酸塩オキシダーゼ活性を導入するのに適したタンパク質月の遺伝子を同定し、単離するという目標を挙げて、それを達成した。

シュウ酸塩類はまた、一般に幾つかの植物種牛に、植物それ自体によって天然に産生された物質として存在する。天然産のシュウ酸塩は、幾つかの種類の緑葉野菜例えばホウレンソウ及びダイオウ、並びに幾つかの飼料用マメ類（ｆｏｒａｇｅ　Ｉｅｇｕａ＋ｅｓ）中に蓄積する。

かかる作物種は食物ビタミン及び無機質の可能性のある供給源であるが、大量の摂取は人間にとって有毒であり、その場合にはシュウ酸塩はカルシウムイオンと結合し、血管中に不溶性のシュウ酸カルシウムとして沈殿して高シュウ酸尿症及び腎組織の退化（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）をもたらす。

また、シュウ酸が別の植物代謝物と反応して高毒性のシュウ酸誘導体を生成し得ることも知られている。１つの例においては、化合物、β−Ｎ−オキザリル−し −α−β−ジアミノプロピオン酸が形成される。該化合物は神経毒である。

従って、幾つかの植物種中にシュウ酸が存在すると、該植物種を人間又は動物の食料として使用することが不可能になる。

特に、本発明者らは、シュウ酸を伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）病原性を妨害するのに有用な一つの酵素を特定した。この唯一特定されたシュウ酸塩オキシダーゼ（ｏｘａｌａｔｅ　ｏｘｉｄａｓｅ）酵素は、シュウ酸塩の酸化分解に関わる（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）反応に触媒作用するか又は寄与して二酸化炭素と過酸化水素を生成する。この反応の一般的な形式は下記の通りである。

シュウ酸塩オキシダーゼシュウ酸塩　＋０２２ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ２この酵素の研究により、該酵素の同定、単離及び発現がもたらされたばかりでなく、該酵素の特定及びそのクローニングであって該酵素発現用の遺伝子が現存しており（ｅｘｔａｎｔ）、植物中に導入され得、且つ植物により発現されて、それによってシュウ酸が重要な成分であるカビ菌類に対する病害抵抗性を付与するようなりローニングもまたもたらされた。かかる植物形質転換によって、得られた形質転換植物は、有害な病気を引き起こすシ丘つ酸の影響から保護されるであろう。

前記発明の用途は、植物の病気発生（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓ　ｉｓ）に限定されないことが認められるであろう。本発明のさらに別の利点は、植物中にシュウ酸塩オキシダーゼを導入して低シュウ酸植物を作り出すことである。これは高シニウ酸塩植物、例えばラッカセイ、サトウダイコン、ホウレンソウ、ダイオウ、大麦、ココア及び多数の草類において特に有益であり得る。ＬＩｂｅｒｔ＆Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｊの論文、Ｊ、Ａｇｒｉｃ、Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｗ、、　３５，９２８−９３８（１９８７）が参照される。また、本発明はシュウ酸塩分解酵素の大規模生産に用途を有する。かかる大規模なシュウ酸塩分解酵素の需要（ｎｅｅｄ）は、種々様々な分野、例えばシュウ酸の存在及び／又は量を測定するための検定キットにおいて使用するための需要、並びに食料品、飲料及び業務用加工品中に存在するシュウ酸の分解において使用するための需要において公知である。例えば、微生物シュウ酸塩デカルボキシラーゼは、醸造工業で使用されており（米国特許第４，６５２，４５２号明細書）、該明細書中に挙げられているようにシュウ酸塩はまたシュウ酸塩オキシダーゼを使用して分解され得る。

本発明の目的は、植物中のシュウ酸を分解するための手段（ｍｅｉｎｓ）を提供することにある。

本発明によれば、シュウ酸塩オキシダーゼ酵素をコード化するＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡであって且つ本明細書に添付図面の図１のＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡ、遺伝暗号の同義性すなわち縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）によって許容される（ｐｅｒｍｉｔｔｅｄ）その変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）、及び上記ｃＤＮ＾がハイブリダイズするゲノムＤＮ＾が提供される。

また本発明によれば、約２５キロダルトンの単一のサブユニツトを特徴とする、シュウ酸塩分解能を有する酵素が提供され、しかも特に植物を処理するのに使用されて該植物中のシュウ酸を分解する実質的に純粋なシュウ酸塩オキシダーゼであって添付図面の図２に示されるアミノ酸配列を有し且つ３．５のｐＨ最適条件、陽性の熱安定性、約２５キロダルトンの単一のサブユニット及びプロテアーゼ安定性を特徴とする実質的に純粋なシュウ酸塩オキシダーゼ（ｏｘａｌａｔｅ　ｏｘｉｄａｓｅ）が提供される。

前記シュウ酸塩オキシダーゼは、該シュウ酸塩オキシダーゼを植物に伝達又は輸送（ｄｅｌ　１ｖｅｒｙ）するための耕種学的（ａｇｒｏｎｏａ＋１ｃａｌ　Ｉｙ）に適当な担体を用いて製剤化し得る。

従って、本発明によればまた、植物中のシュウ酸を分解する方法であって、該植物を該シュウ酸から保護するように該植物にシュウ酸分解酵素を輸送することからなる植物中のシュウ酸を分解する方法が提供される。

該酵素はシュウ酸塩オキシダーゼであることが好ましい。前記のシュウ酸分解酵素の輸送は、前記酵素を農業上許容し得る担体と組合わせて植物に又は該植物の生育場所に施用することによって行い得るし、あるいは別法として前記シュウ酸塩オキシダーゼをコード化する遺伝子を用いて植物ゲノムを遺伝子形質転換させることにより行い得る。

また、本発明によれば、植物組織中のシュウ酸塩の還元方法であって、シュウ酸塩オキシダーゼ酵素をコード化する遺伝子を、例えば遺伝子形質転換によって植物のゲノム中に安定的に組込むことからなる植物組織中のシュウ酸の還元方法が提供される。

この目的に適した遺伝子組立て体は、プロモーター配列と、シグナルペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ）と、前記シュウ酸塩オキシダーゼ酵素をコード化する構造遺伝子配列と、遺伝子末端配列とを含有し得る。

従って、本発明によればまた、シュウ酸塩オキシダーゼ発現用の遺伝子を含有する形質転換植物細胞が提供される。該遺伝子は、添付図面の図１の配列を有し得る。

さらにまた、本発明によれば、シュウ酸を分泌するカビ菌類の感染による植物の病気発生（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）を撲滅する（ｃｏｍｂａｔ）方法であって、シュウ酸塩オキシダーゼをコード化する遺伝子を、形質転換によって植物のゲノム中に安定的に組込むことからなる、シュウ酸を分泌するカビ菌類の感染による植物の病気発生を撲滅する方法が提供される。

シ二つ酸を分泌するカと菌類の属の例は、スクレロチニアス（Ｆａｘｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）属、マイセナ（Ｍｙｃｅｎａ）属、リューコストマ本発明において重要な１つの具体的なカビ菌は、例えばヒマワリ従って、一般的に言えば、本発明は広義には、シュウ酸塩オキシダーゼによって例示されるようなシュウ酸塩分解酵素を、商業用途例えば醸造工業における用途あるいは耕種学的（ａｇｒｏｎｏｓ＋ｉｃ）用途例えばシュウ酸に対する植物の感受性を低下させるための用途又は植物中の内因性シュウ酸濃度を低下させるための用途に使用することについての理解と認識とに関するものである。本発明者らは、本明細書において、特に耕種学的用途について病害又はシュウ酸が重要な侵入上の役割を果たしている他の現象から、植物の死亡数又は破滅（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を低減させるためにシュウ酸塩分解酵素を使用することを認め、示唆することに至っている。本発明者らはまた、本発明を使用することにより、シュウ酸が重要である病害から植物の死亡数及び感染を防止することをもたらし得ることも認めた。かかる病害は、特に多くのカビ菌類の中で本明細書中に挙げた特定の属のカビ菌類によって引起こされる。

シュウ酸塩分解酵素類の、本発明者らの新規な使用についての認識は、文献に報告されている大麦のシュウ酸塩オキシダーゼの物理化学的性質が不正確であったという本発明者らの認識（ｒｅａｌ　１ｚａｔｉｏｎ）及び発明によって特に高められた。従って、本発明者らは、これまでに報告されていなかったシュウ酸塩オキシダーゼ酵素を実質的に精製し、特性決定した。事実、文献に挙げられた酵素の主張された実質的な精製は不正確であることが、本明細書において示される。

具体的にいえば、本発明者らにより、添付図面の図２に示される特定の全アミノ酸組成、３．５のｐＨ最適条件、中性の等電点、陽性の熱安定性、プロテアーゼ安定性及び約２５キロダルトンの単一のサブユニットを有する実質的に純粋なシュウ酸塩オキシダーゼが開示される。　また、本明細書おいては、添付図面の図１に示す特定のＤＮＡ配列をもつシュウ酸塩オキシダーゼをコード化する実質的に純粋な遺伝子の実質的に全部についての発明が記載される。該遺伝子は、前記に挙げた特徴を有するシュウ酸塩オキシダーゼ酵素をコード化する。特に、該遺伝子は、シュウ酸塩オキシダーゼ活性を示して約２５キロダルトンの単一のサブユニットを有する酵素であって、精製された大麦シュウ酸塩オキシダーゼに対して高められた抗体と特異的に反応し、しかも添付図面の図２に示したアミノ酸配列を有する該酵素をコード化する。

また本発明により、植物の病気発生を撲滅するのに使用される化合物であって、シュウ酸分解活性、特にシュウ酸塩オキシダーゼ活性を示す化合物を包含する化合物が提供される。特に、該植物化合物は、病原菌によって産生されたシュウ酸を分解するのに十分な量のシュウ酸塩オキシダーゼ活性を有する。かかる化合物の別の耕種学的用途は、植物又は土壌に直接的に上記化合物を輸送することを可能にする耕種学的に許容される適当な担体と該化合物を組合わせることであることが理解されるであろう。

形質転換植物細胞もまた本明細書中に開示され、該細胞はシュウ酸塩オキシダーゼ又は別のシュウ酸塩分解酵素の発現をコード化する遺伝子によって形質転換される。かかる酵素をコード化する遺伝子は、添付図面の図１に挙げたＤＮＡ配列を含有し得、該配列は本発明者らによって実質的に精製されたシュウ酸塩オキシダーゼ酵素に実質的に対応する。

本明細書には、かかるシュウ酸からの保護を必要としている植物に、シュウ酸からの保護を与える方法が記載される。該方法は、シュウ酸から該植物を保護するのに十分な量のシュウ酸分解酵素を、かかる保護を必要としている植物に供給する方法を包含する。該シュウ酸分解酵素は、図１に示される構造を有する遺伝子によってコード化されたシュウ酸塩オキシダーゼであるのが好ましい。

かかる保護を与える方法は、シュウ酸分解酵素をコード化する遺伝子、特にシュウ酸塩オキシダーゼをコード化する遺伝子による植物の形質転換を含めて多数の形態を取り得る。別法として、該方法は、植物に又は植物が生育する土壌に直接に施用するための、耕種学的に許容し得る担体と組合わせたシュウ酸分解酵素の供給を包含し得る。

本発明の精製されたシュウ酸塩オキシダーゼ、病気発生を撲滅するための薬剤としてのその使用及び植物細胞の形質転換におけるその使用により、病気発生中か又は意図する段階のいずれかにおいてシュウ酸が重要な成分として役割を果たしている植物の病害を防除するための新しい、独特な試みが提供される。もちろん、シュウ酸塩オキシダーゼ酵素の活性は、それがシュウ酸の分解に寄与するものであることは周知である。しかしながら、シュウ酸を化学分解により、例えば酵素分解により攻撃することによって、シュウ酸が重要な役割を果たしている病気に対する病気抵抗性を付与することにおいて重要な農業上の利点がもたらされるということを最初に認めたのは、本発明者らであった。耕種学的に重要な植物例えばヒマワリのごとき作物の商業的栽培における主要な悩みの種はカビ菌類例えばシュウ酸を分泌するスフレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属のカビ菌によってもたらされるという理由から、本発明は特別な期待をもつものである。

本発明者らの発明思想の利点は、植物を形質転換させるか又はシュウ酸塩オキシダーゼを農業上許容し得る適当な担体と所望に応じて多くの場合に組合わせて伝統的な農薬として施用するか、いずれかによって利用される。シュウ酸塩オキシダーゼを農薬として使用する重要な利点の１つは、該シュウ酸塩オキシダーゼが生態学的に安全であり、汚染がなく、しかも植物に害を与えないということである。

前記酵素の外部施用を使用して病原菌から植物又は植物の部分を保護するべきである場合には、該酵素を希釈して液状溶液又は懸濁液を形成させるか、あるいは粉剤として施用されるべき希釈固体と混合することが予期されるであろう。施用法の的確な種類は、標的とされる特定の病原菌及び植物に部分的に左右されるであろう。特定の作物及び病原菌に対して一般的な施用方法を適用する具体的な方法は、’Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｒｏｒ　ｅＶａｌｕａｔｉｎｇ　ｐｅｓｔｌｃｉｄｅｓ　ｆｏｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆｐｌａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ（植物病原菌防除用農薬の評価方法）　’　（Ｋ、Ｄ、　Ｆｌｉｅｋｙ編、Ｔｈｅ　Ａｓｅｒｉｃａｎ　ＰｈｙｔＯＩ）ａｔｈｏＩｏｇｉｅａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ発行（１９８８年）〕に見出し得る。製剤に添加し得る補助剤としては、可溶化助剤、湿潤剤及び安定化剤あるいはマイクロカプセル化製品を製造する諸薬剤が挙げられる。かかる補助剤は当該分野で周知である。

また外部施用は、組換え微生物を、生菌の形態で、あるいは酵素を不活性化させない方法で非生菌の（ｎｏｎ−ｖｉａｂｌｅ）形態に転換させた後でか、そのいずれかで利用し得る。

従来技術文献では報告によればシュウ酸塩オキシダーゼを精製し、それを特定しているが、本発明者らは、かかる文献報告が不正確であったこと及び該酵素は事実適切に精製されておらずしかも特性決定されておらなかったことを知見した。

本明細書で使用した“シュウ酸塩（ｏｘａｌａｔｅ）オキシダーゼ２とは、特にことわらない限りは本明細書に挙げた酵素の精製され、特性決定された形態のものをいうことが理解されるであろう。現存する文献報告と、本発明の精製され、特定された酵素との間の相違は、本明細書において詳細に明らかされ、しかも表１から簡単に見出し得る。

商業的に入手し得るシュウ酸塩オキシダーゼ調剤の不純物、及び文献中の該酵素の不適切な特性決定は、本発明者らが大麦の苗（ｓｅｅｄ＋ｔｎｇ）の根からシュウ酸塩オキシダーゼを初めて精製した際に明らかになった。２つの方法を使用した。その第１の方法においては、大麦の苗の根のシュウ酸塩オキシダーゼの精製に、１〜４倍容の水中への凍結組織の均質化（ホモジナイゼーション）と、チーズクロスを通して濾過して砕片を除去した後の水性抽出物からの精製とを用いた。上記溶液はさらに、ｉｇ、ｏｏｏ　ｃで３０分間遠心分離し、次いで８０℃ で３分間加熱処理することにより精製した。両方の工程における沈殿物は廃棄した。硫酸アンモニウム（ＮＨ４２ＳＯ４について３０％飽和と４０％飽和の間で上清からタンパク質沈殿を遠心分離することにより採取し、水に対して透析した。硫酸アンモニウム沈殿工程から再溶解により分離する（ｒｅｓｏｌｕｂｉｌＩｚｉｎｇ）タンパク質は、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｌａ）　ＦＰＬＣにより、２５ｍＭ酢酸カリウム、ｐＨ４，８で平衡化させたＭｏｎｏ　８１０／１０カラムを使用して、前記と同じ緩衝液中のＮａＣｌ濃度勾配０．０〜０．４Ｍで溶出させて分画した。シュウ酸塩オキシダーゼ活性はＳｕｇｉｕｒａらの方法（Ｃｈｅ寵、　Ｐｈａｒ＊ａ、　ＢＬＪ！１．．２７（９）。

２００３（１９７９））により測定した。シュウ酸塩オキシダーゼ活性のピーク（ｐｅａｋ）画分を一緒にし、低塩酢酸カリウムｐＨ４，８緩衝液で平衡化し、次いでファルマシアＦＰＬＣにより、Ｍｏｎｏ　Ｓ　５１５カラムを使用して前記の緩衝液及びＮａＣｌ濃度勾配で溶出させて、再クロマトグラフィー分離した。Ｍｏｎｏ　５５１５工程から得られたピーク画分を一緒にし、Ｍｏｎｏ　Ｑ　５１５カラムに適用した２５ｍＭ　トリス−ＣＩ　、ｐ）＋　７．８で平衡化し、ＮａＣｌ濃度勾配０．０〜０．４ｍで溶出させた。ピークシュウ酸塩オキシダーゼ活性画分のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は、約２５キロダルトン及び３０〜４０キロダルトンにおいて銀染色により著明なタンパク質バンドを示した。

５ｕｐｅｒｏｓｅ−１２ゲル濾過カラム（５抛Ｎ酢酸カリウム、Ｉ）＋（４，８で平衡化させた）により上記の未変性タンパク質をサイズ分画したものを次にＦＰＬＣにより分画すると、約２５，０００の分子量と一致する時間に溶出する画分が活性の良く明白なピークをもつことが示された。別の分子量に相当した他の画分における溶出物には、シュウ酸塩オキシダーゼ活性は認められなかった。

その第２の方法は、界面活性剤抽出を使用したものである。４〜７日齢の大麦の苗の根を、液体窒素の存在下で粉末化し、−８０℃で保存した。この条件下での保存は、活性の明白なロスを招かなかった。保存した組織を、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩０．５％を含有する蒸留水を用いてホモジナイズし、濾過し、次いで遠心分離した。２種類の画分（上清及びペレット）についてのシュウ酸塩オキシダーゼ検定は、両方の画分が活性を有していたことを示す。

従って、上記ペレットを、タウロデオキシコール酸塩０．５％を含有する蒸留水で抽出した。蒸留水に対して完全に透析した後に、硫酸アンモニウムを加えて濃縮し、可溶性の上滑プローブを分画した。

次いで、沈殿したタンパク質（３０〜７０％硫酸アンモニウム画分）を、界面活性剤を含有する少量の蒸留水に再懸濁し、小さいゲル浸透カラム（セファデックスＧ２５）で脱塩した。得られた活性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ％ｐＨ７、５緩衝液を使用して陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ）にかけ、塩化ナトリウム濃度勾配を使用して結合タンパク質の溶出を行った。酵素的に活性な画分を濃縮し、脱塩し、次いでＭｏｎｏ　Ｑカラム（ファルマシア社製）にかけた。再度、塩化ナトリウム濃度勾配を用いて上記タンパク質を溶出させた。活性検定により、シュウ酸塩オキシダーゼは３つの両分中に濃縮されていることが示された。

これらの両分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析すると、活性は約２５キロダルトンの分子量のポリペプチドと結びついていると決定された。

精製した後に、精製された均質なシュウ酸塩オキシダーゼ製品の特性決定を行った。既に示されており、しかも表１に示されるように、本発明での精製により得られたタンパク質の緒特性は、文献に記載された特性と明かに異なっている。このことは、シュウ酸塩オキシダーゼ酵素を精製しようとする当業者の試みにも拘らず、この酵素がその物理化学的性状の解明によって正確に記載され、しかもフィンガープリントされた（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｅｄ）ことは、今般の本発明者らの努力の成果（ｅｆＴｏｒｔｓ）以前には成されていな力じたことを示唆する。本発明者らによって行われた物理化学的特性決定の結果を表１に示す。比較のために、この酵素の既に報告されている文献の特性決定値も示す。

表１また、シュウ酸塩オキシダーゼ活性を示す本発明者らの酵素の特徴（ｄｉｓｔｌｎｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）の立証は、表２に明らかにし得る。表２から明らかなように、本発明によって、文献に報告されているアミノ酸組成と異なったアミノ酸組成であることが証明される。Ｃｈｉｒｉｂｏｇａの論文、Ｊ、　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｒ　Ｂｌｏｃｈｅｔａｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｌｏｐｈｙｓｌｃｓ、１１Ｂ、５１８−５２３（１９６Ｂ）参照。

表２部分的に精製された大麦の種子（ｓｅｅｄ）の根のシュウ酸塩オキシダーゼを、可溶化し、Ｍｏｎｏ　Ｓカラム（２５畦酢酸カリウム、１）Ｈ４，８、及び同じ緩衝液中の塩化カリウム濃度勾配０〜４００ミリモルを用いて溶出させた）を使用して陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた。

回収された酵素的に活性なタンパク質を、分離用ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によりさらに精製した。約２５キロダルトンの分子量バンドの単一のタンパク質バンドを検出し、次後に上記ゲルから切り取った。

複数の湿潤ゲル切片をフラグメントに分け（ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ）、フロインドアジュバントと混合し、ウサギの尻に近い腿の筋肉の裏側に筋肉内注射した。

このウサギを追加量のタンパク質で追加免疫しくｂｏｏｓｔ）　、試料血液を監視してシュウ酸塩オキシダーゼ特異抗体の産生を確認した。約４か列後に、ウサギから血を取った。産生されたポリクロナールウサギ抗体は非常に高い力価をもつものであった。

図１に示した構造を有する大麦由来のシュウ酸塩オキシダーゼをコード化する遺伝子を、大麦の根から構築したｃＤＮＡライブラリーを使用して図４に示すようにクローン化した。ＲＮＡ全体は、大麦の根から調製した。次いで、ＲＮＡ全体からポリアデニル化ＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡの合成に使用した。ＲＮＡ全体及びポリアデニル化ＲＮ＾の両方は、商業的に入手し得るＲＮ＾抽出キット及び５ＲＮＡ精製キツトを使用して、該キット（Ｐｈａｒｓａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、製）と共に提供される標準取扱い指示書に従って調製した。ｃＤＮＡライブラリーの構築は商業的に行われた（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　ｏ　ｃＤＮＡライブラリー用に選択したベクターはλｇｔ　２２ベクターであった。この発現ベクターの使用は、シュウ酸塩オキシダーゼ抗血清の高力価及び特異性に基づいて選択した。この変換（ｃｏｎｖｅｒｓ　１ｏｎ）に関して使用するために選択された発現ベクターが何であっても、該ベクターがシュウ酸塩オキシダーゼｃＤＮＡクローンのタンパク質生成物について免疫学的選別試験の使用を可能にすることは好都合である。ｃＤＮＡライブラリー用の１．８キロ塩基対の平均挿入断片サイズと、独立クローン（１，７Ｘ１０６個）の数までの良好な発現量（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）とに基づいて、前記ライブラリーは、約２５キロダルトンの大きさのシュウ酸塩オキシダーゼタンパク賞月のｃＤＮ＾クローンを含有するであろうということが推論された。

該ライブラリーの最初の選別試験は、例えばＨｕｙｎｈ、　Ｔ、らの著作、に従って、シュウ酸塩オキシダーゼに対する抗血清を用いて行った。

成熟シュウ酸塩オキシダーゼタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列に関する情報が得られている（Ｎ−末端残基については除く）という理由から、さらにまた該Ｎ −末端配列をも使用して最初の免疫学的選別試験において陽性として回収されたｃＤＮＡクローンの同一性を確認した。

ｃＤＮＡライブラリーから得た１、２ＸｌＧ’個のプラークを抗血清を用いて選別した。１４個の潜在的に（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｌｙ）陽性の信号が得られ、そのうちの１個はその他の信号よりもはるかに強かった。確認された陽性の、単一のプラーク単離体であって分子レベルで特定するつもりである該プラーク単離体を得るために、これらの１４個のクローンについて抗血清を用いて連続して２回の再選別試験を行った。また、プラークＮｏ、１２は、これらの次後の選別試験全体を通して最も強い信号を示した。次いで、プラークＮｏ、１２を使用して、例えば）１ｕｙｎｈ、　Ｔ、らの前記著作に記載の標準法に従って、プラーク信号の特異性の試験としてシュウ酸塩オキシダーゼ抗体を精製した。プラークＮｏ、１２から精製された抗体は、シュウ酸塩オキシダーゼタンパク質のアクリルアミドゲルのウェスタンプロットにプローブとして使用した。プラーク精製された抗体は、プローブとして精製抗体を用いて認められたパターンと同じパターンを示しながら、シュウ酸塩オキシダーゼと特異的に反応した。

プラークＮｏ、１２由来の挿入断片（λｇｔ　２２ベクター中にクローンａｎｄ　Ｖｉｌｅｙ　Ｉｎｒｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　（二＝−ヨーク所在）発行、１９８８年〕ｐＩ）、　１５．０．１−１５．４．６の“釦ｅ　Ｐｏ１ｙｓｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ連鎖反応）”に例証されるような標準的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して取り出した。プラークＮｏ、１２中の挿入断片は、８５０〜７５０塩基対であると判定された（ｅｓｔｉｍａｔｅｄ）　ｏプラークＮｏ。

１２中の挿入断片のサイズは、約２５ｋｄのタンパク質と一致した。ｃＤＮＡ挿入断片についての最初のサイズ判定と、前記抗体のプラーク精製により得られた結果とに基づいて、プラークＮｏ、１２は、別の分子の分析用の最もよい候補であると認められた。次いで、ＰＣＲにより調製したプラークＮｏ、Ｌ２２挿入断を、分析処理をよりよく施すことができるプラスミドベクター中に再クローン化した。また、クローン１２由来のｃＤＮＡ挿入断片を、大麦の根のＲＮＡのノーザンプロットにプローブとして使用して、シュウ酸塩オキシダーゼ用ＲＮＡのサイズを判定した。ホルムアルデヒドゲル電気泳動及びナイロン膜への移し換えは、この膜の商業的供給者、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌによって推奨された方法に従って行った。Ｎｏ、１２プローブは、塩基約８００〜８５０個の長さの一重鎖−ＲＮ＾にハイブリダイズした。

再クローン化したプラークＮｏ、１２挿入断片についてジデオキシヌクレオチド配列決定を行った。商業的に入手し得るＴ７配列決定用キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、製）及びこの製造者の推奨操作を使用した。大麦のｃＤＮ＾挿入断片は、１０個以下の塩基対それぞれを含む（ｃｏｖｅｒｉｎｇ）　２つの小さい領域、すなわちＣ末端と３個のＮ末端塩基の確定とにおいて多少とも不確定しかであるけれども、塩基約６９０個の長さであると決定された。クローン１２挿入断片のヌクレオチド配列を添付図面の図１に図式的に示した。次いで、部分タンパク質配列を、クローン１２のヌクレオチド配列から予測し、精製シュウ酸塩オキシダーゼから直接に得られたＮ−末端アミノ酸配列と比較した。この比較を添付図面の図３に示す。

上記成熟シュウ酸塩オキシダーゼ酵素用の解読（ｃｏｄｉｎｇ）配列を含む添付図面の図１に示した構造を有する遺伝子は、一定の（ｄｅｆｉｎｅｄ）宿主細胞中で構造遺伝子を発現させるのに必要とされる遺伝子調節要素に結合し得る。必要とされる調節要素の第１の型は、遺伝子プロモーター領域であり、該領域は植物細胞の生物学的組織によって認識されるＤＮＡ配列を含有し、しかもＤＮＡ配列の転写をメツセンジャーＲＮＡ（ｌＲＮＡ）に誘発するものである。次いで、１ＲＮＡは構造遺伝子領域によりタンパク質生産解読暗号（コード）に翻訳される。上記プロモーターは、シュウ酸塩オキシダーゼ用遺伝子の前に又は５“の位置に結合され、この結合は当業者に公知の標準的方法に従って行い得る。例えば、Ｔ　Ｍａｎｉａｔｉｓらの著作、ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）　Ｊ　［Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ所在）発行、１９８２年〕、第１０４〜１０６頁参照。植物細胞中でシュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子を発現させるために使用し得るプロモーター領域は、種々様々な異なる植物組織において活性であるプロモーターを含む。例えば、カリフラーワーモザイクウイルス由来の３５３プロモーターが、この目的に適したものであり得る。植物細胞中で使用し得る別の型のプロモーターは、さらに制限された条件下で発現するものである。この分類に含まれるプロモーターは、植物のある種の組織（１種又は複数）においてのみ活性なプロモーターであるか及び／又はある種の刺激様外傷（ｗｏｕｎｄ　ｉｎｇ）によって活性にさせられるプロモーターである。この種のプロモーターの具体例は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）用の遺伝子由来の５′調節領域である。この型のプロモーターは、Ｌｉａｎｇ　Ｘらの論文、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８：９２８４−９２８８（１９８９）において論じられている。微生物宿主中におけるシュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子の発現は、微生物起源から得られるプロモーターを使用することにより達成し得る。かかるプロモータためのｔｒｐプロモーター又はＥｄｅｎｓ　Ｌ、らの論文、“５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄためのグリセルアルデヒドホスフエートデハイドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）プロモーターが挙げられる。また、遺伝子プロモーター配列は、それが転写及び翻訳に関して上記の基準を満たす限りは、宿主細胞の細胞とは異なる細胞中に見出されるプロモーター配列から部分として又は全体として誘導し得る。

第２の遺伝子調節要素は、必ずしもシュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子に結合される必要はないがシュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子に結合され得ることが望ましいものであって、ターミネータ−であるか又はポリアデニル化配列である。該ポリアデニル化配列は、シュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子の転写の有効な終結を促進し、しかも真核生物においてポリアデニル化、すなわちｙｉＲＮＡの３°末端で任意の個数のアデノシンヌクレオチドの付加をも促進するものである。当該技術分野において公知の標準的方法を使用して、ターミネータ−領域を上記シュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子の後ろに又は３′の位置に結合できる。（例えばＴ、　Ｍａｎｉａｔｉｓらの前記論文、第１０４〜１０Ｂ頁参照）。

植物中で発現させるためのかかるターミネータ−／ポリアデニル化配列の例は、Ｈ，ＤｅＧｒｅｖｅらの論文、“Ｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ−５１１（１９８２）に発表されているようなアグロバクテリウムツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｓｅｒａｃｉｅｎｓ）ＴＩプラスミド由来のオクトビンシンターゼ遺伝子由来のものである。微生物宿主中で発現させるためのかかるターミネータ−の例は、サルモネラ・チフィムリウム主筆編集；＾−ｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｙ発行（１９８７年）参照。該遺伝子ターミネータ−配列はまた、それが宿主細胞によって必要とされる転写終結及びポリアデニル化について上記の基準を満たす限りは、宿主細胞の細胞とは異なる細胞中に見出されるターミネータ−配列から部分として又は全体として誘導し得る。

シュウ酸塩オキシダーゼ用遺伝子に結合させ得る別の型の調節要素は、シグナルペプチドをコード化するＤＮＡ配列である。該シグナルペプチドはタンパク質のアミノ末端に結合され、タンパク質が細胞壁に局在化されることを可能にするか又は宿主細胞から分泌されることを可能にする。この局在化の過程の間に、シグナルペプチドは、成熟タンパク質の配列をもったタンパク質生成物を産生じながら開裂する。シグナルペプチド用のＤＮＡ配列は、プロモーターとコーディング領域の間に挿入される。当該技術分野において公知の標準的方法を使用して、シグナルペプチド用のＤＮＡ配列を結合し得る（例えばＴ、　Ｍａｎｉａｔｉｓらの前記論文、第１０４〜１０Ｂ頁参照）。かかるシグナル配列の例としては、植物の拡張遺伝子由来のシグナルペプチド（Ｃｈｅｎ　Ｊ、とＶａｒｎｅｒ　Ｊ、Ｅ、の論文、’ａｎ　ｅｘｔｒａｃｅｌ　Ｉｕｌａｒｍａｔｒｉｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ：　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｒ　ａ　ｇｅｎｏｗｉｃリアーゼ）遺伝子由来のシグナルペプチド及び酵母のパープロ（ｐｅｒｐｒｏ）因子［５ａｉｔｈ　Ｒ，Ａ、らの論文、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２９．１２１９−１２２９（１９８５））由来のシグナルペプチドが挙げられる。該シグナルペプチド配列はまた、それが宿主細胞中でタンパク質のプロセッシング及び局在化について上記の基準を満たす限りは、宿主細胞の細胞とは異なる細胞中に見出されるターミネータ−配列から部分として又は全体として誘導し得る。

外来遺伝子を植物中に導入することに関する公知の種々の方法が、シュウ酸塩オキシダーゼを宿生植物中に挿入するのに使用し得る。

シュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子を用いて植物形質転換を達成するのに選択される方法は、宿主植物に応じて変化する。例として、シュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子を用いて植物形質転換を行うのに有用である１つのよく特定された方法は、アグロバクテリウムを媒介とした植物形質転換である。シュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子を使用するアグロバクテリウムを媒介とした植物形質転換は、この方法について周知の方法に従う。先ず、植物中で発現させるのに適した遺伝子カセットを、中間宿主としてのアグロバクテリウム・ツメフファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｓｅｆａｃｉｅｎｓ）の攻撃手段を取り除いた（ｄｉｓａｒ■ ｅｄ）菌株中に導入する。上記シュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子カセットを選択可能な標識遺伝子、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ等をコード化する遺伝子を含有する組換えプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域に導入す机この方法は多くの文献類例えばＨｏｒｓｃｈらの論文、“＾Ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ　Ｇｅｎｅｓ　Ｉｎｔ。

Ｐｌａｎｔｓ”　、５ｃｉｅｎｃｅ、２２７．１２２９−１２３１（１９８５）に挙げられている。植物組織例えば葉、子葉又は胚軸の細片を、細菌と共に２〜３日間インキュベートし、その後に該細菌を抗生物質例えばカルベニシリンを使用して殺した。用いた選択可能な標識遺伝子に対応する追加の抗生物質を、形質転換植物細胞のみが生育するように植物組織培養培地に含有させた。

次いで、形質転換細胞から再生された植物を、シュウ酸塩オキシダーゼ遺伝子の存在及び発現について試験した。免疫検定及びシュウ酸塩オキシダーゼ活性の試験を使用して、個々の形質転換体を同定し得る。また、外因性シュウ酸耐性は、そのままの完全な（ｉｎｔａｃｔ）組織の機能試験としても使用できる。

報告されているように、数種の別の方法がアグロバクテリウム形質転換とは別に植物形質転換に利用し得る。これらの別のＤＩＩＩＡ輸送方法の例としては、電気穿孔法、すなわちプロトプラストへの化学的に誘導した輸送法、機態注入法、バイオロスティックス（ｂｉｏｌｏｓｔｉｅｓ）及びその他の方法が挙げられる。アグロバクテリウムを媒介とした形質転換に特に適していない植物の種類の例は、ダイズ及びある種の穀物種例えばトウモロコシである。これらの植物は、アグロバクテリウム媒介形質転換以外の方法を使用する植物形質転換法により恩恵を受けることは明らかである。

本明細書に添付の図面は下記の通りである。

図１は、大麦の苗のシュウ酸塩オキシダーゼをコード化するーＲＮＡから逆操作されたｃＤＮＡ配列を示すものである。

図２は、図１に示したｃＤＮＡから翻訳されたアミノ酸配列を示すものである。

図３は、シュウ酸塩オキシダーゼをクローン化するのに使用したクローニング方法であって、以下の実施例１及び２で詳細に説明したクローニング方法を図解的に示すものである。

図４は、以下の実施例３及び４に記載のクローニング方法を図解的に示すものである。

図５は、プラスミドｐＶＢｌの構造を示すものであり、そして図６は、プラスミドｐＢｉｎ１９１の構造を示すものである。

本発明を、例証のために、以下の実施例により説明する。

実施例１トマト形質転換用のシュウ酸塩オキシダーゼ非分泌ベクターの組立て（ａ）シュウ酸塩オキシダーゼ読み取り枠（ＯＲＦ）全体の再構築オリゴヌクレオチド１２１９９０１Ａとオリゴヌクレオチド１２１９９０ＬＡ　Ｃ相補鎖）とを設計し、次いで合成して５°末端でＨｉｎｄｍ制限部位をもち、３°末端でＢｓａ　ｌ制限部位をもつリンカ−を形成させた。

オリゴヌクレオチド　１２１９９０１人Ｓ’−ＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＧＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＧＴＣＧＣＧＧＡＣＣＴＣＧＡＴＧＧＣＡＡＧ（ＪＣＧＧ可ＣＴＣＧ−３’オリゴヌクレオチド１２１９９０１Ａ（相補釦Ｓ　’　−Ｔ（ＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＡＧＧＴＣＣＧＣＧＡＣＧＣＡＧＭＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＴＣＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＡＴＣＡ−３’前記の２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、次０でＨｉｎｄｍでして、ペプチド配列によって示されるような成熟シュウ酸塩オキタ゛−ゼＯＲＦを含んだクローンｐＯＸＯＸＬを生成させた。

クローン非２２中に結合されたＨｉｎｄＩＩＩ／Ｂｓａ　Ｉのクローニング゛の後（こ、成熟シュウ酸塩オキシダーゼＯＲＦの全体性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）をＤＮＡ配＋１１決定によって確認した。

（ｂ）発現ベクター中へのシュウ酸塩オキシダーゼＯＲＦの挿入成熟シュウ酸塩オキシダーゼのコープインク゛領域を、７００　ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ制限断片としてアガロースカ１ら単離し、その両末端これら２つの平滑末端化断片を一緒に連結させて、クローンｐＮＢＯＸＯＸＩを生成させた。クローンｐＮＢＯＸＯＸｌ中のシュウ酸塩オキシタ゛−ゼコーディング領域の正しい配向を、ＤＮＡ配列決定によってＨ。

した。

（ｃ）ｐＢｉｎ１９Ｒｉ中へのシュウ酸塩オキシダーゼ発現カセットの伝達’）　ロー　ンｐＮＢＯＸＯＸｌを、ＨｉｎｄＩＩ［で切断し且つＥｃｏＲＩで部分的１こ切断した。得られた１、９　ｋｂの発現カセットをアガロースカ）ら単離１７、ＥｃｏＲＩと１Ｉ４ｎｄＩＩ［で切断したｐＢｉｎ１９Ｒ４（図６参ｇ）中１こクローニングしてクローンｐＮＯＸ　ｌを得た。

クローンｐＮＯＸｌ中のシュウ酸塩オキシダーゼ発現カセットの存在を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＤＩを用いてプラスミドＤＮＡを制限することにより確認した。

（ａ）ｐＶＢｌ中へのシュウ酸塩オキシダーゼ発現カセットの伝達上記実施例１に記載の、クローンｐＮＢＯＸＯＸ１から単離したシュウ酸塩オキシダーゼ発現カセットを含有する２、１　ｋｂのＥｃｏＲＩ　／Ｈｉｎｄｍ切断断片を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとで切断したｐＶＢｌ　（図５参照）中にクローン化してクローンｐＶＢＯＸ１を得た。

クローンｐＶＢＯＸｌ中のシュウ酸塩オキシダーゼ発現カセットの存在を、ＥｅｏＲＩとＨｌｎｄｍとでプラスミドＤＮＡを制限することにより確認した。

（ｂ）クローンｐＶＢＯＸｌ中へのハイグロマイシン耐性遺伝子の挿入ハイグロマイシン耐性カセットを含有する２、３　ｋｂのＨ１ｎｄｌＩＩ制限断片をｐ１９ＨＹＧから単離し、Ｈｉｎｄｍで切断したクローンｐＶＢＯＸｌ中にクローン化してクローンｐＨ０Ｘ１を得た。

クローンＩ）ＨＯＸ　ｌ中の上記ハイグロマイシンカセットの存在と配向とを、ＥｅｏＲＩでプラスミドＤＮＡを消化することにより確認した。

（ａ）　ＰＣＲによる、拡張シグナルペプチド／シュウ酸塩オキシダーゼ融合物の組立て成熟シュウ酸塩オキシダーゼを拡張シグナルペプチドに融合させるために、オリゴヌクレオチドＥＸＴＯＸ−５とオリゴヌクレオチドＥＸＴＯＸ−３とを設計し、合成した。

ＥＸＴＯＸ−５０ＴＯＸ−３Ｓ’−ＣＴＡＴＴＡＡＡ′ｒＴＣＧＣＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡ？ＡＴＡＴＡＧＡＡＴＴＡＣ−３’前記の２つのオリゴヌクレオチドを、鋳型としてのクローンｐＮＢＯＸ１と共にＰＣＢプライマーとして使用した。得られた７７１　ｂｐのＥＸＴＯＸ　ＰＣＲ生成物であって、成熟シュウ酸塩オキダーゼコーディング領域に対して枠内で融合した２３個のアミノ酸拡張シグナルペプチドを含有する上記ＥＸＴＯＸ　ＰＣＲ生成物を、Ｋｐｎ　Ｉでで切断した。

Ｃｂ）ヘク９−ｐＪＲ１（＋）ＩＪＣ）中へ７７）ＥＸＴＯＸ　ＰＣＲ生成物の挿入上記のＫｐｎ　Ｉで消化したＥＸＴＯＸ　ＰＣＲ生成物を、ＫｐｎＩで切断したｐＪＲＥｌ（ｐＵＣ）中ニクローン化して、りｏ　−：／Ｉ）ＪＥＸＴＯＸＩを害り。クローンｐＪＥＸＴＯＸｌ中ノＥＸＴＯＸ　ＰＣＲ生成物の配向と配列を、ＤＮＡ配列決定ニよって確認した。

（ｃ）ｐＢｉｎ１９１中へ１７）　ＥＸＴＯＸ発現カセ発現カセット強伝達拡張／シュウ酸塩オキシダーゼ発現カセットーンｐＪＥＸＴＯＸＬから、１．５　ｋｂノＥｃｏＲＩ　／Ｈｉｎｄｍ制限断片として単離し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩ［Ｉとで切断したｐＢｉｎｌＱｉ中にクローン化して、クロー：／ＩＩＩＮＥＸＴＯＸＩを得た。

クローンｐＮＥＸＴＯＸｌ中の発現カセットの存在を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｍとでプラスミドＤＮＡを消化することにより確認した。

実施例４ヒマワリ形質転換用のシュウ酸塩オキシダーゼ分泌ベクターの組立て（ａ）分泌発現カセットの単離及びｐＶＢＬ中への挿入拡張／シュウ酸塩オキシダーゼ発現カセットを、クローンｐＪＥＸＴＯＸｌから１．５　ｋｂのＥｃｏＲＩ　／　Ｈ１ｎｄｍ制限ｍ１片として単離し、ＥｃｏＲＩとＨｌｎｄｍとで切断したｐＶＢｌ中にクローン化してクローンｐＶＥＸＴＯＸｌを得た。

クローンｐＶＥＸＴＯＸｌ中の上記発現カセットの存在を、ＥｃｏＲＩとＨ１ｎｄ■でプラスミドＤＮＡを消化することにより確認した。

（ｂ）クローンｐＶＥＸＴＯＸｌ中へのハイグロマイシン耐性遺伝子の挿入上記ハイグロマイシン耐性カセットを含有する２、３　ｋｂのＨ１ｎｄｍ制限断片をｐ１９ＨＹＧから単離し、Ｈｉｎｄｍテ切断したりＯ−ンｐＶＥＸＴＯＸｌ中にクローン化してクローンｐＨＥＸＴＯＸｌを得た。クローンｐＨＥＸＴＯＸｌ中の上記ハイグロマイシンカセットの存在と配向とを、ＥｃｏＲＩでプラスミドＤＮＡを消化することにより確認した。

Σ−ＨζΣ− αｒ　ＣＡ　Ｏ：ｉ　−２’：／４　＞−Ｅ−４−閏く山；のトのＭＨＯｏＯ口Φ山ＺＺＱｂＪ＞山〉ω−−αＯＯ江ｄハト＞ＣＬ４ｃｐ＞Ｃローフ４Σト弓−〇 α−トＯ匡■乙くｒ−−、−Ｊ−ＱＨＣ！ｌＯ’Ａ山口ＧＬＩ閲＜の〉ロロンＦ−４〆Ｚ〆山０江ト＜〉江０− 口く＜区〉のく図５ｐＶＢ１＝形質転換ベクター図６ｐＢＩＮ１９Ｒｉの構造親プラスミドｐＢＩＮ１９　（α、　Ｂｅｖａｎの論文、ＭＡＲ，１２，８７１１−８７２１（１９８４））に対して逆向きである。

図７ｐｌＱＨＹＧＡの構造ＣａＭＶ３５Ｓ　＝カリフラーツーモザイクウィルス３５ＳプロモーターＯＣＳ　＝オクトピンシンターゼ３゛領域親プラスミドはｐＢＩＮ１９である。

、　、、　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１００３３１フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　９１０２　９３５９−４Ｂ（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤＦＩ（７２）発明者　ショール、サリイット、ニス。

アメリカ合衆国、ペンシルバニア・１８９４０゜ニュートン、ティーベリー・レーン、１５（７２）発明者　シュミット、マーク、アール。

アメリカ合衆国、ニューシャーシー・０８６００、トレントン、ケンシングトン・アベニュ、１０７

Claims

【特許請求の範囲】１．シュウ酸塩オキシダーゼ酵素をコード化するＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡであって且つ添付図面の図１のＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡ、及び遺伝暗号の縮重によって許容されるその変異体。２．ゲノムＤＮＡであって、それに対して請求の範囲第１項記載のｃＤＮＡがハイブリダイズするゲノムＤＮＡ。３．約２５キロダルトンの単一のサブユニットを特徴とする、シュウ酸塩分解能を有する酸素。４．植物を処理するのに使用して該植物中のシュウ酸を分解するための実質的に純粋なシュウ酸塩オキシダーゼであって、添付図面の図２に示されるアミノ酸配列を有し且つ３．５のｐＨ最適条件、陽性の熱安定性、約２５キロダルトンの単一のサブユニット及びプロテアーゼ安定性を特徴とするシュウ酸塩オキシダーゼ。５．前記シュウ酸塩オキシダーゼを植物に輸送するための耕種学的に適当な担体をさらに含有する請求の範囲第４項記載のシュウ酸塩オキシダーゼ。６．植物中のシュウ酸を分解する方法であって、該植物を該シュウ酸から保護するように該植物にシュウ酸分解酵素を輸送することからなる植物中のシュウ酸を分解する方法。７．前記酵素がシュウ酸塩オキシダーゼである請求の範囲第６項記載の方法。８．前記シュウ酸分解酵素の輸送は、該酵素を農業上許容し得る担体と組合わせて植物又は該植物の生育場所に施用することによって行われるものである、請求の範囲第６項記載の方法。９．前記シュウ酸塩オキシダーゼ酵素を植物に対して、該シュウ酸塩オキシダーゼをコード化する遺伝子による植物ゲノムの遺伝子形質転換によって輸送する請求の範囲第７項記載の方法。１０．植物組織中のシュウ酸塩の還元方法であって、シュウ酸塩オキシダーゼ酵素をコード化する遺伝子を植物のゲノム中に安定的に組み込むことからなる、植物組織中のシュウ酸塩の還元方法。１１．前記遺伝子が遺伝子形質転換によって前記植物中に組み込まれるものである請求の範囲第１０項記載の方法。１２．プロモーター配列と、シグナルペプチドと、前記シュウ酸塩オキシダーゼ酸素をコード化する構造遺伝子配列と、遺伝子末端配列とを有する遺伝子組立て体によって前記植物ゲノムが形質転換される請求の範囲第１１項記載の方法。１３．シュウ酸塩オキシダーゼの発現用遺伝子を含有する形質転換植物細胞。１４．前記遺伝子が添付図面の図１のＤＮＡ配列を含むものである、請求の範囲第１３項記載の形質転換細胞。１５．前記遺伝子によって発現された前記シュウ酸塩オキシダーゼが約２５キロダルトンの単一のサブユニットである、請求の範囲第１３項記載の形質転換細胞。１６．シュウ酸を分泌するカビ菌類の感染による植物の病気発生を撲滅する方法であって、シュウ酸塩オキシダーゼをコード化する遺伝子を、形質転換によって前記植物のゲノム中に安定的に組み込むことからなる、シュウ酸を分泌するカビ菌類の感染による植物の病気発生を撲滅する方法。１７前記のカビ菌類が、スクレロチニア（Ｓｏｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属、スクレロチウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ペニシリウム（ＰｅｎｉｃｉｌｌＨｕｍ）属、ピチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、パキシラス（Ｐａｘｉｌｌｕｓ）属、マイセナ（Ｍｙｃｅｎａ）属、リューコストマ（Ｌｅｕｃｏｓｔｏｍａ）属、リノクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属、ウエットゼリニア（Ｗｈｅｔｚｅｌｉｎｉａ）属及びシゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属からなるシユウ酸分泌性のカビ菌類の群から選択される一つの属のものである、請求の範囲第１６項記載の方法。１８．前記のカビ菌が菌核病菌（ＳＣｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｏｒｕｍ）である、請求の範囲第１７項記載の方法。１９．前記植物がヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｕｓ）である、請求の範囲第１６項記載の方法。２０．植物であって、そのゲノム中に形質転換によって、シュウ酸塩オキシダーゼをコード化する遺伝子が安定的に組み込まれた植物。